Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

Published: October 30, 2014 doi: 10.3791/52029
Automatic Translation
1, *1, *2,3, 2,4, 1
1Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 3Department of Bioengineering, University of California San Diego, 4Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

הבנת המנגנונים שבאמצעותם מנועים מולקולריים לתאם את פעילותם להובלת מטענים בּוּעִי בתוך הנוירונים דורשת ניתוח כמותי של עמותות מנוע / מטען ברמת השלפוחית ​​אחת. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי כדי לתאם ("המפה") העמדה והכיווניות של תנועת מטענים בשידור חי לסכומי ההרכב ויחסיים של מנועים הקשורים לאותו מטען. "מיפוי מטענים" מורכב מהדמית חיה של מטענים שכותרתו fluorescently נעו באקסונים בתרבית על מכשירי microfluidic, ואחריו קיבעון כימי בזמן ההקלטה של ​​תנועה חיות, ומכתים immunofluorescence שלאחר מכן (IF) של אותו האזורים axonal המדויקים עם נוגדנים כנגד מנועים. Colocalization בין מטענים ומנועים הקשורים בם נבחנים על ידי הקצאת עמדה תת פיקסלים קואורדינטות ערוצי מנוע ומטען, על ידי פונקציות גאוס הולמים לעקיפה-ליפונקציות נקודת התפשטות mited מייצגות מקורות נקודות ניאון פרט. תמונות מטען ומנוע קבועים לאחר מכן הן על גבי לחלקות של תנועת מטענים, ל" המפה "אותם למסלולים במעקב שלהם. כוחו של פרוטוקול זה הוא השילוב של חיה ואם הנתונים לרשום גם את הובלת מטענים בּוּעִי בתאים חיים ולקבוע את מנועים הקשורים למדויקת אותו שלפוחית ​​אלה. טכניקה זו מתגברת על אתגרים קודמים שמשתמשים בשיטות ביוכימיות כדי לקבוע את הרכב המנוע הממוצע של אוכלוסיות שלפוחית ​​תפזורת מטוהרות הטרוגנית, שיטות אלה לא חושפות יצירות על מטענים מרגשים אחד. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לניתוח של מסלולי תחבורה ו / או סחר אחרים בסוגי תאים אחרים, כדי לקשר בין התנועה של מבנים תאיים בודדים עם הרכב החלבון שלהם. מגבלות של פרוטוקול זה הן התפוקה נמוכה יחסית בשל יעילות transfection הנמוכה של תרביתנוירונים עיקרי ושדה מוגבל של תצוגה זמינה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים עתידיים יכולים לכלול את שיטות כדי להגדיל את מספר תאי העצב להביע מטענים שכותרתו fluorescently.

Introduction

תחבורה תאית היא קריטית בכל סוגי התאים לאספקת חלבונים, ממברנות, האברונים, ומולקולות איתות לתחומים תאיים שונים 1. נוירונים הם מאוד מיוחדים תאים עם תחזיות ארוכות, מקוטבות שהאנושות תלויה בתחבורה תאית של מטענים חיוניים למסירה למרחקים ארוכים שלהם לmicrodomains axonal השונים. תחבורה זה מתווכת על ידי kinesins וdyneins - שתי משפחות גדולות של חלבוני מנוע מולקולריים - לאגד את זה למטענים ולעקוב אחר לאורך microtubules המקוטב בכיוונים אנטרוגרדית ומדרדר, בהתאמה. בעוד שתנועת מדרדר בעיקר בתיווכו של dynein, תנועה בכיוון אנטרוגרדית היא הקלה על ידי משפחה גדולה, פונקציונלי מגוונת של מנועים kinesin. כתוצאה מכך, תחבורת האנטרוגרד מטעני axonal יכולה להיות מתווכת על ידי בני משפחה שונים של kinesin superfamily 1-5. למרות שכמה מטענים לנוע בעקביות בכל כיוון, מ 'מטעני OST להעביר bidirectionally ולהפוך לעתים קרובות בדרכם ליעדים הסופיים שלהם 1,5-13. יתר על כן, הוכח שמנועים של מתנגד לקשר יווניות בו-זמנית למטענים, להעלות את השאלה, כיצד תנועה מוסדרת מטענים מתואמת על ידי מנועים הפוכה-קוטביות 5-7. יחד, הובלת מטעני axonal הוא תהליך מרוכז שמוסדר על ידי הרכב המנועים ופעילותם הספציפית ביוכימי, אשר בתורו תלויה במתאמים שונים ושותפים המחייבים רגולציה 14.

נאמנות לתאר את המנגנון של תחבורת axonal למטען ספציפי ולחשוף את תקנה הבסיסית של תחבורה ש, זה הוא בעל חשיבות עליונה כדי לקבוע את ההרכב של חלבוני מנוע והשותפים המחייבים הרגולציה שלהם הקשורים למטענים בודדים במהלך הובלת החיות שלהם. שיטות אחרות, לגישות ביוכימיות דוגמא, מספקות הערכות של mot הממוצעאו יצירות על אוכלוסיות הטרוגניות שלפוחית ​​מטוהרת, אבל הערכות אלה אינן חושפות את הסוג או סכומים של מנועים הקשורים לשלפוחית ​​נעה אחת. כמו כן, הכינון מחדש של תחבורת שלפוחית ​​לאורך microtubules מוצר המורכב מראש במבחנה אפשר מדידת הכמות של סוג אחד של מנוע ברמה שלפוחית ​​אחת 15. עם זאת, ניסויים אלה לא ישירות לתאם הסכום של מנועים עם מאפייני התחבורה של שלפוחית ​​אלה, ונמדדו תחבורה בהיעדר גורמים רגולטוריים סלולריים.

פרוטוקול מוצג כאן, הקובע את הרכב המנוע (סוג וכמות היחסית של מנועים) של שלפוחית ​​נעה בודדת מimmunofluorescence נתונים (IF) מדידה באופן אנדוגני הביעו חלבוני מנוע, וקושר פרמטרים אלה לתחבורה החי של בדיוק את אותו שלפוחית ​​בנוירונים 16. שיטה זו כרוכה במיפוי מדויק של נתוני תנועת מטעני IF-כדי-לחיות. המטרה זו מושגת על ידי צומחנוירונים בהיפוקמפוס עכבר g במכשירי microfluidic הבאים הוקמו פרוטוקולי 17-19. מכשירים אלה מאפשרים לזיהוי ולמתאם ("מיפוי") של אקסונים ומטענים מרגשים יחידים באופני מיקרוסקופ אור קבועים וחיים (איור 1). נוירונים בתרבית הם transfected עם חלבוני מטען שכותרתו fluorescently התחבורה שהוא צילם ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה כדי לקבל מידע מפורט תנועה שהוא להתוות kymographs. במהלך ההדמיה, הנוירונים קבועים עם paraformaldehyde, ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים כנגד חלבוני מנוע אנדוגני. תמונות מטען ומנוע קבועים על גבי זו kymographs תנועה החי ל" מפה "(colocalize) למטען החי תנועת מסלולי 16. לתאם את התנועה החי של מטענים עם העמותה של חלבוני מנוע, colocalization מנותח באמצעות חבילת תוכנת MATLAB מותאמת אישית שנעשה בשם "מוטור colocalization "16,20. מטענים ומנועים שכותרתו fluorescently ליצור תכונות punctate עקיפה מוגבל שיכולים באופן חלקי חפיפה. כדי לפתור את המצב של חפיפת puncta, התוכנה ראשונה באופן אוטומטי מתאימה פונקציות גאוס לכל פונקצית נקודת התפשטות, המייצג puncta ניאון פרט, כדי לקבוע העמדה תת פיקסלים XY המדויקת שלהם מתאם ועוצמת אמפליטודות 21-23. העמדות של מנועים ומטענים הן בהשוואה לאחר מכן לאחד את השני כדי לקבוע colocalization 16,20. לכן, שיטה זו מדויקת יותר מקצה colocalization בין puncta הניאון בהשוואה לשיטות אחרות 24.

כוחה של שיטה זו הוא היכולת להעריך את colocalization של מנועים עם מטען אישי בתאים קבועים, שלמסלולי תנועה חיים (למשל, לכיוון שבו הם נעים בזמן של קיבעון) היו recorded. בשיטה זו, kinesins וdyneins נמצאו לקשר בו-זמנית לשלפוחית ​​שנושא את חלבון הפריון הנורמלי (-cellular C PRP), מטען מועשר neuronally שזז bidirectionally או נשאר נייח באקסונים 16. ניתוח זה אפשר גיבוש מודל עבודה להסדרת תנועת שלפוחית ​​PRP C שבי אנטרוגרדית (kinesin) ומנועים מדרדר (dynein) לתאם את פעילותם על מנת להעביר את שלפוחית ​​בכל כיוון או להישאר קבוע כאשר הקשורים למטען . כוח נוסף של שיטה זו הוא התחולה הרחבה הפוטנציאל שלה לאפיון colocalization / עמותת מטענים רבים שכותרתו fluorescently שנעים כמעט בכל סוג תא, עם כל חלבון אחר (ים) של עניין. כך, מתאם חי / קבוע עלול לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון-מטען חולפים, fluorescently הבודד רב שכותרתו נע חלקיקים יכול להיות מנותח על p רצויeriod זמן. בהתחשב בתחולה הרחבה ואת סוג השאלות ששיטה זו יכולה לטפל, פרוטוקול זה יהיה עניין לקהל רחב של ביולוגים של תא כוללים אלה סחר הלימוד ותחבורה בתאי עצב או בסוגי תאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שנערכו בעקבות פרוטוקולים שאושרו ובהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול האנושי בבעלי חיים במחקר. עכברי ילוד היו מורדמים על ידי עריפת ראש.

1. הכנה של המכשירים microfluidic תרבות תאים

  1. הכן siloxane polydimethyl (PDMS) מכשירי microfluidic לגדילה של נוירונים בהיפוקמפוס כפי שתואר על ידי האריס ועמיתי 17-19. להלן כמה שינויים שהותאמו לפרוטוקול מיפוי מטען.
    הערה: המכשירים microfluidic גם זמינים מסחרי (חומרי רשימה), ובכך גישה למתקן ייצור אינה הכרחית.
  2. הכן מס '½ 1 כוסות כיסוי (24 x 40 מ"מ) על ידי שטיפה אותם שלוש פעמים עם אצטון, ואחריו שלוש שוטף עם 100% אתנול ושלושה שוטף של מים. coverslips חנות במים ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טיפולים אלה מסייעים להבטיח שcoverslips נקי מפסולת שיכול להפריע לציפוי של cells, זיהום, והישרדות.
    הערה: אצטון ואתנול דליקים ומסוכנים במקרה של מגע בעור (גירוי), קשר עין (גירוי), של בליעה, של שאיפה. השלך על פי תקנות רשמיות.
  3. כאשר מוכן לשימוש, למקם את מכסה זכוכית אחד בצלחת תרבית תאי 60 מ"מ למכשיר microfluidic, ולתת לו להתייבש באוויר נחשף במשך 45 דקות בתוך ארון בטיחות ביולוגי, כדי למנוע זיהום.
  4. לאחר ההתקנים לגזור מן המאסטרים ואגרופים כבר לחתוך כדי ליצור את מאגרי המים (איור 1 א, ב '), למקם אותם בערוצי microfluidic הצד למעלה בתוך ארון בטיחות ביולוגי מצוידים במנורת UV למשך 45 דקות לעיקור.
    הערה: השארת מכשירים תחת טיפול UV למשך זמן ארוך יותר מ- 2 hr עלולה להשפיע על שלמות PDMS.
  5. להרכיב את המכשירים על ידי הצבת מכשיר אחד על כל מכסה זכוכית בתוך צלחת תרבית תאי פלסטיק 60 מ"מ, כך שערוצי microfluidic עם הפנים כלפי מטה. להפעיל לחץ עדין o העליונהו המכשיר (להימנע מלגעת microchannels) כדי לספק חותם לא קבוע של המכשיר לכיסוי הזכוכית. כיסוי כל צלחת תרבית תאי 60 מ"מ עם מכסה.
  6. שימוש micropipette, מימה המכשירים על ידי הוספת מים כיתה תרבית תאים לשני מאגרים העליונים microfluidic (1 ו -2 באיור 1 א), המאפשרת למים לזרום דרך. הסר מים עם micropipette ולהוסיף 1 מ"ג / מיליליטר poly-L- ליזין למאגר microfluidic 1 (200 μl) ו -2 (100 μl). ההפרש הנפח יאפשר לpoly-L- ליזין לזרום דרך microchannels (איור 1 א, ב ').
  7. כדי להבטיח שהמכשירים בתוך תרבות מנות תא 60 מ"מ לא ליפול בתוך 37 ° C חממה, מקום שלוש מנות תרבות תא 60 מ"מ המכילות מכשירים לצלחת תרבית תאי פלסטיק 150 מ"מ ולכסות את הצלחת עם מכסה. דגירה O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. בדרך כלל יותר מ -90% מהערוצים הם שמישים לכל מכשיר ולעשותלא מכיל בועות אוויר או חסימה פיזית.
  8. ביום המחרת, להחליף poly-L- ליזין במים ולהשאיר את המכשיר באינקובטור במשך שעה לפחות 1. חזור על זה כביסה שלוש פעמים. הסר מים ומוסיף Neurobasal-מדיום גידול (המכיל 2% B-27 תוסף ו500 מיקרומטר Glutamax) לכל התקן. השאר O / N בחממה 37 ° C עם 5% CO 2.
  9. ביום המחרת, תאי צלחת בהיפוקמפוס, כמתואר להלן.

2. ציפוי של עכבר בהיפוקמפוס ראשי נוירונים במכשירים microfluidic

הערה: ההכנה של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית מחולדות ילוד כבר פורסמה בעבר ביופיטר 25. להלן כמה שינויים שהותאמו לתאי עצב בהיפוקמפוס עכבר צלחת במכשירי microfluidic, וכי היו אופטימליים עבור transfections.

  1. לפני נתיחת מוח עכבר, 10% סרום הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) טרום חם המכיל שור עוברי(FBS; ללא אנטיביוטיקה), תערובת (DL-ציסטאין 125 מ"ג, 125 מ"ג אלבומין בסרום שור (BSA) ו3.125 גרם של D-גלוקוז ב500 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS); סנן לעקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) , וdeoxyribonuclease פתרון (אני DNase: 50 מ"ג של DNase אני ו0.5 מיליליטר של תמיסת 1.2 M MgSO 4 ב 100 מיליליטר מאוזן תמיסת מלח של האנק מסנן (HBSS) לעקר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    1. Neurobasal-מדיום גידול טרום חם בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2 לאזן את רמת החומציות.
  2. לנתח hippocampi מעכברי ילוד ישנים 1-3 יום על פי פרוטוקולים הוקמו 26. שמור hippocampi בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר חיץ דיסקציה (HBSS המכיל 10 HEPES מ"מ pH 7.4, 50 גלוקוז מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין), על קרח. לשים עד 4 hippocampi לכל צינור חרוטי 15 מיליליטר.
  3. בצע את הפרוטוקול שנותר הוא בתנאים סטרילייםשל בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
  4. לדלל 45 יחידות של פפאין ב 5 מיליליטר של תערובת, מערבולת, ודגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד לאבקת פפאין נמס. הוסף 1 מיליליטר של DNase אני פתרון. סנן את התערובת דרך יחידת מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  5. זהירות לשאוב HBSS 'מhippocampi צינור המכיל חרוטי 15 מיליליטר. להוסיף 10 מיליליטר קר (4 ° C) HBSS לhippocampi ולתת להם להתיישב לתחתית של התחתית. לשאוב HBSS בזהירות מצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  6. להוסיף פפאין 1 מיליליטר / DNase אני מערבב לעד 4 hippocampi דגירה במשך 20-30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הטה צינור חרוטי כל 5 דקות להתרחץ hippocampi בתערובת. לחלופין להציב hippocampi שייקרה אמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם (~ 100 סל"ד) הטלטול העדין.
  7. פפאין לשאוב / DNase אני מערבב ולשטוף hippocampi פעמיים עם DMEM המחומם מראש (37 ° C) המכיל 10% FBS.
  8. לאחר לשטוף את השני, להוסיף 2 מיליליטר של DMEM מראש חימם מכיל 10% FBS לhippocampi וhippocampi triturate ידני על ידי pipettingלמעלה ולמטה ~ 10-12 פעמים באמצעות קצה פיפטה 1 מיליליטר לניתק נוירונים.
  9. בואו triturate להסתפק ~ 1 דקות כמו זה יאפשר נוירונים ניתקו לא להתיישב לתחתית צינור חרוטי. העברת supernatant המכיל נוירונים ניתקו צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש הימנעות העברת רקמות גדולות יותר כי יש התיישבו בחלק התחתון של הצינור.
  10. ספין תאי XG ב 1000 למשך 2 דקות ולהסיר supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולה התא. Resuspend תאים ב -80 μl Neurobasal-מדיום גידול על ידי pipetting בעדינות.
  11. הסר בינוני ממאגר microfluidic 1 ו '1. החל 20 μl של תאים (~ 275,000) למאגר microfluidic 1, ולאפשר להם לזרום. תניח את המכשיר ב -37 חממת ° C עם 5% CO 2 למשך 20 דקות.
  12. חפש תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתאים יש דבק הזכוכית המכסה. להוסיף Neurobasal-מדיום גידול לראש הדף את כל המאגרים. חזור מכשיר עם תאים לחממת 37 ° C עם 5% CO
  13. בדקו מכשירים כל אידוי ~ 2-3 ימים ומאגרים העליונים את עם Neurobasal-2% תוסף המכיל B-27 (ללא Glutamax), כדי למנוע. נוירונים להתחיל להאריך האקסונים שלהם דרך ערוצי microfluidic ~ 2-3 ימים לאחר ציפוי. הנוירונים בכפוף לtransfection בדרך כלל 7-10 ימים לאחר ציפוי.

3. Transfection של נוירונים בהיפוקמפוס גדל במכשיר microfluidic

  1. לכל מכשיר, להכין תערובת של Lipofectamine 1.2 μl 2000 ב-30 μl Neurobasal-, ותערובת של 0.5 מיקרוגרם פלסמיד היתוך מטען ניאון ב -30 μl Neurobasal-דגירה 5 דקות ב RT. להוסיף תערובת Lipofectamine לתערובת DNA ודגירה במשך 20 דקות ב RT. הוסף 60 μl של Neurobasal-המכיל 4% תוספת B-27 ל- DNA / Lipofectamine לערבב ולערבב על ידי מצליף את הצינור.
  2. הסר את כל המדיה ממאגר microfluidic 2 ו 2 'ובזהירות למלא את בארות עם Neurobasal-המכילות 2% תוספת B-27 מבלי לשפוך מעל int הבינוניo התאים האחרים.
  3. הסר את המדיה ממאגר microfluidic 1 ו '1. להוסיף 120 μl של ה- DNA / Lipofectamine לערבב למאגר microfluidic 1 ולתת לו לזרום. חזור מכשיר 37 חממת ° C עם 5% CO 2 ל3-4 שעות.
  4. הסר את כל המדיה ממאגר microfluidic 1 ו 1 'ולהחליף עם Neurobasal-2% תוסף המכיל B-27 למשך 24 שעות (או עד שמוכן תמונה). בדרך כלל, 5-7 האקסונים הצומחים במשך microchannels הם transfected בתנאים אלה, המייצגים כ 1-3% יעילות transfection בקנה אחד עם יעילות פורסמה לתאים בתרבית בהיפוקמפוס 26.

4. ניתוח "מטען מיפוי"

  1. הדמיה חיה של תנועת מטענים
    1. לבצע הדמיה על מיקרוסקופ epifluorescence אור הפוך מצוידים ב37 ° C חממה וחדר בקרה CO 2.
    2. הר coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו בMICRמכשיר ofluidic לבמה מיקרוסקופ. כדי להימנע ממוות עצבי, לעבוד בזריזות כדי לשמור על הדגימות במיקרוסקופ במשך שעה לא יותר מ 1.
    3. באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה (100X), למצוא האקסונים של תאי transfected שמרחיבים בערוצים של תאי microfluidic ולרשום את המספר של הערוצים שבי האקסון transfected נמצא. לספור את מספר הערוצים בדלפק יד מספר הנקודות.
      1. להקלטה אופטימלית של תנועה חיות וניתוח colocalization שלאחר מכן, לבחור האקסונים הגדלים שטוחות יחסית בערוצים כך הדמיה זו של רוב שלפוחית ​​יכולה להתבצע בפוקוס.
    4. להסיר את רוב הבינוני ממאגרים 2 ו 2 'עם טפטפת העברת פלסטיק 1 מיליליטר. כדי להקל על היישור הבא של תמונות קבועות עם מסלולי תנועה בkymographs, ליישר את הקצה הימני של microchannels עם שדה הראייה במהלך ההדמיה (איור 1 ב, ג).
    5. כדי להקל על fixinגרם של הדגימות במהלך הדמיה, לבצע הדמיה חיה עם שני אנשים. לחלופין, אם הדמיה חיה מבוצעת על ידי אדם אחד, להשתמש במערכת מיקרוסקופ מצוידת בתיקון להיסחף.
    6. התחל תנועת מטענים בשידור חי הדמיה עם מפרט הזמן לשגות ספציפי לדינמיקה הובלת המטענים המנותחות (מפרטי מיקרוסקופ והגדרות הדמיה YFP-PRP C מפורטים באגדה של איור 2 וחומרי רשימה).
    7. לאחר שנתוני תנועה חיים מספיק כבר נאספו, יש לי אדם אחד למלא את המאגרים 2 ו 2 'עם paraformaldehyde 4% מראש חימם PBS המכיל 0.04 גרם / מיליליטר סוכרוז לתקן את התאים. הימנע מלגעת במכשיר microfluidic, כמו זה יהיה לשבש את המיקוד של ההדמיה החיה. יש האדם האחר לשנות את הפוקוס בזמן שמקבע הוא הוסיף. קיבעון הוא מוצלח כאשר הפסקה מיידית של תנועה הוא ציין. להוסיף מקבע למאגר '1 ולאחר מכן 1.
      הערה: photoblea הזמניצ'ינג של הקרינה המטען עשוי להיות גם ציין, אך הקרינה נמשכת לאחר צביעה אם לחלבוני מנוע הושלמה (השלב ​​הבא).
      הערה: Paraformaldehyde מזיק על ידי שאיפה, במגע עם עור, ואם בלע. מעצבן לעיניים, מערכת נשימה ועור. השלך על פי תקנות רשמיות.
  2. אם מכתים של חלבוני מנוע לניתוח colocalization
    הערה: כדי לכמת את רמות יחסי של חלבוני מנוע (כפי שנקבע על ידי צביעת נוגדן), הקשורים למטענים מרגשים בודדים, לאמת ולכייל נוגדנים כדי לוודא שהנוגדן אנטיגן מחייב רווי. הדבר נעשה על ידי קביעת הספציפיות של הנוגדן באמצעות תאי עצב שבחלבון של עניין כבר דפק החוצה או או דפק למטה, ועל ידי ביצוע אם ניתוח עם עלייה בריכוזי נוגדנים. לבקרות שליליות, תאי עצב מגואלות נוגדנים משני בהעדר נוגדנים ראשוניים. מפורט יותרניתן למצוא תיאור של אימות הנוגדן בEncalada et al. 16, וSzpankowski et al. 20.
    1. הסר את coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו במכשיר microfluidic מבמת מיקרוסקופ. לא לנתק את מכשיר microfluidic מcoverslip, כmicrochannels צריכה להישאר שלם כדי להרכיב את התמונות בשידור חיות וקבועים. בצע את השלבים הבאים בתא לחות.
    2. כדי להבטיח את הזרימה של פתרונות לmicrochannels, לשמור על ההפרש חיץ נפח בין מאגרי 1, 1 ', ו -2, 2' של לפחות 30 μl. בכל הצעדים הבאים. לדוגמא, להוסיף 100 מדיה μl נפח מאגר microfluidic 2, 2 ', ו -70 μl תקשורת נפח מאגר microfluidic 1, 1'.
    3. הסר מקבע מלשכתו של מכשיר microfluidic ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS מחכה 10 דקות בין שוטף.
    4. Permeabilize תאים על ידי הוספת 0.1% Triton X-100 diluטד בPBS למשך 5 דקות לכל המאגרים.
    5. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף עם PBS. חזור על שטיפה שלוש פעמים מחכות 10 דקות בין שוטף.
    6. הסר פתרון מכל המאגרים ולהחיל חסימת מאגר המכיל חמור סרום 10% רגיל ו -3% פרוטאז G חופשי ואימונוגלובולינים (IgG) BSA -חינם ב PBS ו דגירה של לפחות 30 דקות ב RT.
    7. ספין פתרון מניות נוגדן ראשוני ב -20,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את משקעים. לדלל נוגדן לריכוז מתאים בחסימת מאגר. החלף את חיץ חסימה ממכשיר microfluidic עם פתרון נוגדן. דגירה דגימות לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    8. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, מחכה 10 דקות בין שוטף.
    9. ספין פתרון מניות נוגדנים משני ב20,000 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את משקעים. לדלל נוגדן לריכוז מתאים בחסימת מאגר. להחליף PBS עם פתרון נוגדנים משני. דגירהדגימות עבור שעה 1 ב RT.
    10. הסר פתרון מכל המאגרים ולשטוף שלוש פעמים עם PBS, מחכה 10 דקות בין שוטף.
    11. להחליף PBS עם ~ הרכבה בינונית 10-20 μl ישירות על ידי pipetting בינוני הרכבה לפתיחת ערוצי חיבור המאגרים. בואו הרכבה יבשה תקשורת ל~ 20 דק '- שעה 1 בRT.
    12. מכשירי חנות ב 4 ° C המוגנים מפני אור, כדי למנוע photobleaching, ואקסונים תמונה בתוך שני ימים (שבוע לכל היותר) של מכתים.
    13. לאחר הצביעה הושלמה, הר coverslip עם נוירונים בהיפוקמפוס גדלו במכשיר microfluidic לבמה מיקרוסקופ. אתר את האזור של האקסון transfected צילם בשלב 4.1.1-4.1.7.
    14. לרכוש תמונות Z-מחסנית (300 מדרגות ננומטר) לכל אחת משלושת הערוצים: המטען, מנוע 1, מנוע 2, באמצעות מטרה ברזולוציה גבוהה (לדוגמא, מטרת נפט צמצם או מים מספרית גבוהה).
      הערה: רכישת Z- ערימות חשובה כמו האקסונים לעתים קרובות לא גדלים שטוחים לחלוטיןבmicrochannels ולכן לא כל puncta הניאון נמצאים באותו מישור המוקד.
  3. מיפוי מטענים
    1. צור רשם גלים של תנועת מטענים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תוסף ImageJ פותח על ידי Rietdorf וזייץ (EMBL) מומלץ ליצירת kymographs (להורדה לראות רשימת חומרים).
      הערה: ImageJ היא ברשות הציבור, תוכנת עיבוד תמונה המבוססת על ג'אווה שפותחה במכון הלאומי לבריאות 27,28 (להורדה ראה חומרי רשימה).
    2. יישר את התמונה קבועה של מטעני הניאון (שנוצרו בשלב 4.2.14) באופן ידני על ידי superimposing אותם על העמדה של המסלולים ברשם הגלים בנקודת הקיבעון (איור 2 א, ב '), באמצעות תוכנת גרפים זמינה מסחרי (חומרים רשימה). ידני ליישר ידי superimposing ראשון תמונת מטענים המקובעים לרשם הגלים ובחירת puncta המטען שמתאימה למסלול מסוים באופן ידנירשם גלים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר יישור, להשתמש בפרוסת Z שהיא בפוקוס הטוב ביותר עבור המטען הממופה. ניתן להשתמש בפרוסות Z כמה.
    3. לכל תמונה בZ-המחסנית (מטען, מנוע 1 ומנוע 2; שנוצרה בשלב 4.2.14) לקבוע את קואורדינטות XY ואמפליטודות עוצמה עבור כל puncta ניאון באמצעות אלגוריתם שהוקם כדי להתאים Gaussians 2D ל פונקצית התפשטות הנקודה שמייצגת כל מקור נקודה בכל אחד משלושת הערוצים 16,20,21 (איור 2 ד).
      הערה: לקבלת קואורדינטות XY, חבילה מותאמת אישית שנבנתה MATLAB תוכנה בשם "המוטור colocalization" פותחה 16,20, אשר משלבת אלגוריתם מתאים גאוס פותח על ידי Jaqaman, Danuser ועמיתי 21-23. ניתן להשיג את חבילת התוכנה והוראות מפורטות לשימושו על פי דרישה.
    4. לכל אחד מpuncta המטען בנפרד שמופו על המסלולים הניידים או נייחים ברשם הגלים, בחר tהוא קואורדינטות XY ואמפליטודות בעוצמתם מהתוצאות של התכנית "מוטור colocalization" (מטענים אלה שכותרתו בנפרד באיור 2). השתמש בכמה תמונות Z- מחסנית שנרכשו בשלב 4.2.14) כדי למפות יותר מטענים הנמצאים על מטוסי מוקד שונים.
    5. השווה את XY הבודד קואורדינטות עבור המטען הממופה לאלה שהושגו עבור כל אחד מהערוצים המוטוריים בפרוסת Z המתאים (איור 2 ד). להחליט ולבחור את קואורדינטות מנוע XY שנמצאות ברדיוס של 300 ננומטר של המטען. למטענים ומנועים שיש אות באותו המישור המוקד, להשתמש "מוטור colocalization" חבילת התוכנה כדי לקבוע את puncta הנמצאות ברדיוס של 300 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג סקירה כללית של מכשיר microfluidic משמשת לגידול תאי עצב בהיפוקמפוס (איור 1 א, ב '). נוירונים הם מצופים במאגר 1. הגודל של microchannels מונע דיפוזיה של גופי תא (סומה) לתוך תא axonal ואילו האורך של הערוצים מונע תחזיות דנדריטים לחצות את כל הדרך לתא axonal. לאחר ~ 2-3 ימים בתרבות, תאי עצב מתחילים הארכת האקסונים שלהם על פני microchannels לתוך תא axonal (איור 1 ב, ג). האקסונים transfected לבטא חלבון פריון הנורמלי שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP-PRP C) יכולים להיות מזוהים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1 ג '). ביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently באמצעות transfection פלסמיד צריך להיבדק ללוקליזציה ראויה subcellular ומתפקד כביטוי יתר עלול להכניס את החפצים ניסיוניים בשל תצורות חלבון שונות. כך, colocalizatניסויי יון צריכים להיות החמיאו גם עם לימודי שיתוף משקעים ביוכימי, כמו גם עם צביעה אם מחלבונים הביעו באופן אנדוגני. ההתנהגות של YFP-PRP C משמשת כאן נבדקה בעבר 16. הביטוי של YFP-PRP C בתאי נוירובלסטומה transfected הזמני (N2a) היה נמוך, המצביע על כך transfection החולף אינו גורם לרמות YFP-PRP C ביטוי יתר מאוד 16. יתר על כן, אם תאי N2a transfected עם YFP-PRP C באמצעות נוגדנים נגד PRP C ציין כי YFP-PRP C colocalized מאוד עם אנדוגני PRP C, המצביע על כך transfected שני ואנדוגני PRP C התנהג באופן דומה. כדי לוודא שPRP C הקשורים למנועים, immunoisolations השלפוחית ​​בוצע 16.

ללימודי מיפוי מטען אופטימליים, הקצה הימני של microchannels מיושר עם שדה הראייה במהלך הר"י החי וקבועגינג כדי תמונה באותו האזור של האקסון (מסומן במלבן אדום באיור 1 ב, ג). איור 2 ואיור 3 מראים תוצאות נציג למשא מיפוי הניתוחים של נוירונים זמניים transfected עם YFP-PRP C. שלפוחית ​​ביצוע YFP-PRP C מועברות בהאקסונים של יונקים על ידי בני המשפחה Kinesin-1 ושרשרת dynein הכבדה 1 (DYNC1H1) 16, לכן שלפוחית ​​YFP-PRP C מופו לתת יחידת Kinesin-1 שרשרת Kinesin אור 1 (KLC1) , וDYNC1H1 מנועים. תנועת שלפוחית ​​YFP-PRP C הייתה צילמה ולהתוות רשם גלים (איור 2 א). בkymographs, אנטרוגרדית ותנועה מדרדר של שלפוחית ​​YFP-PRP C מיוצגת על ידי מסלולים עם מדרונות שליליים וחיוביים, בהתאמה, ושלפוחית ​​נייחת מתוארות על-ידי מסלולים אנכיים. בקיבעון, כל התנועה פסקה שצוינה על ידי העדר קווים אלכסוניים ברשם הגלים(איור 2 א). האות אם של מנועים מולקולריים ומטענים בהאקסונים קבועים, permeabilized היא punctate 16 (תרשים 2B, C). המטרה של "מיפוי מטען" היא לקבוע אם puncta בערוץ המטען (איור 2) colocalize עם puncta המוטורית (איור 2 ג) בשני ערוצים האחרים. כדי לעשות זאת, תמונות ניאון של שלפוחית ​​קבועה YFP-PRP C, ואת התמונות אם של מקביל KLC1 וDYNC1H1 קשור לpuncta לפוחי היו מיושרות רשם גלים (איור 2 ב, ג). פונקציות גאוס היו מצוידות לפונקציות נקודת התפשטות מקורות נקודות ניאון בכל שלושת ערוצים על מנת למפות את עמדות XY המדויקות של מנועים למסלולי מטען מתקבלים על ידי הדמיה חיה (איור 2 ד). באופן אנדוגני הביע מנועים KLC1 וDYNC1H1 מופיעים ככתמי punctate וcolocalized באופן דיפרנציאלי עם שלפוחית ​​YFP-PRP C (איור 2 ד). Colocalization הוגדר על ידי הנוכחות של YFP-PRP C וpuncta המוטורית במרחק של 300 ננומטר ולכמת על ידי הרמה של colocalization של גאוס XY לתאם עמדות בין C YFP-PRP וכל אחד מpuncta KLC1 וDYNC1H1 (איור 3 א ). מרחק זה נבחר מבוסס על אופטיקה, גבול השתברות של אור, והגודל פיזי הרלוונטי של תת-יחידות מטען ומוטוריות. הכמות היחסית של KLC1 וDYNC1H1 הקשורים לשלפוחית ​​YFP-PRP C התקבלה מעוצמות גאוס, המייצגות את העוצמות של כל puncta (איור 3 ב). נתונים אלה ניתן לנתח נוספים לפי צורך. לדוגמא, בעוצמות של מנועים colocalizing עם puncta YFP-PRP C בין השליטה (wild-type - WT) נוירונים וחסרים יחידות משנה Kinesin-1 אחרת (KIF5C - / - תאי עצב באיור 3 א, KIF5C הוא חבר של Kinesin-1 משפחה), ניתן להשוות כדי לקבוע אם היעדר KIF5C משבש עמותה של KLC1 ו / או DYNC1H1 לשלפוחית ​​YFP-PRP C (עוצמות KLC1 וDYNC1H1 היו ללא שינוי בניסויים שלנו 16). יתר על כן, ניתן להתוות עוצמות KLC1 וDYNC1H1 לבחון התאמות אפשריות בין כמויות מנוע היחסית והכיווניות של תנועה (איור 3 ב). לדוגמא, שלפוחית ​​YFP-PRP C שעוברת ו / או נייח הקשורים לשני KLC1 ו / או DYNC1H1 (איור 3 ב).

איור 1
1. נוירונים בהיפוקמפוס איור תרבית במכשירי microfluidic. תמונה () של מכשיר microfluidic. קווי המתאר של מאגרים הם דמיינו ידי צבעי אדום והכחולים. מספור מתייחס למספר מאגרי microfluidic בשימוש בכל הפרוטוקול. תרשים (B) של מכשיר microfluidic. מספרים מתאימות למאגרים אניn שתקשורת ונוירונים מתווספים. נוירונים transfected מוצגים בירוק. חצים מקווקוות מלבן ואדום אדומים מציינים את האזור המומלץ לדימות פלואורסצנטי החי וקבועה. תמונה (C) של שני האקסונים transfected עם YFP-PRP C גדל דרך microchannel בודד (microchannel אחד וקצה של המכשיר שתואר על ידי קווים לבנים מנוקדים) . שלפוחית ​​YFP-PRP C בנפרד נעה יכולה להיות מכובדת כpuncta בהירה. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. איור מותאם:.. Encalada et al 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. "מיפוי מטענים" לתאם תחבורת שלפוחית ​​YFP-PRP C עםכמויות היחסית של מנועים kinesin וdynein. תמונות הקרינה רחב בתחום של תנועה חי ומטענים קבועים נלקחו על מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בבמה ממונעת ומצלמת CCD ומטרת נפט 100X / 1.4 NA. (א) רשם גלים של YFP תנועת שלפוחית ​​-PrP C של אקסונים שמוצגים באיור 1 ג. תנועה חי נרשמה לזמן כולל שנע 30-60 שניות בחשיפה של 100 אלפיות שנייה (10 הרץ). תאים היו קבועים לאחר ההדמיה תנועת מטענים לפחות 15 שניות. קו מקווקו מציין את הזמן של קיבעון במהלך הדמיה חיות. תיבה אדומה מראה אזור של שלפוחית ​​המודגשת ב( B, C) ​​והורחבה ב( ד '). ראשי חץ להצביע על שלוש שלפוחית ​​שמוצגת ב( ד') מקביל לנייח (כחול), מדרדר (אדום), והאנטרוגרד מסלולים (ירוקים). ( תמונה ב ') של שלפוחית ​​YFP-PRP C קבוע מיושרת לרשם הגלים המקביל. מספרים מציינים את בשלפוחית ​​dividual YFP-PRP C שמופו לזיהוי שpuncta ברשם הגלים. שלפוחית ​​האנטרוגרד ירוק, מדרדר הוא אדומים, ונייח שבם הם כחולים. (ג) קבוע אם תמונות של puncta KLC1 וDYNC1H1 המתאימות לאותו האזור שמוצג ב( B). סרגל קנה מידה (AC) הוא 10 מיקרומטר. (ד) הגדלה של קבוע אותות IF של כל אחד משלושת ערוצים עם משימות פונקצית גאוס 2D. נקודות כחולות מייצגות פיקסלים מקסימום עוצמה מקומיים, נקודות אדומות מייצגות מתאימה גאוס, ונקודות ורודות הן החפיפה בין שתיים. ראשי חץ עולים דוגמאות של שלפוחית ​​YFP-PRP C מוצגת ב(), וcolocalization ההפרש שלהם עם חלבונים מוטוריים KLC1 וDYNC1H1. סרגל קנה מידה הוא 2 מיקרומטר. איור מותאם:.. Et al Encalada 16 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של ה הוא דמות.

איור 3
איור 3. ניתוחים כמותיים של "מיפוי מטען" של שלפוחית ​​YFP-PRP C. כימות () של colocalization בין שלפוחית ​​YFP-PRP C, KLC1 וDYNC1H1 בWT ונוירונים נוקאאוט KIF5C (KIF5C - / -). מספר כולל של puncta ניתחה היה N WT = 887 וN KIF5C - / -. = 1629 16 מספרים בתוך ברים מייצגים את המספר של שלפוחית ​​לכל קטגוריה. מוצגים הם ממוצעי ± SEM. מבחן t התמורה ללא פרמטרי שימש להשוואה בין גנוטיפים 29. מתאם (B) של הרכב מנוע יחסי והכיווניות של תנועה בתאי עצב WT של הנתונים מנותחים ב(). איור מותאם: et al Encalada 16..קבצים / ftp_upload / 52,029 52029fig3large.jpg "target =" .jove.com / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מאפשר המתאם של כיווניות של תנועה של חלקיקי מטען נע פרט ניאון מבוסס microtubule עם הסוג היחסי וכמות חלבוני מנוע הקשורים בתאי עצב חיים. בעבר, הרכב המנוע הכולל של מטעני לפוחי axonal היה assayed על אוכלוסיות הטרוגניות של שלפוחית ​​ואברונים 9,15 מטוהרים מבחינה ביוכימית. עם זאת, הרכב מנוע אפיון לסוג אחד של מטען בתוך תאים היה מאתגר בגלל הקושי בטיהור אוכלוסיות שלפוחית ​​הומוגנית. יתר על כן, בעוד שמדידות של דוכן-כוחות מנוע הציגו אומדנים של מספרי מנוע פעילים בעוברי דרוזופילה, לא היה ברור אם כיווניות של תנועה מתואמות מנועים להיות קשורים ביציבות למטענים או לעמותה / הניתוק המהיר של מנועים פעילים מ / מטען 12. לכן פרוטוקול "מטען מיפוי" descriהמיטה כאן פותחה כדי לחקור את הקשר בין הסוג ומספרם יחסי של מנועים הקשורים להעברה בנפרד מטען בתאי עצב חי נוסף.

כדי להשיג הצלחת נתונים "מיפוי מטען" זה קריטי 1) לבצע הדמיה של תנועת מטענים וIFs קבוע ברזולוציה של זמן ומרחב גבוה, 2) להבטיח תיקון מיידי של המדגם במהלך ההדמיה, 3) ליישר את האזור עניין בתמונות בשידור חי וקבועים ולמפות מטען קבוע ומנועים לkymographs תנועה להן התמונות, ו- 4) לקבוע במדויק קואורדינטות XY של מטענים וpuncta ניאון מנוע כדי לקבוע את סכום colocalization בין חלבוני מטען ומוטוריים.

בעוד פרוטוקול זה מתאים באופן ייחודי כדי לנתח מאפייני תחבורה בהאקסונים מאורגנים בצורה אחידה של תאי עצב גדלו במכשירי microfluidic, זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של שאלות מחקר. לדוגמא, applica זהtion יכול לשמש כדי לאפיין עמותה של שלפוחית ​​עם המתאמים שלהם המעורבים באנדו / exocytosis (למשל, מבחני סחר בfibroblasts), או הצמיחה של microtubules שכותרתו עם חלבוני microtubule + טיפ מחייב. לאלה, התקני מייקרו-נוזליים יכולים להיות מוחלפים על ידי coverslips gridded כדי להקל על הלוקליזציה של תאים צילמו הכרחיים לחיים גומלים ובדיקות הדמיה קבועות. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לאפיין אירועים תאיים לו פרמטר שינויים בזמן בהתאם לסביבה התאית הספציפית. לדוגמא, על שחרורו של חלבון נגיפי שכותרתו fluorescently ממבני endosomal הבודדים לתוך הציטופלסמה יכול להיות מתואם עם הביטוי ו / או התאגדות של חלבוני endosomal.

מגבלה אפשרית אחת של פרוטוקול זה היא שהמיפוי של מטעני צפיפות גבוהים עלול להיות קשה. עם זאת, המשימה של פונקציות גאוס עוקפת את הבעיה במידה רבה על ידי מתןהבחנה של תפקידים בין puncta הניאון ברמה תת-פיקסל. יתר על כן, המיפוי של מנועים למטעני axonal הוא נמוכה תפוקה: כיום, מיפוי יכול להיעשות עבור 2 האקסונים למכשיר microfluidic, בהתחשב בשיעור הנמוך של transfection של תאי עצב והשדה המוגבל של תצוגה בעת השימוש בהגדלה הגבוהה הכרחית לגבוה הדמיה ברזולוציה עם המצלמה שלנו. התפתחויות עתידיות של שיטה זו עשויות לכלול את השימוש במערכות lentiviral כדי transduce נוירונים עם יעילות גבוהה יותר, בידוד של נוירונים מעכברים מהונדסים מבטא חלבונים מתויגים fluorescently או התיוג של האברונים עם צבעי ניאון קטנים כמו Lysotracker או Mitotracker, כל אשר יגדיל את מספר של אקסונים שכותרתו עם סמני ניאון. יתר על כן, גודל השטח שנרשם הוא מוגבל על ידי ההגדלה, גודל פיקסל והגודל של מערך פיקסל של המצלמה המשמשת להדמיה. התפתחויות שוטפות בתחום של טכניקות הדמיה תאפשר שטח גדול יותרשל להיות צילם בעתיד ולכן להגדיל את כמות הנתונים שהתקבלו לתנאי ניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
poly-L-lysine Sigma P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) Life Technologies 11965092
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10082147
Neurobasal-A Medium (1x) Life Technologies 10888022
B-27 Serum Free Supplement Life Technologies 10888022
GlutaMAX I Supplement (100x) Life Technologies 35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) Life Technologies 24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) Life Technologies 14190250
Penicillin/Streptomycin (100x) Life Technologies 15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture  Fisher Scientific MT46000CM
Papain USB Corporation 19925
DL-cysteine HCl Sigma-Aldrich C9768
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
D-glucose Sigma-Aldrich G6152
DNAse I grade II Roche Applied Sciences 10104159001
Lipofectamine 2000 Life Technologies  11668027
Formaldehyde Solution 16% EM Grade Fisher Scientific 50980487 Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
Sucrose Fisher Scientific S5-500
HEPES Sigma H-3375
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-0121
BSA fatty acid and IgG free Jackson Immuno Research 001-000-162
Acetone Fisher Scientific BP2403-4
Ethanol Fisher Scientific BP2818-100
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm Corning 2980-244
Axis microfluidic device, 450 µm Millipore AX450
Adobe Photoshop Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U  Nikon
Coolsnap HQ camera  Roper Scientific
60 mm cell culture dish Fisher Scientific 12-565-95
150 mm cell culture dish Fisher Scientific 12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17 Santa Cruz  sc-13362 specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 Santa Cruz  sc-9115 specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody Life Technologies A10042  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life Technologies A31573  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody Life Technologies A11057  recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody Life Technologies A21447  recommended dilution 1:200.
Plugins and Macros
ImageJ  http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Plugin http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
  6. Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
  7. Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
  8. Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
  9. Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
  10. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  11. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  12. Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  13. Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
  14. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
  15. Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
  16. Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
  17. Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
  18. Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
  19. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
  20. Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
  21. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
  22. Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
  23. Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
  24. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  25. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
  26. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  27. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).

Tags

Neuroscience גיליון 92 kinesin dynein שלפוחית ​​אחת תחבורת axonal מכשירי microfluidic תאי עצב בהיפוקמפוס עיקרי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי
ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neumann, S., Campbell, G. E.,… More

Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029, doi:10.3791/52029 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter