Abstract
Förstå de mekanismer genom vilka molekylära motorer samordna sin verksamhet för att transportera vesikulära laster inom nervceller kräver kvantitativ analys av motor / lastföreningar vid enstaka vesikler nivån. Målet med detta protokoll är att använda kvantitativ fluorescensmikroskopi att korrelera ("karta") position och riktning av förflyttning av levande last till styrelsens sammansättning och relativa mängderna av motorer som är förknippade med samma last. "Cargo kartläggning" består av levande avbildning av fluorescensmärkta laster som rör sig i axoner odlade på mikroflödessystem enheter, följt av kemisk fixering vid inspelning av live-rörelsen, och efterföljande immunofluorescens (IF) färgning av exakt samma axonal regioner med antikroppar mot motorer. Colocalization mellan laster med tillhörande motorer bedöms genom att tilldela delpixel positionskoordinater till motor och lastkanaler, genom att montera Gaussfunktioner till diffraktion-limited punkten spridningsfunktioner som representerar enskilda fluorescerande punktkällor. Fasta last- och motorbilder därefter överlagras på tomter av lasthantering, för att "kartlägga" dem till sina spårade banor. Styrkan i detta protokoll är en kombination av levande och IF data för att spela in både transport av vesikulära laster i levande celler och för att avgöra vilka motorer som är förknippade med dessa exakt samma vesiklar. Denna teknik övervinner tidigare utmaningar som använder biokemiska metoder för att fastställa den genomsnittliga motor sammansättningen av renade heterogena bulk vesikler populationer, eftersom dessa metoder inte avslöjar kompositioner på enskilda rörliga laster. Dessutom kan detta protokoll anpassas för analys av andra transporter och / eller människohandel vägar i andra celltyper för att korrelera förflyttning av enskilda intracellulära strukturer med sin proteinsammansättning. Begränsningar i detta protokoll är den relativt låga genomströmningen på grund av låga transfektionseffektiviteter av odladprimära nervceller och ett begränsat synfält för högupplösta bilder. Framtida applikationer kan omfatta metoder för att öka antalet nervceller som uttrycker fluorescerande laster.
Introduction
Intracellulär transport är kritisk i alla celltyper för leverans av proteiner, membraner, organeller och signalmolekyler till olika cellulära domänerna 1. Nervceller är specialiserade celler med långa, polariserade prognoser som kritiskt beroende av intracellulär transport av viktiga laster för sina långväga leverans till olika axonal mikro. Denna transport förmedlas av kinesiner och dyneins - två stora familjer av molekylära motorproteiner - som binder till last och spåra längs polarise mikrotubuli i antero och bakåtsträvande riktningar, respektive. Medan retrograd rörelse huvudsakligen medieras av dynein är rörelse i anteroriktningen underlättas av ett stort, funktionellt skiftande familj av kinesin motorer. Följaktligen kunde antero transport av axonal laster förmedlas av olika familjemedlemmar i kinesin super 1-5. Även om vissa laster rör sig ständigt i endera riktningen, mOst laster flytta dubbelriktat och vända ofta på väg till sin slutdestination 1,5-13. Vidare har det visat sig att motorerna till motsatta rikt associera samtidigt till last, upp frågan om hur reglerad förflyttning av laster koordineras av motsatt polaritet motorer 5-7. Tillsammans är transport av axonal last en samlad process som regleras av sammansättningen av motorer och deras specifika biokemiska aktiviteter, vilka i sin tur är beroende av olika adaptrar och reglerande bindningspartner 14.
För att troget beskriva mekanismen för axonal transport för en viss last och att avslöja den bakomliggande regleringen av att transporter är det av största vikt att bestämma sammansättningen av motorproteiner och regleringsbindningspartners i samband med enskilda laster under deras live transporten. Andra metoder, exempelvis biokemiska metoder, tillhandahålla beräkningar av genomsnitts MOTeller kompositioner på renade heterogena vesikler populationer, men dessa uppskattningar inte avslöjar vilken typ eller mängd motorer är associerade till enstaka rörliga vesiklar. Även beredning av vesikler transporter längs förmonterade mikrotubuli in vitro aktiverad mäta mängden en typ av motor på en vesikler nivå 15. Emellertid har dessa försök som inte direkt korrelerar antalet motorer med transport egenskaperna hos dessa vesiklar, och mätte transport i frånvaro av cellulära regulatoriska faktorer.
Ett protokoll presenteras här, som bestämmer motorsammansättningen (typ och relativa mängden av motorer) individuella rörliga vesiklar från immunofluorescens (IF) uppgifter som mäter endogent uttryckt motorproteiner, och korrelerar dessa parametrar för transport av levande exakt samma blåsor i nervceller 16. Metoden innebär noggrann kartläggning av IF-to-live lasthantering uppgifter. Detta åstadkommes genom att growing hippocampus mus nervceller i mikrofluidikanordningar följande etablerade protokoll 17 till 19. Dessa enheter kan för identifiering och korrelation ("mapping") av axoner och enskilda rörliga laster inom fast och levande ljus mikroskopi modaliteter (Figur 1). Odlade nervceller transfekteras med fluorescerande last proteiner vars transport avbildas med hög spatial och temporal upplösning för att få detaljerad rörlighet för information som är avsatt i kymographs. Under loppet av avbildning, är neuroner fixerades med paraformaldehyd och färgades därefter med antikroppar mot endogena motorproteiner. Fasta last- och motorbilder över på levande rörelse kymographs till "karta" (colocalize) dem till levande lasthantering banorna 16. För att korrelera den levande rörelsen av laster med sammanslutning av motorproteiner, är colocalization analyseras med hjälp av en specialtillverkad MATLAB programpaket som kallas "Motor colocalization "16,20. Fluorescerande laster och motorer genererar diffraktionsbegränsad punktat funktioner som delvis kan överlappa varandra. För att lösa placeringen av överlappande puncta passar programvaran först automatiskt Gaussfunktioner till varje punktspridningsfunktion, som representerar enskilda fluorescerande puncta, för att fastställa deras exakta XY delpixel positionskoordinater och intensitet amplituder 21-23. Positionerna för motorer och last är Därefter jämförs med varandra för att avgöra colocalization 16,20. Därför kan denna metod tilldelar mer exakt colocalization mellan fluorescerande puncta jämfört med andra metoder 24.
Styrkan med denna metod är förmågan att bedöma colocalization av motorer med individuell last i fasta celler, där levande rörelsebanor (t.ex. i vilken riktning de rör sig vid tidpunkten för fixering) har recorded. Med denna metod har kinesiner och dyneins fann att associera samtidigt till blåsor som bär det normala prionproteinet (PrP C -cellular), ett neuronalt berikat last som rör sig i två riktningar eller förblir stillastående i axoner 16. Denna analys tillät utformningen av en arbetsmodell för reglering av PrP C vesikelns rörelse där antero (kinesin) och bakåtsträvande (dynein) motorer samordna sin verksamhet för att kunna flytta blåsor i endera riktningen eller att stå stilla medan associerade till lasten . En annan styrka med denna metod är dess potentiella bred tillämpning för att karakterisera colocalization / sammanslutning av många fluorescerande laster som rör sig i stort sett varje celltyp, med något annat protein (er) av intresse. Således kunde leva / fast korrelation potentiellt kan påvisas av transienta proteinlast interaktioner, kan så många enskilda fluorescerande rörliga partiklar analyseras över en önskad period av tiden. Med tanke på den breda tillämplighet och den typ av frågor som denna metod kan hantera, kommer detta protokoll vara av intresse för en bred publik av cellbiologer inklusive de som studerar handel och transport i nervceller eller andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes efter godkända protokoll och enligt lokala riktlinjer för human vård av försöksdjur. Neonatal möss avlivades genom dekapitering.
1. Beredning av mikroflödessystem enheter för cellodling
- Förbered polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidikanordningar för tillväxt av hippocampus nervceller som beskrivs av Harris och kollegor 17-19. Nedan följer några modifieringar som har anpassats till last kartläggning protokollet.
OBSERVERA: Mikrofluidikanordningar är också kommersiellt tillgängliga (Materiallista), vilket således tillgång till en tillverkningsanläggning inte är nödvändig. - Förbered No. 1 ½ täckglas (24 x 40 mm) genom att tvätta dem tre gånger med aceton, följt av tre tvättar med 100% etanol och tre tvättar av vatten. Förvara täckglas i vatten vid 4 ° C fram till användning. Dessa behandlingar bidra till att täck är rena från skräp som kan störa plätering av cells, förorening, och överlevnad.
OBS: Aceton och etanol är brandfarliga och farligt i fall av hudkontakt (irriterande), av ögonkontakt (irriterande), av förtäring, av inandning. Kassera enligt myndigheternas föreskrifter. - När du är redo att använda, placera en täckglas i en 60 mm cellodlingsskål per mikroflödessystem enhet, och låt det lufttorka utan lock i 45 min i en biosäkerhet skåp för att undvika kontaminering.
- Efter enheter skärs ut av befälhavarna och stansar har skurits att skapa reservoarer (Figur 1A, B), lägg dem med den mikrofluidikkanaler sidan upp i en biosäkerhet skåp utrustad med en UV-lampa i 45 min för sterilisering.
OBS: Lämnar enheter under UV-behandling under längre tid än 2 timmar kan påverka integriteten av PDMS. - Montera enheterna genom att placera en enhet på varje täckglas på insidan av 60 mm plastcellodlingsskål så att mikroflödessystem kanaler nedåt. Tryck lätt till början of enheten (inte på de mikrokanaler) för att tillhandahålla en icke-permanent tätning av enheten till täckglaset. Täck varje 60 mm cellodlingsskål med ett lock.
- Använd en mikropipett fukta enheterna genom att lägga till cellodling kvalitet vatten till de bästa två mikroflödes reservoarer (1 och 2 i figur 1 A), så att vatten kan rinna igenom. Avlägsna vatten med en mikropipett och tillsätt 1 mg / ml poly-L-lysin i mikrofluidreservoaren 1 (200 | il) och 2 (100 ^ il). Volymen avvikelsen kommer att möjliggöra för de poly-L-lysin för att strömma genom mikrokanalerna (figur 1A, B).
- För att säkerställa att enheterna inuti 60 mm cellodlingsskålar inte välter i en 37 ° C inkubator, placera tre 60 mm cellodlingsskålar innehållande enheterna i en 150 mm plast cellodlingsskål och täck skålen med ett lock. Inkubera O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Typiskt mer än 90% av de kanaler som är användbara per enhet och görainte innehålla några luftbubblor eller fysisk blockering.
- På nästa dag, ersätter poly-L-lysin med vatten och lämnar anordningen i inkubator under åtminstone en timme. Upprepa denna tvätt tre gånger. Ta bort vatten och tillsätt Neuro-A tillväxtmedium (innehållande 2% B-27 tillskott och 500 iM GlutaMAX) till varje enhet. Lämna O / N i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Nästa dag, tallrik hippocampus celler som beskrivs nedan.
2. Plätering av Mouse hippocampus Primary nervceller i mikroflödessystem enheter
OBS: Beredningen av odlade hippocampus nervceller från nyfödda råttor har tidigare publicerats i JUPITER 25. Nedan följer några modifieringar som anpassades till platt mus hippocampus nervceller i mikrofluidikanordningar, och det var optimala för transfektioner.
- Innan mushjärna dissektion, för-varm Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum(FBS; utan antibiotika), Blandning A (125 mg DL-cystein, 125 mg bovint serumalbumin (BSA) och 3,125 g D-glukos i 500 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), filter sterilisera genom ett 0,22 ^ m filter) och deoxiribonukleas I-lösning (DNas I: 50 mg DNas I och 0,5 ml av en 1,2 M MgSO 4-lösning i 100 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) filtersterilisera genom ett 0,22 ^ m filter) i en 37 ° C vattenbad.
- Pre-varm Neurobasal-A tillväxtmedium i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 för att jämna ut pH.
- Dissekera hippocampi 1-3 dagar gamla nyfödda möss enligt etablerade protokoll 26. Hålla hippocampi i ett 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml dissektion buffert (HBSS innehållande 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glukos, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin), på is. Sätt upp till 4 hippocampi per 15 ml koniska rör.
- Utför de återstående protokoll är under sterilt skickar inuti en biosäkerhet skåp.
- Späd 45 enheter av papain i 5 ml av Blandning A, virvel, och inkubera under 5 min vid 37 ° C tills papain pulvret är upplöst. Tillsätt 1 ml DNas I lösning. Filtrera blandningen genom ett 0,22 | im sprutfilterenheten.
- Försiktigt aspirera HBSS "från 15 ml koniska rör innehållande hippocampi. Tillsätt 10 ml kall (4 ° C) HBSS till hippocampi och låta dem sedimentera till botten av röret. Försiktigt aspirera HBSS från 15 ml koniska rör.
- Tillsätt 1 ml papain / DNas jag blanda till upp till 4 hippocampi och inkubera i 20-30 minuter vid 37 ° C. Luta koniska röret var 5 min att bada hippocampi med mix. Alternativt placera hippocampi i ett 37 ° C vattenbad skakapparat med försiktig skakning (~ 100 rpm).
- Sug papain / DNase blanda och tvätta hippocampi två gånger med förvärmda DMEM (37 ° C) innehållande 10% FBS.
- Efter andra tvätt, tillsätt 2 ml förvärmd DMEM innehållande 10% FBS till hippocampi och manuellt finfördela hippocampi genom pipetteringupp och ner ~ 10-12 gånger med hjälp av en 1 ml pipettspets att dissociera nervceller.
- Låt finfördela nöja ~ 1 min eftersom detta gör icke-differentierade nervceller att sjunka till botten av den koniska tuben. Överför supernatanten innehållande dissocierade nervceller till en ny 15 ml koniska rör undvika överföring av större vävnad som har bosatt sig på botten av röret.
- Snurra cellerna vid 1000 xg under 2 min och ta försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten. Resuspendera cellerna i 80 l Neuro-A tillväxtmedium genom att pipettera försiktigt.
- Ta bort mediet från mikroflödes reservoar 1 och 1 '. Applicera 20 | il av celler (~ 275.000) till mikrofluidreservoaren 1, och tillåta dem att flöda igenom. Placera enheten i 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 20 min.
- Titta under mikroskop för att se till att cellerna har anslutit sig till skyddsglas. Lägg Neuro-A tillväxtmedium till toppen av alla reservoarer. Returanordning med celler till en 37 ° C inkubator med 5% CO
- Kolla enheter varje ~ 2-3 dagar och topp utanför reservoarer med Neurobasal-A innehållande 2% B-27 tillägg (utan GlutaMAX) för att undvika avdunstning. Nervceller börjar att förlänga sina axoner genom mikrofluidikkanaler ~ 2-3 dagar efter plätering. Ämnes nervceller transfektion vanligtvis 7-10 dagar efter plätering.
3. Transfektion av hippocampus nervceller Odlas i mikroflödessystem enhet
- Per enhet, förbereda en blandning av 1,2 pl Lipofectamine 2000 i 30 pl Neuro-A, och en blandning av 0,5 mikrogram fluorescerande last fusion plasmid i 30 pl Neuro-A och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur. Lägg Lipofectamine mix till DNA mix och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Lägg 60 pl av Neurobasal-A innehållande 4% B-27 tillägg till DNA / Lipofectamine mixa och blanda genom att ställa röret.
- Ta bort allt material från mikroflödes reservoaren 2 och 2 'och fyll upp brunnar med Neurobasal-A innehållande 2% B-27 tillskott utan att spilla på medellång into de andra facken.
- Ta ut mediet från mikroflödes reservoar 1 och 1 '. Lägg 120 pl av DNA / Lipofectamine mix till mikroflödes reservoar 1 och låta det flöda. Återgå enhet till 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 3-4 h.
- Ta bort allt material från mikroflödes reservoar 1 och 1 'och ersätta med Neurobasal-A innehållande 2% B-27 tillägg för 24 timmar (eller tills den ska bilden). Normalt är 5-7 axoner som växer genom mikrokanaler transfekterades under dessa förhållanden, som utgör cirka 1-3% transfektionseffektivitet förenlig med effektivitetsvinster som publicerats för hippocampus odlade celler 26.
4. "Cargo Mapping" Analyser
- Live avbildning av lasthantering
- Utför avbildning på ett inverterat epifluorescence ljusmikroskop utrustad med en 37 ° C inkubator och en CO2-kontrollkammare.
- Montera täckglas med hippocampusneuroner odlas i en MICRofluidic anordning på mikroskop scenen. För att undvika nervcellsdöd, arbeta snabbt för att hålla proverna vid mikroskopet under högst 1 timme.
- Med hjälp av en högupplöst mål (100X), hitta axoner av transfekterade celler som sträcker sig genom kanaler mikroflödeskammare och registrera antalet kanaler där transfekterade axon hittades. Räkna antalet kanaler med en hand tally räknare.
- För optimal inspelning av levande rörelse och efterföljande colocalization analys, välj axoner som växer relativt platt genom kanalerna så att avbildning av de flesta vesiklar kan utföras i fokus.
- Avlägsna det mesta av mediet från reservoarerna 2 och 2 'med en 1 ml plast överföringspipett. För att underlätta senare anpassning av fasta bilder med rörelsebanor på kymographs, rikta den högra kanten av mikrokanaler med synfältet under avbildning (Figur 1B, C).
- För att underlätta fixing av proverna under avbildning, spela live avbildning med två personer. Alternativt, om levande avbildning utförs av en enda person, använda mikroskop utrustat med drift korrigering.
- Starta bild levande lasthantering med time-lapse specifikationer specifika för transport dynamiken i lasten som analyseras (mikroskop specifikationer och inställningar för avbildning YFP-PrP C specificeras i legenden om figur 2 och Materials List).
- Efter har samlat in tillräckligt med levande rörelsedata, har en person fylla upp reservoarerna 2 och 2 "med förvärmda 4% paraformaldehyd i PBS innehållande 0,04 g / ml sackaros att fixera cellerna. Undvik att röra vid mikroflödessystem enhet, eftersom detta kommer att störa fokus för levande avbildning. Har den andra personen justera fokus medan fixativet sätts. Fixering är framgångsrikt när omedelbart stopp av rörelse observeras. Lägg fixativ till reservoaren 1 och 1 'efteråt.
OBS: Tillfällig photobleaching av last fluorescens kan också observeras, men fluorescens kvarstår efter IF färgning för motorproteiner är klar (nästa steg).
OBS: Paraformaldehyd är farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring. Irriterar ögonen, andningsorganen och huden. Kassera enligt myndigheternas föreskrifter.
- IF färgning av motorproteiner för colocalization analys
NOTERA: För kvantifiering av relativa nivåer av motorproteiner (såsom bestämts genom antikroppsfärgning), associerade till enskilda rörliga laster, validera och titrera-antikroppar för att säkerställa att den antikropps-antigenbindning är mättad. Detta görs genom att bestämma specificiteten av antikroppen med användning av neuroner i vilka proteinet av intresse har antingen knocked-out eller knackade-ner, och genom att utföra IF-analys med ökande antikroppskoncentrationer. För negativa kontroller, är neuroner färgade med sekundära antikroppar i avsaknad av primära antikroppar. Mer utförligbeskrivning av validerings antikropp kan hittas i al. Encalada et 16, och Szpankowski et al., 20.- Ta bort täckglas med hippocampusneuroner odlas i mikroflödessystem enhet från mikroskop scenen. Ta inte bort mikroflödessystem enhet ur täck, eftersom mikrokanaler måste förbli intakt för att överlagra de levande och fasta bilder. Utför följande steg i en fuktkammare.
- För att säkerställa flödet av lösningar in i mikrokanalerna, upprätthålla en buffertvolym avvikelsen mellan reservoarerna 1, 1 'och 2, 2' på minst 30 | il. i alla efterföljande steg. Till exempel lägga 100 pl medievolymen för mikroflödes reservoar 2, 2 ', och 70 pl medievolymen för mikroflödes reservoar 1, 1'.
- Ta bort fixativ från kamrarna i mikroflödessystem enhet och tvätta cellerna tre gånger med PBS väntar 10 min mellan tvättar.
- Permeabilisera celler genom tillsats av 0,1% Triton X-100 diluted i PBS under 5 min till alla reservoarer.
- Ta bort lösningen från alla reservoarer och tvätta med PBS. Upprepa tvätt tre gånger väntar 10 min mellan tvättar.
- Avlägsna lösningen från alla reservoarer och applicera blockeringsbuffert innehållande 10% Normal Donkey Serum och 3% proteas fri och immunglobulin G (IgG) -fri BSA i PBS och inkubera under åtminstone 30 min vid RT.
- Spin primär antikropp-stamlösning vid 20.000 xg under 5 minuter för att avlägsna fällningar. Späd antikropp till en lämplig koncentration i blockeringsbuffert. Ersätta den blockerande buffert från mikrofluidikanordning med antikropp-lösning. Inkubera proven under 2 h vid RT eller O / N vid 4 ° C.
- Avlägsna lösningen från alla reservoarer och tvätta tre gånger med PBS, väntar 10 min mellan tvättar.
- Spin sekundär antikropp-stamlösning vid 20.000 xg under 5 minuter för att avlägsna fällningar. Späd antikropp till en lämplig koncentration i blockeringsbuffert. Ersätt PBS med sekundär antikropp lösning. Inkuberaprover för 1 h vid RT.
- Avlägsna lösningen från alla reservoarer och tvätta tre gånger med PBS, väntar 10 min mellan tvättar.
- Ersätt PBS med ~ 10-20 pl monteringsmedium genom att direkt pipettera monteringsmedium i öppningen av kanalerna som förbinder reservoarerna. Låt montering media torka ~ 20 min - 1 timme vid RT.
- Förvara enheter vid 4 ° C, skyddat från ljus för att undvika fotoblekning och bild axoner inom två dagar (max en vecka) för färgning.
- Efter färgningen är klar, montera täckglas med hippocampusneuroner odlas i mikroflödessystem enhet på mikroskop scenen. Lokalisera regionen av den transfekterade axonet avbildas i steg 4.1.1-4.1.7.
- Förvärva Z-stack bilder (300 nm steg) för var och en av de tre kanalerna: last, motor 1, motor 2, med hjälp av en högupplöst mål (t.ex., en hög numerisk objektiv bländar olja eller vatten).
OBS: Förvärv av Z-stackar är viktigt eftersom axoner ofta inte växer helt platti mikrokanaler och därför inte alla fluorescerande puncta är i samma fokalplan.
- Cargo Mapping
- Generera en kymograph av lasthantering med hjälp av bildanalysmjukvara. ImageJ plugin utvecklats av Rietdorf och Seitz (EMBL) rekommenderas för att generera kymographs (för nedladdning se Materiallista).
OBS: ImageJ är ett offentligt område, Java-baserade bildbehandlingsprogram utvecklats vid National Institutes of Health 27,28 (för nedladdning se Materials List). - Rikta in de fasta bilder av det fluorescerande last (genererad i steg 4.2.14) manuellt genom att överlagra dem på positionen för de banor i kymograph vid punkten för fixering (figur 2A, B), med användning av ett kommersiellt tillgängligt plottning programvara (Material List). Rikta in genom att först överlagra den fasta last bilden på kymograph och manuellt välja den last puncta som motsvarar en specifik bana på manuelltden kymograph. För bästa justeringsresultat, använda Z skiva som är i bästa fokus för lasten kartläggas. Flera Z skivor kan användas.
- För varje bild i Z-stack (last, motor 1 och motor 2, genereras i steg 4.2.14) bestämma XY-koordinater och intensitets amplituder för varje fluorescerande puncta använder en etablerad algoritm för att passa 2D Gaussians till punktspridningsfunktion som representerar varje punktkälla i varje av de tre kanalerna 16,20,21 (figur 2D).
OBS: För att få XY koordinater, en specialbyggd MATLAB programpaket som heter "Motor colocalization" utvecklades 16,20, som innehåller en Gauss passande algoritm som utvecklats av Jaqaman, Danuser och kollegor 21-23. Programpaketet och detaljerade instruktioner för dess användning kan erhållas på begäran. - För var och en av de enskilt last puncta som avbildas på den mobila eller stationära banor på kymograph väljer tHan XY koordinater och intensitet amplituder från resultaten av "Motor colocalization" program (dessa laster är individuellt märkta i figur 2B). Använd flera Z-stack bilder som förvärvats i steg 4.2.14) för att kartlägga fler laster som hittats på olika fokalplan.
- Jämföra den individuella XY-koordinater för den mappade last till de som erhölls för var och en av de motorkanalerna i motsvarande Z-skiva (fig 2D). Bestäm och markera XY motor koordinater som ligger inom en 300 nm radie av lasten. För laster och motorer som har signal i samma fokalplan, använd "Motor colocalization" programpaket för att bestämma puncta som ligger inom en 300 nm radie.
- Generera en kymograph av lasthantering med hjälp av bildanalysmjukvara. ImageJ plugin utvecklats av Rietdorf och Seitz (EMBL) rekommenderas för att generera kymographs (för nedladdning se Materiallista).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en översikt av den mikrofluidanordning som används för att växa hippocampala neuroner (Figur 1A, B). Neuroner är pläterade på behållaren 1. Storleken på mikrokanalerna förhindrar diffusion av cellkroppar (soma) in i axonal utrymmet medan längden av kanalerna förhindrar dendritiska utsprång från att passera hela vägen till den axonal utrymmet. Efter ~ 2-3 dagar i kultur, börjar nervceller utvidga sina axoner över mikrokanaler i axonal facket (Figur 1B, C). Transfekterade axoner uttrycker normalt prionprotein märkt med gula fluorescerande protein (YFP-PrP C) kan identifieras genom fluorescensmikroskopi (Figur 1C). Bör kontrolleras uttryck av fluorescerande proteiner med hjälp plasmidtransfektion för korrekt subcellulär lokalisering och funktion som överuttryck kan introducera experimentella artefakter på grund av förändrade proteinkonformationer. Sålunda colocalization experiment borde kompletterat med både biokemiska medfällning studier, liksom med IF-färgning för endogent uttryckta proteiner. Beteendet hos YFP-PrP C används här testades tidigare 16. Uttryck av YFP-PrP C i transient transfekterade neuroblastomaceller (N2A) var låg, vilket tyder på att gående transfektion inte leder till kraftigt överuttryckta YFP-PrP C-nivåerna 16. Dessutom, om i N2A-celler transfekterade med YFP-PrP C med hjälp av antikroppar mot PrP C indikerade att YFP-PrP C högt samlokaliserades med endogen PrP C, vilket tyder på att både transfekterade och endogen PrP C betedde sig på samma sätt. För att förvissa sig om att PrP C förknippas med motorer, har vesikler immunoisolations utförts 16.
För optimal lastkartläggningsstudier, är den högra kanten av mikrokanaler i linje med synfältet under levande och fast imaging i syfte att bilden i samma region av axonet (indikeras med röd rektangel i figur 1B, C). Figur 2 och Figur 3 visar representativa resultat för lasten kartläggning analyser av neuroner transient transfekterade med YFP-PrP ^. Blåsor som bär YFP-PrP C transporteras i däggdjurs axoner av medlemmar i Kinesin-1 familj och dynein tung kedja 1 (DYNC1H1) 16, var därför YFP-PrP C vesiklar mappas till Kinesin-1 subenhet Kinesin lätt kedja 1 (KLC1) samt att DYNC1H1 motorer. YFP-PrP C vesikler rörelse avbildades och ritade i ett kymograph (Figur 2A). I kymographs är antero och bakåtsträvande rörelse YFP-PrP C vesiklar som representeras av banor med negativa och positiva backar, respektive, och stationära vesiklar avbildas med vertikala banor. Vid fixering, slutade all rörelse indikeras av frånvaron av diagonala linjer i kymograph(Figur 2A). IF-signalen av molekylära motorer och laster i fasta, permeabilized axoner är punktat 16 (Figur 2B, C). Målet med "last mapping" är att avgöra om puncta i lastkanalen (Figur 2B) colocalize med motor puncta (figur 2C) i de två andra kanalerna. För att göra detta, har fluorescerande bilder av fasta YFP-PrP C blåsor och IF bilder av motsvarande KLC1 och DYNC1H1 associerade till vesikulär puncta anpassas till kymograph (Figur 2B, C). Gaussfunktioner anpassades till punkt spridning funktioner fluorescerande punktkällor i alla tre kanaler för att kartlägga de exakta XY positioner motorer till last banor som erhållits genom levande avbildning (figur 2D). Endogent uttryckta KLC1 och DYNC1H1 motorer visas som punktformig färgning och samlokaliserades differentiellt med YFP-PrP C vesiklar (figur 2D). Colocalitionen definierades genom närvaron av YFP-PrP C och motor puncta inom ett avstånd på 300 nm och kvantifieras av graden av samlokalisering av Gauss XY-koordinerade ståndpunkter mellan YFP-PrP C och var och en av de KLC1 och DYNC1H1 puncta (Figur 3A ). Detta avstånd valdes baserat på optik, diffraktionsgränsen av ljus, och den relevanta fysiska storlek last- och motor subenheter. Den relativa mängden av KLC1 och DYNC1H1 samband med YFP-PrP C vesiklar erhölls från de Gaussiska amplituder, som representerar intensiteten hos varje puncta (figur 3B). Dessa data kan analyseras vidare om så önskas. Till exempel, intensiteter av motorer colocalizing med YFP-PrP C puncta mellan kontroll (vildtyp - WT) neuroner och de som saknar andra Kinesin-1-subenheter (KIF5C - / - nervceller i figur 3A är KIF5C medlem i Kinesin-1 familj), kan jämföras för att bestämma om frånvaron av KIF5C stör sammanslutning av KLC1 och / eller DYNC1H1 till YFP-PrP C vesiklar (KLC1 och DYNC1H1 intensiteter var oförändrade i våra experiment 16). Dessutom kan KLC1 och DYNC1H1 intensiteter ritas för att granska eventuella samband mellan relativa motor belopp och riktningen på rörelsen (figur 3B). Exempelvis YFP-PrP C vesiklar som är rörliga och / eller stationära associerad med både KLC1 och / eller DYNC1H1 (Figur 3B).
Figur 1. hippocampusneuroner odlades i mikrofluidanordningar. (A) Bild på en mikrofluidikanordning. Konturerna av reservoar visualiseras genom röda och blå färger. Numrering hänför sig till antalet av mikrofluidreservoarer som används i hela protokollet. (B) Diagram av en mikrofluidanordning. Siffror motsvarar reservoarer in som media och nervceller tillsätts. Transfekterade nervceller visas i grönt. Röd rektangel och röda streckade pilar anger regionen rekommenderas för levande och fast fluorescens avbildning. (C) Bild av två axoner transfekterade med YFP-PrP C växer genom en enda mikro (en mikro och änden på den enhet beskrivs med streckade vita linjer) . Individuellt rörliga YFP-PrP C vesiklar kan urskiljas som ljusare puncta. Skala bar är 10 mikrometer. Figur är anpassad från:.. Et al Encalada 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. "Cargo mapping" för att korrelera YFP-PrP C vesikler transporter medrelativa mängderna av kinesin och dynein motorer. Wide-fältfluorescensbilder av levande rörelse och av fasta laster togs på ett inverterat mikroskop utrustat med en motoriserad scen och en CCD-kamera och en 100X / 1.4 NA olja mål. (A) kymograph av YFP -PrP C vesikel förflyttning av axoner som visas i figur 1C. Live rörelse registrerades under en total tid i intervallet från 30 till 60 sek vid 100 ms exponering (10 Hz). Celler fixerades efter avbildning lasthantering i minst 15 sekunder. Prickad linje visar tidpunkten för fixering vid live-avbildning. Röd ruta visar regionen vesiklar lyfts fram i (B, C) och förstorade i (D). Pilspetsar pekar på tre blåsor som visas i (D) motsvarande stationära (blå), retrograd (röd), och antero (grön) banor. ( B) Bild av fasta YFP-PrP C vesiklar linje med motsvarande kymograph. Siffrorna visar ienskilt YFP-PrP C blåsor som mappade till identifierbara puncta på kymograph. Antero vesiklar är gröna, bakåtsträvande är röda, och stationära är blå. (C) Fast IF bilder av KLC1 och DYNC1H1 puncta motsvarar samma område som visas i (B). Scale bar (AC) är 10 ^ m. (D) Utvidgning av fast IF-signaler från var och en av de tre kanalerna med 2D Gaussfunktion uppdrag. Blå prickar representerar lokala intensitetsmaxima punkter, röda prickar representerar Gauss anfall, och rosa prickar är överlappningen mellan de två. Pilspetsar indikerar exempel på YFP-PrP C vesiklar som visas i (A), och deras differential colocalization med KLC1 och DYNC1H1 motorproteiner. Scale bar är 2 ^ m. Figur är anpassad från:.. Encalada et al 16 Klicka här för att se en större version av th är figur.
Figur 3. Kvantitativ analys av "last kartläggning" av YFP-PrP C vesiklar. (A) Kvantifiering av colocalization mellan YFP-PrP C vesiklar, KLC1 och DYNC1H1 i WT och KIF5C knockout neuroner (KIF5C - / -). Totalt antal puncta analyserade var N WT = 887 och N KIF5C - / -. = 1629 16 Siffror inom staplarna representerar antal vesiklar per kategori. Här visas medelvärden ± SEM. Icke-parametriska permutations t-test användes för jämförelse mellan genotyperna 29. (B) Korrelation av relativ motor sammansättning och riktningen på rörelsen i WT nervceller data som analyseras i (A). Figur är anpassad från: Encalada et al 16...jove.com / filer / ftp_upload / 52029 / 52029fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras här möjliggör korrelation av riktnings rörligheten för enskilda fluorescerande mikrotubuli baserade rörliga lastpartiklar med den relativa typen och mängden av tillhörande motor proteiner i levande neuroner. Tidigare var den totala motor sammansättningen av axonal vesikulära laster analyseras på heterogena populationer av biokemiskt renade blåsor och organeller 9,15. Dock har kännetecknar motorsammansättningen för en enda typ av last inuti celler varit utmanande på grund av svårigheten att rena homogena vesikler populationer. Dessutom, även om mätningar av motor stall-krafter förutsatt uppskattningar av aktiva motornummer i Drosophila embryon, var det oklart om riktningen på rörelsen korrelerad till motorer är stabilt bunden till last eller till den snabba förening / dissociation av aktiva motorer till / från last 12. Därför den "last kartläggning" protokoll descrisäng här utvecklades för att ytterligare undersöka sambandet mellan typ och relativa antalet motorer som är förknippade med individuellt rörliga last i levande nervceller.
För att framgångsrikt få data från "last mapping" det är viktigt att 1) utföra avbildning av lasthantering och fasta investeringsfonder med hög tids- och rumsupplösning, 2) säkerställa omedelbart fastställande av provet under avbildning, 3) rikta regionen intresse för levande och fasta bilder och kart fast last och motorer till rörelse kymographs för samma bilder, och 4) exakt bestämma XY koordinaterna av last och motor fluorescerande puncta för att bestämma mängden colocalization mellan last och motorproteiner.
Även om detta protokoll är unikt anpassad för att analysera transportegenskaper i enhetligt organiserade axoner av nervceller som odlas i mikroflödessystem enheter, kan det anpassas till ett brett spektrum av forskningsfrågor. Exempelvis denna Application kan användas för att karaktärisera sammanslutning av vesiklar med sina adaptrar involverade i endo / exocytos (t.ex. människohandel analyser i fibroblaster) eller tillväxt av mikrotubuli märkta med mikrotubuli + tips bindande proteiner. För dessa skulle mikrofluidikanordningar ersättas av rutindelade täck för att underlätta lokalisering av avbildade kroppar som behövs för korrelat levande och studier fasta imaging. Detta protokoll kan också användas för att karakterisera cellulära händelser, för vilka ett parameterförändringar i tid beroende på den specifika cellulära miljön. Till exempel kan frisättningen av ett fluorescerande virusprotein från enskilda endosomala strukturer i cytoplasman korreleras med uttrycket och / eller sammanslutning av endosomala proteiner.
En möjlig begränsning av detta protokoll är att kartläggningen av hög densitet laster kan vara svårt. Men tilldelningen av Gaussfunktioner kringgår detta problem till stor del genom attskillnaden av positioner mellan fluorescerande puncta på nivån delpixeln. Dessutom är kartläggningen av motorer till axonal laster med låg genomströmning: för närvarande, kan kartläggning göras för 2 axoner per mikroflödessystem enhet, med tanke på den låga transfektion av nervceller och den begränsade synfält när du använder hög förstoring är nödvändig för hög upplösning som avbildar med vår kamera. Framtida utvecklingar av denna metod kan innefatta användning av lentivirala system att transducera neuron med högre effektivitet, isolering av nervceller från transgena möss som uttrycker fluorescensetiketterade proteiner eller märkning av organeller med små fluorescerande färgämnen såsom Lysotracker eller Mitotracker, vilka alla kommer att öka Antalet axoner märkta med fluorescerande markörer. Vidare är storleken på det inspelade området begränsas av den förstoring, pixelstorleken och storleken på bildelementgruppen för den kamera som används för avbildning. Pågående utvecklingen inom avbildningstekniker kommer att möjliggöra större områdear som skall avbildas i framtiden och därför öka mängden data som erhållits per experimentell betingelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899-20mg | |
| D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x) | Life Technologies | 11965092 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10082147 | |
| Neurobasal-A Medium (1x) | Life Technologies | 10888022 | |
| B-27 Serum Free Supplement | Life Technologies | 10888022 | |
| GlutaMAX I Supplement (100x) | Life Technologies | 35050061 | |
| HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution) | Life Technologies | 24020117 | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x) | Life Technologies | 14190250 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140122 | |
| Corning cellgro Water for Cell Culture | Fisher Scientific | MT46000CM | |
| Papain | USB Corporation | 19925 | |
| DL-cysteine HCl | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DNAse I grade II | Roche Applied Sciences | 10104159001 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| Formaldehyde Solution 16% EM Grade | Fisher Scientific | 50980487 | Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| HEPES | Sigma | H-3375 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-0121 | |
| BSA fatty acid and IgG free | Jackson Immuno Research | 001-000-162 | |
| Acetone | Fisher Scientific | BP2403-4 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | |
| Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm | Corning | 2980-244 | |
| Axis microfluidic device, 450 µm | Millipore | AX450 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | ||
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | ||
| Coolsnap HQ camera | Roper Scientific | ||
| 60 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| 150 mm cell culture dish | Fisher Scientific | 12-565-100 | |
| Antibodies Used: | |||
| Anti-Kinesin light chain, V-17 | Santa Cruz | sc-13362 | specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100. |
| Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325 | Santa Cruz | sc-9115 | specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100 |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A31573 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody | Life Technologies | A11057 | recommended dilution 1:200. |
| Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A21447 | recommended dilution 1:200. |
| Plugins and Macros | |||
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/index.html. | ||
| ImageJ Kymograph Plugin | http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html. | ||
References
- Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
- Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
- Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
- Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
- Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
- Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
- Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
- Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
- Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
- Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
- Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
- Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
- Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
- Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
- Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
- Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
- Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Moore, D. S., McCabe, G. P. Introduction to the Practice of Statistics. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).
