Abstract
了解了这些分子马达协调其活动，以神经元内运输小泡货物的机制，要求电机/货运协会在单囊泡水平的定量分析。此协议的目标是使用定量荧光显微术来关联（“图”）的活的货物移动的位置和方向，以具有相同的货物相关联的马达的组成和相对量。 “货物映射”由荧光标记的货物移动在轴突上的微流体装置中培养的实时成像，随后通过化学固定记录的活运动期间，并在完全相同的轴突区域的随后的免疫荧光（IF）染色用抗马达。货物及其关联的电动机之间的共定位是通过分配的子像素位置的评估坐标电机和货物的通道，通过拟合高斯函数的衍射利mited点扩散函数表示各个荧光点源。固定货物和电机影像随后被叠加到地块货运动，以“图”到他们的跟踪轨迹。此协议的强度是活的组合和IF数据记录囊泡货物都在活细胞中的转运，并确定相关于这些完全相同的囊泡的电动机。该技术克服了使用生物化学方法来确定纯化的异构散装囊泡群体的平均电动机组合物，因为这些方法不露出于单个移动货物组合物前面的挑战。此外，该协议可以适于在其他细胞类型中的其他交通工具和/或运输途径的分析来关联个体的细胞内结构的运动与他们的蛋白质组合物。该协议的限制是相对较低的吞吐量，由于培养的低转染效率原代神经元和视可用于高分辨率成像的有限字段。未来的应用程序可以包括的方法，以增加神经元表达荧光标记的货物的数量。
Introduction
胞内运输中的输送蛋白，膜，细胞器，和信号转导分子的各种蜂窝结构域1中的所有细胞类型是至关重要的。神经元是高度专业化与关键取决于必要的货物为他们的长途输送到各微区轴突胞内运输长，极化预测细胞。两个大家族的分子马达蛋白 - - 这种传输是通过驱动蛋白和动力蛋白介导的结合，以货物和沿顺行和逆行方向偏振的微管轨道上。而逆行运动由动力蛋白主要介导，在顺行方向上的移动是通过驱动蛋白马达的大，功能多样家庭容易。因此，轴突货物的顺行传输可以由驱动蛋白超家族1-5中各个家庭成员介导。虽然有些货物移动持续在任一方向，米OST货物移动双向，经常逆转的路上，他们的最终目的地1,5-13。此外，已经显示，同时相对的方向性关联到的货物，提高问题是，如何货物的调节的运动是由极性反转马达5-7协调的电动机。一起，轴突货物的运输是受电动机及其特定生化活性，而这又取决于各种适配器和监管的结合配偶体14的组合物调节的协同过程。
忠实地描述了轴突运输的机制为特定货物和揭开该传输的基本规则，它是最重要的，以确定他们的现场运输过程中与各个货物相关联的电动机蛋白及其调控结合配偶体的组合物。其他的方法，例如生物化学方法，提供平均MOT的估计或成分的纯化异构囊泡的人口，但这些估计不会透露的类型或关联到单个囊泡移动电机的数量。另外，沿着在体外预组装的微管泡运输的重组使测量在单个囊泡级15的一种类型的电机的数量。然而，这些实验并没有直接关联的电机与囊泡运输特性的量，并且在不存在细胞调节因子测量的传输。
的协议在这里提出，它决定了从个人移动小泡从免疫荧光（IF）的数据测量内源表达的马达蛋白马达组成（类型和马达的相对量），并关联这些参数完全相同的囊泡中的神经元的实时传输16。此方法需要IF生存货物运输数据进行精确的映射。这是通过慢慢生长完成克小鼠海马神经元微流体装置按照既定协议17-19。这些设备允许轴突和单个移动货物在固定和活光镜模式的识别和相关 （“映射”）（ 图1）。培养的神经元被转染了荧光标记的货物蛋白的运输被成像在高空间和时间分辨率，以获得该绘制在kymographs详细运动信息。在成像过程中，神经元是多聚甲醛固定，并随后用抗内源性马达蛋白。固定货物和电机的图像叠加到现场运动kymographs到“地图”（共定位），他们活货运动轨迹16。关联货物与马达蛋白的关联的现场动作，共定位是利用所谓的“莫一个定制的MATLAB软件包进行共定位器“16,20。荧光标记的货物和电动机产生衍射限制的点状的功能，可以部分地重叠。为解决重叠泪点的位置时，软件首先自动适合高斯函数对每个点扩散函数，表示各个荧光泪点，以确定其精确的XY子像素位置的坐标和强度振幅21-23电机和货物的位置是随后相互比较，以确定共定位16,20。因此，这种方法比其它方法24更精确地分配荧光泪点之间的共定位。
这种方法的优点是，以评估在固定的细胞马达与个别货物的共定位的能力，为此，活运动轨迹（例如，方向，其中将其在定影时的移动）已录制orded。用这种方法，驱动蛋白和动力蛋白被发现同时关联到该携带正常型朊病毒蛋白（的PrP ^ c -cellular），一个neuronally富集货物该移动双向或保持静止，在轴突16囊泡。该分析允许的工作模式制定了朊病毒Ç囊泡运动的调控，其中顺行（驱动蛋白）和逆行（动力蛋白）电机协调其活动，以移动囊泡在任一方向或保持静止，而相关的货物。这种方法的另一个优势是用于表征多，在几乎所有的细胞类型中移动，与所关注的任何其它蛋白（多个）荧光标记的货物的共定位/关联的潜在广泛的适用性。因此，活/固定关联可能潜在地允许对瞬时蛋白货物的相互作用的检测，因为许多个别的荧光标记的移动粒子可以在一个预定p被分析eriod时间。由于广泛的适用性和问题，该方法可以解决的类型，此协议将有兴趣的广大观众细胞生物学家包括学习贩运和运输中的神经元或其他类型的细胞。
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Protocol
所有实验均进行以下批准的协议，并根据对人道护理研究动物的机构准则。新生儿小鼠断头处死。
1.制备微流体装置的用于细胞培养
- 所描述的哈里斯和他的同事为17-19海马神经元的生长，准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控设备。下面是分别适合于货物映射协议的一些修改。
注意：微流体装置也可商购（材料清单），从而获得了制造设施是没有必要的。 - 通过洗涤他们三次，用丙酮，然后洗涤三次用100％乙醇和水洗涤三次准备号1.5盖玻片（24×40毫米）。商店盖玻片在水中，在4℃直至使用。这些治疗有助于确保盖玻片清洁碎片可能与CEL的镀干扰的ls，污染，和存活。
注：丙酮和乙醇摄入的易燃和危险情况下的皮肤接触（刺激物），眼睛接触（刺激物），吸入。根据官方的规章处理。 - 当准备使用时，将一只玻璃盖在每个微流体装置60毫米的细胞培养皿中，并让其风干揭露为45分钟的生物安全柜中，以避免污染。
- 后设备从主人切出冲头已经被切以创建储层（ 图1A，B）所示，将它们与微流体通道侧式生物安全柜装有UV灯45分钟进行灭菌 的内部。
注：将时间超过2小时，在UV处理设备可能会影响PDMS中的完整性。 - 通过放置到每个盖玻璃60毫米的塑料细胞培养盘内的一个设备组装装置，使得微流体通道朝下。轻轻推压至顶Of显示装置（避免接触微通道），以提供该装置的非永久密封到玻璃盖。涵盖各60 MM细胞培养皿的盖子。
- 用微量中，加入细胞培养级水中，顶部的两个微流体储层（ 图1A中的1和2），从而允许水流过水合设备。用微量中除去水并加入1mg / ml的聚-L-赖氨酸进入微流体储存器1（200微升）和2（100微升）。音量差是允许的聚L-赖氨酸流过微通道（ 图1A，B）。
- 为确保内部60毫米细胞培养皿的设备不翻倒内37℃的孵化器，将装有这些设备360毫米细胞培养皿至150毫米的塑料细胞培养皿中，并盖上盖子的菜。孵育O / N在37℃培养箱中5％的CO 2。通常在90％以上的信道是每个器件可用做不包含任何气泡或物理堵塞。
- 第二天，更换聚-L-赖氨酸与水和离开设备在培养箱中培养至少1小时。重复此洗涤三次。除去水和添加的Neurobasal-A培养基（含2％的B-27补充剂和500μM的含有GlutaMAX）到每个设备。离开O / N在37℃培养箱中培养5％的CO 2。
- 第二天，如下所述板状海马细胞。
2.电镀小鼠海马神经元主要在微流体装置
注：培养海马神经元的新生大鼠制备先前已发表 在朱庇特25。下面是分别适用于平板小鼠海马神经元微流体装置的一些修改，这是最佳的转染。
- 前小鼠脑解剖，预暖的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），含有10％胎牛血清胎牛血清（FBS;不含抗生素），混合物A（125毫克DL半胱氨酸，125mg的牛血清白蛋白（BSA）和3.125克D-葡萄糖在500ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中;过滤除菌通过0.22微米的过滤器）和脱氧核糖核酸酶I溶液（DNA酶I：50毫克，DNA酶I和0.5的100ml Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中过滤1.2M的硫酸镁溶液消毒通过0.22微米的过滤器），在37℃的水浴中。
- 预暖的Neurobasal-A内的37℃培养箱中，用5％CO 2的生长培养基中平衡的pH值。
- 根据既定方案26 1-3日龄乳小鼠海马解剖。保持海马在15ml锥形管中含有10ml夹层缓冲液（HBSS中含有10mM HEPES pH为7.4，50mM葡萄糖，100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素），在冰上。把高达的15毫升锥形管4海马。
- 执行剩余的协议是在无菌条件下s的生物安全柜内。
- 稀释在5ml的混合物A，涡流的45个单位的木瓜蛋白酶，并孵育5分钟，在37℃，直至木瓜蛋白酶粉末溶解。加入1 ml的DNA酶I溶液。过滤通过0.22微米的注射器过滤器单元的组合。
- 小心吸HBSS“15毫升锥形管含海马。加入10毫升冷的（4℃）的HBSS到海马，并让他们沉降到管底部。小心15毫升锥形管吸HBSS。
- 加入1 ml木瓜蛋白酶/ DNA酶I混合至多达4海马孵育20-30分钟，在37℃。倾斜的锥形管，每隔5分钟去洗澡海马与组合。可替换地放置海马在37℃水浴摇床上轻轻振荡（〜100rpm下）。
- 抽吸木瓜蛋白酶/ DNA酶I混合并用含有10％FBS的预温热的DMEM（37℃）洗涤海马两次。
- 第二次洗涤后，加2 ml预热的DMEM中含有10％FBS至海马和手动磨碎海马通过移起来，并使用1毫升移液管尖，以解离的神经元向下〜10-12倍。
- 让磨碎沉降〜1分钟，因为这将允许非解离神经细胞沉降到锥形管的底部。传送含有解离的神经元的上清液至新的15毫升锥形管中，避免较大的组织已经固定在该管的底部的传递。
- 自旋细胞在1000 XG 2分钟，小心地取出上清液，而不会干扰细胞沉淀。轻轻吹打重悬在80微升的Neurobasal-A培养基中的细胞。
- 从微流体储存器1和1'中删除介质。适用于20微升细胞（〜275000），以微流体水库1座，并让他们流过。放置设备在37℃培养箱中，用5％CO 2的20分钟。
- 看显微镜下，以确保细胞粘附在玻璃盖。添加的Neurobasal-A培养基来顶掉所有的水库。返回装置与细胞在37℃培养箱中，用5％的CO
- 检查设备的每个〜2-3天顶过水库的Neurobasal-A含有2％B-27的补充（不含有GlutaMAX），以避免蒸发。神经细胞开始通过微流体通道电镀后的轴突伸长〜2-3天。受试者神经元接种后转染通常7-10天。
3.转染海马神经元生长的微流控设备
- 每台设备，准备1.2μL脂质体2000年30微升的Neurobasal-A混合，和0.5微克荧光货物融合基因在30微升的Neurobasal-A混合，并培育5分钟在室温。添加脂质体的混合的DNA混合，并孵育20分钟，在室温。加入60微升含4％B-27补充DNA的Neurobasal-A的/脂质体混合，并通过弹管混匀。
- 从微流体水库2和2'删除所有媒体和认真填写了含有2％B-27的补充井的Neurobasal-A不洒在中INTØ其他舱室。
- 从微流体水库1和1'取出介质。加入120微升的DNA /脂质体混合到微水库1座，并让它流。返回装置至37℃培养箱，用5％CO 2的3-4小时。
- 从微流体水库1和1'删除所有媒体和用Neurobasal-A含有2％B-27的补充替代24小时（或直到准备映像）。典型地，5-7个轴突，通过微通道长的那些条件，这代表约1-3％的转染效率与已发表 的对海马培养细胞26的效率一致的下转染。
4.“货物映射”分析
- 货物运输的实时成像
- 在倒置落射荧光显微镜的光配备了37℃培养箱中培养和CO 2控制室进行拍摄。
- 安装在一个MICR成长的海马神经元的盖玻片ofluidic设备上的显微镜载物台。为了避免神经元死亡，工作迅速，保持在显微镜的样品，不超过1小时。
- 使用高分辨率的物镜（100X），发现转染的细胞，通过微流体腔室的通道延伸，并记录在其中转染的轴突中发现的信道的数量的轴突。算使用手动式计数器的信道数。
- 对于活运动和随后的共定位分析的最佳记录，选择成长相对平坦的通过渠道，可以重点进行最囊泡的成像轴突。
- 水塘2和2'与1毫升塑料移液管除去大部分培养基。为了便于固定图像与移动轨蹄的上kymographs随后的对齐，对齐的视场中的微通道的右侧边缘成像（ 图1B中的C）中。
- 为了方便菲克桑G拍摄过程中的样品，进行实时成像两个人。另外，如果实时成像是由一个人进行，使用配有漂移校正的显微镜系统。
- 开始摄像活货物异动，具体到货物的被分析的传输动力学时间推移规格（显微镜的规格和设置用于成像的YFP-朊病毒下在图2和材料清单的说明中指定）。
- 经过足够活运动数据已经收集，有一个人填满水库2和2'与在PBS中预温4％多聚甲醛含有0.04克/毫升蔗糖以固定细胞。避免接触微流体装置，因为这样会破坏实时成像的焦点。有而固定剂被加入的其他人调整焦点。固定是成功的，当移动立即停止观察。添加固定剂对储层1和1'之后。
注：临时photoblea货物荧光清也可能被观察到，但荧光仍然存在后，如果染色马达蛋白完成（下一步）。
注意：多聚甲醛吸入有害，皮肤接触和吞食。刺激眼睛，呼吸系统和皮肤。根据官方的规章处理。
- IF染色马达蛋白的共定位分析
注：对于马达蛋白的相对水平（如通过抗体染色测定），相关联的单独移动的货物的定量，验证和滴定的抗体，以确保所述的抗体 - 抗原结合是饱和的。这是通过确定使用神经细胞，其中感兴趣的蛋白质已被任敲除或敲低对抗体的特异性进行，并且通过执行IF分析随着抗体浓度。为阴性对照，神经元染色，在不存在第一抗体的第二抗体。更详细抗体的验证的说明可在Encalada 等人 16和Szpankowski 等 20中找到。- 删除从显微镜载物台在微流控设备增长的海马神经元的盖玻片。不从盖玻片脱离微流体装置中，所述微通道的需要，以叠加的火线和固定的图像保持完整。执行在湿度室中的下列步骤。
- 以确保溶液的流入微通道，至少30微升保持油藏1,1之间的缓冲体积差'和2,2'。在所有后续步骤。例如，添加100μl的培养基体积对微流体贮存器2，2'，和70微升培养基体积对微流体储存器1,1'。
- 从微流体装置的腔室除去固定液，用PBS洗涤等待10分钟，洗涤细胞三次。
- 通过添加0.1％的Triton X-100的稀释剂，清洗剂通透细胞泰德在PBS中5分钟，以全部水库。
- 从所有储层除去溶液和洗涤用PBS。重复洗涤3次等待洗涤之间10分钟。
- 去除所有储层的溶液，并阻断含10％正常驴血清和3％无蛋白酶和免疫球蛋白G（IgG）的-free BSA的PBS缓冲液中孵育至少30分钟，在RT。
- 旋转一次抗体原液以20,000×g离心5分钟以除去沉淀物。稀释抗体至适当的浓度在封闭缓冲液。取代从微流体装置中的封闭缓冲液与抗体溶液。样品孵育2小时，在室温或O / N在4℃。
- 从所有水塘取出溶液并洗涤三次，用PBS，等待洗涤之间10分钟。
- 旋转二次抗体原液以20,000×g离心5分钟以除去沉淀物。稀释抗体至适当的浓度在封闭缓冲液。更换PBS中的第二抗体溶液。孵化样品1小时，在室温。
- 从所有水塘取出溶液并洗涤三次，用PBS，等待洗涤之间10分钟。
- 通过直接吹打安装介质插入连接储存器的通道的开口代替PBS中以〜10-20微升的安装平台。让安装介质干燥〜20分钟 - 1小时RT。
- 内染色两天（不超过1周），避光，以避免光漂白店设备在4℃下，并且图像轴突。
- 染色完毕后，装入盖玻片与微流体装置上生长的显微镜载物台的海马神经元。定位染轴突成像在步骤4.1.1-4.1.7的区域。
- 为三个信道的获取Z堆叠图像（300纳米步骤）：货物，电动机1，电动机2，采用一个高分辨率的目标（ 例如，具有高数值孔径的油或水的目标）。
注：收购Z-栈轴突往往不会长出完全平坦很重要在微通道中，因此，不是所有的荧光泪点都在同一焦平面上。
- 货运映射
- 生成使用图像分析软件货物运输的kymograph。在ImageJ的插件通过Rietdorf和塞茨（EMBL）开发的建议产生kymographs（下载见 材料清单）。
注：ImageJ的是卫生27,28的国家机构制定了公共领域的，基于Java的图像处理程序（下载见材料清单）。 - 通过重叠它们放到在kymograph的轨迹的位置处的固定点（ 图2A，B）中，使用市售的制图软件程序（材料对齐荧光货物（在步骤4.2.14生成）手动的定影图像列表）。手动通过第一重叠固定货物图像转印到kymograph和手动选择对应于特定轨迹上的货物泪点对准该kymograph。为了获得最好的比对结果，使用Z片是在映射的货物最佳焦点。几个ž片都可以使用。
- 在Z堆叠的每个图像（货物，电机1和电机2;在步骤4.2.14产生）确定的XY坐标，并使用已建立的算法强度振幅对每个荧光泪点，以适合二维高斯函数的点扩散函数，它表示每一个点源在三个通道16,20,21（ 图2D）的。
注：要获得XY坐标，一个定制的MATLAB软件包被称为“电机共定位”开发16,20，其中纳入Jaqaman，Danuser和他的同事开发出21-23高斯拟合算法。根据要求可以得到其使用的软件和详细的说明。 - 对于每个单独的货物泪点的分别映射到上kymograph的移动或固定的轨迹，选择吨他XY从“汽车共定位”计划的结果坐标和强度幅值（这些货物分别标示在图2B）。使用）在步骤4.2.14收购了几家Z堆栈的图像映射上找到不同的焦平面更多的货物。
- 比较各个XY坐标的映射货物的那些方法每个马达通道中的对应的Z个切片（ 图2D）中获得。确定和选择在XY马达的坐标的货物的300nm的半径范围内的。对于货物，并且具有相同的焦平面内的信号，电机，使用“汽车共定位”软件包，以确定位于300纳米范围内的泪点。
- 生成使用图像分析软件货物运输的kymograph。在ImageJ的插件通过Rietdorf和塞茨（EMBL）开发的建议产生kymographs（下载见 材料清单）。
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Representative Results
图1示出了微流体装置的用于生长的海马神经元的概览（ 图1A，B）。神经元接种于容器1的微通道的尺寸可以防止细胞体（胞体）扩散到轴突隔室，而通道的长度可以防止树枝状突起从一路穿越到轴突隔室。后在培养〜2-3天，神经元开始穿过微通道延伸它们的轴突到轴突隔室（ 图1B中的C）。转染的轴突表达标记的黄色荧光蛋白（YFP-的PrP C）的正常型朊病毒蛋白可以用荧光显微镜（ 图1C）来鉴定。利用质粒转染荧光标记蛋白的表达应该因改变蛋白质的构象检查正确的亚细胞定位和功能的过度表达可能会引入实验文物。因此，colocalizat离子实验应该被赞扬都与生化共沉淀研究，以及带有IF染色为内源性表达的蛋白质。的YFP-的PrP ^ c这里使用的行为，以前16进行测试。 YFP-的PrP C在瞬时转染的神经母细胞瘤细 胞（的N2a）表达水平较低，这表明瞬时转染不会导致高度过表达YFP-的PrP C水平16。此外，如果的N2a细胞转染与使用抗PrP的ÇYFP-朊蛋白的C表示YFP-的PrP ^ c共定位的高度与内源性的PrP C，这表明这两种转染和内源性的PrP ^ c具有类似的举动。以确定的PrP 下与电机相关的，泡immunoisolations进行16。
为了获得最佳的货物作图研究中，微通道的右边缘被活和固定伊马期间对准视场为了更改到图像轴突的相同区域（在图1B中，C红色的矩形表示）。 图2和图3显示的代表性结果为货物神经元瞬时转染的YFP-的PrP 的C映射分析。囊泡携带YFP-的PrP C受到了驱动蛋白-1的家人和动力蛋白重链1（DYNC1H1）16成员运输在哺乳动物神经轴突，因此YFP-的PrP ^ c囊泡被映射到驱动蛋白亚基1驱动蛋白轻链1（KLC1） ，并DYNC1H1电机。 YFP-的PrP ^ c囊泡运动进行成像和标绘在一个kymograph（ 图2A）。在kymographs，顺行和YFP-的PrP ^ c囊泡逆行运动轨迹由负和正斜率，分别代表和固定囊泡是由垂直的轨迹描绘。在固定，所有运动停止指示的没有斜线的kymograph（ 图2A）。分子马达和货物在固定，透轴突的IF信号是具点16（ 图2B，C）。 “货物映射”的目的是确定是否泪点中的货物信道（ 图2B）共定位用马达泪点（ 图2C）中的其它两个通道。要做到这一点的，固定的YFP-的PrP ^ c囊泡，和对应KLC1和DYNC1H1关联到水疱泪点的中频图像的荧光图像对准到kymograph（ 图2B，C）。高斯函数进行拟合，以在所有三个通道的荧光点光源的点扩散函数，以图电动机的精确的XY位置，以通过实时成像（ 图2D）中获得的货物的轨迹。内源表达的KLC1和DYNC1H1电机出现点状染色，并与YFP-的PrP ^ c小泡（ 图2D）共定位差异。 Colocali矩阵特殊积由高斯的XY的共定位坐标的YFP-的PrP C和每个KLC1和DYNC1H1泪点之间的位置上的电平（ 图3A通过YFP-的PrP 的C的300nm的距离内的存在和马达泪点中定义和量化）。基于光学，光的衍射极限，并且所述货物和马达亚基的有关物理尺寸这一距离被选择。从高斯幅度，这表示每个泪点（ 图3B）的强度得到KLC1和DYNC1H1与YFP-的PrP ^ c囊泡相关联的相对量。这些数据可以进一步分析根据需要。例如，马达的强度colocalizing与对照之间的YFP-的PrP ^ c泪点（野生型- WT）的神经元和那些缺乏其他驱动蛋白1亚基（KIF5C - / - 图3A中的神经元，KIF5C是驱动蛋白-1的构件族），可以进行比较，以确定是否缺少KIF5的Ç破坏KLC1和/或DYNC1H1的关联YFP-的PrP ^ c囊泡（KLC1和DYNC1H1强度在我们的实验中有16人不变）。此外，KLC1和DYNC1H1强度可以绘制审阅相对马达量和运动的方向性（ 图3B）之间的可能的相关性。例如，YFP-的PrP ^ c囊泡被移动和/或与二者KLC1和/或DYNC1H1（ 图3B）的固定相关联。
图1.海马神经元微流体装置培养。 （A）图片微流体装置的。储层的轮廓由红色和蓝色染料可视化。编号指的是在整个协议中使用的微流体槽数量。一个微流体装置（B）的示意图。数字对应水库我n分别加入培养基和神经元。转染的神经元被显示为绿色。红色矩形和红色虚线箭头表示推荐用于实时和固定荧光成像的区域。两个轴突转染YFP -朊病毒下生长，通过一个单一的微通道（C）的图像（一个微通道与所述装置的边缘由虚线白线画出的） 。独立移动YFP-的PrP ^ c囊泡可以区分为亮泪点。比例尺为10微米。图改编自：。Encalada等[16] 请点击这里查看该图的放大版本。
图2.“货物映射”关联YFP-的PrP ^ c囊泡运输带YFP的相对量驱动蛋白和动力蛋白马达。固定的货物被送往在倒置显微镜配备一个摩托化阶段和CCD照相机和100X / 1.4 NA油浸物镜的活运动和宽视场荧光图像。（A）的 Kymograph在图1C所示的轴突-PrPÇ囊泡运动。在线运动被记录的总时间为30至60秒，在100毫秒曝光（10赫兹）。细胞成像货物运输至少15秒后是固定的。虚线表示固定在实时成像的时间。红色框显示囊泡中的（B，C）的高亮显示和放大的区域（D）中。箭头指向在（D）中对应于静止的（蓝色），逆行（红色），顺（绿色）的轨迹如图3囊泡。（对准相应的kymograph固定YFP-的PrP ^ c囊泡B）的图像。数字表示在个别的YFP-的PrP ^ c囊泡被映射到识别的泪点在kymograph。顺小泡是绿色的，逆行是红色的，而静止的是蓝色的。（C）固定中频KLC1和DYNC1H1泪点的图像对应于（B）所示的相同区域。比例尺（AC）为10微米。固定IF（D）放大每三个通道2D高斯函数分配的信号。蓝色圆点表示的局部强度最大值的像素，红色点表示的高斯拟合，和粉红色的点是这两者之间的重叠部分。箭头指示的（A）所示YFP-的PrP ^ c囊泡的例子，他们的差别共存与KLC1和DYNC1H1马达蛋白。比例尺为2微米。图改编自：。Encalada等[16] 请点击这里查看届的放大版本。是的身影。
图3.定量分析“货映射”的YFP-的PrP ^ c囊泡。 YFP-的PrP ^ c小泡，KLC1和DYNC1H1在WT和KIF5C淘汰赛神经元之间的共定位（一）量化（KIF5C - / - ）。泪点分析的总数为：N WT = 887和N KIF5C - / - 。= 1629 16内棒的数字代表每个类别的囊泡的数量。显示的是平均值±标准差。非参数排列采用t检验基因型29之间的比较。（B）在（A）分析数据的小波神经元相电动机组成和运动方向性的相关性。图改编自：Encalada 等[16]。.jove.com /文件/ ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg“TARGET =”_空白“>请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
这里介绍的协议可以实现个别荧光微管为基础的移动货物粒子运动的方向性，相对的类型和相关联的马达蛋白的量在活的神经元的相关性。此前，轴索膜泡货物的总电机组成测定在生化纯化小泡和细胞器9,15不同的人群。然而，对于一个单一类型的货物，在细胞内表征马达组合物一直是由于在纯化均一的囊泡种群的困难的挑战。此外，虽然电机堵转，力量测量果蝇胚胎提供了积极的电机号的估计，目前还不清楚运动的方向性是否相关，电机被稳定结合货物或者主动马达/从货物12迅速协会/解离。因此，“货物映射”协议descri床这里的开发是为了进一步探讨的类型和相关联的单独移动的货物在活的神经元马达的相对数之间的相关性。
从“货物映射”成功获取数据是很重要：1）在一个较高的时空分辨率进行货物移动的成像和固定的IF，2）确保样品的即时定影成像的过程中，3）对齐的区域并在现场和定影图像的兴趣映射固定货物和马达来移动kymographs为同一图像时，以及4）精确地确定货物和马达荧光泪点，以确定货物和马达蛋白质之间的共定位的量的XY坐标。
而这个协议是唯一适合于分析在微流体装置中生长的神经元的均匀组织的轴突运输的特点，它可以适用于广泛的研究课题。例如，本APPLICA灰可用于与他们参与内型/胞吐适配器表征囊泡的关联（ 例如，在成纤维细胞中贩卖测定法），或微管标记的微管+尖端结合蛋白的生长。对于这些，微流体器件可以通过网格盖玻片被取代，以方便必要的相关活细胞成像和固定成像研究的本土化。该协议也可以用于细胞事件的量在时间上的参数的变化取决于特定的细胞环境表征。例如，从个体内体结构的荧光标记的病毒蛋白的释放到细胞质中可以被关联以内含体蛋白的表达和/或关联。
此协议的一个可能限制是，高密度货物映射可能是困难的。然而，高斯函数的分配通过允许绕过这个问题在很大程度上区别在子像素级的荧光泪点之间的位置上的。此外，马达的轴索货物的映射是低通量：目前，映射可以为每个微流体装置2的轴突进行，给定神经元的转染使用的高倍率必需为高时的低速率和视场有限高分辨率成像与我们的相机。这种方法的未来发展可能包括使用慢病毒系统的转导的神经元具有更高的效率，从转基因小鼠中的神经元表达荧光标记的蛋白质或细胞器的小的荧光染料如Lysotracker或Mitotracker，所有这些都将增加标记的隔离轴突标记有荧光标记物的数目。此外，记录区域的大小是由倍率，像素尺寸和用于成像相机的像素阵列的尺寸的限制。在成像技术领域中目前的发展将允许更大的区域s到被成像在未来，因此增加了每个实验条件下获得的数据的量。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
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