Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Published: December 20, 2014 doi: 10.3791/52030
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

Abstract

Centrosomes הם אברונים קטנים אך חשובים, המשמשים כקטבים של ציר mitotic כדי לשמור על שלמות הגנומי או להרכיב cilia העיקרי כדי להקל על פונקציות חושיות בתאים. רמת חלבון עשויה להיות מוסדרת באופן שונה בcentrosomes מאשר במקומות אחרים .cellular, והשינוי ברמת centrosomal של כמה חלבונים בנקודות שונות של מחזור התא נראה חיוני לוויסות הנכונה של ההרכבה צנטריול. פיתחנו assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים המודד שינויים יחסי ברמת חלבון בcentrosomes בתאים קבועים ממדגמים שונים, כגון בשלבים שונים של מחזור התא או לאחר טיפול בחומרים כימיים שונים. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן המתאימה לחלבון באזור קטן, ולנרמל את המדידה שנגד אותם לחלבון אחר שאינו משתנה על פי ג הניסיוני נבחרondition. ניצול assay זה בשילוב עם דופק BrdU ואסטרטגיה מרדף ללמוד מחזורי תא מוטרדים, יש לנו כמותית תוקף התצפית האחרונה שלנו כי בריכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת בcentrosomes במהלך מחזור התא, סביר להניח בשפלה בתיווך פרוטאזום במיוחד בcentrosomes.

Introduction

Centrosomes מורכב של זוג centrioles מוקף חומר pericentriolar (PCM). להיות המרכזים המארגנים microtubule הגדולות (MTOCs) בתאי יונקים, centrosomes לשמש כשני הקטבים של צירים mitotic בתאים מתחלקים, ובכך לסייע לשמור על שלמות הגנומי 1. בתאים שקטים (לדוגמא, בשלב G0), אחד משני centrioles של centrosome, כלומר צנטריול אמא, הופך לגוף בסיסי להרכיב cilium העיקרי, אברון חושי הבולט החוצה מתא השטח 2. ברגע שהתאים להזין מחדש את מחזור התא, cilia העיקרי מפורק וכל צנטריול מכוון את ההרכבה של procentriole בקצה הפרוקסימלי שלה שמתארך בהדרגה ליצירת צנטריול בוגר 3. בתחילת S-שלב, מבנה דמוי גלגלון-המספק הסימטריה 9 פי לצנטריול נוצר על פני השטח של כל צנטריול הקיים ויהפוך את הבסיס של כל procentriole. t Sas6כובע הוא הכרחי להרכבת צנטריול מגויסת כדי ליצור את הרכזת של גלגלון 4-6. לאחר מכן חלבוני centriolar אחרים הם התאספו על גלגלון בפיקוח הדוק, הפרוקסימלי לאופן דיסטלי 7. לאחר שסיים בדיוק כפילות צנטריול, תאים להרכיב חומרי pericentriolar נוספים לבניית שתי centrosomes פונקציונלי בסוף שלב G2 8. בנוסף לרכיבי ליבת centriolar 9-11, כמה חלבונים אחרים, כולל קינאז, phosphatases, מלווים, רכיבי פיגום, חלבונים הקשורים קרום ומכונות השפלה משויך centrioles, גופים בסיסיים וPCM בזמנים שונים של מחזור התא 12-16. הוא ציין כי לעתים קרובות רמות centrosomal של חלבונים רבים מוסדרות באופן זמני על ידי מנגנוני מיקוד centrosomal ו / או השפלה proteasomal בcentrosomes. חשוב לציין, התנודות ברמת centrosomal של כמה חלבונים כגון Plk4, Mps1, Sas6, וCP110נקודות שונות t של מחזור התא נראית חיוני להסדיר הרכבה צנטריול 5,17-22, ובמקרה של Mps1 מניעת השפלה centrosomal זה מוביל להיווצרות של centrioles העודף 19. מצד השני, השברים centrosomal של כמה חלבונים הם פחות יציבים בהשוואה לבריכות cytosolic. לדוגמא siRNA בתיווך למטה ויסות של Centrin 2 (Cetn2) הוביל לירידה מתונה בלבד של רמת החלבון בcentrioles למרות ירידה גדולה ברמות התא כולו 23. לכן זה חיוני כדי למדוד את השינויים ברמה של חלבוני centrosomal בcentrosome ולא מדידת רמות חלבון תא כל עת הערכת פונקציות centrosome הספציפית שלהם.

במחקר זה פיתחנו assay באמצעות immunofluorescence העקיף (IIF) לכמת את הרמה היחסית של חלבון בcentrosomes. assay זו פותח במיוחד לאבחון תאים שנמצאים ממדגמים שוניםולכן לא יכול להיות צילם באותו הזמן. דגימות אלה יכולים להיות תאים שטופלו בחומרים כימיים שונים (כלומר, תרופה לעומת קבוצת ביקורת), שנאספו בנקודות זמן שונות (כלומר, דופק לעומת מרדף), או נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן מתאים לחלבון באזור קטן ולנרמל את הערך שנגד אותם לחלבון אחר שרמות לא להשתנות תחת תנאי ניסוי נבחרו. מספר מחקרים בביולוגיה centrosome לאחרונה נצלו טכניקות שונות כמותי מיקרוסקופיה, בשני תאי החיים או קבועים, כדי לקבוע את פונקצית centrosome הספציפית של חלבוני מועמד 24-27. בדומה למבחנים אלה, הטכניקה הנוכחית גם מודדת את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של חלבון המבחן. עם זאת, ההכללה של הנורמליזציה באמצעות תקן פנימי בassay זה היית צפוי להציע יותרדיוק וביטחון בניתוח שני מדגמים שונים שנמצאים בשני coverslips שונה. יתר על כן, בנוסף לבחינה של רמת החלבון בcentrosomes, עם התאמות קלות בשיטה זו יכולה להיות מיושמת על קבוצה מגוונת של תנאי ניסוי או באתרים סלולריים אחרים.

כאן, אנו משלבים assay מיקרוסקופיה הכמותי שלנו עם אסטרטגית דופק מרדף BrdU להשוות תאים משלבי מחזור התא שונים. במקום להשתמש בטכניקות עצירת מחזור התא סטנדרטית ושחרור ללמוד נקודות שונות בזמן מחזור התא, תאים גדלו באופן אסינכרוני מודגרת עם BrdU לתייג תאים בS-שלב, והתאים שכותרתו נרדפים לזמנים שונים (בדרך כלל 4-6 שעות). רוב התאים שכותרתו יהיה בשלב S-מייד לאחר הדופק. אורכו של המרדף נבחר כך שלאחר המרדף, תאים שכותרתו יהיו בS, G2, או מיטוזה מאוחר, אשר יכול להיות מאומת על ידי מאפיינים מורפולוגיים עמדת As- כזה של centrosomes ביחס לnucליי, מרחק בין centrosomes, עיבוי של כרומוזומים וכו 'לכן, לאורכו של המרדף תלוי במח"מ של S, G2 ושלב M של סוג תא מסוים. מאז גישה זו נמנעת מעכבי מחזור התא כגון hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, וכו ', זה מאפשר יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ניתוח מחזור התא.

לפיכך, אנו מראים כאן שassay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותית בלבד, או בשילוב עם assay דופק המרדף BrdU, הוא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי למדוד במדויק את השינויים יחסי ברמת centrosomal של חלבון מועמד במהלך מחזור תא מוטרד. מדדנו את רמת centrosomal של VDAC3, חלבון שזיהינו לאחרונה בcentrosomes בנוסף למיטוכונדריה 16,28, באמצעות מבחני אלה. תוצאות שהתקבלו כאן לאמת התצפית הקודמת שלנו שברכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה, וגם משתנה בdependen מחזור התאאופן t 16, יתר על כן אימות תחולתה של שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תרבות 1. תא

  1. השתמש הטלומרז אנושי הפוך transcriptase (hTERT) תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית הונצחו (hTERT-RPE1; המכונה כאן RPE1).
    הערה: תאי RPE1 הם תאים קרובים דיפלואידי, שאינו הופכים אדם שמשמשים בדרך כלל כדי ללמוד הרכבה צנטריול וciliogenesis. תאים אלה בצעו מחזור שכפול צנטריול נורמלי מתואם עם מחזור תא מוסדר.
  2. מעבר מנה כמעט ומחוברות 100 מ"מ תרבית תאים של תאי RPE1 ב 1: 5 דילול של התרבות המקורית לתוך צלחת 100 מ"מ טריים המכילה 10 מיליליטר של DME / F-12 (1: 1) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין G ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (הבינוני המלאה נקרא כDME / בינוני F-12). לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2.
    1. דגירה coverslips זכוכית העגולה 12 מ"מ ב 50 מיליליטר של 1 N HCl בכוס זכוכית מכוסה, O / N בלי לרעוד, ב 60 ° C באמבט מים או בחממה.
    2. After השלכת פתרון החומצה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ב 100 מיליליטר מים מזוקקים על ידי דוגרים למשך 15 דקות, כאשר מדי פעם טלטול. חזור על הכביסה באופן דומה, בשנת 70% אתנול ו -95% אתנול.
    3. יבש coverslips ידי בנפרד הפצה אותם על נייר סופג מעבדה בארון בטיחות ביולוגית, ואחריו עיקור בקרינת UV במשך 60 דקות.
  3. מניחים 2-4 coverslips היבש בצלחת תרבית תאי 35 מ"מ. לדלל את הפתרון של פיברונקטין או פיברונקטין כמו פולימר מהונדס (ריכוז מניות של 1 מ"ג / מיליליטר) לריכוז של 25 מיקרוגרם / מיליליטר בתרבית תאי PBS.
    1. הנח 80-100 μl של הפתרון המדולל על coverslip כל דגירה במשך 60 דקות למעייל בצד העליון של coverslip. שטוף את coverslips שלוש פעמים באמצעות PBS לפני הוספה בינונית מלא.

2. תאי גידול ותאי טיפול עם מעכבי פרוטאזום

  1. מעבר 2 x 10 5 אסינכרוני לגדולתאי ing RPE1 בכל מנה 35 מ"מ המכילים coverslips ולגדול התאים 2 מיליליטר בינוני מלא. החלף את מדיום התרבות כל שעות 24 עם בינוני מלא מראש חימם טרי.
    1. כדי לנתח את ההשפעה של עיכוב הפרוטאזום ברמת centrosomal של חלבון הבדיקה (כאן VDAC3 או γ טובולין), לגדול התאים בשתי מנות 35 מ"מ במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום להשלים ולהוסיף גם MG115 או DMSO כממס שליטה בריכוז סופי של 5 מיקרומטר או 0.05% בהתאמה. באותו הזמן, להוסיף BrdU לתאים בריכוז סופי של 40 מיקרומטר ודגירת תאים במשך 4 שעות.
    2. העבר את כל coverslip בצלחת 24 גם. להוסיף מתנול 500 μl המצונן היטב כל אחד ודגירת הצלחת ב -20 ° C במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים על coverslips. מייד לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם 500 חיץ לשטוף μl (1x PBS המכיל 0.5 מ"מ MgCl 2 ו 0.05% Triton-X 100).
  2. לקצור את השיירתאים מצלחת 35 מ"מ ו צנטריפוגות התאים XG ב 1000 במשך 5 דקות. השתמש בתא גלולה לנתח את החלבון הכולל ידי מערבי סופג (שלב 6).

3. דופק BrdU וצ'ייס Assay לנתח רמות חלבון בשלבי Cell Cycle שונים

  1. כדי לנתח את הווריאציה של רמת חלבון (כאן VDAC3, Sas6 או Cep135) בcentrosomes בשלבים שונים של מחזור התא, תאים לגדול בשתי מנות של 35 מ"מ המכילות coverslips במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום מלא המכיל 40 מיקרומטר BrdU דגירה התאים במשך 4 שעות בתרבית תאי החממה.
  2. מצלחת אחת, להעביר את coverslips לצלחת 24 גם כדי לתקן את התאים באמצעות מתנול הצונן כמתואר בשלב 2.1.2.
  3. אחרי דופק BrdU 4 שעות, להסיר את המדיום המכיל BrdU, לשטוף את התאים פעם עם PBS ופעם עם מדיום להשלים, להוסיף בינוני טרי, ולאחר מכן לגדול התאים בהעדר BrdU לזמנים שונים (בדרך כלל עוד 4 שעותלתאי RPE1) לפני תיקון התאים כמתואר בשלב 2.1.2.
    הערה: לתאי RPE1, רוב תאי BrdU חיובי נמצאים בS מאוחר או G2-שלב אחרי מרדף 4 שעות. זה צריך להיקבע באופן עצמאי לכל סוג תא.

4. Immunostaining

  1. דגירה תאים הקבועים על coverslips ב -200 μl חיץ חסימה (BSA 2% ו -0.1% TritonX-100 ב 1x PBS) למשך 30 דקות.
    1. דגירה התאים עם שילוב של נוגדנים ראשוניים (בדרך כלל אחד וגדל ארנב ועוד גדלו בעכבר) בדילול מלא בחסימת O החיץ / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified.
    2. כדי להפוך תא humidified, לשים נייר מגבת רטובה בחצי התחתון של תיבת קצה פיפטה 1,000 μl ריקה. הנח רצועת Parafilm על פני השטח המדף, ולזהות אגל (15-20 μl) של פתרון הנוגדן על Parafilm עבור כל coverslip להיות מודגרות. היפוך coverslip על טיפה של פתרון נוגדן (כך שתאים שקועים) וקרובמכסה קופסא הקצה.
    3. הפוך coverslips שוב ולהחזיר אותם בחזרה לצלחת 24 גם. לשטוף coverslips ואז דגירה אותם בתערובת 150 נוגדנים משני μl (כאן צבע נגד ארנב מצומדות ירוק-ניאון וצבע אדום-ניאון אנטי עכבר מצומדות דילול בחסימת מאגר) במשך שעה 1 ב RT. שטוף את coverslips שלוש פעמים.
      הערה: הנוגדנים משני fluorophore מצומדות הם רגישים לאור. להגן על הדגימות מן האור במהלך שלבים 4.1.3-5.1.2.
  2. היכונו לצביעה נגד BrdU על ידי תיקון תאי RPE1 המוכתם שוב עם מתנול המצונן 500 μl ב -20 ° C למשך 10 דקות, כמתואר בשלב 2.1.2. שטוף את coverslips שלוש פעמים.
    הערה: קיבעון זה מאבטח את תיוג הנוגדן הראשוני והמשני של החלבון (ים) של עניין בתהליך הידרוליזה החומצה בשלב הבא.
    1. דגירה התאים ב -200 μl של 2 N HCl למשך 30 דקות ב RT. לנטרל עם 300 μl של 1 M טריס-Cl, pH 8ד לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף.
    2. חסום את התאים שוב באמצעות 200 μl חיץ חסימה למשך 30 דקות ב RT.
    3. דגירה התאים עם נוגדן אנטי BrdU חולדה (בדילול בחסימת מאגר) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified. להחזיר את coverslips חזרה לצלחת 24 גם, לשטוף אותם ולאחר מכן דגירה עם נוגדן כחול-ניאון הצבע מצומדות אנטי-עכברוש המשני (בדילול מלא 150 μl חיץ חסימה בצלחת 24 גם עבור שעה 1 ב RT.
  3. שטוף את coverslips שלוש פעמים. ספוט אגל (בערך 3-6 μl) של פתרון הרכבה המכיל antifade מגיב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. היפוך coverslip, עם התא בצד פונה כלפי מטה, על פתרון ההרכבה. נגב נוזל עודף בעדינות על ידי לחיצה על coverslip נגד השקופית באמצעות רקמות רכות ניקוי. החל לק שקוף בשולי coverslip כדי לאטום אותו לשקופית מיקרוסקופ.

תמונת Immunofluorescence 5. Acquisition וניתוח

  1. השתמש במטרת 100X תכנית Apo טבילת שמן (עם צמצם מספרי 1.4) לרכישת התמונות של תאי RPE1 BrdU חיובי בטמפרטורת הסביבה.
    1. שים שקופיות במיקרוסקופ (ראה ציוד) מצורף עם מצלמה מסוגלת הדמיה דיגיטלית. עבור כל fluorophore, לקבוע את זמן החשיפה המתאים (בדרך כלל בין 300-1,000 אלפיות שני) על ידי בחינת אופן ידני את כל דוגמאות של ניסוי. לפני רכישת תמונות של תא, לקבוע באופן ידני העליון המתאימות ומישור מוקד תחתון לאורך ציר Z-(בדרך כלל 0.2 מיקרומטר גודל צעד). לרכוש תמונות של מדגמים שונים שנמצאים על coverslips הנפרד באמצעות זמן חשיפה זהה לfluorophores שונה לאורך ציר Z-שימוש בחבילת תוכנת הדמיה מיקרוסקופית דיגיטלית.
  2. בצע deconvolution (במקרים אלה באמצעות אלגוריתם לא השכן) של כל ערימות התמונה שנרכשו לאורך ציר Z-.
    1. השג את הקרנת העצמה הכוללת של כל ערימת תמונה לאורךZ-הציר.
  3. בתאים שבם centrosomes קרוב (מרחק בין שתי centrosomes הוא פחות מ -2 מיקרומטר), לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 20-30 פיקסלים לכל צד) סביב שני centrosomes וסמן את השטח שנבחר.
    1. לצייר ריבוע גדול יותר (בדרך כלל 24-35 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר לכיכר הגדולה.
    2. השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה (S מציין קופסא קטנה וL מציין קופסא גדולה).
    3. לנתח את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של כל fluorophore באמצעות הנוסחא שתוארה על ידי Howell et al 29:. F = F S - [(L F - F S) x S / (L - S)].
    4. השג את עוצמת הקרינה המנורמלת של החלבון של עניין (כאן VDAC3 או Sas6) על ידי חישוב יחס עוצמת הקרינה מתוקן רקע fluorophore לזה של fluorophore משמש להתקן שנבחר על פנימי (כאן γ טובולין, Sas6 או Cep135).
  4. במקרה של ניתוח תאים בי centrosomes מופרדים היטב (מרחק בין שתי centrosomes יעלה על 2 מיקרומטר), לנתח כל centrosome בנפרד על ידי ציור שתי קבוצות נפרדות של תיבות. לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 15-25 פיקסלים לכל צד) סביב כל centrosome וסמן את השטח שנבחר. לצייר ריבוע גדול יותר (20-30 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר.
    1. השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה, ולחשב את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל fluorophore, בנפרד עבור כל centrosome, כמתואר בשלב 5.3.3.
    2. מערבבים את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל חלבון משני centrosomes להשיג את רמת centrosomal הכוללת של חלבון שבתא ש.
    3. השגעוצמה מנורמלת לחלבון של עניין על ידי חישוב יחס עוצמת centrosomal הכוללת שלה לעצמת centrosomal הכוללת של התקן הפנימי.
  5. לנתח לפחות 15-25 תאים לכל תנאי ניסוי ואת העלילה הגרף בגיליון אלקטרוני.

6. ניתוח החלבון סה"כ שימוש סופג מערבי

  1. Resuspend תאי assay radioimmunoprecipitation חיץ (ריף) המכיל pH 50 מ"מ טריס-HCl 8, 150 מ"מ NaCl, 1% P-40, 1% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet (SDS) ודגירה של 10 דקות על קרח לlyse התאים.
    1. צנטריפוגה את התערובת על 10,000 XG במשך 10 דקות, להפריד את lysate מחלק גלולה ולמדוד את ריכוז החלבון הכולל של כל lysate באמצעות ערכת assay חומצת bicinchoninic (BCA).
  2. מערבבים 40 מיקרוגרם של lysate עם חיץ 4x SDS-PAGE טעינה (50 מ"מ טריס-Cl, pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 100 מ"מ dithiothreitol, ברום 0.1%ophenol כחול).
    1. מרתיחים את הדגימות למשך 10 דקות ולהפעיל את הדגימות על 12.5% ​​denaturing SDS-PAGE במתח קבוע של 200 V.
  3. העבר את החלבונים מופרדים על SDS-PAGE על קרום nitrocellulose באמצעות טכניקה מערבית סופג (במתח קבוע של 90 V עבור שעה 1 בקור).
    1. חסום את הממברנה עם חלב 3% דל שומן ב1x PBS, ולאחר מכן דגירה הקרום עם פתרונות של נוגדנים עיקריים בדילול מלא (במקרה ארנב נגד VDAC3, אנטי-α-טובולין ארנב נגד γ טובולין ועכבר זה) ל1 שעות על RT.
    2. לאחר שטיפת הקרום שלוש פעמים (כל אחד דגירה 5 דקות תחת רועד) באמצעות חיץ PBS-T (1x PBS ו -0.2% Tween-20), דגירה הקרום בתערובת של קרוב אינפרא אדום-צבע פלואורסצנטי (IR) נגד ארנב מצומדות ו נוגדני צבע פלואורסצנטי IR מצומדות אנטי עכבר משניים (בדילול מלא PBS-T) במשך שעה 1.
    3. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ולאחר מכן לסרוק את הקרום לנתח את הלהקות באמצעות f אינפרא אדוםמערכת ההדמיה luorescence מתאימה לזיהוי immunoblot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המחקרים האחרונים שלנו זיהו לוקליזציה רומן centrosomal ותפקוד של VDAC3, אחד מporins המיטוכונדריה 16,28. Immunostaining של מספר תאי יונקים כוללים תאי RPE1 באמצעות נוגדן VDAC3 ספציפי הראה צביעת centrosomal בולטת והכתמה של המיטוכונדריה חלשה יחסית. אנחנו גם הראו כי VDAC3 centrosomal קשור באופן מועדף עם צנטריול אמא, ובריכת centrosomal של שני אנדוגני וectopically הביע VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה 16. על מנת לאמת את assay IIF הכמותי בחנו את השינויים בבריכת VDAC3 הקשורים centrosome בתאים הנמצאים בS-שלב.

כאן, טופלו תאי RPE1 גדלו באופן אסינכרוני עם או MG115 מעכבי פרוטאזום או DMSO ממס השליטה למשך 4 שעות. כדי להגביל את הניתוח שלנו לתאים שנמצאים בשלב S-ועובר הרכבה centrosome, בדקנו תאים שהתאגדו BrdU du רקלצלצל אותו 4 שעות והיו לו שתי centrosomes צפופים (במרווחים בתוך 2 מיקרומטר של אחד את השני). בדקנו שדות אקראיים מרובים של תאים מוכתמים עבור BrdU וגרעינים משתי השליטה וטיפול MG115 (איור 1 א) למסקנה שהטיפול הקצר של MG115 לא השפיע על שילוב BrdU (בערך 58%) בהשוואה לטיפול ביקורת (בערך 56%) בתאי RPE1. כפי שהיינו משווים רק תאים שהיו בS-שלב (כמו להישפט על ידי הנוכחות של שני מוקדים γ טובולין מרווחים בתוך 2 מיקרומטר של אחד את השני), אנו נחשבים γ טובולין כסטנדרט פנימי פוטנציאל לנורמליזציה. לפיכך, נבחנו תחילה אם רמות γ טובולין centrosomal בתאי BrdU החיובי להשתנות על עיכוב פרוטאזום. שלא במפתיע, הייתה וריאציה תא אל התא ניכר בעוצמת הקרינה γ טובולין מתא אחד למשנהו, ומצאנו כי וריאציה זו הוצגה הטובה ביותר בדיאגרמות תיבה ושפם שתצגנה את הנתונים שנקבעו בכללות זמינה. אנידיאגרמות תיבת n ושפם, תיבות מייצגות את הרבעון התחתון ועליון, הסמן בתיבה מציין את החציון של כל סדרה, והשפם מייצג ערכי מינימום ומקסימום, כי הם לעתים קרובות (אם כי לא תמיד) חריגים. כפי שניתן לראות באיור 1D, רמת γ טובולין centrosomal לא הייתה שונה באופן משמעותי בין תאי BrdU החיובי שטופלו בשני MG115 או DMSO, וכך אימות γ טובולין כתקן לניסוי זה פנימי. בניגוד לγ טובולין, עוצמת הקרינה מתוקנת הרקע המתאים לVDAC3 centrosomal הייתה בערך פי 2.5 גבוהים יותר בתאים שטופלו-MG115 מאשר בתאי ביקורת (איור 1 ג). כאשר אנו מנורמלים הקרינה VDAC3 כוללת נגד זה של γ טובולין, הגידול של פי ירד מעט ל בערך כפול (איור 1E). למרות שינוי הקיפול היה גדול יותר ללא נורמליזציה, יש לנו יותר ביטחון בדיוקם של הנתונים מנורמלים, שבו אנו מרגישים בטבקרות אה לכל השפעה כללית של טיפול MG115, כמו גם וריאציה בשל עיבוד מדגם. צביעת VDAC3 באתרים לא centrosomal (איור 1) או הרמה התאית הכוללת של VDAC3 (איור 1F) לא הושפעה מעיכוב פרוטאזום. לפיכך, אנו כמותית לאמת התצפית הקודמת שלנו, כי בריכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה בתיווך פרוטאזום.

כדי למדוד את השינוי בVDAC3 centrosomal במהלך מחזור התא שכותרתו התאים עם דופק BrdU 4 שעות ואחריו מרדף 4 שעות של התאים שכותרתו. מאחר שרק תאי S-שלב ישלבו BrdU במהלך הדופק (מרחק ממוצע בין שתי centrosomes הוא 1.35 ± 0.16 מיקרומטר), רוב תאי RPE1 BrdU החיובי לאחר 4 שעות מרדף יהיה בבית או מאוחר S-שלב או שלב G2 המוקדם ( מרחק ממוצע בין שתי centrosomes הוא 1.55 ± 0.22 מיקרומטר), עם אוכלוסייה קטנה בשלב מאוחר G2 בי centroכמה זוג נפרד באופן משמעותי (מרחק ממוצע בין שתי centrosomes> 2 מיקרומטר) 30. γ טובולין, בהיותו מרכיב PCM גדול מאוד מצטבר בcentrosomes במהלך התבגרות centrosome שמתרחשת בשלב G2 31,32, וגידול זה הופך אותו לסטנדרט פנימי עני להערכת וריאציות מחזור התא של חלבוני centrosomal אחרים. מצד השני, Sas6 מגויס לprocentrioles במהלך S-שלב מוקדם כדי לעורר הרכבה של גלגלונים 4,5,7, ונשאר בבסיס centrioles שהוקם זה עתה, עד שתאים להיכנס מיטוזה כאשר הוא מתחיל להיות מושפל (איור 2 והתייחסות 5). עם זאת, בתאים הלה או U2OS, רמת centriolar של Sas6 מגדילה בהדרגה כתאים להתקדם מS-שלב לשלב G2 5. לכן, אנו נמדדים רמת Sas6 centrosomal ראשון ביחס לזה של Cep135, חלבון אחר ליבת centriolar שמתאים לקצוות הפרוקסימלי של centrioles לאורךמחזור התא 33. "קרוב" מרחק תאים בי ממוצע בין שני; אנחנו לא רואים שום הבדל משמעותי בעוצמות הקרינה הכוללת מתוקן רקע Cep135 או Sas6 בתאי RPE1 BrdU חיובי מדופק או מרדף, כאשר centrosomes הם צפופים (איור 3 א-D centrosomes הוא פחות מ -2 מיקרומטר). בהתאם לכך, רמת Sas6 המנורמלת נותרה דומה בתאים אלה (איור 3E). עם זאת, צפינו עלייה מתונה בערכי עוצמת הקרינה הכוללים של Sas6 ועלייה קלה של אותו לCep135 בתאים שבם centrosomes מופרד היטב (מרחק בין שתי centrosomes> 2 מיקרומטר; תאים "רחוקים"). בהתאם לכך, הרמה המנורמלת הכוללת centrosomal Sas6 בתאים עם שתי centrosomes מופרד היטב הייתה מעט, אבל מבחינה סטטיסטית גבוהה באופן משמעותי מזה שבתאים עם centrosomes צפופים. זה כנראה עקב הרגולציה הטבועה של שנינות רמת Sas6התקדמות מחזור תא h 5. עם זאת, אפשר גם שהעליות קלות (שאו של מובהקות סטטיסטיות נמוכות יותר) הן תוצאה של הוספת עוצמות הקרינה של שתי centrosomes שנותחו בנפרד, בהשוואה לניתוח שני centrosomes באותו הזמן בתאים עם centrosomes צפופים. עם זאת, כאשר עוצמת הקרינה של VDAC3 הייתה מנורמל לזה של Sas6 לבד, רמת VDAC3 בשני centrosomes צפופים הוגדלה בערך 1.5 קיפול בתאים הנמצאים בS- / G2-שלב מוקדם מאוחר, בהשוואה לS-השלב מוקדם תאים (איור 4 א-C, F; תאים 'קרובים'). כאשר תאים אלה להתקדם לשלב G2 מאוחר, רמת VDAC3 המנורמלת בשני centrosomes הופחתה פי 2.4 בהשוואה לזה שבS-שלב מאוחר (איור 4C, F).

בגלל רמות Sas6 להגדיל מעט מS-שלב מאוחר G2, באמצעות Sas6 כסטנדרט פנימי מוביל להערכת יתר קלה של דצמברrease ברמות VDAC3 בתאי G2-שלב מאוחרים (centrosomes מופרד על ידי יותר מ 2 מיקרומטר). הנתונים שלנו מצביעים על כך שלמרות שCep135 היא בחירה טובה יותר כסטנדרט להערכת וריאציות מחזור התא פנימי, אנחנו לא יכולים להשתמש בו לVDAC3 כי נוגדני VDAC3 וCep135 הזמינים לנו, שניהם מארנב. עם זאת, הכפלת הערך החציוני לVDAC3 Sas6-מנורמל (F VDAC3 / F Sas6) על ידי הערך החציוני של Sas6 המנורמל-Cep135 נותנת לנו ערך מקורב לx VDAC3 Cep135-מנורמל [(F VDAC3 / F Sas6) (F Sas6 / F Cep135) = F VDAC3 / F Cep135]. כאשר ביצענו ניתוח זה, השינוי ברמות VDAC3 בין G2 מאוחר S / מוקדם ומאוחר G2 טיפות מעט לפי 2. תאי BrdU חיובי שנמצאים בכל שלב של מיטוזה כמו להישפט על ידי הכרומוזומים תמצית וצביעת Sas6 חלשה אינם נכללים בניתוח שלנו, כתוצאה מהירידה הדרמטית ברמות Sas6. עם זאת, ציינו כי VDAC3 centrosomal הרמה מחדשmained נמוך במהלך מיטוזה (מידע לא מוצג). בגלל רמות Cep135 אל תפילו במהלך מיטוזה (מידע לא מוצג), אנחנו יכולים באופן עקרוני לחזור על התהליך מחדש הנורמליזציה להעריך את רמות VDAC3 Cep135-המנורמלת במיטוזה. עם זאת, במציאות רמות Sas6 centrosomal במיטוזה היו משתנים מדי כדי לאפשר לקביעה מדויקת של רמות VDAC3 Sas6-מנורמלות במקום הראשון. ללא קשר, הכוללים, הנתונים שלנו וידאו שברכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת בcentrosomes במהלך מחזור התא.

איור 1
1. תאי RPE1 גדלו באופן אסינכרוני איור הודגרו עם BrdU וMG115 (MG) ​​או DMSO (DM) במשך 4 שעות. () מוצגים הם שדות אקראיים של DMSO או MG115 טופלו תאים מוכתמים עם נוגדן אנטי BrdU (אדום) וHoechst ( DNA; כחול). כאן ובכל תמונות האחרות בר מייצג את 5 מיקרומטר.(BE) שטופל DMSO או MG115 תאים הוכתמו נוגדנים נגד VDAC3, γ טובולין וBrdU. תאי BrdU החיובי היו צילמו בתנאים זהים הדמיה (חשיפה הגיעה זמני 400 אלפיות שניים לfluorophore / BrdU הכחול; 500 אלפיות שני לfluorophore / VDAC3 ירוק; 300 אלפיות שניים לfluorophore האדום / γ טובולין), והרקע תיקנו עוצמות הקרינה של VDAC3 ו γ טובולין נקבע. תמונות נציג מראים VDAC3 (VD3; ירוק), γ טובולין (γ-אמבטיה; אדום) וBrdU (הכחול) מוצגות ב( B). כאן ובכל תמונות האחרות, ריבועים להראות דיגיטליים מוגדלים centrosomes כפי שצוין על ידי הריבועים. עוצמות הקרינה הרקע מתוקנת (F; ביחידות שרירותיות) המתאימות לVDAC3 וγ טובולין מעשרים וחמישה תאים הם זממו בתרשים תיבה ושפם ב( C) ו- (ד) בהתאמה. כאן ובכל המקרים האחרים, תיבות מייצגות תחתונה ועליון רבעון, marker בתיבה (-) מציין את החציון של כל סדרה, והשפם מייצג ערכי מינימום ומקסימום. ערכי עוצמת הקרינה מנורמלים של VDAC3 מהעשרים וחמישה תאים אלה נרשמות ב( E). ל( CE), ערך p נגזר מT-מבחן מזווג. *** מציין p <10 -5, וns מציין p> 0.05. (F) immunoblots מראה רמות כל התא של VDAC3 (שני VDAC3a וVDAC3b 16) וγ טובולין (γ-אמבטיה) שבו α-טובולין (α-אמבטיה) הוא טוען שליטה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 2
תאי RPE1 גדלו באופן אסינכרוני איור 2. שתויגו עם hr 4 Brדופק du ורדף במשך 4 שעות נוספות בהעדר BrdU הוכתמו נוגדנים נגד Sas6 (ירוק) וγ טובולין (γ-אמבטיה; אדום). נציג תמונות להראות מכתימה Sas6 במהלך () S-שלב (עם שני קרוב מוקדי Sas6), (ב) metaphase (שני מוקדי Sas6 חלשים בקטבים) וtelophase (C) (מוקדי Sas6 הם איבדו מהקטבים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
תאי BrdU חיובי תאי RPE1 גדלו באופן אסינכרוני איור 3. תויגו עם דופק BrdU 4 שעות ורדפו במשך 4 שעות נוספות בהעדר BrdU. מוכתמים עבור Cep135 וSas6 היו צילמו בתנאים זהים הדמיה (חשיפה הגיע זמני 400 אלפיות שנייםלfluorophore / BrdU הכחול; 400 אלפיות שני לfluorophore הירוק / Cep135; 500 אלפיות השניים לfluorophore אדום / Sas6), ואת עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של Sas6 וCep135 נקבעו. המרחק בין שתי centrosomes נמדד גם בכל התאים. תא שבו המרחק בין שתי centrosomes הוא פחות מ -2 מיקרומטר נחשב כ'קרוב 'ושבו הערך הוא יותר מ 2 מיקרומטר סווג כ'רחוק'. (AB) נציג תמונות מראים Cep135 (C135; ירוק), Sas6 (אדום) וBrdU (כחול) מוצגות. ב( B), C1 ו- C2 שתי centrosomes של התא "הרחוק" הנציג. (CD) עוצמות הקרינה הרקע מתוקנת (F; ביחידות שרירותיות) המתאימים לSas6 (C) וCep135 (ד ') מחמישה עשרה תאים של כל קטגוריה הם זממו תיבה ותרשים זיף ב. (E) עוצמות מנורמלות של Sas6 הלוך ושובמ 'תאים אלה הם זממו תיבה ותרשים זיף ב. ל( CE), ערך p נגזר מT-מבחן מזווג. * מציין 0.001 <p <0.05, וns מציין p> 0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תאים BrdU חיוביים מassay דופק מרדף BrdU לעיל (איור 3) מוכתם עבור VDAC3 וSas6 היו צילם בתנאים זהים הדמיה (חשיפה הגיע זמני 400 אלפיות שניים לfluorophore / BrdU הכחול; 500 אלפיות שניים לfluorophore הירוק / Sas6; 1,000 אלפיות שניים לfluorophore / VDAC3 אדום), ואת עוצמות הקרינה הרקע המתוקנת של Sas6 וVDAC3 נקבעו. המרחק בין שתי centrosomes נמדד בכל התאים, ותאים היו בסיווג 'גלאבד '(המרחק בין שתי centrosomes <2 מיקרומטר) ו'הרחוק' (המרחק בין שתי centrosomes> 2 מיקרומטר), כמו באיור 3. (AC) נציג תמונות של 'תא קרוב' בBrdU דופק (א), ב מרדף BrdU (B), ותא 'רחוק' במרדף BrdU (C) המוכתם עבור VDAC3 (VD3; ירוק), Sas6 (אדום) וBrdU (כחול) מוצגים. ב( C), C1 ו- C2 שני centrosomes. [DE] עוצמות הרקע תיקן הקרינה (F; ביחידות שרירותיות) המתאימות לVDAC3 (D) וSas6 (E) מחמישה עשרה תאים של כל קטגוריה הם זממו תיבה ותרשים זיף ב. (F) עוצמות מנורמלות של VDAC3 מהתאים אלה הם זממו תיבה ותרשים זיף ב. ל( DF), ערך p נגזר מT-מבחן מזווג. *** מציין p <10 -5, **מציין 10 -5 <p <0.001, וns מציין p> 0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרוסקופיה כמותי בביולוגיה של תא היא נפוצה הקשורים מבחני Live- תא הדמיה כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג), שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), וכו 'עם זאת, יש דוגמאות הולך וגדל של ביולוגים של תא פיתוח מבחני כמותיים מיקרוסקופיה שונות לקבועים תאים בשנים האחרונות 27,34-36. חשוב לציין, התקדמות בהבנת הביולוגיה centrosome לעתים קרובות דורשת הבנה של פונקצית centrosome הספציפית של חלבונים שcentrosomal בריכות עשויים להיות מוסדרת באופן שונה מברכות אחרות. לפיכך, פיתחנו assay IIF כמותית כדי לנתח את רמת centrosomal היחסית של חלבון בשתי דגימות יחס שונה באופן ספציפי. כי זה דורש כי תאים הם קבועים ומעובד על coverslips הנפרד, ולכן אנו הצגנו סטנדרטיים לצורך הנורמליזציה, לשליטה טובה יותר לחפצים אפשריים פנימי כתוצאה מהצורך של טיפול בשתי experimeתא פתיחות opening סגירות closures אוכלוסיות בנפרד, ולהגביר את הדיוק של assay. יש רק מעט מחקרים קודמים 37 שהשתמשו בתקן פנימי כגון למדוד את עוצמת הקרינה היחסית של חלבון מבחן.

בעת בחירת תקן פנימי היא קריטית לדיוק של assay שלנו, זה הוא לטעון את ההיבט המאתגר ביותר. באופן אידיאלי, כפילויות צנטריול הזוג במהלך S-שלב, וcentrioles המשוכפל אז לצבור רכיבי PCM נוספים כוללים γ טובולין במהלך G2 כך ששני centrosomes הבוגר יכול להיות הקטבים של ציר mitotic. לכן, אנו מניחים כי רמת centrosomal של γ טובולין לא תשתנה באופן משמעותי בתאים שהם בהחלט בS-שלב. זה נראה המקרה בתאי RPE1 שבו תאי S-שלב מסומנים על ידי תיוג BrdU קצר. עם זאת, את תוקפו של תקן פנימי חייב להיבדק לכל סוג תא ותנאי ניסוי. לדוגמא, בעוד שהרקע-הקורהקרינה cted VDAC3 עלתה יותר משני לקפל בתגובה לפרוטאזום עיכוב בaphidicolin טופל (נעצר S-שלב) U2OS תאים, היה גם (p-value <0.001 <0.05) עלייה קטנה אך משמעותית מבחינה סטטיסטית בγ טובולין centrosomal (משלימה איור). לפיכך, γ טובולין הוא לא תמיד של בקרה פנימית נאותה, אפילו עבור תאים שנעצרו במחזור התא.

בדומה לכל assay מיקרוסקופיה IIF האחר, אחד החסרונות של assay זה הוא שנוגדנים נגד חלבון המבחן וסטנדרטי הפנימיים חייבים להיות מורמים במינים שונים מארח. הנתונים שלנו מצביעים על כך שלמרות שCep135 הוא תקן פנימי טוב יותר מאשר Sas6, לא היינו יכולים לנרמל את רמות VDAC3 נגד Cep135 כמו הנוגדנים נגד החלבונים הזמינים אלה שגדלו בארנב. לפיכך, אנו במקום מנורמלים נגד Sas6, מה שגרם להערכת יתר של הירידה ברמות VDAC3 בין S-שלב וG2 מאוחר. במצב שבו inteסטנדרטי rnal משתנה בצניעות, אחד יכול להציג את גורם נורמליזציה אחרת כדי להסביר את שונות ש. לדוגמא, כדי לתקן את השונות בSas6, כפלנו את עוצמת VDAC3 Sas6-מנורמלת מעוצמת Sas6 המנורמל-Cep135.

במקרים בהם בחירת תקן פנימי מתאים היא קשה, microspheres צבע ניאון המצופה (.02-.04 מיקרומטר קוטר) עשוי לספק אסטרטגיה חלופית. האות של microsphere הקרינה נוכחי באותו תחום כתא של עניין יכול לשמש כדי לנרמל את אות הקרינה המתאימה לחלבון של עניין. מצד השני, אם תאי הבדיקה ובקרה הם צילמו ביחד, אחד ייתכן שלא צריך תקן פנימי כגון לנורמליזציה. אנחנו השתמשנו בעבר בגרסה של assay זה כדי להשוות את רמת centrosomal של Mps1 בתאי overexpressing או cyclin Antizyme 19 או 20, אשר גם למנוע 19 או לקדם 20 degradation של Mps1 בcentrosomes, בהתאמה, שבתאי untransfected סמוכים צילמו באותו הזמן.

כדי לבחון את ההשפעה של VDAC3 centrosomal על עיכוב פרוטאזום, השתמשנו תיוג BrdU לזהות ולהשוות תאים שנמצאים בS-שלב. בעוד טיפול MG115 עלול לעכב התקדמות מחזור התא, עיכוב זה דורש ריכוז גבוה באופן משמעותי מזה 38 ששמש במחקר זה. בריכוזים משמשים כאן MG115 יכול לחסום מחסומי מחזור התא ומעברים, אך לא יחסום את התקדמות מחזור התא. עם זאת, שיש לאמת לכל סוג תא, כפי שעשינו כאן על ידי מראה כי MG115 לא שינה את אחוז התאים החיוביים BrdU לעומת DMSO. עם זאת, מעצר תאים בשלב S-שימוש aphidicolin או hydroxyurea (האוניברסיטה העברית) או סנכרון תאים באמצעות mitotic 'לנער-off "ולשחרר או לחסום thymidine כפול ושחרור יכולים לשמש כגישות חלופיות ליצירת popula שווה הערךמשא של תאים בS-שלב.

אסטרטגית דופק מרדף BrdU ללמוד נקודות זמן מחזור התא תהיה מאוד שימושית בהרבה מבחני תפקודיים הדורשים מחזור תא מוטרד. זה assay משמעותי מבחינה ביולוגית יותר שיוכל להחליף את טכניקות עצירת מחזור התא באמצעות מעכבי מחזור התא שונים. שימוש במעכבים אלה עשויים לעתים קרובות לגרום לסוגים שונים של לחץ פיסיולוגי בתאים וכתוצאה מכך שינויים חריגים בפנוטיפים מחזור התא. שימוש בגישת דופק המרדף אפשר לנו להפגין דלדול של Cetn2 רק מתעכב הרכבה צנטריול 39 בניגוד לגרימת בלוק שלם כפי שהוצע על ידי מחקרים קודמים 23. גילוי תאי BrdU החיובי דורש הידרוליזה חומצה של הדגימות. אנחנו וחוקרים רבים אחרים משתמשים בטכניקה שמחדש מתקן את התאים לאחר צביעה ראשונית ומשנית לחלבוני בדיקה, לפני הידרוליזה חומצה, עם אובדן משמעותי של עוצמות צביעה לבידולt חלבוני centrosome 40. עם זאת, חלופה פוטנציאלית יכולה להיות להשתמש 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (edu), אנלוגי thymidine אחר, כי הוא, בדומה לBrdU, שהתאגד ביעילות במשכפל DNA 41. ויזואליזציה של edu באמצעות 'לחץ כימיה "אינה דורשת הידרוליזה חומצת 42, ולכן עשוי להיות מתאימה יותר לנוגדנים מסוימים.

בנוסף, assay זה יכול לשמש בקלות למדוד את השינוי שבלאחר translational שינויים של חלבון מסוים בcentrosomes. לדוגמא, רמת centrosomal של זירחון יכולה להיות מנורמל נגד הרמה הכוללת של החלבון עצמו, ובלבד שנוגדנים ספציפיים לאתר זירחון קיימים. assay זה יכול להיות מיושם באופן מיידי להערכת רמות היחסית של זירחון בין תנאי ניסוי או שלבי מחזור התא, אך עלול להיות מותאם להערכת רמות הכוללת של זירחון אם פרמטרים קריטיים של affin הנוגדןities ידוע או ניתן לקביעה. assay זה צריך להיות גם ישים עבור מחקר של חלבונים בכל אתר אחר בתאים, למרות שהאזור של עניין לא צריך להיות גדול מדי. Assay יהיה שימושי במיוחד כדי למדוד את אפנון המיקום ספציפי של חלבון שהוא מקומי באתרים סלולריים מרובים.

יש קומץ של פרמטרים טכניים כגון photobleaching ההפרש, את ההשפעה של הדמיה דיגיטלית, הליניאריות של עוצמות הקרינה של fluorophores, רעש רקע וכו 'שיש לנקוט בתמורה למקסם את הדיוק של המדידה 43. לדוגמא, אחד יכול לעבור fluorochrome משויך לכל נוגדנים משני כדי להעריך את התרומה של photobleaching. פרמטרים רבים אחרים ניתן גם שלטו אם משתמש בתנאים זהים הדמיה (זמן חשיפה, רווח, גודל צעד, מספר Z- ערימות, וכו ') ואת אותה תוכנת הדמיה בכל ריצת הדמיה. למרות שאנו משמשיםהאלגוריתם לא-השכן לאורך assay לבצע deconvolution תמונה, assay זה יכול להיות משולב עם אלגוריתם deconvolution אחר כגון מוגבל איטרטיבי. אנחנו גם לציין כי זה צריך להיות קל להסתגל assay זה לכל מספר של חבילות תוכנת הדמיה שונות, כמו תוכנת ניתוח תמונה הנפוצה ביותר זמינה יש כלים לניתוח של עוצמת הקרינה ומרחקים.

assay זה צריך להיות ישים לכל סוג תא, והבחירה של תאים כאן מבוססת אך ורק על הרלוונטיות שלהם במחקר הביולוגיה centrosome, והשימוש בם בבדיקות הקודמות שלנו של פונקצית VDAC3 centrosomal 16,28. עם זאת, את תוקפו של תקנים פנימיים וזמנים מתאימים לדופק מרדף כדי לזהות תאים בS-שלב, G2, או מיטוזה צריך להיקבע לכל סוג תא. בסך הכל, הטכניקה שלנו חדש שפותחה כמותיים הקרינה בשילוב עם assay דופק מרדף BrdU תהיה שיטה מאוד שימושית כדי לפתור כמה מסובךמנגנונים בביולוגיה centrosome ובהרבה היבטים רחבים של ביולוגיה של תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Sigma F8141 Stock of 1 mg/ml in water
DMSO Sigma D2650
MG115 Sigma SCP0005 Stock of 10 mM in DMSO
BrdU Sigma B5002 Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) Sigma T 6557 1:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)  Aviva Systems Biology ARP35180-P050 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)  Santa cruz biotechnology sc-81431 1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) Abcam ab-75005 1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)  Abcam ab6326 1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Life technologies A21093 1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21202 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technologies A21203 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21206 1:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody Life technologies A21207 1:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal) Sigma T5192 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) Sigma T9026 1:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Life technologies A10043 1:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated Rockland antibodies 610-731-002 1:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent  Life technologies S36936 Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1 Fisherbrand 12-545-80
Olympus IX-81 microscope Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera QImaging  32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective Olympus 1.4 numerical aperture
Slidebook software package Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay Thermo Scientific 23227
U-MNU2 Narrow UV cube Olympus U-M622 Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube Olympus U-M643 Filter
U-MNU2 Narrow Green cube Olympus U-M663 Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 94 הרכבה Centrosome מחזור תא השפלה centrosomal מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים נורמליזציה דופק מרדף VDAC3 BrdU
כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majumder, S., Fisk, H. A.… More

Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes. J. Vis. Exp. (94), e52030, doi:10.3791/52030 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter