Abstract
Понимание механизмов, с помощью которых молекулярные моторы координации их деятельности для транспортировки везикулярные грузов в нейронах требуется количественный анализ двигатель / грузовых ассоциаций на одном уровне пузырьков. Цель этого протокола заключается в использовании количественных флуоресцентной микроскопии соотнести ("карта") позицию и направленность движения живого груза к составу и относительных количеств двигателей, связанных с тем же грузом. "Отображение Cargo" состоит из живых изображений флуоресцентно меченных грузов, движущихся в аксонов культивируемых на микрофлюидных устройств с последующей химической фиксации во время записи живого движения, и последующее иммунофлюоресценции (ИФ) окрашивания тех же аксонов регионах с антителами против двигателей. Колокализации между грузов и связанных с ними двигателей оценивается путем присвоения позиции субпиксельную координаты моторных и грузовых каналов, по монтажу функций Гаусса к дифракционной-лираничена функции рассеяния точки, представляющие отдельные люминесцентные точечные источники. Фиксированные грузовые и моторные образы впоследствии накладывается на участках движения грузового, чтобы "карта" их на гусеничных траекторий. Сила этого протокола является сочетание живой и IF данные для записи как транспорт везикулярного грузов в живых клетках и определять двигатели, связанные с этими же самыми пузырьков. Эта методика позволяет преодолеть прежние проблемы, которые используют биохимические методы для определения средней состав двигателя очищенных гетерогенных популяций массовых пузырьков, как эти методы не выявляют композиции на отдельных движущихся грузов. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа других транспортных и / или оборот путей в других типах клеток коррелирует движение отдельных внутриклеточных структур с их белкового состава. Ограничения этого протокола являются относительно низкая производительность за счет низкой эффективности трансфекции культивируемыхпервичные нейроны и ограниченное поле зрения, доступного для изображений с высоким разрешением. Будущие приложения могут включать в себя методы, чтобы увеличить количество нейронов, экспрессирующих флуоресцентно меченных грузов.
Introduction
Внутриклеточный транспорт имеет решающее значение во всех типах клеток для доставки белков, мембран, органелл и сигнальных молекул в различных сотовых областях 1. Нейроны являются узкоспециализированными клетки с длинными, поляризованных проекций, что критически зависят от внутриклеточного транспорта эфирных грузов для их дальней доставки различных аксонов микродоменов. Этот транспорт опосредуется кинезинов и динеинами - два больших семейств белков молекулярных двигателей - которые связываются с грузами и отслеживать вдоль поляризованных микротрубочек в антероградная и ретроградных направлений, соответственно. В то время как ретроградная движение в основном при посредничестве динеина, движение в направлении антероградной облегчается большой, функционально разнообразной семье кинезиновых двигателей. Следовательно, антероградная транспорт аксонов грузов может быть опосредовано различными членами семьи кинезина суперсемейство 1-5. Хотя некоторые грузы двигаться настойчиво в любом направлении, мОст грузы двигаться в двух направлениях и часто вспять на пути к их конечный пункт назначения 1,5-13. Кроме того, было показано, что двигатели противоположные направленности ассоциировать одновременно грузов, поднимая вопрос о том, как регулируется движение грузов координируется разнополярных двигателей 5-7. Вместе транспорт аксонов грузов является согласованные процесс, который регулируется составе двигателей и их специфических биохимических деятельности, которые в свою очередь зависят от различных адаптеров и нормативных связывающих партнеров 14.
Чтобы точно описать механизм аксонов транспорта для конкретного груза и раскрыть основную регуляцию этого транспорта, это имеет первостепенное значение для определения состава моторных белков и их нормативных связывающих партнеров, связанных с отдельными грузов во время их живого транспорта. Другие методы, например, биохимических подходов, дают оценки средней словцоили композиции на очищенных гетерогенных популяций везикул, но эти оценки не раскрывают тип или количество двигателей, связанных с одиночными движущихся пузырьков. Кроме того, восстановление везикул транспорта вдоль микротрубочек смонтированных в пробирке включен измерения количества одного типа двигателя на одном уровне пузырьков 15. Тем не менее, эти эксперименты не непосредственно коррелируют количество двигателей с транспортных характеристик этих пузырьков, и измеряется транспорт в отсутствие клеточных регулирующих факторов.
Протокол представлен здесь, который определяет состав двигателя (тип и относительное количество двигателей) отдельных движущихся пузырьков из иммунофлюоресценции данных (IF) измерительные эндогенно выраженной моторные белки, и коррелирует эти параметры в прямом перевозки тех же пузырьков в нейронах 16. Этот метод предполагает точное отображение ПЧ к проживанию данных движения грузов. Это достигается путем быть ребёнкомг нейроны гиппокампа мыши в микрофлюидных устройств соответствии с установленными протоколами 17-19. Эти устройства позволяют выявлять и корреляции («отображение») аксонов и одиночных движущихся грузов в фиксированных и живых форм световой микроскопии (рис 1). Искусственный нейроны трансфецировали флуоресцентно меченых грузовых белков, транспорт изображается с высоким пространственным и временным разрешением, чтобы получить подробную информацию движение, что строится в kymographs. В ходе обработки изображений, нейроны фиксировали параформальдегидом, а затем окрашивали антителами против эндогенных белков двигателя. Фиксированные грузовые и моторные изображения накладываются на живые kymographs движения на "карту" (локализуются) их на живого груза траекторий движения 16. Чтобы соотнести живой движение грузов с Ассоциацией моторных белков, колокализация анализируется с помощью настраиваемого сделал MATLAB пакет программного обеспечения под названием "Мотор колокализации "16,20. Флуоресцентную метку грузы и двигатели генерируют дифракционной особенности точечные, которые могут частично перекрываться. Чтобы решить эту позицию перекрытия puncta, программное обеспечение сначала автоматически вписывается гауссовых функций для каждой функции рассеяния точки, представляющие отдельные флуоресцентный puncta, чтобы определить их точное положение XY субпиксельную координаты и интенсивности амплитуд 21-23. Позиции двигателей и грузов являются затем сравниваются друг с другом, чтобы определить, колокализацию 16,20. Таким образом, этот метод более точно назначает колокализацию между флуоресцентным puncta по сравнению с другими методами 24.
Сила этого метода является возможность оценить совместную локализацию двигателей с индивидуальной груза в фиксированных клетках, для которых живые траектории движения (например, направление, в котором они двигались в момент фиксации) были RECorded. С помощью этого метода, кинезины и динеины были найдены, чтобы связать одновременно, чтобы пузырьки, которые несут нормальный белок прион (PrP C -cellular), а обогащенный neuronally груз, который перемещается в двух направлениях или остается неподвижным в аксонов 16. Этот анализ позволил сформулировать рабочую модель для регуляции PrP C движения пузырьков, в которых антероградная (кинезин) и ретроградные (динеина) двигатели координации их деятельности в целях продвижения пузырьки в любом направлении или оставаться неподвижной, а связан с грузом , Другой Сила этого метода является его потенциал широкую применимость для характеристики колокализации / объединение многих флуоресцентно меченных грузов, которые перемещаются в практически любой тип клеток, с любым другим белком (ами), представляющие интерес. Таким образом, в прямом эфире / фиксированной корреляция может потенциально обеспечить для обнаружения переходных белок-грузовых взаимодействий, как многие отдельные флуоресцентно меченных движущихся частиц могут быть проанализированы в течение желаемого рeriod времени. Учитывая широкую применимость и тип вопросов, что этот метод может рассматриваться, этот протокол будет представлять интерес для широкой аудитории клеточных биологов, включая тех, кто учится с торговлей людьми и транспортом в нейронах или в другие типы клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились следующие утвержденные протоколы и в соответствии с ведомственным руководящим принципам для гуманной помощи исследовательских животных. Новорожденных мышей умерщвляли путем обезглавливания.
1. Подготовка микрожидкостных устройств для сотовых культуры
- Подготовка полидиметилсилоксан (PDMS) микрофлюидных устройств для роста нейронов гиппокампа, как описано Харрисом и его коллегами 17-19. Ниже приведены некоторые модификации, которые были адаптированы к протоколу отображения грузов.
Примечание: микрожидкостных устройства также являются коммерчески доступными (Список материалов), таким образом, доступ к изготовлению объекта нет необходимости. - Подготовьте No. 1 ½ покровные стекла (24 х 40 мм) путем промывки их три раза ацетоном, после чего трех промывок 100% -ным этанолом и трех промывок воды. Хранить покровные в воде при 4 ° С до использования. Эти процедуры помогут гарантировать, что покровные чистые от мусора, который может помешать обшивки челLs, загрязнение, и выживание.
ПРИМЕЧАНИЕ: ацетона и этанола являются легковоспламеняющимися и опасными в случае контакта с кожей (раздражитель), попадании в глаза (раздражитель), при приеме внутрь, ингаляции. Уничтожать в соответствии с предписаниями компетентных служб. - Когда все будет готово для использования, положите одну покровного стекла в 60 мм для культивирования клеток блюдо на микрожидкостных устройств, и пусть он сухой воздух раскрыли в течение 45 мин внутри биобезопасности кабинета, чтобы избежать загрязнения.
- После устройства вырезаются из мастеров и удары были сокращены для создания водохранилищ (рис 1а, б), разместить их с микроканалов стороной вверх внутри биобезопасности кабинета, оснащенного УФ-лампы в течение 45 мин для стерилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход устройства под УФ обработки дольше 2 часов может повлиять на целостность PDMS. - Соберите устройств путем размещения одного устройства на каждый покровного стекла внутри 60 мм пластик для культивирования клеток блюдо так, чтобы микроканалов лицом вниз. Нежный давление верхней Oе устройства (не касаясь микроканалов), чтобы обеспечить место непостоянного печать устройства для покровного стекла. Обложка каждого 60 мм для культивирования клеток блюдо крышкой.
- Использование микропипетку, гидрат устройства, добавив культуры клеток класса воду в двух верхних микрофлюидных водоемов (1 и 2 на рис 1А), что позволяет воде проходить через. Удаление воды с помощью микропипетки и добавить 1 мг / мл поли-L-лизин в микрожидкостных резервуара 1 (200 мкл) и 2 (100 мкл). Дифференциальный объем позволит поли-L-лизин, чтобы протекать через микроканалы (фиг.1А, Б).
- Чтобы убедиться, что устройства внутри 60 мм чашки для культивирования клеток не опрокинуться внутри 37 ° С инкубатор, разместить три 60 мм культуры клеток блюда, содержащие устройства в 150 мм пластик клеток блюдо культуры и покрыть блюдо крышкой. Инкубируйте O / N в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. Как правило, более 90% из каналов могут использоваться в устройстве и сделатьне содержит каких-либо воздушных пузырьков или физическое блокирование.
- На следующий день, заменить поли-L-лизин водой и оставить устройство в инкубаторе в течение по крайней мере 1 часа. Повторите это стиральная три раза. Удалить воду и добавить Neurobasal-среде для роста (содержащий 2% B-27 дополнения и 500 мкм Glutamax) для каждого устройства. Оставьте O / N в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- На следующий день, пластины клеток гиппокампа, как описано ниже.
2. Покрытие из мыши гиппокампа первичных нейронах в микрожидкостных устройств
ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка культивируемых нейронов гиппокампа от новорожденных крыс была ранее опубликована в Юпитер 25. Ниже приведены некоторые модификации, которые были адаптированы к пластину мыши нейронов гиппокампа в микрофлюидных устройств, и что были оптимальными для трансфекций.
- Перед мозга мыши диссекции, предварительно тепло Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки(FBS; без антибиотиков), смесь (125 мг DL-цистеина, 125 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 3,125 г D-глюкозы в 500 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS); фильтр стерилизуют через фильтр 0,22 мкм) и Дезоксирибонуклеаза I раствор (ДНКазы I: 50 мг ДНКазы I и 0,5 мл 4 раствора 1,2 М MgSO в 100 мл Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) фильтра стерилизовать через фильтр 0,22 мкм) в водяной бане при 37 °.
- Предварительно теплой Neurobasal-ростовую среду внутри 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, чтобы уравновесить рН.
- Проанализируйте гиппокампа от 1-3-дневных новорожденных мышей в соответствии с установленными протоколами 26. Хранить гиппокампа в 15 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл рассечение буфера (HBSS, содержащем 10 мМ HEPES рН 7,4, 50 мМ глюкозы, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) на льду. Положите до 4 гиппокампе в 15 мл коническую трубку.
- Выполните оставшиеся протокол находится под стерильном состоянииы в шкафу биологической безопасности.
- Развести 45 единиц папаина в 5 мл смеси А, вихря, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С до тех пор, папаин порошок не растворится. Добавить 1 мл раствора ДНКазы I. Фильтр микс через блок шприц фильтр 0,22 мкм.
- Тщательно аспирата ССРХ "от 15 мл коническую трубку, содержащую гиппокампе. Добавить 10 мл холодного (4 ° С) HBSS, в гиппокампе и пусть они оседают на дне пробирки. Тщательно аспирата HBSS от 15 мл коническую трубку.
- Добавить 1 мл папаин / ДНКазы я смешать с до 4 гиппокампе и выдержать в течение 20-30 мин при 37 ° С. Наклоните коническую трубку каждые 5 минут, чтобы искупаться гиппокампа с микса. В качестве альтернативы разместить гиппокампа в 37 ° С водяной бане шейкере при осторожном встряхивании (~ 100 оборотов в минуту).
- Аспирируйте папаин / ДНКазы I смешивать и гиппокамп мыть дважды подогретого DMEM (37 ° C), содержащей 10% FBS.
- После второй промывки, добавить 2 мл подогретого DMEM, содержащей 10% FBS, чтобы гиппокампе и вручную растирают гиппокампа с помощью пипеткивверх и вниз ~ 10-12 раз с помощью пипетки на 1 мл, чтобы отделить нейроны.
- Пусть растирают оседать в течение ~ 1 мин, как это позволит не-диссоциированных нейронов оседают на дне конической трубе. Передача супернатант, содержащий диссоциированных нейронов к новому 15 мл коническую трубку, избегая передачу большего ткани, который лег в нижней части трубки.
- Спин клеток при 1000 х г в течение 2 мин и осторожно удалить супернатант, не нарушая клеточный осадок. Ресуспендируют клеток в 80 мкл Neurobasal-A ростовой среде с помощью пипетки осторожно.
- Удаление среды из резервуара микрожидкостных 1 и 1 '. Применить 20 мкл клеток (~ 275 000), чтобы микрожидкостных резервуара 1, и позволить им течь через. Поместите устройство в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 20 мин.
- Смотрите под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки присоединились к покровным стеклом. Добавить Neurobasal-среде для роста, чтобы завершить все резервуары. Возврат устройство с клетками в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO
- Проверьте устройства каждый ~ 2-3 дня и топ от водохранилищ Neurobasal-A, содержащей 2% B-27 дополнения (без Glutamax), чтобы избежать испарения. Нейроны начинают расширять свои аксоны через микроканалов ~ 2-3 дня после посева. Тема нейроны трансфекцией обычно через 7-10 дней после посева.
3. Трансфекцию нейронов гиппокампа Выросшая в микрожидкостных устройств
- На устройство, приготовить смесь из 1,2 мкл Lipofectamine 2000 в 30 мкл Neurobasal-А, и сочетание 0,5 мкг флуоресцентного грузов слияния плазмиды в 30 мкл Neurobasal-A и инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Добавить Lipofectamine микс микс ДНК и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавить 60 мкл Neurobasal-A, содержащего 4% B-27 дополнение к ДНК / Липофектамин смешивать и смешивать слегка ударяя по пробирке.
- Извлеките носитель из микрожидкостных резервуара 2 и 2 'и тщательно заполнить скважин с Neurobasal-А, содержащих 2% B-27 добавку, не проливая в среднесрочной междунаро других отсеков.
- Снимите носитель из микрожидкостных резервуара 1 и 1 '. Добавить 120 мкл ДНК / Lipofectamine смешать с микрожидкостных резервуара 1 и струись. Возврат устройства до 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 3-4 ч.
- Извлеките носитель из микрожидкостных резервуара 1 и 1 'и заменить Neurobasal-A, содержащей 2% B-27 добавки в течение 24 ч (или до готовности к изображению). Как правило, 5-7 аксоны, которые растут через микроканалы трансфецируют в этих условиях, которые представляют примерно 1-3% эффективность трансфекции в соответствии с эффективностью, опубликованных на гиппокампа культивируемых клеток 26.
4. «Грузовой Картография" Анализы
- Живая съемка движения грузов
- Выполните визуализацию на перевернутой эпифлуоресцентной световом микроскопе, снабженном 37 ° C инкубатор и контрольной камере СО 2.
- Установите покровное с нейронов гиппокампа, выращенных в MICRofluidic устройство на столике микроскопа. Чтобы избежать гибели нейронов, работать оперативно, чтобы сохранить образцы при микроскопом не более чем на 1 час.
- Использование высокого разрешения цель (100X), найти аксоны трансфекции клеток, которые проходят через каналы микрофлюидных камер и записывать числа каналов, в которых был найден трансфектированную аксона. Подсчитайте количество каналов с помощью рук Tally счетчик.
- Для оптимальной записи живого движения и последующего анализа колокализации, выбрать аксоны, которые растут относительно плоский через каналы таким образом, что изображения большинства везикул может быть выполнена в фокусе.
- Удаление самой среды из резервуаров 2 и 2 'с 1 мл пластиковые пипетки. Чтобы облегчить последующее выравнивание основных образов с траекториями движения на kymographs выровняйте правый край микроканалов с поля зрения во время съемки (рис 1B, C).
- Для облегчения Fixinг образцов во время визуализации, выполнять живого изображения с двух человек. В качестве альтернативы, если живой изображений выполняется одним человеком, используют систему микроскопа, снабженного коррекции дрейфа.
- Начните изображения живой движение грузового спецификациям покадровой конкретных динамике транспортных груза анализируемых (спецификаций микроскопов и настроек для работы с изображениями YFP-ПРП C указаны в легенде о рисунке 2 и материалов List).
- После достаточного количества данных живое движение были собраны, имеют один человек заполнить резервуары 2 и 2 'с предварительно нагревают 4% параформальдегида в PBS, содержащий 0,04 г / мл сахарозы, чтобы зафиксировать клетки. Старайтесь не прикасаться микрожидкостных устройств, так как это нарушит фокус живого изображения. Есть другой человек настроить фокус в то время как фиксатор добавляется. Фиксация является успешным, когда наблюдается немедленную остановку движения. Добавить фиксатор в резервуар 1 и 1 'после этого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Временное photobleaцзин грузового флуоресценции также может наблюдаться, но флуоресценция сохраняется после IF окрашивание для моторных белков завершается (следующий шаг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид вредно при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи. Уничтожать в соответствии с предписаниями компетентных служб.
- ЕСЛИ окрашивание моторных белков для анализа колокализации
Примечание: Для количественного определения относительных уровней моторных белков (как определено окрашиванием антителами), связанных с индивидуальными перемещения грузов, проверки и титруют антитела чтобы гарантировать, что связывание антитело-антиген является насыщенным. Это делается путем определения специфичности антитела, используя нейроны, в которых интерес белок был либо выбитых или разобранном и выполняя ЕСЛИ анализ с увеличением концентрации антител. Для отрицательных контролей, нейроны окрашивали вторичными антителами в отсутствие первичных антител. Более подробнаяОписание проверки антитела могут быть найдены в Encalada и др., 16, и Szpankowski и др. 20.- Снимите покровное с нейронов гиппокампа, выращенных в микрожидкостных устройств от столике микроскопа. Не отключайте микрожидкостных устройств от покровного стекла, а микроканалы должны оставаться нетронутыми, чтобы наложить живые и неподвижных изображений. Выполните следующие действия в камере влажности.
- Чтобы обеспечить приток решений в микроканалов, поддерживать объем буфера разницу между резервуаров 1, 1 'и 2, 2', по крайней мере 30 мкл. во всех последующих шагов. Например, добавление объема 100 мкл среды для микрожидкостных резервуара 2, 2 ', и 70 мкл объема носителя для микрожидкостных резервуара 1, 1'.
- Снимите фиксатор из палат микрожидкостных устройств и мыть клетки три раза PBS ждут 10 мин между стирок.
- Проницаемыми клеток путем добавления 0,1% Тритон Х-100 diluTed в PBS в течение 5 мин для всех резервуаров.
- Снимите решение из всех водоемов и промыть PBS. Повторите промывание три раза ждут 10 мин между стирок.
- Удаление раствора из всех резервуаров и применить блокирующем буфере, содержащем 10% нормальной сыворотки осел и 3% протеаза свободными и иммуноглобулин G (IgG) -free BSA в PBS и инкубировали в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
- Спин первичного антитела маточного раствора на 20 000 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить осадок. Развести антитела к соответствующей концентрации в блокирующем буфере. Замените блокирующий буфер из микрожидкостных устройств с раствора антител. Инкубируйте образцы в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С.
- Снимите решение из всех водоемов и мыть три раза PBS, ожидая 10 минут между стирок.
- Спин вторичного антитела маточного раствора на 20 000 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить осадок. Развести антитела к соответствующей концентрации в блокирующем буфере. Заменить PBS раствором вторичного антитела. ВысиживатьОбразцы в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Снимите решение из всех водоемов и мыть три раза PBS, ожидая 10 минут между стирок.
- Заменить PBS с ~ 10-20 мкл монтажной среды непосредственно пипетки монтажную среду в открытии каналов, соединяющих резервуары. Давайте монтажа СМИ высохнуть в течение ~ 20 мин - 1 час при комнатной температуре.
- Храните устройства при 4 ° С, защита от света, чтобы избежать фотообесцвечивания и изображения аксоны в течение двух дней (максимум одна неделя) окрашивания.
- После окрашивания завершен, крепление покровного с нейронов гиппокампа, выращенных в микрожидкостных устройств на столике микроскопа. Найдите область трансфецированного аксона изображаемого в шаге 4.1.1-4.1.7.
- Получение изображений Z-стек (300 нм шаги) для каждой из трех каналов: грузов, двигатель 1, двигатель 2, с помощью высокого разрешения цель (например, высокая численное масло диафрагмы или вода цель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение Z-стеки важно как аксоны часто не растут совершенно плоскойв микроканалов и, следовательно, не все флуоресцентного puncta находятся в одной фокальной плоскости.
- Картография Грузоперевозки
- Генерация кимографе движения грузового использованием программного обеспечения для анализа изображений. Плагин ImageJ разработан Rietdorf и Зейтцем (EMBL) рекомендуется для генерации kymographs (для загрузки см Список материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ является общественным достоянием, Java-программа для обработки изображений разработанный в Национальном институте здравоохранения 27,28 (для загрузки см Список материалы). - Совместите фиксированные образы флуоресцентного груза (полученной на этапе 4.2.14) вручную путем наложения их на позиции траекторий в кимографе в точке фиксации (рис 2А, Б), с использованием коммерчески доступного построения графиков программу (материалы Список). Вручную выровняйте сначала накладывая стационарных грузовых изображение на кимографе и вручную выбирать грузовой puncta, который соответствует определенной траектории накимограф. Для достижения наилучших результатов выравнивания, используйте Z кусочек, который в наилучшей фокусировки для груза отображается. Можно использовать несколько ломтиков Z.
- Для каждого изображения в Z-стек (груза, двигателя 1 и двигателя 2; полученной на этапе 4.2.14) определяют XY координаты и амплитуды интенсивности для каждого флуоресцентного puncta использующие установленную алгоритм, чтобы соответствовать 2D Гаусса для функции рассеяния точки, представляющей каждый точечный источник в каждом из трех каналов 16,20,21 (рис 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения координат х, выстроенный на заказ MATLAB пакет программного обеспечения под названием "Мотор колокализации" была разработана 16,20, которое включает в себя Gaussian достойный алгоритм, разработанный Jaqaman, Danuser и коллег 21-23. Пакет программного обеспечения и подробные инструкции для ее применения могут быть получены по запросу. - Для каждого из индивидуально грузов puncta которые отображается на мобильных или стационарных траекторий на кимографе, выберите тон XY координаты и амплитуды интенсивности от результатов программы «Мотор колокализации" (эти грузы индивидуально помечены на рисунке 2B). Используйте несколько изображений Z-стек, приобретенные в шаге 4.2.14) на карту больше грузов, которые находятся на разных фокальных плоскостях.
- Сравнение индивидуальный XY координаты отображаемого груза к тем, которые получены для каждого из каналов в моторных соответствующего ломтика Z (рис 2D). Определить и выбрать координаты XY двигателя, которые находятся в радиусе 300 нм груза. Для грузов и двигателей, которые имеют сигнал в пределах одной и той же фокальной плоскости, использовать "Мотор колокализации" пакет программного обеспечения для определения puncta что расположены в радиусе 300 нм.
- Генерация кимографе движения грузового использованием программного обеспечения для анализа изображений. Плагин ImageJ разработан Rietdorf и Зейтцем (EMBL) рекомендуется для генерации kymographs (для загрузки см Список материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан обзор микрожидкостных устройств используется расти гиппокампа нейронов (1А, Б). Нейроны высевают в резервуаре 1. Размер микроканалов препятствует диффузии клеточных тел (сомы) в аксонов отделении в то время как длина каналов предотвращает дендритные прогнозы от пересечения весь путь к аксонов отсеке. После ~ 2-3 дней в культуре, нейроны начинают расширяя свои аксоны через микроканалы в аксонов отсека (рис 1B, C). Трансфицированные аксоны, экспрессирующие нормальные прионного белка, меченного желтого флуоресцентного белка (YFP-PrP C) могут быть идентифицированы с помощью флуоресцентной микроскопии (рис 1С). Выражение флуоресцентно меченых белков с использованием плазмиды трансфекции должны быть проверены на правильном субклеточном локализации и функции, как избыточная экспрессия может ввести экспериментальные артефакты из-за изменившихся конформации белков. Таким образом, colocalizatионные эксперименты должны быть дополняется как с со-биохимических исследований осадков, а также с тем, если окрашивание на эндогенно экспрессируемых белков. Поведение YFP-ПРП C используется здесь был протестирован ранее 16. Выражение YFP-PrP C в временно трансфицированных клеток нейробластомы (n2a) была низкой, предполагая, что временная трансфекция не приводит к высоко экспрессия уровней YFP-PrP C 16. Более того, если из N2A клеток трансфекцированных YFP-ПРП С помощью антител против PrP C указывается, что YFP-ПРП С высоко локализуется с эндогенной PrP C, предполагая, что оба трансфецировали и эндогенный PrP C вели себя подобным образом. Чтобы убедиться, что PrP C, связанный с двигателями, везикул immunoisolations проводились 16.
Для получения оптимальных исследований картографических грузов, правый край микроканалов совмещена с полем зрения в ходе живой и фиксированной IMAGing для того, чтобы изображение и ту же область аксона (обозначено красным прямоугольником на фиг.1В, C). Рисунок 2 и Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты для груза карт анализа нейронов временно трансфицированных с YFP-PrP C. Пузырьки, несущие YFP-ПРП C транспортируются в аксоны млекопитающих членами семьи Kinesin-1 и динеина тяжелой цепи 1 (DYNC1H1) 16, поэтому YFP-ПРП C везикулы отображается на Kinesin-1 субъединицы Kinesin легкой цепи 1 (KLC1) и DYNC1H1 двигатели. YFP-ПРП C движение пузырьков удалось сфотографировать и построены в кимографа (рис 2А). В kymographs, антероградная и ретроградным движение YFP-PrP C пузырьков представлена траекторий с отрицательными и положительными склонах, соответственно, и стационарные везикулы изображены вертикальными траекторий. В фиксации, все движения перестали свидетельствует отсутствие диагональных линий в кимографе(2А). Сигнал ПЧ молекулярных двигателей и грузов в стационарных, пермеабилизированных аксонов является точечный 16 (фиг.2В, С). Цель «картирования грузов", чтобы определить, если puncta в грузовом канала (рис 2B) локализуются с мотором puncta (рис 2С) в двух других каналов. Для этого, флуоресцентные изображения фиксированных пузырьков YFP-ПРП С, а изображения, если соответствующих KLC1 и DYNC1H1 связанный с везикулярного puncta были выровнены по кимографе (рис 2B, C). Гаусса функции были установлены на точки распространения функций люминесцентных точечных источников во всех трех каналов с целью картирования точные XY позиции двигателей к грузовым траекторий, полученных живого изображения (рис 2D). Эндогенно выразил KLC1 и DYNC1H1 двигатели появляются как окрашивание точечной и локализуется дифференцированно с YFP-ПРП C пузырьков (рис 2D). Colocaliция была определена присутствии YFP-PrP C и двигательной puncta на расстоянии 300 нм и количественно по уровню колокализации гауссовой XY координат позиции между YFP-PrP C и каждого из KLC1 и DYNC1H1 puncta (фиг.3А ). Это расстояние было выбрано на основе оптики, дифракционного предела света, и соответствующего физического размера грузовых и автотранспортных подразделений. Относительное количество KLC1 и DYNC1H1 связано с YFP-ПРП C пузырьков была получена из гауссовых амплитуд, которые представляют интенсивности каждого puncta (рис 3B). Эти данные могут быть дополнительно проанализированы по желанию. Например, интенсивность двигателей colocalizing с YFP-ПРП C puncta между контролем (дикого типа - WT) нейронов и тех не хватает других Kinesin-1 субъединицы (KIF5C - / - нейроны в фигуре 3А, KIF5C является членом Kinesin-1 Семейство), могут быть сравнены, чтобы определить, является ли отсутствие KIF5С разрушает ассоциацию KLC1 и / или DYNC1H1 для YFP-ПРП C пузырьков (KLC1 и DYNC1H1 интенсивности были неизменными в наших экспериментах 16). Кроме того, KLC1 и DYNC1H1 интенсивности могут быть построены на тщательно возможные корреляции между относительными количествами моторных и направленности движения (рис 3B). Например, YFP-ПРП C пузырьки, которые движутся и / или стационарный связано как с KLC1 и / или DYNC1H1 (рис 3б).
Рисунок 1. нейронов гиппокампа, культивируемые в микрофлюидных устройств. (A) Изображение микрофлюидном устройства. Очертания водоемов визуализируются красными и синими красками. Нумерация относится к числу микрожидкостных резервуаров, используемых в протоколе. (В) Схема микрожидком устройства. Цифры соответствуют водохранилищ яп, средства массовой информации и нейроны добавляются. Трансфицированные нейроны показаны зеленым цветом. Красный прямоугольник и красные пунктирные стрелки указывают регион, рекомендованный для живой и фиксированной флуоресцентной томографии. (C) Изображение двух аксонов трансфекцированных YFP-ПРП C растет через единый микроканале (один микроканальным и кромки устройства очерчен пунктирными белыми линиями) , Индивидуально движущиеся YFP-ПРП C пузырьки могут быть выделены в качестве яркого puncta. Масштабная линейка составляет 10 мкм. Рисунок взят из:.. Encalada др 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. "отображение Cargo" соотнести YFP-ПРП C везикул транспорт сОтносительные количества кинезиновых и динеина двигателей. флуоресцентные изображения Wide-полевые живого движения и использования основных грузов были приняты на инвертированный микроскоп, снабженный моторизованным стадии и ПЗС-камерой и нефти целью 100X / 1.4 NA. (А) кимографе из YFP -PrP C пузырек движение аксонов, показанных на рисунке 1С. Живой движение был записан в течение общего времени от 30 до 60 сек при 100 мс экспозиции (10 Гц). Клетки фиксировали после визуализации движение грузового, по крайней мере 15 секунд. Пунктирная линия показывает время фиксации во время живого изображения. Красная коробка показывает область пузырьков выделенных в (B, C) и увеличенные в (D). Стрелки указывают на три пузырьков, показанных на (D), соответствующей стационарной (синий), ретроградная (красный), и антероградная (зеленый) траекторий. ( Б) изображение основных пузырьков YFP-ПРП С выровненных с соответствующим кимографе. Цифры указывают инdividual YFP-ПРП C пузырьки, которые были отображены в идентифицируемых puncta на кимографе. Антероградная пузырьки зеленый, ретроградная красные, и стационарные них являются синий. (C) Исправлена ЕСЛИ образы KLC1 и DYNC1H1 puncta соответствующая той же области, показанной на (B). Шкала бар (АС) составляет 10 мкм. (D) Расширение фиксированной ПЧ сигналы каждого из трех каналов с 2D заданий гауссовой функции. Синие точки представляют местные максимумы интенсивности пикселей, красные точки представляют Гаусса припадки, и розовые точки являются перекрытие между ними. Стрелки указывают примеры YFP-ПРП C пузырьков, показанных на (А), и их дифференциальная колокализация с KLC1 и DYNC1H1 моторных белков. Масштабная линейка 2 мкм. Рисунок взят из:.. Encalada др 16 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию го это цифра.
Рисунок 3. Количественный анализ "картирования грузов" от YFP-ПРП C пузырьков. (А) Количественная оценка колокализации между YFP-ПРП C пузырьков, KLC1 и DYNC1H1 в WT и KIF5C нокаутом нейронов (KIF5C - / -). Общее количество puncta анализируемого был N WT = 887 и N KIF5C - / -. = 1629 16 Числа внутри баров представляют число пузырьков в категории. Показаны средние ± SEM. Непараметрический перестановка т тест был использован для сравнения между генотипами 29. (B) Соотношение относительной состава моторного и направленности движения в мас нейронов данных, проанализированных в (А). Рисунок взят из: Encalada др 16...jove.com / файлы / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "цель =" _ пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь дает соотношение направленности движения отдельных флуоресцентных микротрубочек на основе перемещения грузов частиц с относительной типа и количества связанных моторных белков в живых нейронов. Ранее общая моторная состав аксонов везикулярного грузов анализировали на гетерогенных популяций биохимически очищенных везикул и органелл 9,15. Тем не менее, характеризующие двигатель композиция для одного типа груза внутри клеток было достаточно сложной задачей из-за трудности в очистке однородные множества пузырьков. Более того, в то время как измерения моторных стойло-сил при условии оценки активных номеров двигателя в эмбрионах дрозофилы, неясно, является ли направленность движения коррелирует с двигателями будучи стабильно связан с грузами или с быстрым ассоциации / диссоциации активных двигателей в / из груза 12. Поэтому протокол "груз отображение" descriкровать здесь была разработана для дальнейшего расследования корреляцию между типом и относительного числа двигателей, связанных с индивидуально перемещения грузов в живых нейронов.
Для успешного получения данных из "карт грузов" очень важно, чтобы 1) выполнять визуализацию движения грузового и фиксированные МСФ на высоким временным и пространственным разрешением, 2) обеспечить немедленное фиксацию образца в ходе визуализации, 3) совместите регион интереса к живой и фиксированных образов и карта фиксированный груз и моторы к движению kymographs для тех же изображений, и 4) точно определить XY координаты груза и двигателя флуоресцентного puncta для того, чтобы определить количество колокализации между грузовыми и моторных белков.
В то время как этот протокол уникально подходит для анализа транспортные характеристики в равномерно организованных аксонов нейронов, выращенных в микрожидкостных устройств, он может быть адаптирован к широкому кругу вопросов исследования. Например, это Applicaции могут быть использованы для характеристики ассоциацию везикул с их адаптерами, участвующих в эндо / экзоцитоза (например, анализы с торговлей фибробластов), или рост микротрубочек, меченных микротрубочек + наконечник связывающих белков. Для них, микрофлюидных устройства могут быть заменены в узлах регулярной сетки покровные для облегчения локализации отображенных клеток, необходимых для корреляционного жить и фиксированных визуальных исследований. Этот протокол также может быть использован для характеристики клеточных событий, для которых параметр изменяется во времени в зависимости от конкретной клеточной среде. Например, выпуск флуоресцентно меченого белка вирусной из отдельных структур эндосом в цитоплазму может быть коррелирует с экспрессией и / или ассоциации эндосомных белков.
Одним из возможных ограничений данного протокола является то, что отображение высоких грузов плотности может быть трудно. Тем не менее, назначение функций Гаусса обходит этот вопрос в значительной степени, позволяяРазличие позиций между флуоресцентной puncta на уровне суб-пикселей. Кроме того, отображение моторов для аксонов грузов низкая пропускная: в настоящее время, отображение может быть сделано в течение 2 аксонов в микрожидкостных устройств, учитывая низкий уровень трансфекции нейронов и ограниченное поле зрения при использовании высокое увеличение необходимо для высокой Разрешение изображения с нашей камерой. Дальнейшее развитие этого способа может включать в себя использование систем лентивирусов трансдуцировать нейронов с более высокой эффективностью, изоляции нейронов от трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентно меченных белков или маркировку органелл с небольшими флуоресцентных красителей, таких как Lysotracker или Mitotracker, все из которых будет возрастать количество аксонов, меченных флуоресцентными маркерами. Кроме того, размер записанной области ограничен увеличение, размер пиксела и размера матрицы пикселей камеры, используемой для формирования изображения. Текущие события в области методов визуализации позволит большей площадиS, чтобы быть отображены в будущем, и, следовательно, увеличить объем данных, полученных в экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
