Abstract
Forståelse af de mekanismer, som molekylære motorer koordinere deres aktiviteter, til at transportere vesikuløse laster inden neuroner kræver kvantitativ analyse af motor / cargo foreninger på enkelt vesikel niveau. Målet med denne protokol er at bruge kvantitativ fluorescensmikroskopi at korrelere ("kort") position og retningsbestemmelse bevægelighed for levende last til sammensætning og relative mængder af motorer, der er forbundet med den samme last. "Cargo mapping" består af levende billeddannelse af fluorescensmærkede ladninger bevæger sig i axoner dyrket på mikrofluidenheder, efterfulgt af kemisk fiksering under optagelse af levende bevægelse, og efterfølgende immunofluorescens (IF) farvning af de nøjagtige samme axonale regioner med antistoffer mod motorer. Colokalisering mellem laster og deres tilknyttede motorer vurderes ved at tildele sub-pixel position koordinater motordrevne og fragt kanaler, ved montering af Gauss funktioner diffraktion-ligrænset punkt spredning funktioner, der repræsenterer de enkelte fluorescerende punktkilder. Faste last- og motoriske billederne efterfølgende overlejret til plots af fragt bevægelse, at "kort" dem til deres sporede baner. Styrken ved denne protokol er kombinationen af levende og IF data til at optage både transport af vesikulære last i levende celler og til at bestemme motorerne forbundet til disse nøjagtig samme vesikler. Denne teknik overvinder tidligere udfordringer, der bruger biokemiske metoder til at bestemme den gennemsnitlige motor sammensætning af oprensede heterogene bulk-vesikel populationer, da disse metoder ikke afsløre kompositioner på enkelte bevægelige laster. Endvidere kan denne protokol tilpasses til analyse af andre transport- og / eller menneskehandel veje i andre celletyper at korrelere bevægelsen af individuelle intracellulære strukturer med deres proteinsammensætning. Begrænsninger i denne protokol er den relativt lille produktion på grund af lave transfektionseffektiviteter af dyrkedeprimære neuroner og et begrænset synsfelt til rådighed for høj opløsning billeddannelse. Fremtidige applikationer kan omfatte metoder til at øge antallet af neuroner, som udtrykker fluorescensmærkede ladninger.
Introduction
Intracellulær transport er afgørende i alle celletyper for levering af proteiner, membraner, organeller og signalmolekyler til forskellige cellulære domæner 1. Neuroner er højt specialiserede celler med lange, polariserede fremskrivninger, der kritisk afhængige af intracellulær transport af væsentlige laster for deres lange afstande levering til forskellige axonale mikrodomæner. Denne transport er medieret af kinesiner og dyneins - to store familier af molekylære motoriske proteiner - som binder til fragter og spore langs polariserede mikrotubuli i anterograd og retrograd retninger, hhv. Mens retrograd bevægelse primært medieres af dynein er bevægelse i anterograd retning lettes af en stor, funktionelt forskelligartet familie af kinesin motorer. Derfor kan anterograd transport af axonal ladninger medieres af forskellige familiemedlemmer kinesin superfamilien 1-5. Selvom nogle ladninger bevæger sig konstant i begge retninger, mOst ladninger bevæger sig i to retninger og vende ofte på deres vej til deres endelige destinationer 1,5-13. Endvidere er det blevet påvist, at motorer modstående retningsvirkning associeret samtidigt til laster, hvilket rejser spørgsmålet om, hvordan reguleret bevægelse af laster koordineres af modsat polaritet motorer 5-7. Sammen transport af axonale laster er en samordnet proces, der er reguleret af sammensætningen af motorer og deres specifikke biokemiske aktiviteter, der igen er afhængig af forskellige adaptere og reguleringsmæssige bindingspartnerne 14.
Trofast beskrive den mekanisme af axonal transport til en bestemt last og for at afdække den underliggende regulering af denne transport, er det altafgørende at bestemme sammensætningen af motordrevne proteiner og deres regulerende bindingspartnere forbundet med individuelle laster under deres live-transport. Andre metoder, for eksempel biokemiske metoder, give skøn over gennemsnittet moteller kompositioner på oprensede heterogene vesikel populationer, men disse skøn afslører ikke typen eller mængden af motorer, der er forbundet til enkelte bevægelige vesikler. Også rekonstituering af vesikel transport langs formonterede mikrotubuli in vitro aktiveret måling af mængden af en type motor på en enkelt vesikel niveau 15. Men disse forsøg ikke direkte korrelerer mængden af motorer med transport- karakteristika af disse vesikler og målt transport i fravær af cellulære regulatoriske faktorer.
Præsenteres her En protokol, der bestemmer motorens sammensætning (type og relative mængde af motorer) af individuelle bevægelige vesikler fra immunofluorescens (IF) data, der måler endogent udtrykte motoriske proteiner og korrelerer disse parametre til transport af levende nøjagtig samme vesikler i neuroner 16. Denne metode indebærer præcis kortlægning af IF-til-live fragt bevægelse data. Dette opnås ved growing hippocampus mus neuroner i mikrofluidenheder følgende etablerede protokoller 17-19. Disse enheder giver mulighed for at identificere og korrelation ("mapping") af axoner og enlige bevægelige laster i faste og levende lys mikroskopi modaliteter (figur 1). Dyrkede neuroner transficeres med fluorescensmærkede lastproteiner hvis transport afbildes ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning for at få detaljerede oplysninger, som er afbildet i kymographs bevægelse. Under billeddannelse neuroner fikseret med paraformaldehyd og efterfølgende farvet med antistoffer mod endogene motordrevne proteiner. Faste last- og motoriske billeder overlejret på levende bevægelse kymographs til "kort" (colocalize) dem til live fragt bevægelsesbaner 16. At korrelere levende bevægelse af ladninger med Sammenslutningen af motordrevne proteiner er colokalisering analyseres ved hjælp af en skræddersyet MATLAB software pakke kaldet "Motor colokalisering "16,20. Fluorescensmærkede laster og motorer generere diffraktionsbegrænset punktformig funktioner, der kan delvist overlapper hinanden. For at løse den position af overlappende puncta softwaren først passer automatisk Gauss funktioner til hver punktspredningsfunktionen, der repræsenterer de enkelte fluorescerende puncta, at bestemme deres præcise XY sub-pixel position koordinerer og intensitet amplituder 21-23. Positionerne af motorer og laster er derefter i forhold til hinanden for at afgøre colokalisering 16,20. Derfor er denne metode mere præcist tildeler colokalisering mellem fluorescerende puncta i forhold til andre metoder 24.
Styrken ved denne metode er evnen til at vurdere colokalisering af motorer med individuel last i fikserede celler, som levende bevægelsesbaner (f.eks, i hvilken retning de bevægede sig på tidspunktet for fiksering) har været recbestilte. Med denne metode blev kinesiner og dyneins fundet at associere samtidigt til vesikler, der bærer den normale prionprotein (PrP C -cellular), et neuronalt beriget last, der bevæger sig bidirektionalt eller forbliver stationært i axoner 16. Denne analyse tillod formulering af en arbejdsgruppe model for regulering af PrP C vesikel bevægelse, hvor anterograd (kinesin) og retrograd (dynein) motorer koordinere deres aktiviteter med henblik på at flytte vesiklerne i begge retninger eller at forblive stationær, mens forbundet til lasten . En anden styrke ved denne metode er dens potentielle brede anvendelighed til karakterisering colokalisering / sammenslutning af mange fluorescensmærkede laster, der bevæger sig i stort set enhver celletype, med andre protein (r) af interesse. Således kunne levende / fast korrelation potentielt give til påvisning af forbigående protein-cargo interaktioner, kan så mange individuelle fluorescensmærkede bevægelige partikler analyseres over et ønsket period af tid. I betragtning af den brede anvendelighed og den type spørgsmål, som denne metode kan adresse, vil denne protokol være af interesse for et bredt publikum af cellebiologer herunder dem, der studerer handel og transport i neuroner eller i andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført efter godkendte protokoller og i henhold til de institutionelle retningslinjer for human pleje af forsøgsdyr. Nyfødte mus blev aflivet ved halshugning.
1. Fremstilling af mikrofluidenheder for Cell Culture
- Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluide anordninger til vækst i hippocampale neuroner, som beskrevet af Harris og kolleger 17-19. Nedenfor er nogle ændringer, der blev tilpasset til lasten kortlægning protokollen.
BEMÆRK: Mikrofluid enheder er også kommercielt tilgængelige (Materials List), således adgang til en fabrikation facilitet er ikke nødvendig. - Forbered No. 1½ dækglas (24 x 40 mm) ved at vaske dem tre gange med acetone, efterfulgt af tre vaske med 100% ethanol og tre vaske med vand. Store dækglas i vand ved 4 ° C indtil anvendelse. Disse behandlinger hjælpe med at sikre, at dækglas er rene fra snavs, der kan interferere med plettering af cells, kontaminering og overlevelse.
BEMÆRK: Acetone og ethanol er brandfarligt og farligt i tilfælde af af hudkontakt (lokalirriterende), ved kontakt med øjne (lokalirriterende), fra indtagelse, fra indånding. Fjernes i overensstemmelse med myndighedernes forskrifter. - Når du er klar til at bruge, placere et dækglas i en 60 mm celledyrkningsskål per mikrofluid enheden, og lad det lufttørre udækket i 45 minutter inde i et biosikkerhed kabinet for at undgå forurening.
- Efter enheder er skåret ud fra mestre og stemplerne er blevet skåret til at skabe reservoirerne (figur 1A, B), placere dem med mikrofluidkanaler side inde i en biosikkerhed kabinet udstyret med en UV-lampe i 45 minutter til sterilisering.
BEMÆRK: Leaving udstyr under UV-behandling i længere tid end 2 timer kan påvirke integriteten af PDMS. - Saml enheder ved at placere en enhed på hver dækglas inde i 60 mm plast celledyrkningsskål så mikrofluidkanaler nedad. Påfør let tryk på toppen of enheden (undgå at røre mikrokanalerne) for at tilvejebringe en ikke-permanent forsegling af enheden til dækglasset. Dæk hver 60 mm cellekultur skål med låg.
- Ved hjælp af en mikropipette, hydrat enhederne ved tilsætning cellekulturkvalitet vand til de to øverste mikrofluide reservoirer (1 og 2 i figur 1A), lader vand strømme igennem. Fjerne vand med en mikropipette og der tilsættes 1 mg / ml poly-L-lysin i mikrofluid reservoir 1 (200 pi) og 2 (100 pi). Volumen forskellen vil muliggøre poly-L-lysin til at strømme gennem mikrokanalerne (figur 1A, B).
- At sikre, at udstyret inde i cellekulturskåle 60 mm ikke vælte inde i en 37 ° C inkubator, placere tre 60 mm cellekultur skåle indeholdende enhederne i et 150 mm plast celledyrkningsskål og dække skålen med et låg. Inkuber O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Typisk mere end 90% af kanalerne er anvendelige per enhed og gøreikke indeholder nogen luftbobler eller fysisk blokering.
- Den næste dag udskiftes poly-L-lysin med vand og forlade indretningen i inkubator i mindst 1 time. Gentag denne vask tre gange. Fjernelse af vand og tilføje Neurobasal-A vækstmedium (indeholdende 2% B-27 supplement og 500 uM GlutaMAX) til hver enhed. Lad O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- Den næste dag, plade hippocampale celler som beskrevet nedenfor.
2. Belægning af Mouse Hippocampal Primary neuroner i mikrofluidenheder
BEMÆRK: forberedelse af dyrkede hippocampusneuroner fra nyfødte rotter har tidligere været offentliggjort i JOVE 25. Nedenfor er nogle ændringer, der blev tilpasset til plade mus hippocampusneuroner i mikrofluidenheder, og der var optimal for transfektioner.
- Før musehjerne dissektion, pre-varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum(FBS; uden antibiotika), Blanding A (125 mg DL-cystein, 125 mg bovint serumalbumin (BSA) og 3,125 g af D-glucose i 500 ml phosphatbufret saltvand (PBS), filter steriliseres gennem et 0,22 um filter) og deoxyribonuklease I-opløsning (DNase I: 50 mg DNase I og 0,5 ml af en 1,2 M MgSO4-opløsning i 100 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) filter steriliseres gennem et 0,22 um filter) i et 37 ° C vandbad.
- Pre-varm Neurobasal-A vækstmedium i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 for at udligne pH.
- Dissekere hippocampi 1-3 dage gamle nyfødte mus i henhold til etablerede protokoller 26. Hold hippocampi i et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml dissektion buffer (HBSS indeholdende 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glucose, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin), på is. Sætte op til 4 hippocampi per 15 ml konisk rør.
- Udfør resterende protokol er under sterile betingelsers inde i en biosikkerhed kabinet.
- Fortynd 45 enheder af papain i 5 ml af en blanding A, vortex, og der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C, indtil papain pulveret er opløst. Tilsæt 1 ml DNase I-opløsning. Filtrer blandingen gennem et 0,22 um sprøjtefilter enhed.
- Omhyggeligt aspireres HBSS "fra 15 ml koniske rør indeholdende hippocampus. Tilsæt 10 ml kold (4 ° C) HBSS til hippocampi og lade dem sedimentere til bunden af røret. Aspirere forsigtigt HBSS fra 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 1 ml papain / DNase I blandes op til 4 hippocampi og inkuberes i 20-30 min ved 37 ° C. Vip konisk rør hver 5 min at bade hippocampi med mix. Alternativt placere hippocampi i et 37 ° C vandbad shaker med forsigtig omrystning (~ 100 rpm).
- Aspirat papain / DNase I blandes og vaskes hippocampi to gange med forvarmet DMEM (37 ° C) indeholdende 10% FBS.
- Efter anden vask, tilsættes 2 ml forvarmet DMEM indeholdende 10% FBS til hippocampi og manuelt triturat hippocampi ved pipetteringop og ned ~ 10-12 gange med en 1 ml pipettespids at adskille neuroner.
- Lad triturat nøjes med ~ 1 min, da dette vil gøre det muligt for ikke-dissocierede neuroner til at sedimentere til bunden af den koniske rør. Overfør supernatanten indeholdende dissocierede neuroner til en ny 15 ml konisk rør undgå overførsel af større væv, der er fast i bunden af røret.
- Spin celler ved 1.000 xg i 2 min og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre cellepelleten. Resuspendér celler i 80 pi Neurobasal-A vækstmedium ved pipettering forsigtigt.
- Fjern mediet fra mikrofluid reservoir 1 og 1 '. Anvend 20 pi celler (~ 275.000) til mikrofluid reservoir 1, og tillade dem at flyde igennem. Placere enheden på 37 ° C inkubator med 5% CO 2 for 20 min.
- Kig under mikroskop for at sikre, at cellerne er klæbet til dækglasset. Tilføj Neurobasal-A vækstmedium til toppen off alle reservoirer. Returnere enheden med celler til en 37 ° C inkubator med 5% CO
- Tjek enheder, hver ~ 2-3 dage og top fra reservoirer med Neurobasal-A indeholdende 2% B-27 supplement (uden GlutaMAX) for at undgå fordampning. Neuroner begynder at udvide deres axoner gennem mikrofluidkanaler ~ 2-3 dage efter udpladning. Subject neuroner transfektion typisk 7-10 dage efter udpladning.
3. Transfektion af hippocampusneuroner Grown i mikrovæskeanordning
- Per device, forberede en blanding af 1,2 pi Lipofectamine 2000 30 pi Neurobasal-A, og en blanding af 0,5 ug fluorescerende last fusion plasmid i 30 pi Neurobasal-A og inkuberes 5 minutter ved stuetemperatur. Tilføj Lipofectamine mix til DNA-blandingen og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Tilføj 60 pi Neurobasal-A, der indeholder 4% B-27 supplement til DNA / lipofectamin mix og bland ved at knipse røret.
- Fjern alle medier fra mikrofluid reservoir 2 og 2 'og omhyggeligt fylde brøndene med Neurobasal-A indeholdende 2% B-27 supplement uden at spilde på mellemlang into de andre rum.
- Fjern medier fra mikrofluid reservoir 1 og 1 '. Tilføj 120 pi DNA / Lipofectamine mix til mikrofluid reservoir 1 og lad det strømme. Returnere enheden til 37 ° C inkubator med 5% CO 2 for 3-4 timer.
- Fjern alle medier fra mikrofluid reservoir 1 og 1 'og erstat med Neurobasal-A indeholdende 2% B-27 supplement for 24 timer (eller indtil den er klar til billedet). Typisk 5-7 axoner, der vokser gennem microchannels transficeret under disse betingelser, som tegner sig for ca. 1-3% transfektionseffektivitet overensstemmelse med effektivitetsgevinster offentliggøres for hippocampus dyrkede celler 26.
4. "Cargo mapping" Analyser
- Live-Imaging af fragt bevægelse
- Udfør billeddannelse på en omvendt epifluorescens lysmikroskop udstyret med en 37 ° C inkubator og en CO 2 styrekammer.
- Montere dækglasset med hippocampale neuroner dyrket i et MICRofluidic enheden til mikroskopbordet. For at undgå neuronal død, arbejde hurtigt for at opbevare prøverne ved mikroskopet længere end 1 time.
- Ved hjælp af en høj opløsning mål (100X), find axoner af transficerede celler, der strækker sig gennem kanaler af mikrofluide kamre og registrere antallet af kanaler, hvor den transficerede Axon blev fundet. Tæl antallet af kanaler ved hjælp af en hånd taelleinstrument.
- For optimal optagelse af levende bevægelse og efterfølgende colokalisering analyse vælge axoner, der vokser relativt flade gennem kanaler, så billeddannelse af de fleste vesikler kan udføres i fokus.
- Fjerne det meste af medium fra reservoirerne 2 og 2 'med en 1 ml plastik transfer pipette. For at lette den efterfølgende tilpasning af faste billeder med bevægelse baner på kymographs, justere den højre kant af mikrokanalerne med synsfelt under billedbehandling (figur 1B, C).
- For at lette Fixing af prøverne under billedbehandling, optræde live billeddannelse med to personer. Alternativt, hvis levende billeddannelse udføres af en enkelt person, skal du bruge et mikroskop, der er udstyret med afdrift korrektion.
- Start imaging levende last bevægelse med time-lapse specifikationer specifikke for transportsektoren dynamik last, der analyseres (mikroskop specifikationer og indstillinger for billeddannelse YFP-PrP C er specificeret i legenden i figur 2 og Materialer liste).
- Når der er indsamlet levende bevægelse tilstrækkelige data, har én person fylde reservoirerne 2 og 2 'med forvarmet 4% paraformaldehyd i PBS indeholdende 0,04 g / ml saccharose fikseres cellerne. Undgå at røre ved mikrofluid enheden, da dette vil forstyrre fokus i direkte billedvisning. Har den anden person justere fokus, mens tilsættes fiksativ. Fiksering er vellykket, når øjeblikkelig stop af bevægelse overholdes. Tilføj fiksativ til reservoiret 1 og 1 'bagefter.
BEMÆRK: Midlertidig photobleaChing af lasten fluorescens kan også observeres, men fluorescens fortsætter efter IF farvning for motoriske proteiner er afsluttet (næste trin).
BEMÆRK: Paraformaldehyd er skadeligt ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse. Irriterer øjnene, åndedrætsorganerne og huden. Fjernes i overensstemmelse med myndighedernes forskrifter.
- HVIS farvning af motoriske proteiner til colokalisering analyse
BEMÆRK: kvantificering af relative niveauer af motordrevne proteiner (som bestemt ved hjælp af antistof-farvning), der er forbundet til de enkelte bevægelige laster, validere og titreres antistoffer at sikre, at antistof-antigen-binding er mættet. Dette gøres ved at bestemme specificiteten af antistoffet ved hjælp af neuroner, hvor proteinet af interesse er blevet enten bankede-out eller slået ned, og ved at udføre IF analyse med stigende antistofkoncentrationer. For negative kontroller, er neuroner farves med sekundære antistoffer i fravær af primære antistoffer. Mere detaljeretfindes beskrivelse af antistof validering Encalada et al. 16 og Szpankowski et al. 20.- Fjern dækglasset med hippocampusneuroner dyrket i mikrovæskeanordning fra mikroskopbordet. Tag ikke mikrofluidanordning fra dækglasset, som mikrokanalerne nødt til at forblive intakt for at overlejre levende og faste billeder. Udfør følgende trin i et fugtigt kammer.
- At sikre strømmen af løsninger i mikrokanalerne, vedligeholde stoedpudevolumen forskellen mellem reservoirerne 1, 1 'og 2, 2' på mindst 30 pi. i alle efterfølgende trin. For eksempel tilsættes 100 pi medier volumen til mikrofluid reservoir 2, 2 ', og 70 pi medier volumen til mikrofluid reservoir 1, 1'.
- Fjern fiksativ fra kamre i mikrofluidapparatet og vaske cellerne tre gange med PBS venter 10 min mellem vaskene.
- Permeabilisere celler ved tilsætning af 0,1% Triton X-100 Diluted i PBS i 5 min til alle reservoirer.
- Fjern løsning fra alle reservoirer og vask med PBS. Gentag vask tre gange venter 10 min mellem hver vask.
- Fjerne opløsning fra alle reservoirer og anvende blokerende buffer indeholdende 10% Normal Donkey Serum og 3% protease fri og immunoglobulin G (IgG) -fri BSA i PBS og inkuberes i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
- Spin primært antistof stamopløsning ved 20.000 xg i 5 minutter til fjernelse af bundfald. Fortyndet antistof til en passende koncentration i blokeringsbuffer. Erstatte den blokerende buffer fra mikrovæskeanordning med antistof opløsning. Inkuber prøverne i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C.
- Fjern løsning fra alle reservoirer og vaskes tre gange med PBS, venter 10 min mellem hver vask.
- Spin sekundært antistof stamopløsning ved 20.000 xg i 5 minutter til fjernelse af bundfald. Fortyndet antistof til en passende koncentration i blokeringsbuffer. Erstatte PBS med sekundært antistof opløsning. Inkuberprøver i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern løsning fra alle reservoirer og vaskes tre gange med PBS, venter 10 min mellem hver vask.
- Erstatte PBS med ~ 10-20 pi mounting medium ved direkte pipettering mounting medium i åbningen af kanaler, der forbinder reservoirerne. Lad montering tørt medie for ~ 20 min - 1 time ved stuetemperatur.
- Store enheder på 4 ° C beskyttet mod lys for at undgå fotoblegning og billedfiler axoner inden for to dage (højst en uge) for farvning.
- Efter farvningen er afsluttet, monteres dækglas med hippocampusneuroner dyrket i mikrovæskeanordning på mikroskop scenen. Lokalisere den region af det transficerede axon afbildet i trin 4.1.1-4.1.7.
- Erhverve Z-stack billeder (300 nm trin) for hver af de tre kanaler: fragt, motor 1, motor 2 ved hjælp af en høj opløsning mål (f.eks, en høj numerisk apertur olie eller vand mål).
BEMÆRK: Køb af Z-stacks er vigtigt, da axoner ofte ikke vokser helt fladmikrokanaler og derfor ikke alle fluorescerende puncta er i samme fokale plan.
- Cargo Mapping
- Generer en kymograph af fragt bevægelse anvendelse af billedanalyse software. Den ImageJ plugin udviklet af Rietdorf og Seitz (EMBL) anbefales til at generere kymographs (til download se Materialer List).
BEMÆRK: ImageJ er et offentligt domæne, Java-baserede billedbehandling program udviklet på National Institutes of Health 27,28 (for download se Materialer List). - Juster faste billeder af fluorescerende fragt (frembragt i trin 4.2.14) manuelt ved at overlejre dem på positionen af baner i kymograph ved punktet for fiksering (figur 2A, B) ved hjælp af en kommercielt tilgængelig grafer software program (Materialer List). Ensrette manuelt ved først at overlejre den faste last billede på kymograph og manuelt vælge lasten puncta, der svarer til en bestemt bane påden kymograph. For de bedste alignment resultater ved at bruge Z skive, der er i bedst fokus for lasten kortlagt. Flere Z skiver kan anvendes.
- For hvert billede i Z-stack (fragt, motor 1 og motor 2 frembragt i trin 4.2.14) bestemme XY koordinater og intensitet amplituder for hver fluorescerende puncta ved anvendelse af en etableret algoritme til at passe 2D Gaussians til punktspredningsfunktionen der repræsenterer hver punktkilde i hver af de tre kanaler 16,20,21 (figur 2D).
BEMÆRK: For at opnå XY koordinater, en specialbygget MATLAB softwarepakke kaldet "Motor colokalisering" er udviklet 16,20, som inkorporerer en gaussisk fitting algoritme udviklet af Jaqaman, Danuser og kolleger 21-23. Softwarepakken og detaljerede anvisninger for dens anvendelse kan rekvireres. - For hver af de individuelt fragt puncta der blev afbildet på de mobile eller stationære baner på kymograph vælge than XY koordinater og intensitet amplituder fra resultaterne af "Motor colokalisering" program (disse ladninger er individuelt mærket i figur 2B). Brug flere Z-stack billeder optaget i trin 4.2.14) at kortlægge flere laster, der findes på forskellige fokusplaner.
- Sammenligne den enkelte XY koordinater for det kortlagte fragt til dem, der opnås for hver af de motoriske kanaler i den tilsvarende Z skive (figur 2D). Bestemme og vælge XY motordrevne koordinater ligger inden for en 300 nm radius af lasten. For laster og motorer, der har signal inden for samme fokusplan, bruge "Motor colokalisering" software-pakke til at bestemme puncta der ligger inden for en 300 nm radius.
- Generer en kymograph af fragt bevægelse anvendelse af billedanalyse software. Den ImageJ plugin udviklet af Rietdorf og Seitz (EMBL) anbefales til at generere kymographs (til download se Materialer List).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en oversigt over mikrofluidapparatet anvendes til dyrkning af hippocampus-neuroner (figur 1A, B). Neuroner udplades i reservoiret 1. Størrelsen af mikrokanaler forhindrer diffusion af cellelegemer (soma) i axonal rum mens længden af kanalerne forhindrer dendritiske fremspring krydse hele vejen til axonal rum. Efter ~ 2-3 dage i kultur, begynder neuroner udvide deres axoner tværs mikrokanaler i axonal rum (figur 1B, C). Transficerede axoner udtrykker normal prion protein mærket med gult fluorescerende protein (YFP-PrP C) kan identificeres ved hjælp af fluorescens mikroskopi (figur 1C). Ekspression af fluorescensmærkede proteiner ved anvendelse af plasmid transfektion bør kontrolleres for korrekt subcellulær lokalisering og funktion som overekspression kunne indføre eksperimentelle artefakter på grund af ændrede protein konformationer. Således colocalization eksperimenter bør suppleres med både biokemiske co-udfældning undersøgelser samt med IF farvning for endogent udtrykte proteiner. Opførslen af YFP-PrP C anvendes her blev testet tidligere 16. Ekspression af YFP-PrP C i forbigående transficerede neuroblastomceller (N2A) var lav, hvilket antyder, at forbigående transfektion ikke resulterer i stærkt overudtrykt YFP-PrP C-niveauer 16. Desuden, hvis af N2A-celler transficeret med YFP-PrP C ved anvendelse af antistoffer mod PrP C viste, at YFP-PrP C stærkt colocalized med endogent PrP C, hvilket tyder på, at både transficerede og endogent PrP C opførte sig på samme måde. At konstatere, at PrP C er forbundet med motorer, blev vesikelpartikler immunoisolations udført 16.
For optimale fragt kortlægningsundersøgelser er den højre kant af mikrokanalerne linie med synsfeltet i løbet af levende og faste imaging for at afbilde samme region af axon (angivet med en rød rektangel i figur 1B, C). Figur 2 og Figur 3 viser repræsentative resultater af lasten mapping analyser af neuroner transient transficeret med YFP-PrP C. Vesikler bærer YFP-PrP C transporteres i mammale axoner af medlemmer af kinesin-1 familie og dynein Heavy Chain 1 (DYNC1H1) 16, blev derfor YFP-PrP C vesikler kortlagt til kinesin-1 subunit kinesin Light Chain 1 (KLC1) og at DYNC1H1 motorer. YFP-PrP C vesikel bevægelse blev afbildet og afbildet i en kymograph (figur 2A). I kymographs er anterograd og retrograd bevægelse af YFP-PrP C vesikler repræsenteret ved baner med negative og positive skråninger, henholdsvis og stationære blærer er afbildet med lodrette baner. Ved fiksering, stoppede al bevægelse angivet ved fraværet af diagonale linjer i kymograph(Figur 2A). IF signalet af molekylære motorer og laster i faste, permeabiliserede axoner er punktformet 16 (figur 2B, C). Målet med "cargo mapping" er at afgøre, om puncta i bagagerummet kanalen (figur 2B) colocalize med motor puncta (figur 2C) i de to andre kanaler. For at gøre dette, blev fluorescerende billeder af faste YFP-PrP C vesikler, og IF billeder af tilsvarende KLC1 og DYNC1H1 associeret med vesikulær puncta tilpasset til kymograph (figur 2B, C). Gauss funktioner blev monteret punkt spredes funktioner fluorescerende punktkilder i alle tre kanaler for at kortlægge de præcise XY positioner af motorer med fragt baner opnået ved billeddannelse (figur 2D). Endogent udtrykt KLC1 og DYNC1H1 motorer vises som punktvis farvning og colocalized differentielt med YFP-PrP C vesikler (Figur 2D). Colocalining blev defineret ved tilstedeværelsen af YFP-PrP C og motor puncta inden for en afstand på 300 nm og kvantificeres ved niveauet for co-lokalisering af Gauss XY koordinere positioner mellem YFP-PrP C og hver af de KLC1 og DYNC1H1 puncta (figur 3A ). Denne afstand blev valgt baseret på optik, diffraktionsgrænsen af lys, og de relevante fysiske størrelse af last- og motoriske subunits. Den relative mængde af KLC1 og DYNC1H1 forbundet med YFP-PrP C vesikler blev opnået fra Gauss amplituder, som repræsenterer intensiteten af hver puncta (figur 3B). Disse data kan analyseres yderligere som ønsket. For eksempel intensiteter af motorer colocalizing med YFP-PrP C puncta mellem kontrol (vildtype - WT) neuroner og de mangler andre kinesin-1-underenheder (KIF5C - / - neuroner i figur 3A KIF5C er medlem af kinesin-1 familien), kan sammenlignes for at bestemme om fraværet af KIF5C forstyrrer sammenslutning af KLC1 og / eller DYNC1H1 til YFP-PrP C vesikler (KLC1 og DYNC1H1 intensiteter var uændrede i vores eksperimenter 16). Desuden kan KLC1 og DYNC1H1 intensiteter plottes at granske mulige sammenhænge mellem relative motoriske beløb og retningsbestemmelse af bevægelse (figur 3B). For eksempel, at YFP-PrP C vesikler bevæger sig, og / eller stationært forbundet med både KLC1 og / eller DYNC1H1 (figur 3B).
Figur 1. Hippocampale neuroner dyrket i mikrofluide anordninger. (A) Billede af en mikrofluidapparatet. Konturerne af reservoirer visualiseres ved røde og blå farvestoffer. Nummereringen refererer til antallet af mikrofluide reservoirer anvendes i hele protokollen. (B) Diagram af en mikrofluidapparatet. Numre svarer til reservoirer in, hvilke medier og neuroner tilsættes. Transficerede neuroner er vist med grønt. Rødt rektangel og røde stiplede pile angiver regionen anbefales til levende og fast fluorescensimagografi. (C) Billede af to axoner transficeret med YFP-PrP C vokser gennem en enkelt mikrokanal (én mikrokanal og kant af den enhed er skitseret med stiplede hvide linjer) . Individuelt bevægelige YFP-PrP C vesikler kan skelnes som lysere puncta. Scale bar er 10 um. Figur er tilpasset fra:.. Encalada et al 16 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. "Cargo mapping" at korrelere YFP-PrP C vesikel transport medrelative mængder af kinesin og dynein motorer. Wide-field fluorescensbilleder af levende bevægelse og af faste ladninger blev taget på et omvendt mikroskop er udstyret med et motoriseret scene og en CCD-kamera og en 100X / 1,4 NA objektiv olie. (A) Kymograph af YFP -PrP C vesikel bevægelse af axoner vist i figur 1C. Levende bevægelse blev registreret i et samlet tidsrum i området fra 30 til 60 sek ved 100 ms eksponering (10 Hz). Cellerne blev fikseret efter billeddannelse last bevægelse i mindst 15 sek. Den stiplede linie angiver tidspunktet for fiksering under direkte billedvisning. Rød boks viser region af vesikler fremhævet i (B og C) og udvidet i (D). Pilespidser peger på tre vesikler er vist i (D) svarende til stationær (blå), retrograd (rød), og anterograd (grøn) baner. ( B) Billede af faste YFP-PrP C vesikler tilpasset til den tilsvarende kymograph. Tal indikerer iindividuel YFP-PrP C vesikler, der blev kortlagt identificerbare puncta på kymograph. Anterograd vesikler er grønne, retrograd er rød, og stationære dem er blå. (C) Fast IF billeder af KLC1 og DYNC1H1 puncta svarende til den samme region er vist i (B). Scale bar (AC) er 10 um. (D) Udvidelse af fast IF-signaler af hver af de tre kanaler med 2D Gaussisk funktion opgaver. Blå prikker repræsenterer lokale intensitet maxima pixels, røde prikker repræsenterer Gauss passer, og lyserøde prikker er overlapningen mellem de to. Pilespidser angiver eksempler på YFP-PrP C vesikler vist i (A) og spændet colokalisering med KLC1 og DYNC1H1 motoriske proteiner. Scale bar er 2 um. Figur er tilpasset fra:.. Encalada et al 16 Klik her for at se en større udgave af th er figur.
Figur 3. Kvantitative analyser af "cargo mapping" af YFP-PrP C vesikler. (A) Kvantificering af co-lokalisering mellem YFP-PrP C vesikler, KLC1 og DYNC1H1 i WT og KIF5C knockout neuroner (KIF5C - / -). Samlede antal puncta analyseret var N WT = 887 og N KIF5C - / -. = 1629 16 Numbers inde søjler repræsenterer antallet af vesikler per kategori. Vist er gennemsnit ± SEM. Ikke-parametrisk permutation t-test blev anvendt til sammenligning mellem genotyper 29. (B) Korrelation af relative motor sammensætning og retningsbestemt bevægelse i WT neuroner data analyseres i (A). Figur er tilpasset fra: Encalada et al 16...jove.com / files / ftp_upload / 52.029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her giver korrelationen af retningen af bevægelse af enkelte fluorescerende mikrotubulus-baserede flytte gods partikler med den relative type og mængde af de tilknyttede motordrevne proteiner i levende neuroner. Tidligere blev den samlede motor sammensætningen af axonale vesikuløse laster analyseret på heterogene populationer af biokemisk rensede vesikler og organeller 9,15. Imidlertid har karakteriserer motor sammensætning til en enkelt type gods i celler været udfordrende, fordi det er vanskeligt at oprense homogene vesikel befolkninger. Selv målinger af motorstop-kræfter forudsat estimater af aktive motoriske tal i Drosophila embryoner, var det uklart, om retningen af bevægelse korreleret til motorer bliver stabilt bundet til fragter eller den hurtige forening / dissociation af aktive motorer til / fra lasten 12. Derfor er "last mapping" protokol descriseng her blev udviklet til at undersøge sammenhængen mellem type og relative antal af motorer, der er forbundet til individuelt at flytte gods i levende neuroner yderligere.
For med held at indhente data fra "cargo mapping" er det vigtigt at 1) udføre billeddannelse af fragt bevægelse og faste IF'er ved en høj tidslig og rumlig opløsning, 2) sikre øjeblikkelig fiksering af prøven i løbet af billeddannelse, 3) tilpasse regionen interesse i levende og faste billeder, og kortlægge fast fragt og motorer til bevægelse kymographs for de samme billeder, og 4) præcist at bestemme XY koordinater af last og motor fluorescerende puncta for at bestemme mængden af colokalisering mellem last- og motoriske proteiner.
Mens denne protokol er unikt egnet til at analysere transport karakteristika ensartet organiserede axoner af neuroner, der dyrkes i mikrofluidenheder, kan det tilpasses til en bred vifte af forskningsspørgsmål. For eksempel er dette ansøgning kan anvendes til at karakterisere sammenslutning af vesikler med deres adaptere involveret i endo / exocytose (fx assays trafficking i fibroblaster) eller væksten af mikrotubuli mærket med mikrotubuli + tip proteiner. For disse kunne mikrofluidenheder erstattes af kvadratnet dækglas for at lette lokaliseringen af afbildede celler, der er nødvendige for korrelative levende og faste billeddiagnostiske undersøgelser. Denne protokol kan også anvendes til at karakterisere cellulære begivenheder, som en parameter ændringer i tid afhængigt af den specifikke cellulære miljø. For eksempel kunne frigivelsen af en fluorescens-mærket viralt protein fra individuelle endosomale strukturer i cytoplasmaet være korreleret med ekspressionen og / eller sammenslutning af endosomale proteiner.
En mulig begrænsning af denne protokol er, at kortlægning af ladninger med høj massefylde kan være svært. Men overdragelse af Gauss funktioner omgår dette problem i høj grad ved at tilladeskelnen af positioner mellem fluorescerende puncta på sub-pixel-niveau. Desuden kortlægning af motorer til axonale laster er lav-throughput: I øjeblikket kan kortlægning gøres for 2 axoner pr mikrovæskeanordning grund af den lave sats for transfektion af neuroner og den begrænsede synsfelt, når du bruger høj forstørrelse er nødvendig for høj- opløsning billeddannelse med vores kamera. Fremtidige udvikling af denne fremgangsmåde kan omfatte anvendelsen af lentivirale systemer til at transducere neuroner med højere effektivitet, isolering af neuroner fra transgene mus, der udtrykker fluorescerende mærkede proteiner eller mærkning af organeller med små fluorescerende farvestoffer, såsom lysoTracker eller Mitotracker, som alle vil øge antallet af axoner mærket med fluorescerende markører. Endvidere er størrelsen af den registrerede område begrænset af forstørrelsen pixel størrelse og størrelsen af pixels i kameraet anvendes til billeddannelse. Igangværende udvikling inden for billeddannende teknikker vil give mulighed for større areals skal afbildes i fremtiden, og derfor øge mængden af data per eksperimentel betingelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
