Protocol
1 Embryoid Body (EB) Bildning
- Gelatin-anpassning ekonomiska och sociala råd som har underhålls på mus embryofibroblaster (MEF). Passage ESCs tre gånger på 6-brunnars vävnadsodlingsplatta som belagts med 0,1% gelatin för att avlägsna MEFs.
- Odla celler i ESC underhållsmedier med LIF att hålla cellerna odifferentierade (tabell 1). Se till att cellerna aldrig överstiga 80% sammanflödet. Använd låg passage (10 eller färre passager efter avlägsnande från MEF) celler för differentiering.
- På dagen före ekonomiska och sociala råd odlas för EB differentiering, passage cellerna så att de kommer att vara cirka 50-70% sammanflytande nästa dag. Fortsätt att odla celler i ESC underhållsmedium för att behålla cell pluripotencyen.
- På dagen för den differentiering, aspirera ESC underhålls media och tvätta med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, och 11,9 mM fosfatbuffert, pH 7,4) per brunn i en 6-brunnsplatta.
- Lägg 200 ul av 0,25% Trypsi / EDTA till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 3 min.
- Inaktivera trypsin / EDTA med 800 l av differentieringsmedia. Pipettera upp och ned i en 2 ml serologisk pipett med en p200 spetsen för att bryta upp cellerna i en enda cellsuspension. Se till att p200 spetsen sitter tätt på slutet så media inte går upp mellan pipett och dricks gränssnitt.
- Pipet upp och ner ungefär 5-10 gånger. Se till att inte skapa bubblor under pipettering.
- Överför celler till en 15 ml koniskt rör. Ta upp volymen till 10 ml med PBS. Centrifugera vid 315 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten. Tvätta två gånger med 5 ml PBS för att ta bort kvarvarande material som innehåller LIF. Centrifugera som i steg 1.4 för varje tvätt.
- Resuspendera slutliga cellpelleten i 2 ml differentieringsmedium (Tabell 2).
- Räkna celler med en hemocytometer eller cellräknare och plattan 6,000-10,000 celler / ml i en 10 cm Petri-platta(Icke-vävnadsodling behandlad).
- Bestäm exakt celler / ml empiriskt för varje ESC linje. Använd sterila petriplattor som normalt används för bakteriell arbete eller låg följsamhet plattor.
OBS: För bästa differentiering resultat bör EBS bildar sfärer som finns kvar i suspension utan att fästa till plattan. Testa flera märken av plattor för att hitta de med minst följsamhet. - Inkubera de differen ESCs i en 37 ° C vävnadskultur inkubator med 5% CO2.
- Bestäm exakt celler / ml empiriskt för varje ESC linje. Använd sterila petriplattor som normalt används för bakteriell arbete eller låg följsamhet plattor.
| Reagens | Lager | Slutlig koncentration | Volym | Företag | Katalog nr |
| DMEM | 1x | 410 ml | S Igma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (ES Skärmad) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Icke-essentiella aminosyror | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11.140 |
| L-glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 35.050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15.070 |
| β-merkaptoetanol | 14,3 M | 114 pM | 4 pl | Sigma / Aldrich | M3148 |
| Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | 10 7 enheter / ml | 1000 enheter / ml | 50 | il | Millipore | ESG1107 |
| Reagens | Lager | Slutlig koncentration | Volym | Företag | Katalog nr |
| DMEM | 1x | 410 ml | Sigma / Aldrich | D5796 | |
| FBS (Användare screenas för optimal differentiering) | 100% | 15% | 75 ml | Hyclone | SH30070.03E |
| Icke-essentiella aminosyror | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 11.140 |
| L-glutamin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologier | 35.050 |
| Penncillin / Streptomycin | 100x | 1x | 5 ml | Life Technologies | 15.070 |
| β-merkaptoetanol | 14,3 M | 114 pM | 4 pl | Sigma / Aldrich | M3148 |
Tabell 2: Differentiering Media.
2. Förbereda EB celler för virus infektion
- Vid den önskade utvecklingsstadium (mellan dag 2 och dag 3), överföra EBS från 10 cm petriskål till 15 ml koniska rör. Tvätta plattan med 5 ml PBS och lägga tvätten i koniska rör.
- Pellets EB vid 315 xg vid rumstemperatur i 5 minuter. Tvätta EB-celler med 5 ml PBS.
- Tillsätt 1 ml tinat cell lossnar lösning (innehållande proteolytiska och kollagenolytiska enzymer) och placera rören i ett 37 ° C vattenbad (eller inkubator) under 30 minuter med occasional omrörning (från snärta eller ljus virvling).
- Tillsätt 1 ml differentieringsmedia. Pipettera upp och ned med en 2 ml pipett med en P200 pipettspets. Placera röret i 37 ° C vattenbad igen för 30-60 min.
- Centrifugera ner cellerna vid 315 xg under 5 min och tvätta cellerna med PBS.
3 Virus Infektion
- Resuspendera cellerna i 1,5 ml av differentiering medier. Överför cellsuspensionen till en 6-brunnars icke-vävnadsodlingsbehandlade plattan.
- Förbered retrovirus med standardtekniker i förväg. Lägg 5-100 pl av viral supernatant till cellerna, beroende på viral titer. Lägg inte till polybrene att förbättra infektion eftersom det hämmar den efterföljande reformation i EBS.
- Spinoculate cellerna med viruset genom centrifugering vid 2120 xg under 90 min vid rumstemperatur.
4 Skilja virusinfekterade EB celler i Hängande Drops
- Tillsätt 2 ml av differentiering media till varje brunn i Infected EB cellsuspension.
- Pipettera 3,5 ml infekterad EB cellsuspensionen i ett sterilt reagensbehållare för multipipettors. Använd multipipettor att pipettera 15-20 rader om åtta 20 l droppar på den inverterade lock 15 cm Petri platta.
- Tillsätt 10 ml sterilt PBS eller vatten till den nedre halvan av petriplatta. Sedan invertera locket med droppar och plats fast på Petri plattan. Se till att dropparna hängande upp och ner från locket med PBS eller vattnet nedanför för att hålla kammaren fuktas.
- Sätt in skålarna i 37 ° C vävnadsodling inkubator med 5,0% CO2.
- Efter 2 dagar, samla EB bildas i hängande droppar genom att vända lock och tvättning med 4,5 ml differentieringsmedia.
- Överför media och EB till ett nytt 10 cm icke-vävnadsodling Petri plattan. Tvätta locket ytterligare en gång med 3 ml differentieringsmedia och överföring till 10 cm platta.
- Harvest celler för analys med flödescytometri efter totalt 8dagars odling med början från den inledande överföringen av celler för differentiering media (-LIF).
5. Förbereda celler för flödescytometer Analys
- Överför celler till ett 15 ml koniskt rör med en 10 ml pipett. Tvätta plattan med 5 ml PBS och överför till samma koniska rör.
- Pellets cellerna vid 315 x g. Tvätta pellets med 10 ml PBS.
- Tillsätt 1 ml av den upptinade celler lossnar och placera rören i ett 37 ° C vattenbad i 30 min med tillfällig omrörning. För detektering av vissa cellytantigener kan trypsin användas istället.
- Lägg 1 ml differentieringsmedia och pipettera upp och ned med en 2 ml pipett. Använd en p200 tips till slutet av pipett för att hjälpa till att bryta upp diger EB i encellssuspension.
- Placera röret i ett 37 ° C vattenbad igen under 60 min för att de integrerade membranproteiner för att återvinna till cellytan.
- Pellets cellerna vid 315 xg under 5 minuter.
- Tvätta cellerna with 0,1% bovint serumalbumin fraktion V (BSA) beredd i PBS (PBS / BSA) och inkubera cellerna med specifika fluorescensmärkta antikroppar.
6. Flödescytometrianalys för hematopoetiska stamceller
- Placera 10 6 EB härledda celler i en 5 ml 12 x 75 mm rundbottnad röret. För justering flödescytometer inställningar ersättning, använda ersättnings pärlor enligt tillverkarens anvisningar.
- Pellets cellerna vid 315 x g. Häll bort supernatanten och återsuspendera pelleten i återstående PBS / BSA-lösning i röret.
- För att upptäcka ESC HPC, inkubera cellerna med fluorescerande märkta antikroppar: anti-mus CD41-PE (R-fykoeryterin) och anti-mus-CD117 (ckit) -APC / CY7 (allofykocyanin Cyanine 7).
- Späd antikroppar 1: 100 i PBS / BSA. Lägg 100 | il utspädd antikropp till varje prov. Bestäm korrekt spädning av antikropp för varje leverantör, klon, och parti eller antikropp. Bestäm optimal utspädning för att märka celler individuellt.
- Inkubera prov på is i mörker under 30 minuter.
- Tillsätt 2 ml PBS / BSA och pelletceller vid 315 xg under 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 300 | il PBS eller annan isoton buffert.
- Filtrera suspenderades celler genom en cell sil lock (0.35 M) för att ta bort stora cellaggregat.
- Analysera cellerna på en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dessa studier gelatiniserade RW4 (Härstammar från 129X1 / SVJ musstammen) ekonomiska och sociala råd användes. EB isolerades på 3 dagar av differentiering. För bästa resultat EBS ska vara sfäriska och icke-vidhäftande (figur 1 A, B). Efter spinoculation med virus samuttrycker den fluorescerande markör GFP tillsammans med en gen av intresse, var EB reformeras med hängande släpp-metoden. EBS har framgångsrikt reformeras från cellsuspensioner framställda från 2,0, 2,5 och 3,0 dag EBS. Dock kunde EB inte reformeras från cellsuspensioner framställda från dag 4.0 EBS. Den chimerism av EBS mellan infekterade och icke-infekterade celler observerades genom fluorescensmikroskopi på dag 8 av differentiering (Figur 2A, B). Densiteten hos EBS gör ofta EBS verkar vara 100% GFP-positiva. Emellertid kan fokusera på olika fokalplan avslöja bidraget av GFP-positiva och negativa celler till EBS (Figur 2B).
For analys av HPC utveckling, var chimära EB dissocieras till enkelcellsuspensioner efter 8 dagar av differentiering. Antagonist aktiviteten av miRNA (er) i mirn23a klustret (Mirs-23a, 24-2, och -27) resulterar i en oförmåga ekonomiska och sociala råd att differentiera till blod stamceller (Manuskript under utarbetande). För att avgöra om överuttryck av mirn23a klustret har motsatt effekt, har ekonomiska och sociala råd smittade vid uppkomsten av differentiering. Detta resulterar emellertid i generering av minskad HPC. Eftersom mirn23a klustret kan vara inblandade i TGFß / BMP / Smad signalering 18-21, får klustret har tydliga effekter när de uttrycks i olika skeden av EB utveckling liknande den BMP4 aktiverat Smad1 protein 12,13. Med hjälp av detta protokoll, har EB Enkelcellsuspensioner smittats efter 3 dagar av differentiering. EB reformerades genom hängning droppe, och därefter analyseras på dag 8 för HPC generering genom att analysera CD41 och CD117 cellytan expression med flödescytometri. CD41 + enstaka positiva celler är en pool av primitiva och slutgiltiga HPC, medan CD41 + CD117 + celler innehåller endast definitiva HPC 22,23. Vi observerade en betydande ökning av den totala populationen av CD41 + HPC i MSCV-mirn23a infekterade celler jämfört med MSCV kontroll virusinfekterade celler (Figur 3). Figuren visar också att uppnås en hög bidrag infekterade celler till de reformerade EBS. Det är viktigt att infektera EB med både ett kontrollvirus som uttrycker det fluorescerande proteinet enbart, liksom infektera celler med den experimentella viruset. Infekterade populationer (GFP +) ska sedan jämföras för skillnader i fenotyp. Undersöka skillnader mellan oinfekterade celler kontra infekterade celler kan ge felaktiga resultat. Jämföra GFP- (oinfekterade) och GFP + (infekterad) populationer finns det en skillnad i CD41 befolkningarna i både MSCV och MSCV-mirn23a kulturer (Figur 3). Denna ökning kan berotill retrovirus infekterar proliferativa celler.
Figur 1: Representant Dag 3 Embryoid organ RW4 ekonomiska och sociala råd har bytt från ESC underhållsmaterial i differentierings media och odlade i 10 cm plattor (A) 4X och (B) 10X bilderna visas i embryoidkroppar som utvecklades efter 3 dagars odling... I 4X bilden baren representerar 1.000 um, medan i 10X bilden baren representerar 400 pm.
Figur 2: Åtta dagars Embryoid organ (EB) reformerade från retroviral infekterade dag 3 EB-celler. (A) Vänster sidobilder handen är ljusa fält. (B) De tre fluorescerande kolumner av fluorescerande bilder till höger är samma EB tas i diflunda fokalplan. I 4X bilderna baren representerar 1.000 um, medan det i 10X bilderna baren representerar 400 pm.
Figur 3:. Flödescytometrianalys av hematopoetiska progenitorceller som produceras i chimära EB Enstaka celler suspensioner framställdes av d3 EBS, och infekterades med de indikerade retrovirus. EB reformerades genom hängning droppe, och odlas i ytterligare 8 dagar. Enkelcellsuspensioner genererades och inkuberades med fluorescerande antikroppar mot CD41 och CD117. Vänster histogram tomter visar GFP- (icke-infekterade celler) och GFP + (infekterade celler) grindar. De högra panelerna visar färgpunktdiagram av celler positiva för CD41 och CD117 uttryck i GFP- och GFP + grindar. Primitiva hematopoietiska progenitorer påträffas i CD41 + fraktioner och slutgiltiga progenitorer är närvarande i både CD41 + CD117- och CD41 + CD117 + fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som diskuterats ovan, kan ESK kloner som inducerbart uttrycker en gen av intresse tas fram med doxycyklin system är dock tidskrävande och arbetsintensiv produktion av dessa linjer. Beskrivs i detta protokoll är en metod för att uttrycka en gen av intresse i en enda cell suspension beredd från ESC härledda EBS. Dessa infekterade celler sedan omformas till EB genom hängning droppe att undersöka senare differentiering. I exemplet (Figur 3), visas att uttrycket av mirn23a klustret ökar hematopoetisk utveckling när den uttrycks på dag 3 av differentiering. Vid denna punkt utvecklingen av begynnande GRODDBLAD vävnad har inträffat bland tidiga mesoderm som ger upphov till blodstamfäder. På dag 2 och 3 i RW4 ESC differentiering, uttryck av gener som representerar ektoderm (Pax6), endoderm (FoxA2) och mesoderm (T, Twist och Tbx6) upptäcks av kvantitativ omvänd transkriptas-PCR (Q-RT-PCR, Data inte visad). För mirn23a att öka HPC produktion, kan det behöva uttryckas i tidiga mesoderm. Denna teknik gör det möjligt att kunna avgöra om en transgen har olika effekter på den temporala uttryck utan att spilla en hel del ansträngning för att generera nya reagenser. Vid observation fenotyper associerade med distinkta tidsuttryck, kan en utredare vill nu spendera försök att generera inducerbara linjer där uttrycket av transgenen kan hårt kontrollerade.
Andra tillämpningar för denna teknik inkluderar utföra räddningsförsök i ekonomiska och sociala råd, där båda alleler av en gen av intresse har strukits (Double Knockout ekonomiska och sociala råd, DKOs). Den vildtyp-gen eller muterade versioner av den borttagna genen kunde återinföras i de differen EB celler. Dessutom räddning av en fenotyp av gener nedströms den borttagna genen kan analyseras. Denna metod kan användas för att undersöka cell inneboende natur av de observerade fenotyperna. Till exempel i hematopoiesis har defekter observerats i gener som påverkar antingen hematopoetiska stam och progenitorceller själva eller ibland felet kan påverka celler i mikromiljön som behövs för att stödja utvecklingen av stamceller och progenitorceller 16,24. I detta system, om felet är inneboende hematopoetiska progenitorceller, sedan återinförandet av vildtyp genen kommer bara rädda hematopoetisk utveckling i GFP + (retroviral infekterade celler). Om defekten var icke-cell autonom, då retroviral infektion skulle resultera i en räddning av hematopoietisk utveckling observeras i både GFP + och GFP- populationer.
I detta protokoll flödescytometri används för att identifiera hematopoetiska progenitorceller från cellytan uttryck av CD41 och CD117. Alternativt, efter 8 dagar av differentiering infekterade GFP + celler kunde isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). De isolerade cellerna kan därefter analyseras för närvaron av specific hematopoetiska stamceller från hematopoetiska kolonianalyser i metylcellulosa media som vi har tidigare beskrivits 25,26. På liknande sätt kan RNA extraheras från sorterade celler och analyserades för expression av härstamnings specifika gener.
Fördelen med den beskrivna tekniken är att den kräver minimal ansträngning för att generera de nödvändiga reagensen, och möjliggör temporal expression av en transgen i framkallnings EB. Om en viral vektor som samuttrycker genen av intresse med ett fluorescerande protein är redan tillgänglig experimentet kan utföras omedelbart. Det finns några begränsningar som skall beaktas med väljer att använda det här protokollet. Tekniken beskrivs här kräver förmågan att producera hög-titer retrovirus för att få tillräckligt många celler för analys. Observera även att användningen av retrovirus kan resultera i insertionsmutationer som kan ge en fenotyp. Men eftersom detta protokoll undersöker en pool av infekterade celler i stället för ettklonal population, är det mindre sannolikt att en fenotyp på grund av insertionsmutationer kommer att observeras under den korta tid av kultur. Den huvudsakliga begränsningen av tekniken (jämfört med ett inducerbart system såsom vid tet-systemet) är att uttryck av transgenen kan inte tystas vid en senare tidpunkt, och det finns ingen möjlighet att kontrollera nivåerna av uttryck. ESCs som uttrycker en transgen under kontroll av doxycyklin reglering är fördelaktig, eftersom den gör det möjligt inte bara för att slå på den gen i ett tidsmässigt sätt, men tillåter också för att stänga av genen vid en senare tidpunkt. Variera mängden en inducerare såsom doxycyklin kommer också att möjliggöra för användaren att finjustera uttrycket. Slutligen de inducerbara system möjliggör reproducerbart uttryck av transgenen i alla celler, medan i denna retroviral protokoll finns chimär expression av transgenen. Som diskuterats ovan fast denna chimär uttryck skulle kunna vara värdefullt för vissa tillämpningar. De inducerbara system erbjuder helt klart enmånga fördelar. Men på grund av den lätthet och minskade bekostnad av den teknik som beskrivs här, kommer många utredare finna det användbart för deras studier av embryonal stamcellsdifferentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ES Screened) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Falcon Non-treated Plates 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| Falcon Petri dish 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Falcon Petri dish 15 cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| Falcon Tube 5 ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| Falcon Tube 5 ml with Cell Strainer Cap | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| White sterile resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| Rat anti-mouse CD41 PE-conjugated | Biolegend | 133906 | |
| Rat anti-mouse CD117 APC/CY7-conjugated | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
References
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
- Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
- Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
- Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
- Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
- Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
- Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
- Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
- Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
- Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
- Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
- Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
- Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
- Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
- Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
- Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).
