Summary
इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के कई पहलुओं reproducing अनुमति देता है जो entorhino-हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों के लिए एक प्रोटोकॉल, प्रस्तुत किया है. न्यूरॉन्स में परिवर्तन के अलावा neurovasculature के परिवर्तनों का अध्ययन करके, इस प्रोटोकॉल की चोट के बाद तंत्रिका ऊतक में प्लास्टिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है.
Abstract
इस्कीमिक मस्तिष्क चोट उचित मस्तिष्क समारोह समझौता सबसे आम और खतरनाक स्थितियों के बीच में है और अक्सर प्रभावित रोगियों में कार्यात्मक घाटे बने की ओर जाता है. गहन अनुसंधान प्रयासों के बावजूद, अभी भी न्यूरोनल चोट कम कर देता है और देरी माध्यमिक मौत से इस्कीमिक क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की रक्षा करता है कि उपलब्ध कोई प्रभावी उपचार विकल्प है. इस क्षेत्र में रिसर्च को आम तौर पर व्यापक और समस्याग्रस्त पशु मॉडल का इस्तेमाल शामिल है. ऑक्सीजन और ग्लूकोज के अभाव (OGD) के साथ चुनौती दी Entorhino-हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों मस्तिष्क ischemia नकल जो इन विट्रो मॉडल में स्थापित कर रहे हैं. इस अध्ययन के उपन्यास पहलू मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं के परिवर्तनों की तुलना में और सहसंबद्ध किया जा सकता न्यूरोनल परिवर्तन और neuronal कम्पार्टमेंट और नाड़ी डिब्बे दोनों की प्रतिक्रिया के अलावा अध्ययन कर रहे हैं कि है. इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत तरीकों में काफी की संभावित अनुप्रयोगों को विस्तृत याganotypic टुकड़ा संस्कृति दृष्टिकोण. OGD या अकेले हाइपोक्सिया के शामिल होने organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में नहीं बल्कि साधारण माध्यम से आवेदन किया है और तंत्रिका ऊतक में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नुकसान होता जा सकता है. इस विवो में स्ट्रोक और ischemia उत्प्रेरण जटिल और समस्याग्रस्त पशु प्रयोगों के विपरीत में है. विश्लेषण का विस्तार करके बनाए रखने और मस्तिष्क के कार्य को बहाल करने के बारे में नए तरीके प्रदान कर सकता vasculature की प्रतिक्रिया का अध्ययन शामिल है. यहाँ प्रस्तुत टुकड़ा संस्कृति दृष्टिकोण इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के अध्ययन के लिए एक आकर्षक और महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में विकसित हो सकता है और neuroprotection के उद्देश्य संभावित चिकित्सीय उपायों के परीक्षण के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र vasculature से एक हानि या ऑक्सीजन और ग्लूकोज की आपूर्ति की कमी करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है. मस्तिष्क को रक्त की आपूर्ति की भी एक नहीं बल्कि कम रुकावट ठेठ स्ट्रोक सिंड्रोम के लिए अग्रणी प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों के समारोह की एक स्थायी नुकसान पैदा कर सकते हैं. प्राथमिक प्रभावित क्षेत्रों में neuronal नुकसान के अलावा, आमतौर पर माध्यमिक क्षति के माध्यम से अतिरिक्त देरी neuronal नुकसान होता है. दुर्भाग्य से अब तक, माध्यमिक neuronal मौत की कमी के लिए कोई न्यूरोप्रोटेक्टिव उपचार 1 उपलब्ध था. माध्यमिक क्षति के तंत्र के अध्ययन के लिए अनुसंधान प्रयासों मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा और विभिन्न thrombotic रोड़ा तकनीकों जैसे मस्तिष्क ischemia के पशु मॉडल के उपयोग पर भरोसा करते हैं (एक हाल की समीक्षा के लिए 2 देखें). समानांतर में, के कारण भी सीमाओं और पशु मॉडल, विभिन्न सीएनएस ऊतकों की organotypic टुकड़ा संस्कृति के उपयोग के साथ नैतिक चिंताओं के छात्रों की अनुमति है कि इस्तेमाल किया गया हैचोटों 3-5 के विभिन्न प्रकार के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं के डी वाई.
इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट की नकल है कि परिस्थितियों में neuronal प्रतिक्रिया का अध्ययन के लिए, ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव के मॉडल प्रणाली (OGD) विकसित किया गया है. इस मॉडल में, टुकड़ा संस्कृतियों अस्थायी रूप से ग्लूकोज की कमी होती है और ऑक्सीजन के अभाव में नाइट्रोजन गैस के साथ equilibrated किया गया है कि एक माध्यम के संपर्क में हैं. इस तरह के एक उपचार के साथ, यह विवो 6, 7 में इस्कीमिक चोट के बाद मनाया एक के लिए नहीं बल्कि समान है जो neuronal चोट और हानि के लिए प्रेरित करने के लिए संभव है. हिप्पोकैम्पस में, इस तरह के एक उपचार में विशेष रूप से सीए 1 में neuronal नुकसान लाती है, लेकिन नहीं सीए 3 क्षेत्र या हिप्पोकैम्पस की दांतेदार गाइरस. इसके विपरीत, टुकड़ा संस्कृतियों में नाड़ी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन अब तक व्यापक रूप से किए नहीं किया गया है. एक स्पष्ट कारण टुकड़ा संस्कृति मॉडल में परिसंचरण और रक्त वाहिका छिड़काव की कमी है. हालांकि, हम यह ख बनाए रखने के लिए संभव है कि पहले से पता चला हैसीएनएस में lood जहाजों 9, कई दिनों से 8 के लिए संस्कृतियों टुकड़ा.
इस विधि के समग्र लक्ष्य OGD के बाद न्यूरॉन्स के भाग्य की निगरानी लेकिन चोट की प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है जो vasculature के भाग्य और remodeling के लिए अध्ययन का विस्तार करने के लिए ही नहीं है. अब तक इस तरह के अध्ययन पशु प्रयोगों का उपयोग करने की आवश्यकता है. (डी जोंग एट अल, 1999; Cavaglia एट अल 2001.). प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत करने में, हम इस तरह के अध्ययन हाइपोक्सिया के साथ या दोनों neuronal अस्तित्व और रक्त वाहिनियों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण द्वारा पीछा excitotoxic घावों से या तो चुनौती दी entorhino-हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में विस्तार किया जा सकता है कि कैसे. इस प्रोटोकॉल इस विषय 10 पर एक पहले से प्रकाशित अध्ययन पर आधारित है और सीएनएस में neurovascular बातचीत में रुचि किसी भी प्रयोगशाला के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Protocol
पशु प्रयोगों 22 सितंबर 2010 के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के अनुसार किए गए (2010/63 / ईयू) और समीक्षा की और स्विस अधिकारियों से अनुमति दी गई.
1 Organotypic Entorhino-hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों की स्थापना
- स्थिर ऊष्मायन विधि 4,11 का उपयोग प्रसव के बाद सुबह 4 (पी 4) माउस पिल्ले से entorhino-हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों (EHOSCs) तैयार करें. इधर, C57BL6 और CB6F1 चूहों का उपयोग करें.
- यानी टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी के लिए माउस पिल्ला प्रति लगभग 30 मिनट, 6 माउस पिल्ले के कूड़े के लिए 3 घंटा ले लो. निष्फल सर्जिकल उपकरणों के साथ एक लामिना का प्रवाह कार्यक्षेत्र में बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों को पूरा.
- Septo लौकिक अक्ष के साथ टुकड़ा की स्थिति से एक संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए, केवल हिप्पोकैम्पस सेप्टल आधे के स्लाइस का उपयोग करें. अन्यथा कहा नहीं, तो आरटी पर सभी कदम बाहर ले.
- टी कटवह शल्य कैंची के साथ एक पी 4 माउस पिल्ला के सिर. कोई संज्ञाहरण इस कदम के लिए आवश्यक है.
- मस्तिष्क के आसपास खोपड़ी निकालें और मस्तिष्क गोलार्द्धों और मध्यमस्तिष्क की दुम अंत के बीच दरार की पहचान. ध्यान से खोपड़ी से मध्यमस्तिष्क के लिए मस्तिष्क व्याख्यान चबूतरे का हिस्सा हटाने और एल glutamine की एक स्थिर फार्म के साथ पूरक सदस्य से मिलकर बहुत ठंडा तैयारी मध्यम में जगह है.
- मस्तिष्क बर्फ ठंड तैयारी मध्यम में डूबे होने के साथ एक stereomicroscope के तहत विच्छेदन जारी रखें. कॉर्टिकल गोलार्द्धों से शेष तानिका निकालें. गोलार्द्ध के औसत दर्जे का दुम सतह पर हिप्पोकैम्पस पहचानें और मस्तिष्क के शेष से सटे entorhinal प्रांतस्था के साथ मिलकर यह अलग.
- एक ऊतक हेलिकॉप्टर के लिए ऊतक स्थानांतरण और हिप्पोकैम्पस के septo लौकिक अक्ष को सड़न रोकनेवाला शर्तों आड़ा तहत 400 माइक्रोन मोटी स्लाइस काट लें.
- CE पर स्लाइस रखेंडालूँगा संस्कृति सम्मिलित (लगभग 6 डालने के प्रति स्लाइस) और ऊष्मायन मध्यम (47 मिलीलीटर सदस्य, 25 एमएल ईगल मध्यम से अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीग्राम, 25 मिलीग्राम घोड़े सीरम, एक की 1 मिलीलीटर Glutamax मैं, 1 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों में उन्हें सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में बाँझ 10% ग्लूकोज समाधान, पीएच 7.3). मध्यम अगले दिन और 1 हफ्ते के लिए तो हर दूसरे दिन बदलें.
Reperfusion के साथ इन विट्रो hypoxia में 2 और ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव
- प्रक्रिया की एक सटीक समय अनुसूची के लिए 1 टेबल देखें. हाइपोक्सिया या OGD के लिए जोखिम से पहले 5 दिन (DIV5) के लिए संस्कृति EHOSCs. इस समय बिंदु पर निम्नलिखित संरचना के साथ मुक्त मध्यम सीरम 25% घोड़े सीरम युक्त ऊष्मायन मध्यम से मध्यम स्विच: Neurobasal मध्यम 2% B27 पूरक, 1% Glutamax और अतिरिक्त 0.1% ग्लूकोज के साथ.
- संदर्भ 7 घटकों की व्याप्ति अंतिम सांद्रता में विस्तृत रूप में निम्नलिखित होगा OGD मध्यम तैयार: 0.3मिमी 2 CaCl, 70 मिमी NaCl, 5.25 मिमी 3 NaHCO, 70 मिमी KCl, पीएच 6.8 से 1.25 मिमी नाह 2 पीओ 4, 2 मिमी MgSO 4, और 10 मिमी सूक्रोज. दो 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए OGD माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक हाइपोक्सिया कक्ष में 1 घंटे के लिए 2 एन के साथ OGD मध्यम छिड़कना और फिर सील और ओ रखने / 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एन.
- Hypoxic संकेतक के रूप में अवायवीय स्ट्रिप्स का उपयोग करें. स्ट्रिप्स का रंग सफेद करने के लिए गुलाबी से बदल जब ऑक्सीजन मुक्त होने के लिए मध्यम पर विचार करें.
- हाइपोक्सिया के शामिल होने के लिए, बजाय OGD मध्यम से ग्लूकोज के साथ सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग करें. उपयोग से पहले, OGD माध्यम के लिए ऊपर विस्तृत रूप में एक हाइपोक्सिया कक्ष में एन 2 के साथ मध्यम छिड़कना.
- स्लाइस OGD को उजागर कर रहे हैं इससे पहले, 30 मिनट के लिए 2 एन के साथ फिर से OGD मध्यम छिड़कना. एक 1 मिलीग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) 30 मिनट के लिए स्लाइस (2 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) अच्छी तरह से प्रति समाधान और चयन के 2 μl जोड़ेंप्रयोग के लिए ही स्वस्थ स्लाइसें पीआई सकारात्मक कोशिकाओं की कम संख्या से संकेत के रूप में.
- . OGD जोखिम और reperfusion चित्रा 1 में संकेत की अनुसूची का उपयोग 15 मिनट के लिए या तो ऑक्सीजन केवल (हाइपोक्सिया) या ऑक्सीजन और ग्लूकोज (OGD) के स्लाइस से वंचित.
- हाइपोक्सिया या OGD के शामिल होने के लिए, OGD माध्यम में स्लाइस हस्तांतरण और हाइपोक्सिया कक्ष में 15 मिनट के लिए रहते हैं. संस्कृतियों OGD मध्यम और वापस करने के लिए नियमित रूप से मध्यम से बदल रहे हैं जब डालने के किनारों पर बने हुए हैं कि सभी तरल पदार्थ से दूर aspirated हैं सुनिश्चित करें.
- हाइपोक्सिया या OGD के बाद, ऑक्सीजन सीरम मुक्त माध्यम से OGD मध्यम जगह और संस्कृतियों 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर नियमित इनक्यूबेटर में सीरम मुक्त माध्यम में 3, 24 या 48 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है. कोशिका मृत्यु के निर्धारण के लिए निर्धारण करने के लिए फिर से पहले गड़बड़ी जोड़ें.
Entorhino-हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस संस्कृति के 3 औषधीय उपचार
- संस्कृतियोंऔषधीय उपचार के लिए जोखिम से पहले ऊष्मायन मध्यम में 5 दिन (DIV5) के लिए ई EHOSCs. औषधीय उपचार OGD के दौरान या तुरंत स्लाइसें सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं जब OGD के बाद या तो शुरू करो.
- OGD से सुरक्षा के लिए उपचार.
- 30 मिनट के लिए OGD प्रेरण के तुरंत बाद 100 माइक्रोन 6 cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-Dione (CNQX) या (15 मिनट के लिए) OGD प्रेरण दौरान संस्कृति के माध्यम से 1 माइक्रोन tetrodotoxin (TTX) या जोड़ें. फिर, निर्धारण से पहले 48 घंटे के लिए normoxic सीरम मुक्त माध्यम में सेते हैं.
- Excitotoxic मौत के शामिल होने के लिए उपचार.
- ऊष्मायन मध्यम स्विच संस्कृतियों में 5 दिनों के बाद 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन (राज्यसभा) -α अमीनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) युक्त मुक्त मध्यम सीरम.
- आकांक्षा (डालता है पर किसी भी अवशिष्ट मध्यम दूर करने के लिए ध्यान रखना) द्वारा AMPA युक्त संस्कृति के माध्यम निकालें, तो सामान्य सीरम मुक्त मध्यम और साथ ताजा प्लेटों को स्लाइस हस्तांतरणनिर्धारण तक 48 घंटे के लिए उन्हें रखना.
4 के फिक्सेशन और immunostaining Entorhino-हिप्पोकैम्पस Organotypic स्लाइस संस्कृति
- Propidium आयोडाइड (पीआई) धुंधला.
- 2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में रहने वाले स्लाइस की संस्कृति के माध्यम से 30 मिनट के लिए पीआई जोड़ें. प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ लाइव संस्कृतियों देखें और आगे के उपचार के लिए स्लाइस का चयन करें. Immunohistochemistry साथ संयोजन में गड़बड़ी धुंधला के लिए, पूर्व संस्कृतियों का निर्धारण करने के लिए गड़बड़ी समाधान 30 मिनट में जोड़ें.
- स्लाइस का निर्धारण.
- 6 अच्छी तरह से थाली से संस्कृति के माध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 3 मिलीलीटर जोड़ें. फिर एक फ्रिज में 6 अच्छी तरह से थाली प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन तय.
- पीएफए समाधान अगले दिन निकालें और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ स्लाइस 3-4 बार धो लो.
- सेल संस्कृति मैं से स्लाइस का हटायाnsert और मुक्त अस्थायी वर्गों के immunohistochemistry के लिए अवरुद्ध प्रक्रिया.
- ध्यान से अलग और आकार 0 या छोटे के एक कला पेंट ब्रश का उपयोग संस्कृति आवेषण से स्लाइस को हटा दें. (3% सामान्य बकरी सीरम (NGS) और 2% ट्राइटन-X100 के साथ पीबीएस) बफर अवरुद्ध से भरा एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्रत्येक व्यक्ति टुकड़ा स्थानांतरण. एक कक्षीय प्रकार के बरतन से लगातार आंदोलन के तहत आरटी पर 2 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर में स्लाइस रखें.
- टुकड़ा संस्कृतियों के immunostaining
- लेबलिंग के लिए रक्त वाहिकाओं 1 के कमजोर पड़ने पर पॉलीक्लोनल विरोधी laminin उपयोग: 200 पीबीएस 1% NGS और 0.5% ट्राइटन-X100 युक्त में.
- पीबीएस 1% NGS और 0.5% ट्राइटन-X100 युक्त में 500: लेबलिंग न्यूरॉन्स 1 के कमजोर पड़ने पर प्रोटीन 2 (MAP2) जुड़े विरोधी microtubule का उपयोग करें.
- लगातार आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइस सेते हैं. ऊष्मायन अवधि के बाद, 3-4 बार के लिए 0.5% ट्राइटन-X100 के साथ पीबीएस में उन्हें धोने. माध्यमिक एंटीबॉडी 1 पतला: 500 पीबीएस 1% NGS और 0.5% ट्राइटन-X100 युक्त में. एलेक्सा फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अंधेरे में आरटी पर 2 घंटे के लिए स्लाइस सेते हैं. एलेक्सा 350 या 488 संयुग्मित उपयुक्त बकरी विरोधी खरगोश या बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और Tris-buffered खारा (टीबीएस) के साथ स्लाइस तीन बार धोने; गिलास स्लाइड पर उन्हें माउंट और Mowiol साथ स्लाइड coverslip.
- दाग स्लाइस की माइक्रोस्कोपी
- Epifluorescence उपकरण के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप पर या एक confocal खुर्दबीन के साथ या तो दाग स्लाइस देखें. एक उपयुक्त कैमरा के साथ छवियों को ले लो. कुछ छवियों के लिए, एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि पर अंधेरे में सना हुआ वाहिकाओं उपज के क्रम में प्रतिदीप्ति विपरीत (आंकड़े 5 और 6) पलटना.
संस्कृति में क्षेत्रीय पोत घनत्व के 5 निर्धारण
- Vesse योंसंदर्भ 8 में बताए अनुसार पोत क्रॉसिंग पर आधारित एल घनत्व.
- इन मापों के लिए laminin के लिए दाग स्लाइस का प्रयोग करें. प्रत्येक ग्रिड वर्ग प्रति 100 x 100 माइक्रोन, 0.25 मिमी 2 के कुल क्षेत्र के बराबर है जहां एक 6 एक्स 6 ग्रिड, साथ 10x बढ़ाई के दर्ज की छवियों मिलाना.
- सीए 1, सीए 3, महानिदेशक, और ईसी क्षेत्र में ओवरले तीन ऐसे ग्रिड (चित्रा 2). ग्रिड की लाइनों को पार करने जहाजों गणना.
- एक अच्छा सांख्यिकीय प्रासंगिकता के साथ परिणाम प्राप्त करने के लिए, माउस पिल्ला प्रति 3 स्लाइस के साथ 3 माउस पिल्ले से, कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों में प्रत्येक में डेटा माप बनाने.
- प्रत्येक क्षेत्र के लिए ग्रिड से पोत क्रॉसिंग के औसत मूल्य निर्धारण और उचित आँकड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (के रूप में महत्वपूर्ण परिभाषित पी <0.05) पद अस्थायी परीक्षण के रूप में Bonferroni सुधार के साथ एनोवा द्वारा एक सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं.
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Representative Results
ऑक्सीजन ग्लूकोज अभाव और हाइपोक्सिया हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र में विशेष रूप से neuronal मौत और रक्त वाहिनियों की कमी को प्रेरित.
पहले 7 वर्णित के रूप में इसी तरह के हिप्पोकैम्पस (चित्रा 3) के सीए 1 क्षेत्र में विशेष रूप से propidium आयोडाइड धुंधला द्वारा देखा के रूप में OGD या ऑक्सीजन के अभाव अकेले 15 मिनट के लिए कोशिका मृत्यु का एक मजबूत प्रेरण प्रेरित किया. मार्करों रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क कल्पना करने के साथ, यह रक्त वाहिका घनत्व और संगठन सीए 1 क्षेत्र के अपवाद के साथ संस्कृति के अधिकांश भागों में OGD चुनौती के बाद नियंत्रण के समान दिखाई दिया कि पाया गया था. रक्त वाहिका घनत्व वहाँ कम था और रक्त वाहिका नेटवर्क आंशिक रूप से (चित्रा 3, ई और एफ) ठप हो गई थी. ये परिवर्तन केवल propidium आयोडाइड धुंधला बढ़ा दिया गया था, जहां क्षेत्र में देखा गया था.
संवहनी परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम Neur की कि समानताएंonal अध: पतन.
हम 3 घंटा, 24 घंटा और ऑक्सीजन के अभाव (hypoxia) के बाद 48 घंटे में समय बिंदुओं का उपयोग सीए 1 में दोनों neuronal अध: पतन और रक्त वाहिनियों की हानि के समय के पाठ्यक्रम का अध्ययन किया है. 3 घंटा पोस्ट हाइपोक्सिया, कोई propidium आयोडाइड धुंधला दिखाई नहीं थी और इस समय कोई परिवर्तन दिखाई दे रहे थे अभी तक यह दर्शाता है कि रक्त वाहिनियों की वास्तुकला में वर्तमान में कोई बदलाव नहीं (चित्रा 4, ए और बी) थे. 24 घंटे बाद हाइपोक्सिया में सीए 1 में कोशिका मृत्यु की प्रगति का संकेत propidium आयोडाइड धुंधला की उपस्थिति थी. इस समय बिंदु पर रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क पहले से ही परेशान थी और रक्त वाहिकाओं CA1 क्षेत्र (चित्रा 4, सी और डी) में खो गए थे. दोनों propidium आयोडाइड धुंधला और रक्त वाहिनियों की हानि (चित्रा 4, ई और एफ) 48 घंटा पोस्ट हाइपोक्सिया में और अधिक स्पष्ट हो गया.
Neuronal मौत दोनों औररक्त वाहिका नुकसान OGD या हाइपोक्सिया के बाद उत्तेजना अवरुद्ध द्वारा रोका जाता है.
हम अतिरिक्त ग्लूटामेट जारी रोका कि औषधीय उपचार के साथ OGD संयुक्त, यह OGD प्रेरित कोशिका मृत्यु से न्यूरॉन्स को बचाने के लिए संभव था. Neuronal मौत (चित्रा 5, डी और एफ) से या उपचार CNQX साथ (AMPA प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स को रोकता है) बचाया CA1 पिरामिड कोशिकाओं (संभावित कार्रवाई अभिवाही टर्मिनलों का मुंह बंद करने में जिसके परिणामस्वरूप पीढ़ी को रोकता है) TTX साथ उपचार. इन परिणामों OGD के बाद neuronal मौत ग्लूटामेट की excitotoxic कार्रवाई द्वारा मध्यस्थता है कि संकेत मिलता है. इन उपचार के बाद, न केवल neuronal सेल मौत को रोका गया था, लेकिन यह भी पोत अखंडता संरक्षित किया गया था और सीए 1 में रक्त वाहिकाओं की हानि (चित्रा 5, सी और ई) को रोका गया था.
AMPA उपचार हिप्पोकैम्पस बू में व्यापक excitotoxic neuronal मौत लातीटी पोत नुकसान सीए 1 के लिए प्रतिबंधित है.
इस अध्ययन में इस्तेमाल के रूप में OGD सीए 1 में विशेष रूप से neuronal मौत लाती है. इसके विपरीत, 30 मिनट के लिए 100 माइक्रोन AMPA साथ उपचार नहीं बल्कि दांतेदार गाइरस (चित्रा 6C) में हिप्पोकैम्पस (सीए 1 और सीए 3) और subiculum की पूरी कोर्नु एम्मोनिस में एक व्यापक neuronal नुकसान प्रेरित किया. दिलचस्प है, रक्त वाहिका नुकसान इस क्षेत्र (चित्रा 6D) में कोई रक्त वाहिका नुकसान था सीए 3 में एक समान neuronal नुकसान के बावजूद, सीए 1 क्षेत्र तक ही सीमित था. दांतेदार गाइरस में न तो neuronal मौत और न ही रक्त वाहिका नुकसान था. पोत घनत्व की मात्रा का ठहराव रक्त वाहिकाओं नहीं बल्कि संस्कृति चित्रा 6E के अन्य क्षेत्रों में, सीए 1 में खो जाते हैं कि पुष्टि करता है.
OGD जोखिम और reperfusio की संख्या 1 अनुसूचीएन. विट्रो संस्कृतियों में 5 दिन OGD, हाइपोक्सिया या AMPA उपचार के अधीन हैं के बाद. संस्कृति 3 घंटा, 24 घंटा और 48 घंटे के अस्तित्व के समय के बाद तय कर रहे हैं.
Entorhino-hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों के विभिन्न क्षेत्रों में रक्त वाहिका घनत्व चित्रा 2 मात्रा. (यहां वर्गों के रूप में दिखाया गया है) तीन 6 एक्स 6 ग्रिड सीए 1, सीए 3, महानिदेशक, और ईसी क्षेत्र में मढ़ा जाता है. ग्रिड की आंतरिक लाइनों को पार रक्त वाहिकाओं प्रत्येक वर्ग के लिए गिना रहे थे.
चित्रा 3 Hypoxia उपचार neuronal मौत और सीए 1 में रक्त वाहिका नुकसान लाती है. (ए,सी, ई) नियंत्रण संस्कृतियों, (बी, डी, एफ) संस्कृतियों normoxia की 48 घंटा द्वारा पीछा हाइपोक्सिया उपचार के अधीन. हरे रंग में कम बढ़ाई laminin immunostaining लाल (सी डी) में उच्च बढ़ाई (ए, बी), पीआई धुंधला, (ई) में laminin और पीआई धुंधला के लिए छवियों का विलय कर दिया और (च). और (ए, बी बी) में स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन (सी, डी, ई, एफ के लिए एफ). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
संवहनी परिवर्तन और neuronal की 4 चित्र टाइम कोर्सऑक्सीजन के अभाव (hypoxia). (ए, सी, ई) में दिखाया गया है लाल रंग में गड़बड़ी धुंधला के बाद अध: पतन, (बी, डी, एफ) में दिखाया गया पीआई धुंधला और laminin (हरा) के लिए छवियों को विलय कर दिया. 3 घंटा पोस्ट हाइपोक्सिया उपचार में, वहाँ दिखाई नहीं पीआई धुंधला है और कोई नाड़ी परिवर्तन (ए, बी) स्पष्ट कर रहे हैं. 24 घंटा गड़बड़ी धुंधला उभरे और रक्त वाहिनियों को नुकसान भी (सी, डी) स्पष्ट है के बाद. पीआई धुंधला और रक्त वाहिका नुकसान दोनों 48 घंटा (ई, एफ) के बाद और अधिक स्पष्ट हो गया है. (एफ) में स्केल बार 100 माइक्रोन =. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5.; Neuronal मौत और रक्त वाहिका नुकसान neuronal उत्तेजना की ब्लॉकर्स द्वारा रोका जाता है पीआई धुंधला (बी, डी, एफ) और रक्त वाहिनियों के साथ देखा के रूप में TTX (सी, डी) या CNQX (ई, एफ) neuronal नुकसान दोनों को रोका या तो आवेदन. नुकसान laminin धुंधला (ए, सी, ई) द्वारा पता चला. OGD अकेले सीए 1 में neuronal घटाने और रक्त वाहिकाओं के नुकसान (ए, बी) दोनों लाती है. (एफ) में स्केल बार 100 माइक्रोन =. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 6 neuronal मौत और रक्त वाहिका नुकसान AMPA उपचार के बाद. व्यापक प्रेरित उपचार 100 माइक्रोन AMPA साथ 30 मिनट के लिएन्यूरोनल हिप्पोकैम्पस (सी) के अधिकांश क्षेत्रों में नुकसान, लेकिन रक्त वाहिकाओं की हानि क्षेत्र सीए 1 (डी) के लिए प्रतिबंधित रहे. (डी) में स्केल बार 100 माइक्रोन =. रक्त वाहिकाओं की मात्रा का ठहराव CA1 क्षेत्र (ई) में चयनात्मक नुकसान की पुष्टि करता है. कॉलम पोत क्रॉसिंग, SEM दिखा त्रुटि सलाखों के मतलब संख्या दिखाते हैं. महत्वपूर्ण मतभेद पी <0.01 के लिए ** के साथ संकेत कर रहे हैं. परिणाम तीन विश्लेषण किया संस्कृतियों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किए गए प्रत्येक (एन = 9) हर क्षेत्र के लिए. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| समय | लड़ाई |
| DIV 4 | OGD या हाइपोक्सिया मध्यम तैयार |
| DIV 4 | OGD छिड़कना यातो 1 एक हाइपोक्सिया कक्ष में घंटा और के लिए 2 एन के साथ हाइपोक्सिया मध्यम सील और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में हे / एन रखना |
| DIV 4 | , ऊष्मायन मध्यम से Neurobasal सीरम मुक्त मध्यम + ग्लूकोज को संस्कृतियों स्विच उन्हें हे / एन या 1 दिन आराम करने की अनुमति |
| DIV 5 | 30 मिनट के लिए 2 एन के साथ फिर से OGD मध्यम छिड़कना |
| DIV 5 | के 2 μl जोड़ें एक 1 मिलीग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) 30 मिनट के लिए स्लाइस (2 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) अच्छी तरह से प्रति समाधान और पीआई सकारात्मक कोशिकाओं की कम संख्या से संकेत के रूप में प्रयोग के लिए ही स्वस्थ स्लाइसें चयन |
| DIV 5 | नियमित रूप से मध्यम चूसना बंद और वेल्स को OGD मध्यम जोड़ें. संस्कृतियों वापस OGD / हाइपोक्सिया मध्यम करने के लिए नियमित रूप से मध्यम से बंद कर रहे हैं और जब डालने के किनारों पर बने हुए हैं कि सभी तरल पदार्थ से दूर aspirated हैं सुनिश्चित करें. हाइपोक्सिया चैम्बर के लिए प्लेट हस्तांतरण |
| DIV 5 | हाइपोक्सिया कक्ष में 15 मिनट के लिए 2 एन के साथ छिड़कना |
| DIV 5 | कक्ष से थाली निकालें. वापस Neurobasal मध्यम के लिए स्विच और 5% सीओ 2 के साथ humidified इनक्यूबेटर में वापस जगह |
| DIV 5 | गड़बड़ी जोड़ें और 3 घंटा अंतराल के लिए OGD / हाइपोक्सिया के बाद 3 घंटा तय |
| DIV 6 | गड़बड़ी जोड़ें और 24 घंटे के अंतराल के लिए OGD / हाइपोक्सिया के बाद 24 घंटा तय |
| DIV 7 | गड़बड़ी जोड़ें और 48 घंटे के अंतराल के लिए OGD / हाइपोक्सिया के बाद 48 घंटा तय |
OGD / हाइपोक्सिया उपचार के लिए कदम की तालिका 1 विस्तृत समय अनुक्रम.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत तरीकों के साथ, हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों चोट के बाद तंत्रिका ऊतक में प्लास्टिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों संवहनी परिवर्तन का एक साथ अध्ययन का नया पहलू 7, ischemia 6 के बाद neuronal प्रतिक्रियाओं का अध्ययन के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है जबकि काफी इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों को बढ़ाता है. OGD या अकेले हाइपोक्सिया के शामिल होने organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में नहीं बल्कि साधारण माध्यम से आवेदन किया है और तंत्रिका ऊतक में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नुकसान होता जा सकता है. इसके अलावा, टुकड़ा संस्कृति दृष्टिकोण केवल इस्कीमिक चुनौती के परिणामों का अध्ययन नहीं की अनुमति देता है, लेकिन यह भी neuroprotection के उद्देश्य संभावित चिकित्सीय उपायों के परीक्षण के लिए अनुमति देता है. टुकड़ा संस्कृतियों इसलिए इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के अध्ययन के लिए एक आकर्षक और महत्वपूर्ण उपकरण है.
यहाँ प्रस्तुत विधि हा सभी प्रयोगशालाओं के लिए लागू करने के लिए आसान हैसीएनएस टुकड़ा संस्कृतियों के साथ कुछ अनुभव ving. OGD या हाइपोक्सिया लागू प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के क्रम में एन 2 के साथ संस्कृति के माध्यम से एक सावधान संतुलन की आवश्यकता है. यह भी पूर्व OGD के आवेदन करने के लिए गड़बड़ी पॉजिटिव कोशिकाओं की एक कम संख्या के साथ ही उपयोग टुकड़ा संस्कृतियों के लिए महत्वपूर्ण है. हाइपोक्सिया की शर्तों (यानी, लागू कर रहे हैं जो हाइपोक्सिया या OGD के लिए समय) विविध और इस्तेमाल किया टुकड़ा संस्कृति के प्रकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता.
Ischemia के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया गया है, जबकि बड़े पैमाने पर hypoxic इस्कीमिक मस्तिष्क की चोट के बाद संवहनी परिवर्तन के बारे में उपलब्ध कम जानकारी ही नहीं है. एक सप्ताह 8 तक, 9 हिप्पोकैम्पस organotypic टुकड़ा संस्कृतियों 10 की सेटिंग में हाइपोक्सिया चुनौती के बाद vasculature की परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अवसर खोल दिया है के लिए है कि रक्त वाहिकाओं और रक्त मस्तिष्क बाधा का भी मार्करों ढूँढने organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में रखा जाता है. बेशक यह करने की जरूरत हैटुकड़ा संस्कृतियों में रखा जाता है कि जहाजों perfused नहीं कर रहे हैं एहसास हो. इसके अलावा, हम पूर्व मौजूदा रक्त वाहिकाओं के बजाय उपन्यास रक्त वाहिकाओं के व्यापक गठन के नुकसान में मतभेद मनाया है. इस मॉडल प्रणाली शायद इसलिए, एक इस्कीमिक अपमान के बाद नए पोत गठन के अध्ययन के लिए इष्टतम नहीं है.
संभावना न्यूरॉन्स के बीच जटिल बातचीत की आगे व्याख्या के लिए organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए और vasculature अध्ययन का एक नया क्षेत्र खुल जाता है और बाद विशेष मस्तिष्क ischemia में, की एक बेहतर समझ प्राप्त करने और neurovascular विकारों के लिए नए उपचार के विकल्प के विकास में मदद करने का वादा किया स्ट्रोक.
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Disclosures
पशु प्रयोगों 24 नवंबर 1986 (86/609 / ईईसी) के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के अनुसार किए गए और स्विस अधिकारियों से समीक्षा की और अनुमति दी गई. लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के बेसल विश्वविद्यालय, बायोमेडिसिन विभाग, और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (31003A_141007) द्वारा समर्थित किया गया. मार्कस Saxer तकनीकी सहायता प्रदान की है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | stabilized form of L-glutamine |
| Millicell cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| Basal medium Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Anaerobic strips | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R&D systems | 0169-10 | |
| CNQX | R&D systems | 0190/10 | |
| TTX | R&D systems | 1078/1 | |
| polyclonal anti-laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | Molecular Probes | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | Molecular Probes | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | Molecular Probes | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | Molecular Probes | A11008 | |
| Statistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism | |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
References
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