Summary
Brain myeloide celler karakterisering efter slagtilfælde kan udføres ved stereologi anvendelse af optisk fraktioneringskolonne metode eller ved en flowcytometrisk analyse af hjernen leukocytter suspensioner. Begge er nyttige teknikker til at udføre en nøjagtig fænotypisk forskel på de vigtigste myeloide celledelmængder fundet i iskæmisk hjernen.
Abstract
Mikroglia aktivering samt ekstravasation af hæmatogen makrofager og neutrofiler, menes at spille en central rolle i hjerneskade efter slagtilfælde. Disse myeloide cellesubpopulationer kan vise forskellige fænotyper og funktioner og skal være fremtrædende og karakteriseret for at studere deres regulering og bidrag til vævsskade. Denne protokol giver to forskellige metoder til hjerne immun celle karakterisering: en præcis Stereologisk tilgang og en flowcytometrisk analyse. Den Stereologisk tilgang er baseret på den optiske fraktionator metode, der beregner det samlede antal celler i et område af interesse (infarkt hjernen) estimeres ved en systematisk stikprøver. Den anden karakterisering fremgangsmåde giver en enkel måde at isolere hjernens leukocyt suspensioner og karakterisere ved flowcytometri, giver mulighed for karakterisering af mikroglia, infiltreret monocytter og neutrofiler i det iskæmiske væv. Derudover er det også Letails en cerebral iskæmi model i mus, der udelukkende påvirker hjernens cortex, genererer meget reproducerbare infarkter med en lav dødelighed, og proceduren for histologiske hjerne behandling for at karakterisere infarktvolumen ved Cavalieri metoden.
Introduction
Morfologiske, fænotypiske og genekspression ændringer i mikroglia samt ekstravasation og aktivering af hæmatogen makrofager og neutrofiler menes at spille en afgørende rolle i den patofysiologiske kaskade efter hjerneskade 1-4. Denne protokol giver to fremgangsmåder til at estimere antallet af forskellige myeloid celle delgrupper i den iskæmiske hjerne og til at udføre deres fænotypisk karakterisering. Derudover giver det også en beskrivelse af en eksperimentel model for cerebral iskæmi i mus, som består af forbigående eller permanent ligering af både distale arteria cerebri (MCA) og den fælles carotidarterie (CCA), herunder hvordan at evaluere infarkt ved nøjagtig Cavalieri metoden i en Stereologisk software.
Den første metode til at karakterisere myeloide celledelmængder af den iskæmiske hjerne er en Stereologisk metode baseret på den optiske fraktionator tilgang 5. Dette er den mestalmindeligt anvendt Stereologisk sonde i biovidenskab og giver en høj grad af præcision med lave koefficienter af fejl 5-7. Dette er det bedste valg for celle kvantificering når vævet skæres i sektioner, da man derved undgår bias på celle estimering grund af opsplitningen af vævet i sektioner. Denne metode er en meget effektiv måde at karakterisere numre, dynamik og fænotypiske ændringer af infiltreret neutrofile subpopulationer af det iskæmiske væv 8.
Den anden karakterisering tilgang er baseret på en modificeret protokol fra Campanella og samarbejdspartnere 9, der giver en enkel måde at isolere hjernen leukocyt suspensioner og at beskrive dem ved flowcytometri. I modsætning til konventionelle immunhistokemiske teknikker, flowcytometri karakterisering tillader at skelne mellem mikroglia (CD45 lo CD11b +) og infiltreret myeloide celler (CD45 hi CD11b +) baseret på deres different ekspressionsniveauer af CD45 9-13. Desuden proinflammatoriske monocytter (CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi), neutrofiler (CD45 hi CD11b + Ly-6G +) og andre leukocytter delmængder af den iskæmiske væv kan skelnes. Denne fremgangsmåde giver en pålidelig og hurtig assay til at vurdere neuroinflammation i eksperimentelle modeller af hjerneiskæmi. Imidlertid kan vævsbehandling påvirke aktivering tilstand og antallet af de forskellige cellepopulationer fundet i iskæmisk væv give en semi-kvantitativ karakterisering.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøgsprotokoller klæbet til retningslinjerne fra Animal Welfare Udvalg for Universidad Complutense (efter EU-direktiver 86/609 / CEE og 2003/65 / CE).
1. cerebral iskæmi Model
BEMÆRK: cerebral iskæmi-modellen i dette papir indebærer permanent eller forbigående okklusion af både CCA (fælles halspulsåren) og MCA (midterste cerebrale arterie) ved ligering med en nylon sutur.
- Pre-kirurgiske præparater
- Steriliseres alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering eller med et glas perle sterilisator. Desinficere kirurgiske område med 70% ethanol samt.
- Bedøver mus med passende anæstetika. Opnå induktion med isofluran 2,5% og vedligeholde med med isofluran 1,5% i en blanding af 80% luft / 20% oxygen under anvendelse af en fordamper. Anvend kunstige tårer til musene øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Placer musen på en varmepude, der er knyttet til et gebyrdback enhed med en temperatursonde placeret i endetarmen og indstillet temperatur ved fysiologiske niveauer (36,5 ± 0,5 ºC) under den kirurgiske procedure.
- Carotis arterie okklusion ved ligering
- Anbring musen liggende på ryggen og immobilisere med tape. Desinficer huden med 70% ethanol eller povidon-iodid og klippe håret af den øvre ventrale del.
- Under et kirurgisk mikroskop, gør en 1 cm midtlinjeincision omkring den ventrale overflade af halsen.
- Træk fra hinanden alle bløde væv (kirtelvæv, herunder sub-maxillary, sublingual og parotideale kirtler) og identificere den venstre, fælles carotidarterie (CCA), som er lokaliseret lateralt i forhold til trachea. Træk musklerne og eksponere venstre CCA. Dissekere grundigt vagus nerve.
- Når dissekeret, okkludere venstre CCA ved en ligatur ved anvendelse af en 6/0 nylon sutur. Liger med en permanent knude eller en slipknot (for at tillade reperfusion hvis en forbigående cerebral iskæmi model ønskes).
- Placer kirtelvæv i sin oprindelige position, og lukke indsnittet på halsskindet med en 6/0 nylon sutur.
BEMÆRK: Sham dyr udsættes for samme kirurgiske indgreb som MCAO dyr men CCA ikke okkluderet.
- Distal mellem-cerebral arterieokklusion ved ligering
- Placer musen på sin højre side og immobilisere med tape. Desinficer hovedet huden med 70% ethanol eller povidon-iodid og klippe håret af musen hovedet (fjerne hår efter opskæring).
- Under et kirurgisk mikroskop, lave en incision i huden mellem øjet og øret. Flyt hud væk og hold den med tape.
- Foretag en vandret snit på Tindingmusklen fra højre til venstre. Derefter foretage et andet lodret snit i højre side af den tidsmæssige muskel (være omhyggelig med at undgå skære tidsmæssig vene). Træk fra hinanden Tindingmusklen fra kraniet og hold den med en sutur at opretholde en ren kranium overflade.
- Rengør kraniet overflademed koldt sterilt saltvand til at detektere den nøjagtige position af den venstre midterste cerebrale arterie (MCA) via kraniet gennemsigtighed. Udfør en rund kraniotomi (1 mm i diameter) med en rustfri stål grat i frontallappen mellem Kindbuen og squamosal knogle. Fjern forsigtigt kraniet og eksponere MCA.
- Påfør en lille mængde koldt steril saltvandsopløsning til overfladen af hjernen og fjerne meninges (dura og Spindelhinden) ved hjælp af pincet.
- Udfør ligering af den venstre MCA i den distale stammen lige før forgreningen mellem frontal og posteriore MCA grene. Okkludere venstre MCA ved en ligatur ved anvendelse af en 9/0 nylon sutur. Liger med en permanent knude eller en slipknot (for at tillade reperfusion hvis en forbigående cerebral iskæmi model ønskes). Tidsrummet mellem CCA og MCA okklusion er cirka 10-20 minutter afhængig af operatørens erfaring.
- Placer Tindingmusklen i sin oprindelige position, og luk incision på halsen hud med en 6/0 nylon sutur.
- Retur musen til buret for at komme sig efter anæstesi (normalt 5-10 min) og injicere mus med buprenorphin intraperitoneal (IP) (0,3 mg / kg).
- Overvåg musen for flere timer at opdage enhver ubehag (ikke forlader musen uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje). Da post-kirurgisk vægt tabt generelt observeres, placere mosede fødevarer i en petriskål til at lette spise.
- Når dyret er fuldt tilbagebetalt, tilbage til selskab med andre dyr.
- Hvis der ønskes en forbigående MCAO model, bedøver musen igen og fjerne slipknot af CCA og MCA at tillade reperfusion (normalt mellem 0,5-2 timer (figur 1)).
BEMÆRK: Sham dyr underkastet den samme kirurgiske procedure som MCAO dyr, men MCA ikke okkluderet.
2. Perfusion og sectioning af hjernevæv
- 24 eller 48 timer efter MCAO ofre mus med en dødelig dosis af bedøvelsesmiddel (fx natrium pentobarbital, IP 86 mg / kg eller en overdosis med isofluran).
- Perfundere musen med phosphatbuffer 0,1 M, efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatpuffer (pH 7,4).
- Fjern hjerne som følger:
- Halshugge dyret lige over rygmarven.
- Foretag en posterior-anterior indsnit på hovedet hud for at blotlægge kraniet. Lav to laterale snit ved krydset af sidevæggene og bunden af kraniet, og fjern det lille stykke knogle.
- Lave et snit gennem kraniet langs sagittale sutur.
- Fjern kraniet overliggende hver halvkugle ved hjælp af en pincet til at udsætte hjernen. Brug en spatel til at adskille hjernen fra kraniet og hældes 4% PFA løsning.
- Post-fix i 3 timer i 4% PFA-opløsning ved 4 ºC.
- Fjern PFA opløsning og incubate hjernen i 48 timer i 30% saccharose løsning cryoprotect hjernen.
- Fjern saccharoseopløsning og fryse hjernen hurtigt i koldt isopentan (-40 ºC). Opbevares frosset hjerne ved -80 ºC.
- Opnå koronale hjernen sektioner (30 um) med en indefrysning mikrotom. Saml ti serielle sæt i en kryopræserverende opløsning. Hvert serielle sæt består af omkring 14-16 koronale skiver med en interslice afstand på 300 um, som i tilstrækkelig grad prøve musehjernen mellem 1,94 og -2,46 posterior til bregma.
3. Nissl Farvning og infarktvolumen Estimation
- Nissl farvning med cresylviolet
- Mount hjernesnit i en SuperFrost objektglas. For infarktvolumen bestemmelse af Cavalieri metoden i Nissl-farvede sektioner, bruge en brøkdel 1/20 slice-sampling (1/2 sektioner af en af de ti serielle apparater indsamlet i trin 2.7, cirka, i alt 7-8 sektioner med en interslice afstand på 600 μM er anvendt). Vær omhyggelig med at opretholde en ordentlig anterior-posterior retning (infarktområdet er placeret i højre side).
- Udfør konventionel Nissl farvning på følgende måde:
- Tillad slide-monterede sektioner tørre i flere timer.
- Rehydrere slide-monterede sektioner og plette med 0,1% cresylviolet løsning i 5 min.
- Dehydrer med en gradueret serie af EtOH (70%, 90% og 100%; 5 min pr ændring). Rengør slide monterede sektioner med xylen, tilføj distrene-80 blødgører xylen (DPX) monteringsmedie og dække med et dækglas.
- Brug Stereologisk software til at estimere infarktvolumen ved Cavalieri metoden i Nissl-farvede serielle snit
- Brug parametre vist i tabel 1 at kvantificere infarktvolumen ved Cavalieri fremgangsmåde 14 og en stereologi system, som består af et mikroskop udstyret med et kamera, en XYZ motoriseret computer fase og Stereologisk software (The mainanvisningerne nedenfor er relateret til pc'er, men vejledningen kan variere for andre operativsystemer).
- Tænd pc, mikroskop, scene controller og kamera i den rigtige rækkefølge. Start Stereologisk software.
- Flyt 10X målsætning på plads, og vælg 10X fra målet rullemenu.
- Flyt rundt på første Nissl-farvede sektion og finde en passende referencepunkt. Klik med musen for at oprette referencepunktet (at bevæge sig rundt, er det nødvendigt at aktiv glæden fri knap).
- Vurdere "monteret snittykkelse" (dækkets faktiske tykkelse under hensyntagen til svind). Tryk på "fokusposition Meter" -knappen og beregne tykkelsen fra bunden til toppen af afsnittet.
- Opret en kontur værktøj til contralesional og ipsilesional områder og infarktområdet.
- Klik på menuen "Display" og vælg "Skærmindstillinger". Dette åbner than Display Settings Dialog.
- Vælg fanebladet "konturer", og klik på knappen "tilføj Contour type".
- Opret en kontur for hver region at kvantificere og gøre dem synlige i konturen down menuen. Klik på OK.
- Opret en markør værktøj til contralesional og ipsilesional halvkugle og infarktområdet.
- Klik på menuen "Display" og vælg "Vis indstillinger" for at åbne dialogboksen Skærmindstillinger den.
- Vælg fanebladet "markører" og ændre markørerne navn ved at dobbeltklikke på de tilgængelige markører. Gøre dem synlige i Marker Bar. Klik på OK.
- Aktiver sektionen manager.
- Klik på menuen "Funktioner / Serial sektionsleder". Tilføj et nyt afsnit med "nye sektion" knappen. Denne knap åbner "Serial afdeling Setup dialogboksen".
- Indstil "Block Advance" som 30 um. Indstil"Monteret snittykkelse" med skønnet i trin 3.2.5 værdi.
- Indstil "Evaluering Interval" som 20. Brug en brøkdel prøveudtagning 1/20 skive.
- Indstil "udgangstværsnittet nummer" som 1. Sæt "Z-aksen værdi for toppen af den første sektion" som 0. Klik på OK.
- Tegn en kontur til at skitsere den kontralaterale hemisfære.
- Vælg Contralesional halvkugle værktøj (tidligere oprettet i trin 3.2.6) fra konturen down menuen.
- Tegn en kontur til at skitsere den kontralaterale hemisfære.
- For at afslutte spore contralesional halvkugle, højreklik på musen og vælg "Luk kontur".
- Vurdere contralesional halvkugle kontur af Cavalieri.
- Klik på menuen "Probes" og vælg Cavalieri Estimator. Indstil "Grid Mellemrum" som 100 um. Indstil "Grid Rotation" som 0. Indstil "Blåse Advance "som 30 um. Klik på OK.
- Vælg "The contralesional halvkugle" knappen fra Markers Bar. Højreklik inde i Contralesional halvkugle kontur.
- Vælg "Paint Cavalieri Markers Mode". Højreklik inde i contralesional halvkugle kontur igen og vælg "Paint Markers i Contour".
- Deaktiver Cavalieri Estimator ved at klikke på sonder og Cavalieri Estimator og deaktivere contralesional markør knappen fra markør bar.
- Gentag samme procedure for ipsilesional halvkugle og infarktområdet (trin 3.2.7 og 3.2.8). Gem dataene efter estimeringen af arealet af hver sektion.
- Beregn den kontralaterale, ipsilesional og infarkt områder i resten af Nissl-farvede sektion.
- Opret en ny sektion som i trin 3.2.6. Du må ikke ændre værdierne indtastet i dialogen "Serial sektion Setup". Klik på OK.
- Gentag trin 3.2.7-3.2.8 i den nye sektion.
- Eksportere resultaterne af kvantificering til et regneark fil.
- Klik på "Probes" i Stereo Investigator menuen. Vælg "Display Probe Run List". Dette åbner "Dialog Forrige Stereologisk Runs".
- Vælg alle afsnittene ved at klikke på dem. Tryk på "Vis resultater" knappen. Dette åbner "Cavalieri Estimator Resultater", hvor den anslåede areal og volumen for hver region, vises.
- For at eksportere resultaterne til et regneark, skal du klikke på "Kopier alle resultater til Udklipsholder", og indsætte til en Excel-fil med de vigtigste resultater fra hver region (tabel 2).
- Express infarktvolumen som mm3 eller som% af halvkugle, der er infarkt (% IH) ved hjælp af formlen 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, hvor
ContrVol (Contralesional halvkugle Volume) = ΣContrArea i
4. Stereologisk Kvantificering af infiltreret Neutrophils Efter cerebral iskæmi af det optiske fraktionator
- Farvning af hjernen sektioner:
- Ved vurdering af det samlede antal infiltrerede neutrofiler efter MCAO af det optiske fraktionator 16, skal du bruge en brøkdel prøveudtagning 1/10 skive. Immunofarvningsprocedure neutrofiler ved anvendelse af konventionelle immunofluorescensteknikker med rotte-anti-Ly6G antistof (1A8) og højre sekundære antistof på fritflydende sektioner. Desuden en modfarvning med en nuklear maker ligesom DAPI eller TOPRO, selvom det ikke er nødvendigt for neutrofil identifikation, kan gøre det lettere at detektere infarktområdet.
- Mount hjerne sektioner i en SuperFrost mikroskopobjektglas med infarktområdet placeret i højre side.
- Quantification af infiltrerede leukocytter i den iskæmiske hjerne ved den optiske fraktioneringskolonne
- Brug parametre vist i tabel 3 at kvantificere infiltreret leukocytter i den iskæmiske hjerne ved den optiske fraktioneringskolonne tilgang med stereologi system. Gentag trinene 3.2.1-3.2.5 fra punkt 3.
- Opret en kontur værktøj til infarktramte område, som det er blevet beskrevet i trin 3.2.6 i afsnit 3.
- Opret en markør værktøj for neutrofiler, som det er blevet beskrevet i trin 3.2.7 i afsnit 3.
- Aktiver sektion manager og oprette en ny sektion som i trin 3.2.8. I dette tilfælde skal du indstille "Evaluering Interval" som 10 (en fraktion prøveudtagning 1/10 skive anvendes til estimering af neutrofil tal).
- Vælg "infarktområdet" kontur værktøj (tidligere oprettet i trin 4.2.1) fra konturen down menuen. Tegn en kontur skitsere infarktområdet på 10X mål. Skift til formål at 100X at udføre neutrophil kvantificering (glem ikke at vælge 100X fra målet rullemenu).
- Klik på menuen "Sonder" og vælg "Optisk fraktionator". Indstil "XY Placering af tælle Frames" som 230 for både X og Y gitterstørrelse. Indstil "Grid Rotation" som 0. Indstil "Block Advance" som 30 um. Klik på OK.
- Vælg "neutrofil" knappen fra Marker Bar. Mark farves neutrofiler i infarktområdet. Når færdig, deaktivere Optical fraktionator sonden ved at klikke på "Probes" og "Optical fraktionator". Deaktiver neutrofil knappen fra markør bar.
- Gentag samme procedure for hver sektion (4.2.4-4.2.9).
- Eksportere resultaterne af kvantificering til et regneark fil.
- Klik på "Probes" i Stereo Investigator menuen. Vælg "Vis Probe Run List" for at åbne "Tidligere stereologiske Kører"dialogen.
- Vælg alle afsnittene ved at klikke på dem. Tryk på "Vis resultater" for at åbne "de optiske fraktionator Results", hvor det anslåede antal neutrofiler vises.
- Eksportere resultaterne til et regneark fil ved at klikke på "Kopier alle resultater til Udklipsholder", og indsætte et regneark fil.
5. Brain Dissociation og flowcytometri-analyse
BEMÆRK: myeloid subpopulation karakterisering ved flowcytometri på frisk hjernevæv kan anvendes som et alternativ til den foregående neutrofil karakterisering udført på faste og immunofarvede hjerne sektioner.
- Brain dissociation og enkelt cellesuspension forberedelse
- Lav 10 ml / dyr af RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) -Percoll opløsning indeholdende 8 ml RPMI, 1 ml 30% Percoll og 1 ml af en 10x PBS (phosphatbufret saltvand).
- ReFlyt musehjerne efter MCAO som beskrevet i trin 2.3.
- Under et mikroskop, dissekere ud kerne- og peri-infarkt områder af den ipsilaterale cortex fra hjerne iskæmisk mus (eller et tilsvarende region for fingeret og naive dyr) fra hjernen. Vægt hjernevæv og læg det i 5 ml iskold RPMI-Percoll (vægten trin kan udføres for normalisering mellem eksperimentelle grupper).
- Dissocierer vævet i en enkelt cellesuspension under anvendelse af en Potter-Elvehjem-typen vævsformaler med teflon pestles.
- Overførsel cellesuspensioner til en 50 ml ultracentrifugerør og tilføje endnu 5 ml RPMI-Percoll-opløsning til prøverne.
- Centrifuger cellesuspensioner ved 7.800 xg i 30 minutter ved 25 ºC. Efter centrifugering sikre et hvidt farvet lag svarende til myelin vises på toppen af opløsningen.
- Fjern myelin lag omhyggeligt og filtrere hele cellesuspensioner, herunder de pelleterede celler, gennem 40 um nylon mesh strainer.
- Der tilsættes 10 ml RPMI på sien at sikre, at alle cellerne filtreres og placere opløsningen i et 50 ml rør. Der tilsættes 30 ml RPMI og centrifuger 50 ml cellesuspension ved 600 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og resuspender leukocyt pellet med 1 ml PBS. Tilsæt 4 ml lysisbuffer (150 mM NH4CI, 10 mM NaHCO3 og 0,1 mM EDTA) og inkuber cellerne i 2-3 minutter ved stuetemperatur for at lysere erythrocytter fra cellesuspensionen. Centrifugeres opløsningen ved 600 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Cell farvning og flowcytometri
- Forbered en mærkning cocktail for flowcytometri, indeholdende 200 pi PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-Block, 01:40 anti-CD45-PerCP rotte, 01:40 anti-Ly6G-APC rotte, 01:40 anti CD11b-FITC rotte og 01:40 anti-Ly-6C-PE rotte pr prøve.
- Resuspender cellerne i mærkningen cocktail og inkuber prøverne i 45 minutter i is.
- Vask mærkningen cocktailmed 1 ml kold PBS og centrifugeres cellerne ved 600 x g i 10 min ved 4 ° C. Pelleten resuspenderes med 100 pi FACS Flow og erhverve hele cellesuspensionen ved flowcytometri.
- Brug en flowcytometri analyse software til at karakterisere og kvantificere cellepopulationer.
- Vigtigste leukocytundergrupper svarer til mærkningen cocktail udarbejdet i denne protokol kan karakteriseres som følger: CD45 Lo CD11b +: hjemmehørende mikrogliaceller; CD45 hi CD11b + Ly-6G +: neutrofiler; CD45 hi CD11b + Ly-6G - Ly-6C hi: pro-inflammatoriske monocytter.
Representative Results
Den cerebral iskæmi modellen her genererer infarkter set udelukkende i cortex uden at påvirke striatum siden lenticulostriatal grene af MCA at overrisle striatum ikke okkluderet (figur 1). Af Nissl farvning kan det beskadigede område identificeres som en hypokrom kortikale område (figur 2). Denne model er kendetegnet ved meget reproducerbar infarktvolumener ved 24 timer efter MCAO (% IH 15.89 ± 0,28) estimeres ved Cavalieri metode Nissl-farvede snit (figur 2). Skøn over infarktområdet volumen ved Cavalieri metoden er en præcis metode med en lav fejl, der afspejles i koefficienten for fejl (CE) af Gundersen i contralesional og ipsilesional halvkugle samt i infarktområdet (tabel 2). Beskadiget væv volumen kan udtrykkes i mm 3, men også som% IH hjælp af formlen i afsnit 3.2.13. Desuden estimationaf den samlede mængde af de ipsilesional og contralesional regioner muliggør beregning af ødem indeks at korrigere infarktområdet volumen og for at undgå en overvurdering af det beskadigede væv (tabel 2).
Da den serielle sektionering behandling af hjernevæv, kan dette udnyttes til at foretage en nøjagtig beregning af det samlede antal af cellesubpopulationer, som infiltrerede neutrofiler i det iskæmiske område, ved hjælp af optiske fraktioneringskolonne fremgangsmåde (figur 3 og tabel 4) med parametre, der er vist i tabel 3. Denne protokol anslår et samlet antal neutrofiler (Ly6G-positive celler) i infarktområdet på 23.328 ± 3.623 på 24 timer og 82.856 ± 8.143 på 48 timer i mus efter pMCAO (figur 3D). I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, er neutrofil infiltration direkte korreleret med infarktstørrelse (figur 3E). Estimering af tHan antal neutrofiler af det optiske fraktionator metoden er en præcis metode med en lav fejl, afspejles i EF af Gundersen (tabel 4).
Den leukocyt isolation og flowcytometri karakterisering protokol tillader isolering af 47.922 ± 23.174 myeloide celler fra cortex i ipsilesional halvkugle af iskæmiske mus. Dette omfatter 10-30% af de samlede arrangementer fundet i cellesuspensionen. Langt størstedelen af tilfangetagne begivenheder ved hjælp af denne protokol til stede en lav FSC parameter, der er forbundet til cellerester (figur 4). CD11b farvning viser, at CD11b + celler har en højere FSC værdi (figur 4), hvilket tyder på, at cellerester ikke er mærket med denne markør, og som tidligere angivet, at det kan udelukkes fra yderligere analyse ved at sætte tærsklen FSC 200 9. Det variable beløb af cellerester opnået med denne metode tyder, at forskelle på prøve procesING (timing, væv bevarelse, prøve temperatur, effektiv myelin fjernelse, etc.) kan redegøre for det. Desuden er der også behov for anvendelse af celle sier for at undgå tilstedeværelsen af cellulære klemmer i prøverne; Dette trin skal gøres før cellefarvning. Brug af gating strategi er vist i figur 5, som er baseret på CD11b og CD45-ekspression, kan vi skelne mellem residente og infiltreret myeloide celler i den iskæmiske væv. This CD11b + -populationen stigninger i den iskæmiske hemisfære sammenlignet med naive og med sham-gruppen, hvori disse celler er for det meste forbundet med en lav ekspression af CD45 indikerer, at mikroglia er prolifererende efter iskæmi (figur 4, figur 5 og tabel 5) . Denne forskel skyldes sandsynligvis celleinfiltration fra periferien, som det fremgår af fremkomsten af en CD11b + CD45 hi cellesubpopulation i den iskæmiske hjerne (figur 4Figur 5 og tabel 5), som er lavt antal i naive og sham hjerner. Bidrag infiltrater til CD11b + cellepopulationen i hjerneiskæmi er en meget dynamisk proces 4. I MCAO model ved ligatur, kan det variere fra 30% til 60% af de samlede CD11b + celler afhængigt af størrelsen af læsionen og af det tidspunkt, hvor karakterisering er blevet gjort. Neutrofiler, karakteriseres som Ly-6G + celler, er de mest talrige infiltreret celle population findes på 24 timer efter MCAO i iskæmiske musehjerne ved hjælp af denne model af cerebral iskæmi, da de omfatter 70-80% af CD11b + CD45 hi. Resten af cellerne er for det meste en subpopulation af CD11b + CD45 hi Ly-6G - Ly-6C hi proinflammatoriske monocytter. I denne model, vil denne population stige i antal i de iskæmiske områder i hjernen 24-48 timer efter MCAO.
Figur 1:. Kirurgisk procedure for MCA ligering (A) efter tilbagetrækning af Tindingmusklen er en lille kraniotomi udføres i mus kraniet. MCA er ligeret med en knude eller en slipknot hjælp af en 9/0 sutur. (B) Repræsentative billeder af det kortikale læsion genereret af MCAO model. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af infarktvolumen af Cavalieri. (A) Repræsentative billeder af Nissl-farvede hjernesektioner 24 timer efter permanent MCA ligering. Den høje forstørrelse viser hipocromatic området efter Nissl farvning, somidentificerer det beskadigede område (kerne) efter MCAO. Peri-infarkt (PI) region er også vist. (B) Kvantificering af infarktvolumen repræsenteret% infarkt halvkugle (% IH) ved hjælp af Cavalieri metode serielle Nissl-farvede sektioner, 24 timer efter MCAO (n = 50 mus ).
Figur 3: Stereologisk kvantificering af neutrofiler i infarktområdet 24 og 48 timer efter ligering, ved hjælp af optiske fraktioneringskolonne metode. (A) repræsentativt billede af infiltrerede neutrofiler (Ly6G-positive celler) i det iskæmiske område på 24 timer efter MCAO. Afgrænsning viser infarktområdet. (B, C) Eksempler på en optisk dissektoren for neutrofil kvantificering af den optiske fraktioneringskolonne. (D) Kvantificering af den samlede neutrofiler i infarktområdet område ved 24 og 48 timer (n = 4 mus). (E)Korrelation af antallet af neutrofiler med infarktstørrelse på 24 og 48 timer efter MCA ligering. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4:. Repræsentant dot-plot scatter analyse af hjernen leukocytter opnået fra naive, sham og iskæmisk (24 timer efter MCAO) halvkugler på grundlag af fysiske parametre (SSC og FSC) En population af begivenheder, der udtrykker CD11b (rød) blev identificeret i alle grupper. Denne population blev gated og karakteriseret ved ekspression af CD45. Celler, der udtrykker lave niveauer af CD45 (grøn) var til stede i den iskæmiske og ikke-iskæmiske hjernebark og svarede til mikrogliaceller. I modsætning hertil celler, der udtrykker høje niveauer af CD45 (gul) var kunfindes i den iskæmiske hemisfære og i mindre grad i sham-gruppen. Yderligere analyse af CD11b + CD45 hi befolkning viser, at neutrofiler (Ly-6G + celler, blå) og pro-inflammatoriske monocytter (Ly-6C hi celler, orange) er de vigtigste cellesubpopulationer findes i hjernen infiltrerer 24 timer efter slagtilfælde. Venligst klik her for en større version af dette tal.
Figur 5:. Gating strategier til at differentiere resident infiltreret myeloide celler i den iskæmiske væv CD11b + celler blev først gated ifølge isotype fluorescensintensitet (A). Et repræsentativt dot plot af cellesuspensioner af den iskæmiske hjerne, er vist i op højre hjørne af panelet. IDesuden er typiske værdier for det samlede antal begivenheder, og for antallet af CD11b + begivenheder erhvervet ved hjælp af denne teknik vist (ingen celler / iskæmisk hjernehalvdel;. (A) CD45 Fluorescensintensitet analyse af CD11b + celler er vist i panel B. En repræsentativ punktdiagram analyse af CD45 og CD11b udtryk gated CD11b + subpopulation vises i up-højre hjørne af panelet. Desuden typiske antal CD45 lo CD45 hi celler erhvervet pr iskæmisk hjernehalvdel ved hjælp af denne teknik vises (B).
| Parametre, der anvendes til Cavalieri metode | |
| § Tykkelse (t) | 30 um |
| Formål | 10X |
| Slice fraktion prøvetagning (SSF) | 1/ 20 |
| Afstanden mellem afsnittene | 600 um |
| Grid Mellemrum | 100 um |
Tabel 1: Parametre anvendt til Stereologisk kvantificering af infarkt væv.
| Resultater | Contralesional | Ipsilesional | Infarkt |
| Samarbejdsområde (μm²) | 151460000 | 155060000 | 22600000 |
| Volumen (μm³) | 90876000000 | 93036000000 | 13560000000 |
| Volumen Korrigeret for Over Projection (μm³) | 89957100000 | 92046300000 | <strong> 13416600000 |
| Koefficient af fejl (Gundersen) m = 0 | 0,068 | 0,077 | 0,067 |
| Koefficient af fejl (Gundersen) m = 1 | 0,015 | 0,017 | 0,015 |
| Koefficient af fejl (Gundersen) alpha (q) | 0,068 | 0,077 | 0,067 |
| % Infarktramte halvkugle | 14.90 | ||
| Brain Ødem (Ips Vol / Cont Vol) | 1,02 | ||
Tabel 2: Repræsentative eksempler på contralesional, ipsilesional og infarktvolumener ved Cavalieri metoden ved hjælp af Stereo Investigator Software.
| Parametre, der anvendes til den optiske fraktionator | |
| Snittykkelse (TSF) | 30 um |
| Formål | 100X |
| Slice fraktion prøvetagning (SSF) | 1/10 |
| Kugleramme Højde | 40 um |
| Kugleramme Bredde | 40 um |
| X grid størrelse | 230 um |
| X grid størrelse | 230 um |
| Sikker Guard | 2 um |
| Optisk Disector Højde | 14 um |
Tabel 3: Parametre, der anvendes til Stereologisk kvantificering af infiltrerede neutrofiler efter hjerneiskæmi med den optiske fraktionator sonden ved hjælp af Stereo Investigator Software.
| Estimation af neutrofiler af det optiske fraktionator | |
| Antal prøveudtagningssteder websteder | 430 |
| Formfaktoren | 6,24 |
| Total markører Tælles | 166 |
| Anslået Neutrofiler ved optisk fraktionator | 117,608.03 |
| Koefficient af fejl (Gundersen), m = 0 | 0,22 |
| Koefficient af fejl (Gundersen), m = 1 | 0,09 |
Tabel 4: Et repræsentativt eksempel på de anslåede infiltrerede neutrofiler efter hjerneiskæmi med det optiske fraktionator sonden ved hjælp af Stereo Investigator Software.
| CD11b + | Neutrofiler | Monocytter | Mikroglia | |
| Naive | 25.863 ± 4,575.8 | 473 ± 75,8 | 525 ± 191,4 | 19.012 ± 1.523 |
| Sham 24 timer | 24.563 ± 5.263 | 873 ± 192,5 | 1.124 ± 391,5 | 23.734 ± 2.910 |
| pMCAO 24 timer | 47.922 ± 23.174 | 4874 ± 748,7 | 4826 ± 1.345 | 35.395 ± 10.833 |
Tabel 5: Repræsentative resultater af de estimerede myeloide celler efter hjerneiskæmi med Flow cytometri tilgang.
Discussion
Den cerebral iskæmi model introduceret her giver meget reproducerbare infarktvolumener bestemt 24-48 timer og 7 dage efter MCA ligering af forskellige tilgange 8,15,17. Denne MCAO model har en lav dødelighed (mindre end 1%) i forhold til andre, minimere antallet af dyr, der anvendes i undersøgelser. Et afgørende skridt for at opnå denne lave dødelighed er at opretholde ordentlig aseptiske forhold for at undgå infektioner, som kan påvirke overlevelse efter slagtilfælde induktion. Denne MCAO model kan ikke kun bruges som en permanent MCAO model, der betragtes som en klinisk relevant model for translationel forskning 18, men også som en midlertidig model ved forbigående ligering af CCA og MCA med en slipknot og bageste reperfusion på det ønskede tidspunkt 19. Denne metode er blevet anvendt med succes i mus og rotter 17,20. Alt dette beviser indikerer, at MCAO ved ligering er en høj alsidig model af cerebral iskæmi med flere programmer. En critical trin af denne teknik er, at det kræver invasiv kirurgi under et stereomikroskop; kraniotomi skal udføres meget omhyggeligt for ikke at beskadige kindbenet samt MCA. Dog (ikke udføres, der udsættes for den kirurgiske procedure, men CCA og MCA ligering), anvendelse af skin dyr giver et nyttigt værktøj til at skelne kirurgisk procedure-afhængige virkninger. Omfanget af hjerneskade efter denne teknik kan kvantificeres ved flere metoder. Vores protokol hjerne skæring Nissl farvning og efterfølgende vurdering af omfanget af Cavalieri giver mulighed for en nøjagtig kvantificering af den beskadigede region og minimerer antallet af mus, der anvendes i denne type undersøgelser, eftersom serielle hjerne sektioner kan også anvendes til forskellige immunhistokemisk analyse. For en bedre ydeevne af denne metode, er det afgørende at vælge de relevante parametre, der anvendes i stereologi software (tabel 1), som vil være nødvendige for at estimere the mængden af de forskellige regioner ved formlen: V = 1 / SSF * en f * t * ΣP I (SSF er fraktionen skive prøveudtagning, T er den gennemsnitlige tykkelse af sektionerne, en f er det område af gitterafstand og ΣP antallet af point rammer struktur).
Den distale MCAO ved ligering kan være nyttigt at karakterisere infiltreret leukocyt- og immune cellesubpopulationer 8,13 der deltager i den inflammatoriske proces efter hjerneskade 1-4. Her foreslår vi to forskellige metoder til hjernen immuncelle karakterisering, en præcis Stereologisk tilgang og en flowcytometrisk analyse muligt at indkredse flere leukocytter subpopulationer.
Udnyttelse af seriel hjerne sektionering, kan kvantificering af det totale antal neutrofiler opnås ved den optiske fraktioneringskolonne metode 16, der anslår det samlede antal af celler fra antallet af celler udtages Witha Systematic stikprøver (SRS) sæt uvildige virtuelle optælling områder, der dækker hele regionen af interesse, i vores tilfælde infarkt regionen, med ensartet afstand mellem uvildige virtuelle optælling rum i retninger X, Y og Z. Denne metode giver en nøjagtig redskab til anslå samlede neutrofile numre i den iskæmiske hjerne på forskellige tidspunkter efter ligering. Selv om det ikke er påvist i denne undersøgelse, kan denne protokol også anvendes til estimering af de forskellige neutrofile subpopulationer efter iskæmi 21 og for en nøjagtig kvantificering af enhver anden celle population findes i den iskæmiske hjerne ligesom andre infiltreret leukocytter (monocytter / makrofager) og også til at estimere overlevende neuroner eller endda for neurogenese kvantificering efter slagtilfælde. Det vigtigste skridt for en nøjagtig vurdering i det ønskede område er udvælgelsen af de relevante parametre, som dem vist i tabel 3 for neutrofil kvantificering i det iskæmiske område.Disse parametre vil blive anvendt til stereologi software til at beregne den samlede positive celleantal (N) ved brug af ligningen N = ΣQ- x 1 / SSF x 1 / ASF x 1 / TSF (ΣQ- er det samlede antal talte celler med fraktionatoren, SSF er fraktionen afsnittet prøvetagning, asf er prøvetagning fraktion området, og TSF er fraktionen prøvetagning tykkelse) 5. Selv om denne metode er langsommere end andre kvantificering teknikker (for eksempel analyse af neutrofile markører af mg væv, densitometri af repræsentative billeder eller antal af neutrofiler pr område), har den fordel at være en objektiv og en solid teknik, som giver en præcis kvantificering af celleantal.
Hjernen leukocyt isolation fremgangsmåde giver mulighed for en samtidig identifikation og kvantificering af adskillige immune celle undertyper uden behov for at forspænde systemet ved in vivo-farvning eller genetiske manipulationer. Efterfølgende cellesortering fra kendetegnet myeloid populations eller deres immunomagnetisk adskillelse kan bruges til flere downstream applikationer, såsom yderligere undersøgelser af gen eller protein-ekspression. Den nøjagtige karakterisering af neutrofiler, monocytter og mikroglia opnået med denne fremgangsmåde tilvejebringer høj specificitet med hensyn til eksisterende metoder såsom immunhistokemiske undersøgelser, en fordel, som gør det muligt at tildele bestemte funktioner til forskellige myeloide celler, som medierer respons hjerne medfødte immunreaktion. Desuden kan det blive yderligere udvidet til at karakterisere andre hjerne befolkninger med passende etiket, ligesom blod født makrofager (CD11 + CD45 hi CD68 +), og den kan anvendes til undersøgelse af andre CNS sygdomme eller skader. Derfor er denne teknik giver et vigtigt redskab til at udforske heterogenitet af den inflammatoriske reaktion i hjernen. En største begrænsning ved denne teknik er bosat på udarbejdelsen af leukocyt suspensioner fra frisk hjernevæv, som kan ændreaktivering tilstand af cellerne eller deres antigen ændring. Selvom denne teknik giver mulighed for en mere detaljeret kvalitativ karakterisering forhold til immunohistokemiske undersøgelser, det giver en mindre nøjagtig kvantificering baseret på celle isolation. På trods af dette, effektiviteten af vores celle isolation protokol svarer til andre offentliggjorte metoder 9 og det effektivt kan anvendes til at detektere forskelle i antallet af hjernens immunceller mellem kontrol og MCAO grupper eller endda mellem MCAO grupper udsat for forskellige behandlinger 8.
Kritiske trin i denne protokol er vævet dissektion, vævet forstyrrelser procedure, og myelin fjernelse. Med hensyn til vævet indsamling, kan en normalisering trin inkluderes (ved at veje vævet indsamlet) for at undgå variation på grund af forskellige dissektion forestillinger. Desuden kan normalisering mellem forskellige MCAO grupper også forekomme gennem infarktvolumen (tidligere bestemt af Magnetic Resonance). En anden måde at løse dette problem er at anvende hele ipsilaterale hemisfære af både iskæmiske og kontrolgrupper eller endda bruge den kontralaterale hemisfære af den iskæmiske mus som en kontrol for at minimere antallet af anvendte dyr. Selv om denne fremgangsmåde undgår forskellene mellem hvert dissektion, det har en største ulempe; en fortyndingsfaktor tilsættes ved at øge det samlede antal celler, men ikke antallet af myeloide celler, som udelukkende er placeret i kernen og peri-infarkt områder af den ipsilaterale cortex. Med hensyn vævssprængning, denne protokol viser trin for den mekaniske afbrydelse af hjerneceller, undgå enzymatiske behandlinger og forebyggelse overfladeantigen ændring 9,22, et væsentligt problem for yderligere kvalitativ og kvantitativ analyse af de inflammatoriske cellesubpopulationer. Ud over udarbejdelsen af cellen suspension af interesse, myelin fjernelse fra hjernen prøver er et stærkt anbefalet skridt for at undgå interferens med downstReam applikationer, såsom immunomagnetisk celle separation eller flowcytometri 23,24. Dette kan opnås ved hjælp af forskellige metoder, såsom saccharose eller Percoll gradienter, eller anti-myelin perler. Her og baseret på tidligere studier, der sammenligner forskellige metoder til hjernen cellesuspension isolation, mekanisk afbrydelse i kombination med Percoll brug for at fjerne myelin bruges til at forbedre celleudbytter og levedygtighed 25.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photonic Led F1 | WPI | 571329-8 | Equipment |
| Temp Controller | Panlab | HB 101/2 | Equipment |
| Volvere GX | NSK | Ne22L | Equipment |
| Microscope | WPI | PZMIII-BS | Equipment |
| Stainless Steel Burrs | FST | 19007-14 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | Surgical material |
| Forceps Dumont #5SF | FST | 11252-30 | Surgical material |
| Suture 6/0 | LorcaMarin | 55108 | Surgical material |
| Suture 9/0 | LorcaMarin | 61966 | Surgical material |
| Nikon Eclipse | Nikon | TE300 | Equipment |
| Isoflurane | Esteve | 571329-8 | Chemical |
| Sodium Pentobarbital | Vetoquinol | 570681 | Chemical |
| Freezing microtome | Leica Microsystems GmbH | SM2000R | Equipment |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | 2014-07 | Lab material |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | Chemical |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TE300 | Equipment |
| XYZ motorized computer stage and controller | Ludl electronics Products | Equipment | |
| Stereo Investigator System | Microbrightfield | Version 7.003 software | Software |
| 5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle | Thomas Scientific | 0913X70 | Lab Material |
| Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube | Nalgene | 3119-0050 | Lab material |
| Percoll | Sigma | p1644-100 | Chemical |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-702F | Chemical |
| Beckman Ultracentrifugue | Beckman Coulter | Equipment | |
| Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti | Beckman Coulter | Equipment | |
| BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron | BD | BD 352340 | Lab Material |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3733-500G | Reagment |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi | 130-092-575 | Antibody |
| CD11b-FITC, human and mouse | Miltenyi | 130-098-085 | Antibody |
| CD45-PE, mouse | Miltenyi | 130-102-596 | Antibody |
| Anti-Ly-6G-APC, mouse | Miltenyi | 130-102-936 | Antibody |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C | Biolegend | 128012 | Antibody |
| BD FACS Flow | BD | 342003 | Reagment |
| BD FACSCalibur; 4-color | BD | 342975 | Equipment |
| BD Cell Quest Pro Software | BD | Software | |
| FlowJo software | Treestar inc. | Software |
References
- Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).
- Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
- Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
- Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).
- Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).
- Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
- Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).
- Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
- Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).
- Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
- Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).
- Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
- Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
- García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
- Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
- Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
- Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
