Abstract
Compreender os mecanismos pelos quais motores moleculares coordenam suas atividades para o transporte de cargas vesiculares dentro dos neurônios requer a análise quantitativa de associações motor / carga ao nível da vesícula única. O objetivo deste protocolo é a utilização de microscopia de fluorescência quantitativa correlacionar ("mapa") a posição e direcionalidade do movimento de cargas vivas à composição e relativas quantidades de motores associados com a mesma carga. "Mapeamento Cargo" consiste em imagens ao vivo de cargas marcados com fluorescência que se deslocam em axônios cultivadas em dispositivos microfluídicos, seguido de fixação química durante a gravação de movimento ao vivo, e posterior imunofluorescência (IF) coloração das mesmas regiões axonal exatas com anticorpos contra motores. Co-localização entre cargas e seus motores é avaliada através da atribuição de posição sub-pixel coordena a canais de motor e de carga, por funções de Gauss de montagem para a difração-liMITED funções ponto de propagação representam fontes pontuais fluorescentes individuais. De carga e motor imagens fixas são posteriormente sobreposta a parcelas de movimentação de cargas, para "mapear" os a suas trajetórias de rastos. A força deste protocolo é a combinação de viver e se os dados para gravar tanto o transporte de cargas vesicular em células vivas e para determinar os motores associados a essas mesmas vesículas exatas. Esta técnica ultrapassa os desafios anteriores que utilizam métodos bioquímicos para determinar a composição média do motor de populações heterogéneas de vesículas granel purificados, uma vez que estes métodos não revelam composições em cargas móveis individuais. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise de outras vias de transporte e / ou de tráfico em outros tipos de células para correlacionar o movimento das estruturas intracelulares individuais com a sua composição proteica. As limitações deste protocolo são a relativamente baixa taxa de transferência devido à baixa eficiência de transfecção de culturaneurônios primários e um campo de visão limitado disponível para imagens de alta resolução. As aplicações futuras poderão incluir métodos para aumentar o número de neurónios que expressam cargas marcados com fluorescência.
Introduction
Transporte intracelular é crucial em todos os tipos de células para a administração de proteínas, membranas, organelos, e moléculas de sinalização celulares a vários domínios 1. Os neurônios são células altamente especializadas, com, projeções polarizadas longos que criticamente dependem do transporte intracelular de cargas essenciais para a sua entrega de longa distância para várias microdomínios axonal. Este transporte é mediado por kinesins e dyneins - duas grandes famílias de proteínas motoras moleculares - que se ligam às cargas e acompanhar ao longo dos microtúbulos polarizados em anterógrada e retrógrada direções, respectivamente. Enquanto movimento retrógrado é mediada principalmente por dineína, o movimento na direcção anterógrada é facilitada por uma grande família, funcionalmente diversificada de motores de cinesina. Consequentemente, o transporte de cargas axonal anterógrado poderia ser mediada por vários membros da família do kinesin superfamília 1-5. Apesar de algumas cargas mover persistentemente em qualquer direção, mcargas ost mover bidirecionalmente e reverter freqüentemente em seu caminho para seus destinos finais 1,5-13. Além disso, demonstrou-se que os motores de direccionalidade associado opostas simultaneamente às cargas, levantando a questão sobre a forma como o movimento regulado de cargas é coordenado por motores de polaridade oposta 5-7. Juntos, o transporte de cargas axonais é um processo concertada que é regulada pela composição dos motores e das suas actividades bioquímicas específicas, que por sua vez são dependentes de vários adaptadores e parceiros de ligação de regulação 14.
Para descrever fielmente o mecanismo de transporte axonal para uma carga específica e para descobrir a regulação subjacente de que o transporte, é fundamental para determinar a composição de proteínas a motor e seus parceiros de ligação regulamentares associadas com cargas individuais durante o seu transporte de animais vivos. Outros métodos, como por exemplo abordagens bioquímicas, fornecer estimativas de mot médiaou composições sobre as populações heterogêneas vesícula purificados, mas estas estimativas não revelam o tipo ou a quantidade de motores associados ao único vesículas móveis. Além disso, a reconstituição do transporte de vesículas ao longo dos microtúbulos pré-montados in vitro permitiu a medição da quantidade de um tipo de motor em um único nível de vesícula 15. No entanto, estas experiências não se correlacionam directamente a quantidade de motores eléctricos com as características de transporte dessas vesículas, e medido o transporte, na ausência de factores de regulação celular.
Um protocolo aqui é apresentado, o qual determina a composição do motor (tipo e quantidade relativa de motores), da vesículas que se deslocam individuais a partir de imunofluorescência (IF) de dados de medição endogenamente expressa proteínas do motor, e correlaciona-se esses parâmetros para o transporte directo de exactas as mesmas vesículas em neurónios 16. Este método implica mapeamento preciso dos dados IF-to-live movimentação de cargas. Isto é conseguido por growing neurónios do hipocampo de rato em dispositivos de microfluidos de acordo com protocolos estabelecidos 17-19. Estes dispositivos permitem a identificação e correlação ("mapeamento") dos axônios e cargas móveis individuais nas modalidades de microscopia de luz fixa e ao vivo (Figura 1). Neurônios cultivados são transfectadas com proteínas de carga fluorescente etiquetado cujo transporte é fotografada em alta resolução espacial e temporal para obter informações detalhadas movimento que é representada em kymographs. Durante o curso de imagiologia, os neurónios foram fixados com paraformaldeído, e subsequentemente corados com anticorpos contra as proteínas endógenas a motor. De carga e motor imagens fixas são sobrepostos kymographs movimento vivo de "mapa" (colocalize) los para a carga viva movimento trajetórias 16. Correlacionar o movimento vivo das cargas com a associação de proteínas motoras, co-localização é analisado usando um pacote de software MATLAB custom made chamado de "Motor co-localização "16,20. Cargas e motores marcados com fluorescência gerar recursos limitados puntiformes-difração que podem se sobrepõem parcialmente. Para resolver a situação de sobreposição de pontos lacrimais, o primeiro software ajusta automaticamente as funções de Gauss para cada função de dispersão, o que representa puncta fluorescente indivíduo, para determinar a sua posição exacta XY sub-pixel coordena e intensidade amplitudes 21-23. As posições dos motores e cargas são subsequentemente comparados uns com os outros para determinar colocalização 16,20. Por conseguinte, este método atribui mais precisamente entre pontos lacrimais colocalização de fluorescência em comparação com outros métodos de 24.
A robustez do método é a capacidade de avaliar a co-localização dos motores com carga indivíduo em células fixas, para as quais trajectórias de movimento vivos (por exemplo, a direcção em que eles se moviam no momento da fixação) foram recorded. Com este método, cinesinas e dyneins foram encontrados para associar simultaneamente a vesículas que transportam a proteína prião normal (PrP C CELULARES), uma carga que se move neuronalmente enriquecido bidireccionalmente ou permanece estacionário em 16 axónios. Esta análise permitiu a formulação de um modelo de trabalho para a regulamentação da PrP C movimento vesícula em que anterógrada (kinesin) e (dineína) motores retrógradas coordenar suas atividades, a fim de mover as vesículas em qualquer direção ou permanecer parado enquanto associada à carga . Outra força deste método é a sua potencial aplicabilidade ampla para a caracterização de uma co-localização / associação de muitas cargas marcadas com fluorescência que se movem em virtualmente qualquer tipo de célula, com qualquer outra proteína (s) de interesse. Assim, a correlação vivo / fixo poderia potencialmente permitir a detecção de interacções proteína-transientes de carga, como muitos fluorescentemente marcado indivíduo partículas em movimento pode ser analisado ao longo de um p desejareríodo de tempo. Dada a aplicabilidade ampla e do tipo de questões que este método pode resolver, este protocolo vai ser de interesse para um grande público de biólogos celulares, incluindo aqueles que estudam o tráfico eo transporte em neurônios ou em outros tipos de células.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados e de acordo com as diretrizes institucionais para o atendimento humanitário de animais de pesquisa. Ratinhos recém-nascidos foram sacrificados por decapitação.
1. Preparação de dispositivos microfluídicos para Cultura de Células
- Prepare polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos microfluídicos para o crescimento de neurônios do hipocampo, como descrito por Harris e colegas 17-19. Abaixo estão algumas modificações que foram adaptados ao protocolo de mapeamento de carga.
NOTA: Os dispositivos Microfluidic também estão comercialmente disponíveis (Lista de Materiais), assim o acesso a uma instalação de fabricação não é necessário. - Prepare No. 1 ½ vidros de cobertura (24 x 40 mm), lavando-se três vezes com acetona, seguido de três lavagens com etanol a 100% e três lavagens de água. Armazenar lamelas em água a 4 ° C até à sua utilização. Estes tratamentos ajudam a garantir que lamelas estão limpos de detritos que possam interferir com chapeamento de cells, contaminação e sobrevivência.
NOTA: A acetona e etanol são inflamáveis e perigosos em caso de contato com a pele (irritante), de contato com os olhos (irritante), de ingestão, inalação. Descarte de acordo com os regulamentos oficiais. - Quando estiver pronto para usar, coloque uma tampa de vidro em uma placa de 60 mm de cultura celular por dispositivo micro, e deixe secar descoberto por 45 minutos dentro de um gabinete de biossegurança para evitar a contaminação.
- Após dispositivos são cortados a partir dos mestres e dos punções têm sido cortada para criar os reservatórios (Figura 1A, B), colocá-los com os canais de microfluidos lado-se dentro de uma cabine de segurança biológica equipado com uma lâmpada de UV durante 45 min para a esterilização.
NOTA: Saindo de dispositivos sob tratamento UV por mais de 2 horas pode afetar a integridade dos PDMS. - Montar os dispositivos, colocando um dispositivo em cada tampa de vidro no interior do 60 milímetros de cultura de células de plástico prato de forma que os canais microfluídicos viradas para baixo. Aplique uma pressão suave para o topof o dispositivo (evitar tocar nos microcanais) para proporcionar uma vedação não permanente do dispositivo para o vidro de cobertura. Cobrir cada cultura de 60 mm de células prato com uma tampa.
- Usando uma micropipeta, hidratar os dispositivos através da adição de água de grau de cultura de células para os dois principais reservatórios de microfluidos (1 e 2 na Figura 1A), permitindo que a água flua através dele. Remover a água com uma micropipeta e adicionar 1 mg / ml de poli-L-lisina para o reservatório de microfluidos 1 (200 ul) e 2 (100 ul). O diferencial de volume irá permitir a poli-L-lisina a fluir através dos microcanais (Figura 1A, B).
- Para garantir que os dispositivos no interior das placas de cultura de 60 milímetros de células não tombar dentro de uma incubadora a 37 ° C, colocar três placas de cultura de células 60 milímetros contendo os dispositivos em uma célula de 150 milímetros de plástico prato de cultura e cobrir o prato com uma tampa. Incubar O / N em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. Normalmente mais de 90% dos canais são utilizáveis por dispositivo e fazernão contém quaisquer bolhas de ar ou obstrução física.
- No dia seguinte, substituir a poli-L-lisina com água e deixar dispositivo na incubadora durante pelo menos 1 hr. Repita esta lavagem três vezes. Remover a água e adicionar-Neurobasal Um meio de crescimento (contendo 2% de suplemento B-27 e 500? M GlutaMAX) para cada dispositivo. Deixar S / N em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
- No dia seguinte, as células do hipocampo placa conforme descrito abaixo.
2. chapeamento de Rato Hippocampal Primária Neurônios em dispositivos microfluídicos
NOTA: A preparação de neurônios do hipocampo de ratos neonatos em cultura foi publicado anteriormente em JoVE 25. Abaixo estão algumas modificações que foram adaptadas para os neurônios do hipocampo placa do mouse em dispositivos microfluídicos, e que eram ideais para transfections.
- Antes de dissecção cérebro do rato, por Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal pré-aquecer(FBS; sem antibióticos), Mistura A (125 mg de DL-cisteína, 125 mg de albumina de soro bovino (BSA) e 3,125 g de D-glucose em 500 ml de solução salina tamponada de fosfato (PBS); filtro de esterilização através de um filtro de 0,22 nm) , e desoxirribonuclease I solução (ADNase I: 50 mg de ADNase I e 0,5 ml de uma solução a 4 1,2 M de MgSO em 100 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) de filtro esterilizar através de um filtro de 0,22 um) em um C num banho de água a 37 °.
- Pré-quente Neurobasal-se um meio de crescimento dentro de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 para equilibrar o pH.
- Dissecar hipocampos 1-3 dias de idade camundongos recém-nascidos de acordo com protocolos estabelecidos 26. Manter hipocampos em um tubo de 15 ml contendo 10 ml de tampão de dissecção (HBSS contendo 10 mM de HEPES pH 7,4, glucose a 50 mM, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), em gelo. Ponha-se a 4 hipocampos por tubo de 15 ml.
- Execute o protocolo restante está sob condição estérils dentro de uma cabine de segurança biológica.
- Dilui-se 45 unidades de papaína em 5 ml de uma mistura, vórtice, e incubar durante 5 min a 37 ° C, até o pó de papaína é dissolvido. Adicionar 1 ml de solução de ADNase I. Filtrar a mistura através de uma unidade de filtro de seringa de 0,22 um.
- Cuidadosamente aspirado HBSS 'de tubo de 15 ml contendo hipocampos cônicos. Adicionar 10 ml de frio (4 ° C) para HBSS hipocampos e deixá-los assentar no fundo do tubo. Aspirar cuidadosamente HBSS de tubo de 15 ml.
- Adicionar 1 ml de papaína / ADNase I para misturar até 4 hipocampos e incubar durante 20-30 min a 37 ° C. Incline tubo cônico a cada 5 minutos para tomar banho hipocampos com mix. Alternativamente coloque hipocampos em uma temperatura de 37 ° C a água do banho shaker com agitação suave (~ 100 rpm).
- Aspirar papaína / ADNase I misturar e lavar duas vezes com DMEM hipocampos pré-aquecido (37 ° C) contendo 10% de FBS.
- Após segunda lavagem, adicionar 2 ml de DMEM pré-aquecido contendo 10% de FBS para hipocampos e hipocampos manualmente triturado por pipetagemcima e para baixo ~ 10-12 vezes utilizando uma ponta de pipeta de 1 ml para dissociar os neurônios.
- Vamos triturar contentar com ~ 1 min pois isso permitirá que os neurônios não-dissociada para resolver a parte inferior do tubo cônico. Transferir o sobrenadante contendo os neurónios dissociados para um novo tubo de 15 ml para evitar a transferência do tecido maior do que se estabeleceu no fundo do tubo.
- O Spin células a 1000 xg durante 2 min e cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Ressuspender as células em 80 mL Neurobasal-A meio de crescimento por pipetagem suavemente.
- Remova o meio de reservatório de microfluidos 1 e 1 '. Aplicar 20 ul de células (~ 275000) para um reservatório de microfluidos, e permitir-lhes a fluir. Colocar no dispositivo 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 durante 20 min.
- Olhe sob o microscópio para garantir que as células tenham aderido ao vidro da tampa. Adicionar Neurobasal-A meio de crescimento, para terminar todos os reservatórios. Dispositivo com as células e volta para uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO
- Confira todos os dispositivos de evaporação ~ 2-3 dias e reservatórios blusa com Neurobasal-A contendo 2% de B-27 suplemento (sem GlutaMAX) para evitar. Os neurônios começam a estender seus axônios através de canais microfluídicos ~ 2-3 dias após o plaqueamento. Neurônios sujeitos a transfecção normalmente 7-10 dias após o plaqueamento.
3. A transfecção de neurônios do hipocampo Cultivadas em dispositivo micro
- Por dispositivo, preparar uma mistura de 1.2 ul de Lipofectamina 2000, em 30 ul Neurobasal-A, e uma mistura de 0,5 ug fluorescente plasmídeo de fusão de carga em 30 ul Neurobasal-A e incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionar a mistura de Lipofectamine mistura de DNA e incubar durante 20 min à TA. Adicionar 60 mL de Neurobasal-A contendo 4% de B-27 suplemento ao DNA / Lipofectamine misturar e misturar sacudindo o tubo.
- Remova toda a mídia do reservatório microfluídica 2 e 2 'e cuidadosamente encher os poços com Neurobasal-A contendo 2% de B-27 suplemento sem derramar a médio into os outros compartimentos.
- Remova a mídia da microfluídica reservatório 1 e 1 '. Adicionar 120 mL de DNA / Lipofectamine misturar ao reservatório microfluídicos 1 e deixá-lo fluir. Dispositivo e volta para 37 ° C incubadora com 5% de CO 2 durante 3-4 horas.
- Remova toda a mídia do reservatório microfluídicos 1 e 1 'e substituir com Neurobasal-A contendo 2% de B-27 suplemento para 24 horas (ou até que esteja pronto para a imagem). Normalmente, 5-7 axônios que crescem através de microcanais são transf sob essas condições, que representam cerca de 1-3% a eficiência de transfecção de acordo com a eficiência publicados para células cultivadas do hipocampo 26.
4. Análise de "Mapeamento de carga"
- Imagens ao vivo da movimentação de cargas
- Realizar a imagiologia em um microscópio invertido de epifluorescência luz equipado com uma incubadora a 37 ° C e uma câmara de controlo de CO 2.
- Colocar a tampa com os neurônios do hipocampo cultivadas em um micrdispositivo ofluidic para o palco microscópio. Para evitar a morte neuronal, trabalhar rapidamente para manter as amostras no microscópio para não mais do que 1 hora.
- Usando um objetivo de alta resolução (100X), encontrar axônios das células transfectadas que se estendem através de canais microfluídicos de câmaras e registrar o número de canais em que foi encontrado o axônio transfectadas. Contar o número de canais utilizando um contador de contagem mão.
- Para a gravação de movimento óptima vivo e análise subsequente co-localização, escolher axónios que crescem relativamente plana, através dos canais de modo que a imagem latente da maior parte das vesículas pode ser realizada em foco.
- Remover a maior parte do meio a partir de reservatórios 2 e 2 'com uma pipeta de 1 ml de transferência de plástico. Para facilitar o alinhamento posterior de imagens fixas com as trajetórias de movimento em kymographs, alinhar a margem direita dos microcanais com o campo de visão durante o exame (Figura 1B, C).
- Para facilitar arrumadog das amostras durante a criação de imagens, realizar imagem ao vivo com duas pessoas. Alternativamente, se as imagens ao vivo é executada por uma única pessoa, use um sistema de microscópio equipado com correção de drift.
- Comece imagem movimentação de cargas ao vivo com as especificações de lapso de tempo específicos para a dinâmica de transporte de carga a ser analisados (especificações de microscópio e configurações para imagens YFP-PrP C são especificados na legenda da Figura 2 e Materiais lista).
- Depois que os dados de movimento ao vivo suficientes foram recolhidos, tem uma pessoa encher reservatórios 2 e 2 ', com pré-aquecido paraformaldeído 4% em PBS contendo 0,04 g / ml de sacarose para fixar as células. Evitar tocar no dispositivo de microfluidos, pois isso irá perturbar a focagem da imagem ao vivo. Tenha a outra pessoa ajustar o foco enquanto o fixador é adicionado. A fixação é bem sucedido quando a parada imediata do movimento é observado. Adicionar fixador para o reservatório 1 e 1 'em seguida.
NOTA: photoblea temporáriaChing da fluorescência de carga pode também ser observado, mas persiste a fluorescência após coloração IF para proteínas do motor é completada (passo seguinte).
NOTA: O paraformaldeído é nocivo por inalação, em contacto com a pele e por ingestão. Irritante para os olhos, vias respiratórias e pele. Descarte de acordo com os regulamentos oficiais.
- Se a coloração de proteínas motoras para a análise co-localização
NOTA: Para a quantificação dos níveis relativos de proteínas do motor (conforme determinado por coloração com anticorpo), associados às cargas móveis individuais, validar e titula-se anticorpos para assegurar que a ligação do anticorpo-antigénio está saturado. Isto é feito através da determinação da especificidade do anticorpo utilizando neurónios em que a proteína de interesse foi batido ou batido-fora ou para baixo, e através da realização de análise de IF com concentrações crescentes de anticorpo. Para controlos negativos, os neurónios são coradas com anticorpos secundários na ausência de anticorpos primários. Mais detalhadaDescrição de validação anticorpo pode ser encontrada em Encalada et al. 16, e Szpankowski et al. 20.- Retirar as lamelas com os neurônios do hipocampo cultivadas no dispositivo micro do palco microscópio. Não retire o dispositivo micro da lamela, como os microcanais precisa permanecer intacta, a fim de sobrepor as imagens ao vivo e fixo. Execute as seguintes etapas em uma câmara de umidade.
- Para assegurar o fluxo de soluções nos microcanais, manter um diferencial de volume do tampão entre os reservatórios 1, 1 'e 2, 2' de pelo menos 30 ul. em todas as etapas subseqüentes. Por exemplo, adicionar o volume de 100 ul de meios de reservatório de microfluidos 2, 2 ', e volume de suporte 70 ul de reservatório de microfluidos 1, 1'.
- Remover fixador de câmaras do dispositivo de microfluidos e lave as células três vezes com PBS à espera de 10 min entre as lavagens.
- Permeabilizar as células por adição de 0,1% de Triton X-100 Diluted em PBS durante 5 min para todos os reservatórios.
- Remova a solução de todos os reservatórios e lavar com PBS. Repita a lavagem três tempos de espera de 10 minutos entre as lavagens.
- Remoção da solução de todos os reservatórios e aplicar tampão contendo 10% de soro normal Donkey e 3% de protease livre e imunoglobulina G (IgG) de BSA em PBS livre de bloqueio e incubar durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
- O Spin solução estoque anticorpo primário a 20.000 xg durante 5 min para remover os precipitados. Dilui-se o anticorpo a uma concentração apropriada em tampão de bloqueio. Substituir o tampão de bloqueio a partir do dispositivo de microfluidos com a solução de anticorpo. Incubar as amostras durante 2 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C.
- Remoção da solução de todos os reservatórios e lavar três vezes com PBS, à espera de 10 min entre as lavagens.
- O Spin solução estoque anticorpo secundário a 20000 xg durante 5 min para remover os precipitados. Dilui-se o anticorpo a uma concentração apropriada em tampão de bloqueio. Substituir PBS com solução de anticorpo secundário. Incubaras amostras durante 1 h à TA.
- Remoção da solução de todos os reservatórios e lavar três vezes com PBS, à espera de 10 min entre as lavagens.
- Substituir PBS com ~ 10-20 ul de meio de montagem por pipetagem directamente meio de montagem na abertura dos canais de ligação entre os reservatórios. Deixe meios de montagem seco durante ~ 20 min - 1 h à TA.
- Armazene-a 4 ° C ao abrigo da luz para evitar a fotodegradação, e axônios imagem dentro de dois dias (máximo uma semana) de coloração.
- Após a coloração é concluída, montar lamela com os neurônios do hipocampo cultivadas no dispositivo micro para o palco microscópio. Localize a região do axônio transfectadas fotografada na etapa 4.1.1-4.1.7.
- Adquirir imagens Z-stack (300 passos nm) para cada um dos três canais: carga, motor 1, motor 2, utilizando uma objectiva de alta resolução (por exemplo, um objetivo de óleo ou água abertura numérica elevada).
NOTA: Aquisição de Z-pilhas é importante porque muitas vezes os axônios não crescem perfeitamente planaem microcanais e, por conseguinte, todos os pontos lacrimais fluorescente não estão no mesmo plano focal.
- Mapeamento de carga
- Gerar um quimógrafo de movimentação de cargas usando o software de análise de imagem. O plugin ImageJ desenvolvido pela Rietdorf e Seitz (EMBL) é recomendado para gerar kymographs (para download ver Lista de Materiais).
NOTA: ImageJ é um programa de processamento de imagem baseado em Java domínio público desenvolvido no National Institutes of Health 27,28 (para download ver Lista de Materiais). - Alinhar as imagens fixas da carga fluorescente (gerado no passo 4.2.14) manualmente, sobrepondo-as para a posição de as trajectórias no quimógrafo no ponto de fixação (Figura 2A, B), utilizando um programa de software de gráficos disponíveis comercialmente (Materiais List). Alinhar manualmente pelo primeiro sobrepondo a imagem de carga fixada na quimógrafo manualmente e escolhendo os pontos lacrimais de carga que corresponde a uma trajectória específica sobreo quimógrafo. Para obter melhores resultados do alinhamento, utilizar a fatia Z que é melhor em foco para a carga mapeada. Podem ser utilizadas várias fatias Z.
- Para cada imagem na pilha Z (de carga, motor 1 e motor 2; gerado na etapa 4.2.14) determinar as coordenadas XY e amplitudes de intensidade para cada puncta fluorescente usando um algoritmo criado para caber 2D Gaussians para a função de propagação do ponto que representa cada fonte pontual em cada um dos três canais 16,20,21 (Figura 2D).
NOTA: Para obter as coordenadas XY, um pacote de software MATLAB personalizado construído chamado de "Motor co-localização" foi desenvolvido 16,20, que incorpora um algoritmo de ajuste Gaussian desenvolvido pela Jaqaman, Danuser e colegas 21-23. O pacote de software e instruções detalhadas para a sua utilização pode ser obtida mediante solicitação. - Para cada um dos pontos lacrimais carga individual que foram mapeadas para as trajetórias móveis ou estacionários no quimógrafo, selecione tele coordenadas XY e amplitudes de intensidade a partir dos resultados do programa "Motor colocalização" (estas cargas são rotulados individualmente na Figura 2B). Use várias imagens Z-stack adquiridos na etapa 4.2.14) para mapear mais cargas que são encontrados em diferentes planos focais.
- Comparar as coordenadas XY do indivíduo para a carga mapeados aos obtidos para cada um dos canais a motor na fatia Z correspondente (Figura 2D). Determinar e selecionar as coordenadas XY motores que estão dentro de um raio de 300 nm da carga. Para cargas e motores que têm sinal dentro do mesmo plano focal, use o pacote de software "Motor co-localização" para determinar os pontos lacrimais que estão localizados dentro de um raio de 300 nm.
- Gerar um quimógrafo de movimentação de cargas usando o software de análise de imagem. O plugin ImageJ desenvolvido pela Rietdorf e Seitz (EMBL) é recomendado para gerar kymographs (para download ver Lista de Materiais).
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma vista geral do dispositivo de microfluidos usadas para crescer neurónios do hipocampo (Figura 1A, B). Os neurónios são banhados no reservatório 1. O tamanho dos microcanais impede a difusão dos corpos celulares (soma) no compartimento axonal enquanto que o comprimento dos canais evita projecções dendríticas a partir de atravessar todo o caminho para o compartimento axonal. Depois de ~ 2-3 dias em cultura, os neurônios começam a estender seus axônios através de microcanais no compartimento axonal (Figura 1B, C). Axónios transfectadas que expressam a proteína prião normal, marcado com proteína fluorescente amarela (YFP-PrP C) podem ser identificados por microscopia de fluorescência (Figura 1C). Expressão de proteínas marcadas com fluorescência, usando plasmídeo transfecção deve ser verificado para localização subcelular adequada e função como superexpressão pode introduzir artefatos experimentais devido a conformações de proteínas alteradas. Assim, colocalizatexperimentos de iões deve ser complementado tanto com estudos de co-precipitação bioquímicos, bem como com coloração IF para proteínas expressas endogenamente. O comportamento do YFP-PrP C usado aqui foi testado anteriormente 16. Expressão do YFP-PrP C em células de neuroblastoma transfectadas transientemente (N2a) foi baixa, sugerindo que a transfecção transiente não resulta em níveis de 16-YFP PrP C altamente sobre-expressos. Além disso, IF de células N2a transfectadas com YFP-PrP C utilizando anticorpos contra PrP C indicou que YFP-PrP C altamente colocalized com endógeno PrP C, o que sugere que ambos os transf e PrP endógeno C se comportava de forma semelhante. Para verificar que PrP C associada a motores, immunoisolations vesícula foram realizados 16.
Para os estudos de mapeamento de cargas óptimas, a borda direita dos microcanais é alinhada com o campo de visão durante vivo e fixo imaging, a fim de imagem da mesma região do axónio (indicado pelo rectângulo vermelho na Figura 1B, C). Figura 2 e Figura 3 mostra resultados representativos para a carga análises de mapeamento de neurónios transitoriamente transfectadas com YFP-PrP C. As vesículas que transportam YFP-PrP C são transportados em axónios de mamífero por membros da família de cinesina-1 e Dynein Cadeia Pesada 1 (DYNC1H1) 16, portanto vesículas YFP-PrP C foram mapeados para a cinesina-1 subunidade Cinesina Cadeia Leve 1 (KLC1) , e para DYNC1H1 motores. YFP-PrP C circulação vesícula foi representada por imagem e representados num quimógrafo (Figura 2A). Em kymographs, anterógrada e movimento retrógrado de vesículas YFP-PrP C é representado por trajectórias com declives positivos e negativos, respectivamente, e vesículas estacionárias são representados por trajectórias verticais. Na fixação, todo o movimento parou indicado pela ausência de linhas diagonais na quimógrafo(Figura 2A). O sinal de FI de motores moleculares e cargas em fixos, axônios permeabilizadas é pontuada 16 (Figura 2B, C). O objectivo de "mapeamento de carga" é para determinar se o canal de pontos lacrimais em carga (Figura 2B) colocalize com pontos lacrimais do motor (Figura 2C) nos outros dois canais. Para fazer isso, as imagens fluorescentes de vesículas YFP-PrP C fixos, e as imagens se de KLC1 e DYNC1H1 associado a puncta vesicular correspondentes foram alinhados à quimógrafo (Figura 2B, C). Funções gaussianas foram ajustados para as funções de ponto de propagação de fontes pontuais fluorescentes em todos os três canais, a fim de mapear as posições XY precisas de motores para trajetórias de carga obtidos por imagens ao vivo (Figura 2D). Expresso endogenamente motores KLC1 DYNC1H1 e aparecem como coloração pontilhada e colocalized diferencialmente com vesículas YFP-PrP C (Figura 2D). Colocalização foi definida pela presença de YFP-PrP C e pontos lacrimais do motor dentro de uma distância de 300 nm e quantificada por o nível de co-localização de coordenadas XY do Gaussian posições entre a YFP-PrP C e cada um dos pontos lacrimais e KLC1 DYNC1H1 (Figura 3A ). Esta distância foi escolhido com base nos óptica, limite de difração da luz, eo tamanho físico relevante da carga e motor subunidades. A quantidade relativa de KLC1 e DYNC1H1 associada com vesículas YFP-PrP C foi obtido a partir das amplitudes de Gauss, que representam as intensidades de cada pontos lacrimais (Figura 3B). Estes dados podem ser ainda analisados quanto desejado. Por exemplo, intensidades de motores colocalizing com YFP-PrP C puncta entre o controle (tipo selvagem - WT) neurônios e aqueles que não possuem outros Cinesina-1 subunidades (KIF5C - / - neurônios na Figura 3A, KIF5C é um membro da Cinesina-1 família), podem ser comparadas para determinar se a ausência de KIF5C perturba associação de KLC1 e / ou DYNC1H1 para vesículas YFP-PrP C (KLC1 e DYNC1H1 intensidades foram inalterada em nossos experimentos 16). Além disso, KLC1 e DYNC1H1 intensidades podem ser plotados para examinar possíveis correlações entre os valores relativos a motor e direcionalidade do movimento (Figura 3B). Por exemplo, as vesículas YFP-PrP C que estão em movimento e / ou estacionário associado com ambos KLC1 e / ou DYNC1H1 (Figura 3B).
Figura 1. neurônios cultivados em dispositivos microfluídicos. (A) Imagem de um dispositivo micro. Os contornos dos reservatórios são visualizados por corantes vermelhos e azuis. A numeração refere-se ao número de reservatórios de microfluidos usados em todo o protocolo. (B) Diagrama de um dispositivo de microfluidos. Os números correspondem aos reservatórios in que são adicionados mídia e neurônios. Neurônios transfectadas são mostrados em verde. Rectângulo vermelho e vermelho setas tracejadas indicam a região recomendado para imagiologia de fluorescência vivo e fixa. (C) Imagem de dois axónios transfectadas com YFP-PrP C em crescimento através de um único microcanal (microcanais e uma borda do dispositivo é delineada por linhas brancas pontilhadas) . Móveis individualmente vesículas YFP-PrP C podem ser distinguidos como brilhante pontos lacrimais. Barra de escala é de 10 mm. Figura é adaptado de:.. Encalada et al 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. "mapeamento Cargo" para correlacionar transporte vesícula YFP-PrP C comquantidades relativas de motores kinesin e dineína. Wide-campo imagens de fluorescência de movimento ao vivo e de cargas fixas foram tiradas em um microscópio invertido equipado com um palco motorizado e uma câmera CCD e um objetivo de óleo 100X / 1.4 NA. (A) quimógrafo de YFP -PrP C vesícula movimento de axónios mostrados na Figura 1C. Movimento vivo foi registada durante um tempo total que varia de 30 a 60 segundos a 100 ms de exposição (10 Hz). As células foram fixadas após imagiologia movimentação de cargas por pelo menos 15 segundos. A linha pontilhada indica o tempo de fixação durante imagens ao vivo. Caixa vermelha mostra a região de vesículas destacadas em (B, C) e ampliado em (D). As setas apontam para três vesículas mostrados em (D) correspondente ao estacionário (azul), retrógrada (vermelho), e anterógradas (verde) trajetórias. ( B) Imagem de vesículas fixos YFP-PrP C alinhados à quimógrafo correspondente. Os números indicam o emvesículas dividual YFP-PrP C que foram mapeados para identificáveis puncta no quimógrafo. Vesículas anterógrada são verdes, retrógrada são vermelhas, e os estacionários são azuis. (C) fixo, se as imagens de KLC1 e DYNC1H1 puncta correspondente à mesma região mostrada em (B). Barra de escala (AC) é de 10 mm. (D) Alargamento de fixo se os sinais de cada um dos três canais com 2D atribuições da função de Gauss. Os pontos azuis representam locais intensidade maxima pixels, pontos vermelhos representam ajustes de Gauss, e pontos-de-rosa são a sobreposição entre os dois. As setas indicam exemplos de vesículas YFP-PrP C mostrados em (A), e sua co-localização diferencial com proteínas motoras KLC1 e DYNC1H1. Barra de escala é de 2 mm. Figura é adaptado de:.. Encalada et al 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior do th é figura.
Figura 3. análises quantitativa de "mapeamento de carga" de vesículas YFP-PrP C. (A) Quantificação de co-localização entre vesículas YFP-PrP C, KLC1 e DYNC1H1 em WT e neurónios KIF5C knockout KIF5C (- / -). Número total de pontos lacrimais analisado foi N WT = 887 e N KIF5C - / -. = 1629 16 números dentro barras representam o número de vesículas por categoria. Mostrado são médias ± SEM. Teste não paramétrico de permutação t foi utilizado para comparação entre os genótipos 29. (B) Correlação de composição motora relativa e direcionalidade do movimento nos neurônios WT de dados analisados em (A). Figura é adaptado de: Encalada et al 16...jove.com / files / ftp_upload / 52029 / "target =" _ 52029fig3large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado permite a correlação de direcionalidade do movimento de partículas fluorescentes de carga em movimento baseado em microtúbulos individuais com o tipo de relação e quantidade de proteínas motoras associadas em neurônios vivos. Anteriormente, a composição do motor total de cargas vesiculares axonal foi analisada em populações heterogêneas de vesículas e organelas 9,15 bioquimicamente purificados. No entanto, a caracterização composição do motor para um único tipo de carga no interior de células tem sido um desafio devido à dificuldade em purificar as populações de vesículas homogéneos. Além disso, enquanto as medidas de motores tenda forças forneceu estimativas de números motoras ativas em embriões de Drosophila, não ficou claro se a direcionalidade do movimento correlacionado com motores a ser estavelmente ligado às cargas ou para a rápida associação / dissociação de motores ativos para / de carga 12. Portanto, o protocolo de "carga mapeamento" descricama aqui foi desenvolvido para investigar a correlação entre o tipo eo número relativo de motores associados a mover individualmente carga em neurônios vivos.
Para a obtenção de dados com sucesso a partir de "mapeamento de carga" é crítico para 1) realizar imagem de movimentação de cargas fixas e FI com uma resolução temporal e espacial elevada, 2) garantir a fixação imediata da amostra durante o curso de imagiologia, 3) alinhar a região de interesse em imagens ao vivo e fixos e mapear carga fixa e motores para kymographs movimento para as mesmas imagens, e 4) determinar com precisão as coordenadas XY de carga e puncta fluorescente do motor, a fim de determinar a quantidade de co-localização entre as proteínas de carga e motor.
Embora este protocolo é exclusivamente adequado para analisar as características de transporte em axónios uniformemente organizados de neurónios cultivados em dispositivos de microfluidos, que poderia ser adaptado a uma ampla variedade de questões de pesquisa. Por exemplo, este aplição pode ser utilizado para caracterizar associação de vesículas com as respectivas placas envolvidas no endo / exocitose (por exemplo, ensaios de tráfico de fibroblastos), ou o crescimento de microtúbulos marcados com proteínas de microtúbulos + ponta de ligação. Para estes, dispositivos microfluídicos poderia ser substituído por lamelas em grade para facilitar a localização das células fotografada necessárias para viver correlativo e estudos de imagem fixa. Este protocolo poderia também ser usado para caracterizar eventos celulares para os quais a alteração de parâmetros no tempo, dependendo do ambiente celular específica. Por exemplo, a libertação de uma proteína viral marcado por fluorescência a partir de estruturas individuais endossomal para o citoplasma pode ser correlacionada com a expressão e / ou da associação de proteínas endossomais.
Uma possível limitação deste protocolo é que o mapeamento das cargas de alta densidade pode ser difícil. No entanto, a atribuição de funções de Gauss contorna este problema, em grande medida, permitindo quedistinção de posições entre puncta fluorescente no nível de sub-pixel. Além disso, o mapeamento de motores para cargas axonal é de baixo rendimento: atualmente, o mapeamento pode ser feito por dois axônios por dispositivo micro, dada a baixa taxa de transfecção de neurônios eo campo de visão limitado ao usar a alta ampliação necessária para alta imaging resolução com a nossa câmera. Os futuros desenvolvimentos deste método pode incluir a utilização de sistemas de lentivírus para transduzir neurónios com maior eficiência, o isolamento dos neurónios de ratos transgénicos que expressam proteínas marcadas por fluorescência ou a rotulagem de organelos pequenos com corantes fluorescentes, tais como Lyso Tracker ou Mitotracker, todas as quais vão aumentar a número de axónios marcados com marcadores fluorescentes. Além disso, o tamanho da área gravada é limitada pela ampliação, o tamanho do pixel e o tamanho da matriz de pixels da câmara utilizada para imagiologia. Desenvolvimentos em curso no domínio das técnicas de imagem vai permitir maior áreas para ser trabalhada no futuro e, portanto, aumentar a quantidade de dados obtidos para cada condição experimental.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
