Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

क्षणिक या स्थायी मस्तिष्क ischemia के मॉडल में ल्युकोसैट उप-जनसंख्या का Stereological और फ्लो विशेषता

Published: December 28, 2014 doi: 10.3791/52031
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Unidad de Investigacón Neurovascular, Departmento de Farmacología, Falcultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid
* These authors contributed equally

Summary

स्ट्रोक निम्नलिखित ब्रेन माइलॉयड कोशिकाओं लक्षण वर्णन ऑप्टिकल fractionator विधि का उपयोग Stereology द्वारा प्रदर्शन, या मस्तिष्क के एक प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा निलंबन leukocytes जा सकता है। दोनों इस्कीमिक मस्तिष्क में पाया मुख्य माइलॉयड सेल सबसेट का सही phenotypical भेद प्रदर्शन करने के लिए उपयोगी तकनीकों हैं।

Abstract

Microglia सक्रियण, साथ ही haematogenous मैक्रोफेज और neutrophils के परिस्त्राव, स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क की चोट में एक निर्णायक भूमिका निभा माना जाता है। ये माइलॉयड सेल उप-जनसंख्या अलग phenotypes और कार्यों को प्रदर्शित करने और प्रतिष्ठित होने की जरूरत है और ऊतकों को नुकसान करने के लिए उनके विनियमन और योगदान करने के लिए अध्ययन की विशेषता कर सकते हैं। एक सटीक stereological दृष्टिकोण और एक प्रवाह cytometric विश्लेषण: इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क प्रतिरक्षा सेल लक्षण वर्णन के लिए दो अलग अलग तरीके प्रदान करता है। stereological दृष्टिकोण एक व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना द्वारा अनुमानित ब्याज (infarcted मस्तिष्क) के एक क्षेत्र में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करता है, जो ऑप्टिकल fractionator पद्धति पर आधारित है। दूसरा लक्षण वर्णन दृष्टिकोण मस्तिष्क ल्युकोसैट निलंबन को अलग करने और microglia के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, प्रवाह cytometry द्वारा उन्हें चिह्नित करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, monocytes और इस्कीमिक ऊतकों की न्यूट्रोफिल में घुसपैठ की। इसके अलावा, यह भी घविशेष रूप से मृत्यु दर की दर कम है, और कावालिएरी विधि द्वारा रोधगलितांश मात्रा चिह्नित करने के लिए ऊतकीय मस्तिष्क प्रसंस्करण के लिए प्रक्रिया के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दौरे पैदा करने, मस्तिष्क प्रांतस्था को प्रभावित करता है कि चूहों में एक मस्तिष्क ischemia मॉडल etails।

Introduction

रूपात्मक, प्ररूपी और जीन अभिव्यक्ति microglia की परिवर्तन, साथ ही परिस्त्राव और haematogenous मैक्रोफेज और neutrophils के सक्रियण मस्तिष्क की चोट 1-4 निम्नलिखित pathophysiological झरना में एक निर्णायक भूमिका निभा माना जाता है। इस प्रोटोकॉल के दो दृष्टिकोण इस्कीमिक मस्तिष्क के विभिन्न माइलॉयड सेल सबसेट की संख्या का अनुमान लगाने के लिए और उनके phenotypical लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए प्रदान करता है। इसके अलावा, यह भी, कैसे रोधगलितांश का मूल्यांकन करने सहित दोनों बाहर का मध्य मस्तिष्क धमनी की क्षणिक या स्थायी बंधाव (एमसीए) और आम मन्या धमनी (सीसीए) के होते हैं, जो चूहों में मस्तिष्क ischemia के एक प्रयोगात्मक मॉडल की एक विवरण प्रदान करता है एक stereological सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सही कावालिएरी विधि द्वारा।

इस्कीमिक मस्तिष्क के माइलॉयड सेल सबसेट चिह्नित करने के लिए पहले दृष्टिकोण ऑप्टिकल fractionator दृष्टिकोण 5 पर आधारित एक stereological विधि है। यह सबसे अधिक हैसामान्यतः जीवन विज्ञान में stereological जांच इस्तेमाल किया और त्रुटि 5-7 की कम गुणांक के साथ परिशुद्धता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है। इसकी वजह यह वर्गों में ऊतक के विखंडन की सेल आकलन पर पूर्वाग्रह से बचा जाता है के रूप में ऊतक, वर्गों में काटा जाता है जब यह सेल मात्रा का ठहराव के लिए सबसे अच्छा विकल्प है। इस विधि नंबर, गतिशीलता और इस्कीमिक ऊतक 8 की घुसपैठ की न्युट्रोफिल उप-जनसंख्या के प्ररूपी परिवर्तन चिह्नित करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली तरीका है।

दूसरा लक्षण वर्णन दृष्टिकोण मस्तिष्क ल्युकोसैट निलंबन को अलग करने और प्रवाह cytometry द्वारा उन्हें चिह्नित करने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है कि Campanella और सहयोगियों 9 से एक संशोधित प्रोटोकॉल पर आधारित है। पारंपरिक immunohistochemical तकनीक के विपरीत, उनके अन्तर पर आधारित माइलॉयड कोशिकाओं (CD45 हाय CD11b +) लक्षण वर्णन (CD45 लो CD11b +) microglia के बीच फर्क करने की अनुमति देता प्रवाह cytometry और घुसपैठCD45 9-13 की erent अभिव्यक्ति के स्तर। इसके अलावा, समर्थक भड़काऊ monocytes (CD45 हाय CD11b + Ly-6G - Ly-6C HI), न्यूट्रोफिल (CD45 हाय CD11b + Ly-6G +) और इस्कीमिक ऊतक के अन्य ल्यूकोसाइट्स कैंपेन्स प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण मस्तिष्क ischemia के प्रयोगात्मक मॉडल में neuroinflammation का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय और तेजी से परख प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक प्रसंस्करण सक्रियण राज्य और एक अर्द्ध मात्रात्मक लक्षण वर्णन प्रदान करने इस्कीमिक ऊतकों में पाया अलग सेल आबादी की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं।

Protocol

नोट: Universidad Complutense के पशु कल्याण समिति के दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (यूरोपीय संघ के निर्देशों 86/609 / CEE और 2003/65 / सीई के बाद)।

1. मस्तिष्क ischemia मॉडल

नोट: इस समाचार पत्र में मस्तिष्क ischemia मॉडल एक नायलॉन सीवन के साथ बंधाव द्वारा सीसीए (आम मन्या धमनी) और एमसीए (मध्य मस्तिष्क धमनी) दोनों का स्थायी या क्षणिक रोड़ा शामिल है।

  1. पूर्व शल्य तैयारी
    1. Autoclaving द्वारा या एक गिलास मनका अजीवाणु के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित। के रूप में अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र कीटाणुरहित।
    2. उपयुक्त एनेस्थेटिक्स के साथ माउस anesthetize। Isoflurane के 2.5% से प्रेरण को प्राप्त करने और एक vaporizer का उपयोग कर 80% हवा / 20% ऑक्सीजन का एक मिश्रण में isoflurane के द्वारा के साथ 1.5% बनाए रखें। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए चूहों आंखों को कृत्रिम आँसू लागू करें।
    3. एक शुल्क से जुड़ा हुआ है कि एक हीटिंग पैड पर माउस रखेंशल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान शारीरिक स्तर पर एक तापमान मलाशय में रखा जांच और निर्धारित तापमान (36.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस) के साथ dback डिवाइस।
  2. बंधाव द्वारा आम मन्या धमनी रोड़ा
    1. पृष्ठीय लेटना में माउस प्लेस और टेप के साथ स्थिर करना। 70% इथेनॉल या povidone-आयोडाइड के साथ त्वचा को शुद्ध करना और ऊपरी उदर भाग के बाल काट दिया।
    2. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, गर्दन के उदर सतह के चारों ओर एक एक सेमी midline चीरा बनाते हैं।
    3. इसके अलावा यह सब नरम ऊतकों (उप दाढ़ की हड्डी, मांसल और कर्णमूलीय ग्रंथियों सहित ग्रंथियों के ऊतक) खींचो और श्वासनली के लिए पार्श्व स्थानीय है जो छोड़ दिया आम मन्या धमनी (सीसीए), की पहचान। मांसपेशियों को वापस लेना और बाईं सीसीए बेनकाब। ध्यान से वेगस तंत्रिका से काटना।
    4. एक बार एक 6/0 नायलॉन सीवन का उपयोग कर एक संयुक्ताक्षर द्वारा छोड़ा सीसीए रोक देना, विच्छेदित। (एक क्षणिक मस्तिष्क ischemia मॉडल वांछित है reperfusion की अनुमति देने के लिए) एक स्थायी गाँठ या एक Slipknot साथ ligate।
    5. अपनी मूल स्थिति में ग्रंथियों के ऊतक प्लेस और एक 6/0 नायलॉन सीवन के साथ गर्दन की त्वचा पर चीरा बंद करें।
      नोट: नकली पशुओं MCAO जानवरों के रूप में एक ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के अधीन हैं लेकिन सीसीए occluded नहीं है।
  3. बंधाव से बाहर का मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा
    1. इसकी सही पक्ष पर माउस की स्थिति और टेप के साथ स्थिर करना। 70% इथेनॉल या povidone-आयोडाइड के साथ सिर की त्वचा को शुद्ध करना और माउस सिर के बाल काट (काटने के बाद बाल निकालने के लिए)।
    2. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, आंख और कान के बीच एक त्वचा चीरा बनाते हैं। दूर त्वचा ले जाएँ और टेप के साथ इसे पकड़।
    3. बाईं करने के लिए सही से अस्थायी पेशी पर एक क्षैतिज चीरा बनाओ। फिर, लौकिक मांसपेशियों के सही पक्ष पर एक दूसरे ऊर्ध्वाधर चीरा बनाने (कट अस्थायी नस से बचने के लिए सावधान रहना)। खोपड़ी से अस्थायी पेशी के अलावा खींचो और एक साफ खोपड़ी की सतह बनाए रखने के लिए एक सीवन के साथ इसे पकड़।
    4. खोपड़ी की सतह को साफ करेंठंड बाँझ खारा के साथ खोपड़ी पारदर्शिता के माध्यम से छोड़ दिया मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) की सही स्थिति का पता लगाने के लिए। गाल की हड्डी का कट्टर और squamosal हड्डी के बीच ललाट पालि में एक स्टेनलेस स्टील गड़गड़ाहट के साथ एक दौर craniotomy (व्यास में 1 मिमी) प्रदर्शन करते हैं। ध्यान से खोपड़ी निकालें और एमसीए बेनकाब।
    5. मस्तिष्क की सतह के लिए ठंड बाँझ खारा समाधान की एक छोटी राशि लागू करें और संदंश का उपयोग करके तानिका (ड्यूरा और मकड़ी का मेटर) को हटा दें।
    6. सिर्फ ललाट और पीछे एमसीए शाखाओं के बीच विभाजन से पहले बाहर का ट्रंक में छोड़ दिया एमसीए के बंधाव प्रदर्शन करते हैं। एक 9/0 नायलॉन सीवन का उपयोग कर एक संयुक्ताक्षर द्वारा छोड़ा एमसीए रोक देना। (एक क्षणिक मस्तिष्क ischemia मॉडल वांछित है reperfusion की अनुमति देने के लिए) एक स्थायी गाँठ या एक Slipknot साथ ligate। सीसीए और एमसीए रोड़ा बीच के समय की अवधि के ऑपरेटर के अनुभव के आधार पर लगभग 10-20 मिनट है।
    7. अपनी मूल स्थिति में अस्थायी पेशी प्लेस और incisio बंद करेंएक 6/0 नायलॉन सीवन के साथ गर्दन की त्वचा पर एन।
    8. संज्ञाहरण (आम तौर पर 5-10 मिनट) से उबरने और buprenorphine intraperitoneal (आईपी) (0.3 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस इंजेक्षन करने के लिए पिंजरे के लिए माउस लौटें।
      1. किसी भी असुविधा का पता लगाने के लिए कई घंटे के लिए माउस मॉनिटर (यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक नायाब माउस छोड़ नहीं है)। खो शल्य चिकित्सा के बाद वजन आम तौर पर मनाया जाता है, खाने की सुविधा के लिए एक पेट्री डिश में मसला हुआ भोजन जगह है।
    9. जानवर पूरी तरह से ठीक है, जब अन्य जानवरों की कंपनी के लिए वापसी।
    10. एक क्षणिक MCAO मॉडल वांछित है, तो फिर से माउस anesthetize और (आमतौर पर 0.5-2 घंटा (चित्रा 1) के बीच) reperfusion की अनुमति देने के लिए सीसीए और एमसीए की Slipknot हटा दें।
      नोट: नकली पशुओं MCAO जानवरों के रूप में एक ही शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के अधीन हैं, लेकिन एमसीए occluded नहीं है।

2. छिड़काव और SECTIमस्तिष्क के ऊतकों की oning

  1. 24 या MCAO के बाद 48 घंटा, एक घातक संवेदनाहारी की खुराक (जैसे, सोडियम pentobarbital, आईपी 86 मिलीग्राम / किग्रा या isoflurane के साथ जरूरत से ज्यादा) के साथ माउस का बलिदान।
  2. फॉस्फेट बफर में 4% paraformaldehyde (पीएफए) (7.4 पीएच) द्वारा पीछा फॉस्फेट बफर 0.1 एम के साथ माउस छिड़कना।
  3. इस प्रकार के रूप में मस्तिष्क निकालें:
    1. बस रीढ़ की हड्डी के ऊपर पशु सिर काटना।
    2. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए सिर की त्वचा पर एक पश्च-पूर्वकाल चीरा बनाओ। पार्श्व दीवारों के जंक्शन और खोपड़ी के आधार पर दो पार्श्व कटौती करने और हड्डी के छोटे टुकड़े को हटा दें।
    3. बाण के समान सिवनी साथ खोपड़ी के माध्यम से एक कटौती करें।
    4. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए एक संदंश का उपयोग करके प्रत्येक गोलार्द्ध overlying खोपड़ी निकालें। खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग किया और 4% पीएफए ​​समाधान में स्थानांतरित करने के लिए एक रंग का प्रयोग करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​समाधान में तीन घंटे के लिए पोस्ट तय।
  5. पीएफए ​​समाधान और incubat निकालेंमस्तिष्क cryoprotect करने के लिए 30% sucrose के समाधान में 48 घंटे के लिए मस्तिष्क ई।
  6. Sucrose के समाधान निकालें और ठंड isopentane (-40 डिग्री सेल्सियस) में जल्दी से मस्तिष्क फ्रीज। स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क में जमे हुए।
  7. एक ठंड सूक्ष्म साथ राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों (30 माइक्रोन) प्राप्त करते हैं। एक cryopreservative समाधान में दस धारावाहिक के सेट ले लीजिए। प्रत्येक धारावाहिक सेट पर्याप्त रूप से शीर्षस्थान के लिए 1.94 और -2.46 पीछे के बीच माउस मस्तिष्क नमूना है, जो 300 मीटर की एक interslice दूरी के साथ चारों ओर 14-16 राज्याभिषेक स्लाइस से बना है।

3. Nissl धुंधला और रोधगलितांश वॉल्यूम आकलन

  1. Cresyl बैंगनी द्वारा Nissl धुंधला
    1. एक Superfrost खुर्दबीन स्लाइड में माउंट मस्तिष्क वर्गों। 7-8 वर्गों के लगभग एक कुल संख्या; Nissl दाग वर्गों में कावालिएरी विधि द्वारा रोधगलितांश मात्रा दृढ़ संकल्प के लिए, एक 1/20 टुकड़ा नमूना अंश (कदम 2.7 में एकत्र दस धारावाहिक के सेट में से एक का 1/2 वर्गों का उपयोग 600 μ के एक interslice दूरी के साथ; मी) किया जाता है। उचित पूर्वकाल-पीछे अभिविन्यास बनाए रखने के लिए सावधान रहें (infarcted क्षेत्र सही दिशा में रखा गया है)।
    2. इस प्रकार के रूप में पारंपरिक Nissl धुंधला प्रदर्शन करना:
      1. स्लाइड पर चढ़कर वर्गों कई घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
      2. स्लाइड पर चढ़कर वर्गों rehydrate और 5 मिनट के लिए 0.1% cresyl बैंगनी समाधान के साथ दाग।
      3. EtOH के एक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण (70%, 90%, और 100%; परिवर्तन प्रति 5 मिनट)। Xylene साथ स्लाइड पर चढ़कर वर्गों साफ, distrene-80 plasticizer xylene (dpx) बढ़ते मीडिया जोड़ सकते हैं और एक गिलास coverslip के साथ कवर किया।
  2. में कावालिएरी विधि द्वारा रोधगलितांश मात्रा का अनुमान लगाने के stereological सॉफ्टवेयर का उपयोग धारावाहिक वर्गों Nissl दाग
    1. (कावालिएरी विधि 14 और एक कैमरा, एक एक्सवायजेड मोटर चालित कंप्यूटर मंच के साथ लगे एक खुर्दबीन के होते हैं, जो एक Stereology प्रणाली, और stereological सॉफ्टवेयर द्वारा रोधगलितांश मात्रा यों के लिए मुख्य तालिका 1 में दिखाया गया मापदंडों का प्रयोग करें) नीचे प्रदान दिशाओं पीसी से जुड़े हुए हैं, लेकिन दिशाओं अन्य ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए अलग कर सके।
    2. उचित क्रम में पीसी, माइक्रोस्कोप, मंच पर नियंत्रक और कैमरा चालू करें। Stereological सॉफ्टवेयर शुरू करो।
    3. जगह में 10X उद्देश्य ले जाएँ और डाउन मेनू उद्देश्य बूंद से 10X का चयन करें।
    4. पहले Nissl दाग अनुभाग चारों ओर ले जाएँ और एक उपयुक्त संदर्भ बिंदु हैं। संदर्भ बिंदु स्थापित करने के लिए माउस क्लिक करें (यह सक्रिय आनन्द मुक्त बटन करने के लिए आवश्यक है चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए)।
    5. "घुड़सवार खंड मोटाई" (खाते में सिकुड़न ले जा वास्तविक अनुभाग मोटाई) का अनुमान है। "फोकस स्थिति मीटर" बटन दबाएँ और खंड के शीर्ष करने के लिए नीचे से मोटाई की गणना।
    6. Contralesional और ipsilesional क्षेत्रों और infarcted क्षेत्र के लिए एक समोच्च उपकरण बनाने।
      1. मेनू "प्रदर्शन" पर क्लिक करें और "प्रदर्शन सेटिंग्स" का चयन करें। यह टी खोलता हैवह सेटिंग संवाद प्रदर्शित करें।
      2. "कंटूर प्रकार जोड़ने के" "आकृति" टैब का चयन करें और बटन पर क्लिक करें।
      3. यों और मेनू नीचे समोच्च में उन्हें दिखाई बनाने के लिए प्रत्येक क्षेत्र के लिए एक समोच्च बनाएँ। ठीक क्लिक करें।
    7. Contralesional और ipsilesional गोलार्द्धों और infarcted क्षेत्र के लिए एक मार्कर उपकरण बनाने।
      1. मेनू "प्रदर्शन" पर क्लिक करें और प्रदर्शन सेटिंग संवाद खोलने के लिए "प्रदर्शन सेटिंग्स" का चयन करें।
      2. "मार्कर" टैब का चयन करें और उपलब्ध मार्कर से अधिक डबल क्लिक करके ही नाम मार्करों बदल जाते हैं। मार्कर पट्टी में दिखाई है। ठीक क्लिक करें।
    8. खंड प्रबंधक को सक्रिय करें।
      1. मेनू "उपकरण / सीरियल धारा प्रबंधक" पर क्लिक करें। "नया अनुभाग" बटन के साथ एक नया खंड जोड़ें। यह बटन "सीरियल धारा सेटअप संवाद" को खोलता है।
      2. 30 माइक्रोन के रूप में "ब्लॉक अग्रिम" सेट। जमीकदम 3.2.5 में अनुमानित मूल्य के साथ "घुड़सवार खंड मोटाई"।
      3. 20. उपयोग के रूप में "मूल्यांकन अंतराल" एक 1/20 टुकड़ा नमूना अंश निर्धारित करें।
      4. 0. ठीक पर क्लिक करें रूप में "प्रथम खंड के शीर्ष के लिए जेड अक्ष मूल्य" सेट 1. "के रूप में शुरू करने के खंड संख्या" सेट।
    9. Contralateral गोलार्द्ध की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक समोच्च ड्रा।
      1. Contralesional गोलार्द्ध उपकरण का चयन करें मेनू नीचे समोच्च से (पहले कदम 3.2.6 में बनाया)।
      2. Contralateral गोलार्द्ध की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक समोच्च ड्रा।
      3. Contralesional गोलार्द्ध अनुरेखण खत्म करने के लिए, सही माउस क्लिक करें और "करीब समोच्च" का चयन करें।
    10. Cavalieri द्वारा contralesional गोलार्द्ध समोच्च का अनुमान है।
      1. मेनू "जांच" पर क्लिक करें और कावालिएरी अनुमानक का चयन करें। 100 माइक्रोन के रूप में "ग्रिड स्पेसिंग" सेट। 0. "बी सेट के रूप में" ग्रिड रोटेशन "सेट30 माइक्रोन के रूप में "अग्रिम ताला। ठीक क्लिक करें।
      2. मार्करों बार से "contralesional गोलार्द्ध" बटन का चयन करें। राइट Contralesional गोलार्द्ध समोच्च के अंदर क्लिक करें।
      3. "पेंट कावालिएरी मार्करों मोड" का चयन करें। फिर से ठीक contralesional गोलार्द्ध समोच्च के अंदर क्लिक करें और "कंटूर में मार्कर रंग" का चयन करें।
      4. जांच और कावालिएरी अनुमानक पर क्लिक करके कावालिएरी अनुमानक निष्क्रिय और मार्कर पट्टी से contralesional मार्कर बटन निष्क्रिय।
    11. Ipsilesional गोलार्द्ध और infarcted क्षेत्र (चरणों 3.2.7 और 3.2.8) के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ। प्रत्येक अनुभाग के क्षेत्र के आकलन के बाद डेटा को बचाओ।
    12. Nissl दाग खंड के बाकी हिस्सों में, प्रतिपक्षी ipsilesional और infarcted क्षेत्रों की गणना।
      1. कदम 3.2.6 के रूप में एक नया खंड बनाएँ। "सीरियल अनुभाग सेटअप" संवाद में प्रवेश किया मूल्यों को संशोधित न करें। ठीक पर क्लिक करें।
      2. चरणों को दोहराएँ 3.2.7-3.2.8 नए खंड में।
    13. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल को गुणात्मक रूप से परिणामों को निर्यात।
      1. स्टीरियो अन्वेषक मेनू में "जांच" पर क्लिक करें। "प्रदर्शन जांच को चलने सूची" का चयन करें। यह "पिछले Stereological संवाद रन" खोलता है।
      2. उन पर क्लिक करके सभी वर्गों का चयन करें। "देखें परिणाम" बटन दबाएँ। यह प्रत्येक क्षेत्र के लिए अनुमानित क्षेत्र और मात्रा प्रदर्शित कर रहे हैं, जहां "कावालिएरी अनुमानक परिणाम" खोलता है।
      3. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए परिणामों को निर्यात करने के लिए, प्रत्येक क्षेत्र (तालिका 2) से प्राप्त मुख्य परिणामों के साथ फ़ाइल एक एक्सेल में "क्लिपबोर्ड करने के लिए सभी परिणामों की प्रतिलिपि" और पेस्ट क्लिक करें।
    14. 3 मिमी के रूप में या, जहां सूत्र 15% IH = InfVol / ContrVol * 100 का उपयोग कर (% IH) infarcted है कि गोलार्द्ध के% के रूप में एक्सप्रेस रोधगलितांश मात्रा
ove_content "> InfVol (Infarcted ऊतक वॉल्यूम) = ΣInfArea मैं,
ContrVol (Contralesional गोलार्ध वॉल्यूम) = ΣContrArea मैं

ऑप्टिकल fractionator द्वारा मस्तिष्क ischemia के बाद घुसपैठ की न्यूट्रोफिल 4. Stereological मात्रा

  1. मस्तिष्क वर्गों का धुंधला:
    1. ऑप्टिकल fractionator 16 से MCAO के बाद घुसपैठ की neutrophils की कुल संख्या के आकलन के लिए, एक 1/10 टुकड़ा नमूना अंश का उपयोग करें। चूहा विरोधी Ly6G एंटीबॉडी (1A8) और मुक्त अस्थायी वर्गों पर सही माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का उपयोग करके Immunostain न्यूट्रोफिल। यह न्युट्रोफिल पहचान के लिए आवश्यक नहीं है, हालांकि इसके अतिरिक्त, एक, DAPI या TOPRO तरह एक परमाणु निर्माता के साथ counterstaining, infarcted क्षेत्र का पता लगाने के लिए आसान बना सकते हैं।
    2. सही दिशा में रखा infarcted क्षेत्र के साथ एक Superfrost खुर्दबीन स्लाइड में माउंट मस्तिष्क वर्गों।
  2. Quantificऑप्टिकल fractionator से इस्कीमिक मस्तिष्क में घुसपैठ leukocytes की समझना
    1. तालिका 3 में दिखाया उपयोग के मापदंडों के एक Stereology प्रणाली के साथ ऑप्टिकल fractionator दृष्टिकोण से इस्कीमिक मस्तिष्क में घुसपैठ की ल्यूकोसाइट्स यों की। धारा 3 से कुछ कदम दूर 3.2.1-3.2.5 दोहराएँ।
    2. यह धारा 3 के कदम 3.2.6 में वर्णित किया गया है के रूप में infarcted क्षेत्र के लिए एक समोच्च उपकरण बनाने।
    3. यह धारा 3 के कदम 3.2.7 में वर्णित किया गया है के रूप में न्यूट्रोफिल के लिए एक मार्कर उपकरण बनाने।
    4. खंड प्रबंधक को सक्रिय करने और कदम 3.2.8 के रूप में एक नया अनुभाग बनाते हैं। इस मामले में, (एक 1/10 टुकड़ा नमूना अंश न्युट्रोफिल संख्या के आकलन के लिए प्रयोग किया जाता है) के रूप में 10 "मूल्यांकन अंतराल" की स्थापना की।
    5. "Infarcted क्षेत्र" समोच्च उपकरण का चयन करें मेनू नीचे समोच्च से (पहले कदम 4.2.1 में बनाया)। 10X उद्देश्य पर infarcted क्षेत्र की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक समोच्च ड्रा। Neutroph प्रदर्शन करने के लिए 100X करने के उद्देश्य बदलेंआईएल मात्रा का ठहराव (डाउन मेनू उद्देश्य बूंद से 100X चयन करने के लिए भूल नहीं है)।
    6. मेनू "जांच" पर क्लिक करें और "ऑप्टिकल fractionator" का चयन करें। एक्स और वाई ग्रिड आकार दोनों के लिए 230 के रूप में "फ्रेम गिनती के xy प्लेसमेंट" सेट। 30 माइक्रोन के रूप में "ब्लॉक अग्रिम" 0. सेट के रूप में "ग्रिड रोटेशन" सेट करें। ठीक क्लिक करें।
    7. मार्कर बार से "न्युट्रोफिल" बटन का चयन करें। मार्क infarcted क्षेत्र में न्यूट्रोफिल दाग। खत्म होने के बाद, "जांच" और "ऑप्टिकल fractionator" पर क्लिक करके ऑप्टिकल fractionator जांच निष्क्रिय। मार्कर पट्टी से न्यूट्रोफिल बटन निष्क्रिय करें।
    8. प्रत्येक खंड (4.2.4-4.2.9) के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
    9. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल को गुणात्मक रूप से परिणामों को निर्यात।
      1. स्टीरियो अन्वेषक मेनू में "जांच" पर क्लिक करें। "पिछले Stereological रन" खोलने के लिए "जांच को चलने सूची प्रदर्शित" का चयन करेंसंवाद।
      2. उन पर क्लिक करके सभी वर्गों का चयन करें। Neutrophils की अनुमानित संख्या प्रदर्शित किया जाता है, जहां "ऑप्टिकल fractionator परिणाम" खोलने के लिए "देखें परिणाम" बटन दबाएँ।
      3. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए "क्लिपबोर्ड करने के लिए सभी परिणामों की प्रतिलिपि" और पेस्ट क्लिक करके एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए परिणामों को निर्यात।

5. ब्रेन हदबंदी और फ्लो विश्लेषण

नोट: ताजा मस्तिष्क के ऊतकों पर प्रवाह cytometry द्वारा माइलॉयड उप-जनसंख्या लक्षण वर्णन तय की और immunostained मस्तिष्क वर्गों पर प्रदर्शन पिछले न्युट्रोफिल लक्षण वर्णन करने के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. ब्रेन हदबंदी और एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
    1. बनाओ 10 मिलीग्राम / एक RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम) के पशु RPMI के 8 मिलीग्राम, 30% Percoll के 1 मिलीलीटर और एक 10x पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) के 1 मिलीलीटर युक्त -Percoll समाधान।
    2. आर2.3 कदम के रूप में वर्णित MCAO के बाद emove माउस मस्तिष्क।
    3. एक खुर्दबीन के नीचे, मस्तिष्क से मस्तिष्क इस्कीमिक माउस से ipsilateral कॉर्टेक्स (या नकली और भोले जानवरों के लिए एक समान क्षेत्र) के कोर और पेरी-रोधगलितांश क्षेत्रों बाहर काटना। वजन मस्तिष्क के ऊतकों और बर्फ ठंड RPMI-Percoll (वजन कदम प्रयोगात्मक समूहों के बीच सामान्य बनाने के लिए किया जा सकता है) के 5 मिलीलीटर में जगह।
    4. Teflon pestles साथ एक कुम्हार-Elvehjem प्रकार ऊतक बनाने की मशीन का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन में ऊतक अलग कर देना।
    5. एक 50 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और नमूने के RPMI-Percoll समाधान के 5 अधिक मिलीलीटर जोड़ने।
    6. 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 7800 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। Centrifugation के बाद, माइलिन के लिए इसी एक सफेद रंग की परत समाधान के शीर्ष पर प्रकट होता है सुनिश्चित करते हैं।
    7. 40 माइक्रोन नायलॉन जाल straine के माध्यम से, pelleted कोशिकाओं सहित, ध्यान से माइलिन परत को हटाने और पूरे सेल निलंबन को फ़िल्टरआर।
    8. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में समाधान सभी कोशिकाओं छान रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए और जगह के लिए झरनी पर RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर सेल निलंबन के 50 मिलीलीटर RPMI के 30 मिलीलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र।
    9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ ल्युकोसैट गोली resuspend। Lysis बफर (150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी 3 NaHCO और 0.1 मिमी EDTA) के 4 मिलीलीटर जोड़ें और सेल निलंबन से एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए आरटी पर 2-3 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र।
  2. सेल धुंधला और प्रवाह cytometry
    1. पीबीएस-बीएसए (1%) 1 के 200 μl युक्त, प्रवाह cytometry के लिए एक लेबलिंग कॉकटेल तैयार: 100 एफसी-ब्लॉक, 1:40 विरोधी CD45-PercP चूहे, 1:40 विरोधी Ly6G-एपीसी चूहे, 1:40 विरोधी CD11b-FITC चूहा और नमूना प्रति 01:40 विरोधी Ly-6C पीई चूहा।
    2. लेबलिंग कॉकटेल में कोशिकाओं Resuspend और बर्फ में 45 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
    3. लेबलिंग कॉकटेल धोएंएक ठंड पीबीएस के मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर कोशिकाओं के साथ। FACS के प्रवाह के 100 μl के साथ गोली Resuspend और प्रवाह cytometry द्वारा पूरे सेल निलंबन के अधिग्रहण।
    4. सेल आबादी विशेषताएँ और यों के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर cytometry के एक प्रवाह का उपयोग करें।
      1. CD45 लो CD11b +: इस प्रकार है: इस प्रोटोकॉल में तैयार लेबलिंग कॉकटेल के लिए इसी मुख्य ल्युकोसैट कैंपेन्स विशेषता जा सकता निवासी microglial कोशिकाओं; CD45 हाय CD11b + Ly-6G +: न्यूट्रोफिल; CD45 हाय CD11b + Ly-6G - Ly-6C हाय: समर्थक भड़काऊ monocytes।

Representative Results

यहाँ दिखाया गया है मस्तिष्क ischemia मॉडल स्ट्रिएटम की सिंचाई कि एमसीए की lenticulostriatal शाखाओं (चित्रा 1) occluded नहीं कर रहे हैं के बाद से striatal ऊतक को प्रभावित किए बिना कोर्टेक्स में विशेष रूप से देखा दौरे उत्पन्न करता है। Nissl धुंधला करके, क्षतिग्रस्त क्षेत्र एक अल्पवर्णी cortical क्षेत्र (चित्रा 2) के रूप में पहचाना जा सकता है। इस मॉडल Nissl दाग वर्गों में कावालिएरी विधि द्वारा अनुमान लगाया MCAO (% IH 15.89 ± 0.28) (चित्रा 2) के बाद 24 घंटे में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश संस्करणों की विशेषता है। कावालिएरी विधि द्वारा infarcted मात्रा का आकलन contralesional और ipsilesional गोलार्द्धों में GUNDERSEN की त्रुटि (सीई) के गुणांक में के रूप में अच्छी तरह से infarcted क्षेत्र (तालिका 2) में परिलक्षित होता है कि एक कम त्रुटि के साथ एक सही तरीका है। क्षतिग्रस्त ऊतकों की मात्रा 3 मिमी में बल्कि अनुभाग 3.2.13 में सूत्र का उपयोग% IH के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। इसके अलावा, आकलनipsilesional और contralesional क्षेत्रों की कुल मात्रा का infarcted मात्रा सही करने के लिए और क्षतिग्रस्त ऊतकों (तालिका 2) के एक overestimation से बचने के लिए शोफ सूचकांक की गणना के लिए अनुमति देता है।

मस्तिष्क के ऊतकों के धारावाहिक सेक्शनिंग प्रसंस्करण को देखते हुए, इस ऑप्टिकल fractionator दृष्टिकोण (चित्रा 3 और 4 तालिका) का उपयोग कर, इस्कीमिक क्षेत्र में घुसपैठ की न्यूट्रोफिल की तरह, सेल उप-जनसंख्या की कुल संख्या का सही आकलन करने के लिए प्रदर्शन का लाभ लिया जा सकता है तालिका 3 में दिखाया गया मानकों के साथ। इस प्रोटोकॉल 24 घंटा और pMCAO (चित्रा 3 डी) के बाद चूहों में 82,856 ± 8143 48 में मानव संसाधन पर 23,328 ± 3623 की infarcted क्षेत्र में न्यूट्रोफिल (Ly6G पॉजिटिव कोशिकाओं) की कुल संख्या का अनुमान है। पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में, न्युट्रोफिल घुसपैठ सीधे रोधगलितांश आकार (चित्रा 3E) के साथ जोड़ा जाता है। टी का आकलनऑप्टिकल fractionator विधि द्वारा neutrophils की वह संख्या GUNDERSEN (तालिका 4) के सीई से परिलक्षित होता है कि एक कम त्रुटि के साथ एक सही तरीका है।

ल्युकोसैट अलगाव और लक्षण वर्णन प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry इस्कीमिक चूहों के ipsilesional गोलार्द्ध के कोर्टेक्स से 47,922 ± 23,174 माइलॉयड कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है। यह सेल निलंबन में पाया कुल घटनाओं में से 10-30% शामिल हैं। सेलुलर मलबे (चित्रा 4) के लिए जुड़े इस प्रोटोकॉल मौजूद एक कम है FSC पैरामीटर का उपयोग कर लिया घटनाओं के विशाल बहुमत। CD11b धुंधला CD11b + कोशिकाओं पहले संकेत के रूप में यह 200 9 में FSC दहलीज निर्धारित करके आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है, सेल मलबे इस मार्कर के साथ लेबल नहीं है, सुझाव है कि और, चित्रा (4) एक उच्च FSC मूल्य है कि पता चलता है। इस विधि के साथ प्राप्त सेल मलबे के चर राशि नमूना प्रक्रिया पर मतभेद है कि पता चलता हैआईएनजी (समय, ऊतक संरक्षण, नमूना तापमान, कुशल माइलिन हटाने, आदि) इसके लिए खाते सकता है। इसके अलावा, सेल strainers का उपयोग भी नमूने में सेलुलर clamps के उपस्थिति से बचने के लिए की जरूरत है; इस कदम से पहले सेल धुंधला करने के लिए किया जाना चाहिए। CD11b और CD45 अभिव्यक्ति पर आधारित है जो चित्रा 5 में दिखाया गया gating रणनीति का प्रयोग, हम इस्कीमिक ऊतकों में निवासी और घुसपैठ की माइलॉयड कोशिकाओं के बीच भेदभाव कर सकते हैं। इस्कीमिक गोलार्द्ध में इस CD11b + जनसंख्या बढ़ जाती है (चित्रा 4, चित्रा 5 और 5 तालिका) अनुभवहीन साथ और इन कोशिकाओं ज्यादातर microglia ischemia के बाद proliferating है यह दर्शाता है कि CD45 के एक कम अभिव्यक्ति से जुड़े हुए हैं, जिसमें नकली समूह, के साथ तुलना में जब । इस्कीमिक मस्तिष्क में एक CD11b + CD45 हाय सेल उप-जनसंख्या की उपस्थिति के सबूत के रूप यह अंतर (कारण, परिधि से सेल घुसपैठ करने के लिए चित्रा 4 की संभावना है, चित्रा 5 और भोले में और दिखावा दिमाग में कम संख्या है, जो 5 तालिका)। मस्तिष्क ischemia के में CD11b + सेल की आबादी के लिए पैठ का योगदान एक बहुत गतिशील प्रक्रिया 4 है। संयुक्ताक्षर द्वारा MCAO मॉडल में, यह 30% से घाव के आकार के और लक्षण वर्णन किया गया है, जब समय के आधार पर कुल CD11b + कोशिकाओं का 60% करने के लिए अलग-अलग हो सकते हैं। Ly-6G + कोशिकाओं के रूप में होती न्यूट्रोफिल, वे CD11b + CD45 के 70-80% शामिल है, के रूप मस्तिष्क ischemia के इस मॉडल का उपयोग कर इस्कीमिक माउस मस्तिष्क में MCAO के बाद 24 घंटे में पाया सबसे अनेक घुसपैठ की सेल की आबादी हैं हाय। Ly-6C हाय समर्थक भड़काऊ monocytes - कोशिकाओं के बाकी ज्यादातर CD11b + CD45 हाय Ly-6G की एक उप-जनसंख्या कर रहे हैं। इस मॉडल में, इस आबादी 24 से MCAO के बाद 48 घंटे के लिए इस्कीमिक मस्तिष्क क्षेत्रों में संख्या में वृद्धि होगी।


चित्रा 1:। एमसीए बंधाव के लिए सर्जिकल प्रक्रिया (ए) के अस्थायी पेशी के त्याग के बाद, एक छोटे craniotomy माउस खोपड़ी में किया जाता है। एमसीए एक गाँठ या एक 9/0 सीवन का उपयोग कर एक Slipknot द्वारा ligated है। (बी) MCAO मॉडल द्वारा उत्पन्न कॉर्टिकल घाव के प्रतिनिधि छवियाँ। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: Cavalieri द्वारा रोधगलितांश मात्रा की मात्रा। (ए) Nissl दाग मस्तिष्क वर्गों के प्रतिनिधि छवियों स्थायी एमसीए बंधाव के बाद 24 घंटा। उच्च बढ़ाई Nissl धुंधला के बाद hipocromatic क्षेत्र है जो दिखाता हैMCAO के बाद क्षतिग्रस्त क्षेत्र (कोर) को पहचानती है। पेरी-रोधगलितांश (पीआई) क्षेत्र में भी दिखाया गया है। (बी) (एन = MCAO के बाद, सीरियल Nissl दाग वर्गों में 50 चूहों 24 घंटा कावालिएरी विधि का उपयोग कर% Infarcted गोलार्ध (% IH) के रूप में प्रतिनिधित्व रोधगलितांश मात्रा की मात्रा का ठहराव )।

चित्रा 3
चित्रा 3: infarcted क्षेत्र 24 में न्यूट्रोफिल और बंधाव के बाद 48 घंटे के Stereological मात्रा का ठहराव, ऑप्टिकल fractionator विधि के प्रयोग से। MCAO के बाद 24 घंटे में इस्कीमिक क्षेत्र में घुसपैठ की न्यूट्रोफिल (Ly6G पॉजिटिव कोशिकाओं) (ए) प्रतिनिधि छवि। परिसीमन infarcted क्षेत्र से पता चलता है। (बी, सी) ऑप्टिकल fractionator द्वारा न्युट्रोफिल मात्रा का ठहराव के लिए एक ऑप्टिकल चीड़फाड़ के उदाहरण हैं। (डी) 24 पर infarcted क्षेत्र में कुल neutrophils की मात्रा और 48 घंटा (एन = 4 चूहों)। (ई)रोधगलितांश 24 में आकार और एमसीए बंधाव के बाद 48 घंटा के साथ neutrophils की संख्या के सहसंबंध। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। शारीरिक मापदंडों (एसएससी और FSC) के आधार पर भोले, दिखावा और इस्कीमिक (MCAO के बाद 24 घंटा) गोलार्द्धों से प्राप्त मस्तिष्क leukocytes के प्रतिनिधि डॉट साजिश बिखराव विश्लेषण CD11b (लाल) व्यक्त कि घटनाओं की एक आबादी की पहचान की थी सभी समूहों में। इस आबादी CD45 की अभिव्यक्ति के अनुसार gated और विशेषता थी। CD45 (हरा) के निम्न स्तर व्यक्त कोशिकाओं इस्कीमिक और गैर इस्कीमिक मस्तिष्क प्रांतस्था में मौजूद थे और microglial कोशिकाओं के लिए corresponded। इसके विपरीत, कोशिकाओं (पीला) CD45 के उच्च स्तर को व्यक्त ही थेइस्कीमिक गोलार्द्ध में और दिखावा समूह में हद तक कम करने में पाया। CD11b + CD45 हाय जनसंख्या के आगे विश्लेषण न्यूट्रोफिल (ly-6G + कोशिकाओं, नीला) और समर्थक भड़काऊ monocytes (ly-6C हाय कोशिकाओं, नारंगी) मुख्य सेल मस्तिष्क में पाया उप-जनसंख्या स्ट्रोक के बाद 24 घंटा पैठ कर रहे हैं कि इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। इस्कीमिक ऊतकों में घुसपैठ की माइलॉयड कोशिकाओं से निवासी अंतर करने के लिए रणनीतियों Gating CD11b + सेल पहले निर्धारण प्रतिदीप्ति तीव्रता (ए) के अनुसार gated थे। इस्कीमिक मस्तिष्क की कोशिका निलंबन का एक प्रतिनिधि डॉट साजिश पैनल के ऊपर दाएँ कोने में दिखाया गया है। मेंइसके अलावा, इस तकनीक का उपयोग कर हासिल की घटनाओं की कुल संख्या के लिए और CD11b + घटनाओं की संख्या के लिए विशिष्ट मूल्यों (दिखाया गया है कोई कोशिकाओं के / इस्कीमिक मस्तिष्क गोलार्द्ध;। (ए) CD11b + कोशिकाओं की CD45 प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण पैनल में दिखाया गया है gated CD11b + उप-जनसंख्या का CD45 और CD11b अभिव्यक्ति की बी एक प्रतिनिधि डॉट साजिश विश्लेषण पैनल के ऊपर दाएँ कोने में दिखाया गया है। इसके अलावा, इस्कीमिक मस्तिष्क गोलार्द्ध प्रति हासिल कर ली CD45 लो CD45 हाय कोशिकाओं के विशिष्ट संख्या इस तकनीक का उपयोग (बी) में दिखाया गया है।

कावालिएरी विधि के लिए इस्तेमाल किया मानकों
अनुभाग मोटाई (टी) 30 माइक्रोन
लक्ष्य 10X
स्लाइस नमूना अंश (SSF) 1/ 20
वर्गों के बीच दूरी 600 माइक्रोन
ग्रिड स्पेसिंग 100 माइक्रोन

तालिका 1: infarcted ऊतक के stereological मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर।

परिणाम Contralesional Ipsilesional रोधगलितांश
क्षेत्र (μm²) 151,460,000 155,060,000 22,600,000
वॉल्यूम (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
वॉल्यूम के लिए सही
प्रक्षेपण से अधिक (μm³) 		89957100000 92046300000 <मजबूत> 13416600000
त्रुटि के गुणांक (GUNDERSEN),
एम = 0 		0.068 0.077 0.067
त्रुटि के गुणांक (GUNDERSEN),
एम = 1 		0.015 0.017 0.015
त्रुटि के गुणांक (GUNDERSEN),
अल्फा (क्यू) 		0.068 0.077 0.067
% Infarcted गोलार्ध 14.90
ब्रेन Oedema (आईपीएस वॉल्यूम / शेष भाग खंड) 1.02

तालिका 2: स्टीरियो अन्वेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कावालिएरी विधि द्वारा, contralesional ipsilesional और रोधगलितांश संस्करणों के प्रतिनिधि उदाहरण हैं।

ऑप्टिकल fractionator के लिए इस्तेमाल अवधि = "2"> पैरामीटर्स
अनुभाग मोटाई (TSF) 30 माइक्रोन
लक्ष्य 100X
स्लाइस नमूना अंश (SSF) 1/10
फ्रेम ऊंचाई गिनती 40 माइक्रोन
फ्रेम चौड़ाई गिनती 40 माइक्रोन
एक्स ग्रिड आकार 230 माइक्रोन
एक्स ग्रिड आकार 230 माइक्रोन
सुरक्षित रक्षक 2 माइक्रोन
ऑप्टिकल Disector ऊँचाई 14 माइक्रोन

तालिका 3: स्टीरियो अन्वेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऑप्टिकल fractionator जांच के साथ मस्तिष्क ischemia के बाद घुसपैठ की neutrophils के stereological मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया पैरामीटर।

ऑप्टिकल fractionator द्वारा न्यूट्रोफिल का आकलन
सैम्पलिंग साइटों की संख्या 430
फैक्टर आकृति 6.24
कुल मार्करों शुमार 166
ऑप्टिकल fractionator द्वारा अनुमानित न्यूट्रोफिल 117,608.03
त्रुटि के गुणांक (GUNDERSEN), M = 0 0.22
त्रुटि के गुणांक (GUNDERSEN), M = 1 0.09

तालिका 4: स्टीरियो अन्वेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऑप्टिकल fractionator जांच के साथ मस्तिष्क ischemia के बाद अनुमान लगाया घुसपैठ neutrophils के प्रतिनिधि उदाहरण है।

CD11b + न्यूट्रोफिल Monocytes Microglia
भोला-भाला 25,863 ± 4,575.8 473 ± 75.8 525 ± 191.4 19,012 ± 1523
शाम 24 घंटा 24,563 ± 5263 873 ± 192.5 1124 ± 391.5 23,734 ± 2910
pMCAO 24 घंटा 47,922 ± 23,174 4874 ± 748.7 4826 ± 1345 35,395 ± 10,833

तालिका 5: दृष्टिकोण प्रवाह cytometry के साथ मस्तिष्क ischemia के बाद अनुमान लगाया माइलॉयड कोशिकाओं के प्रतिनिधि परिणाम है।

Discussion

यहाँ पेश मस्तिष्क ischemia मॉडल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश संस्करणों 24-48 घंटा और अलग अलग दृष्टिकोण 8,15,17 से एमसीए बंधाव के बाद 7 दिनों के निर्धारित देता है। इस MCAO मॉडल के अध्ययन में इस्तेमाल जानवरों की संख्या कम से कम दूसरों की तुलना में एक कम मृत्यु दर (कम से कम 1%), है। मृत्यु दर के इस कम दर प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम स्ट्रोक प्रेरण के बाद अस्तित्व प्रभावित हो सकती है, जो संक्रमण से बचने के लिए उचित सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के लिए है। इस MCAO मॉडल केवल लेकिन यह भी वांछित समय में एक Slipknot और पीछे reperfusion साथ सीसीए और एमसीए की क्षणिक बंधाव द्वारा एक अस्थायी मॉडल के रूप में, शोधों 18 के लिए एक नैदानिक ​​प्रासंगिक मॉडल माना जाता है जो एक स्थायी MCAO मॉडल के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता 19। इस पद्धति को सफलतापूर्वक चूहों और चूहों 17,20 में इस्तेमाल किया गया है। यह सब सबूत बंधाव द्वारा MCAO कई अनुप्रयोगों के साथ मस्तिष्क ischemia के एक उच्च बहुमुखी मॉडल है कि इंगित करता है। एक critiइस तकनीक का काल कदम यह एक stereomicroscope के तहत इनवेसिव सर्जरी की आवश्यकता है; एमसीए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गाल की हड्डी हड्डी को नुकसान नहीं के रूप में craniotomy बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए। हालांकि, नकली पशुओं के उपयोग के शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया पर निर्भर प्रभाव भेदभाव करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है (शल्य प्रक्रिया लेकिन सीसीए और एमसीए बंधाव के अधीन हैं, जो नहीं किया जाता है)। इस तकनीक को निम्नलिखित मस्तिष्क की चोट की हद तक कई तरीकों से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। मस्तिष्क सेक्शनिंग, Nissl धुंधला और Cavalieri द्वारा मात्रा के बाद के आकलन की हमारी प्रोटोकॉल क्षतिग्रस्त क्षेत्र का सही मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है और धारावाहिक मस्तिष्क वर्गों को भी अलग immunohistochemical विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से पढ़ाई के इस प्रकार में इस्तेमाल चूहों की संख्या को कम करता है। इस पद्धति का एक बेहतर प्रदर्शन के लिए, यह Stereology सॉफ्टवेयर में प्रयोग किया जाता उपयुक्त मानकों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है (तालिका 1) वें आकलन करने के लिए आवश्यक हो जाएगा जोसूत्र ने अलग-अलग क्षेत्रों के ई की मात्रा: वी = 1 / SSF * एक एफ * टी * ΣP मैं (SSF टी वर्गों का मतलब मोटाई है, टुकड़ा नमूना अंश है, एक च ग्रिड रिक्ति का क्षेत्र है और ΣP संरचना मार अंक की संख्या)।

बंधाव से बाहर का MCAO घुसपैठ ल्युकोसैट और प्रतिरक्षा सेल उप-जनसंख्या मस्तिष्क की चोट 1-4 निम्नलिखित भड़काऊ प्रक्रिया में भाग लेने कि 8,13 चिह्नित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। यहाँ, हम मस्तिष्क प्रतिरक्षा सेल लक्षण, एक सटीक stereological दृष्टिकोण और बेहतर कई ल्यूकोसाइट्स उप-जनसंख्या निस्र्पक के लिए एक प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए दो अलग अलग तरीके का प्रस्ताव।

धारावाहिक मस्तिष्क सेक्शनिंग का लाभ उठाते हुए, neutrophils की कुल संख्या की मात्रा का ठहराव कोशिकाओं जांचा बुद्धि की संख्या से कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान है, जो ऑप्टिकल fractionator विधि 16, के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैहा दिशाओं एक्स में निष्पक्ष आभासी गिनती रिक्त स्थान के बीच एक समान दूरी के साथ हमारे मामले में, रोधगलितांश क्षेत्र के हित के पूरे क्षेत्र को कवर निष्पक्ष आभासी गिनती रिक्त स्थान, के व्यवस्थित अनियमित नमूना (एसआरएस) सेट, वाई और जेड इस विधि के लिए एक सटीक उपकरण प्रदान करता है बंधाव के बाद अलग अलग समय पर इस्कीमिक मस्तिष्क में कुल न्युट्रोफिल संख्या का अनुमान है। यह इस अध्ययन में नहीं दिखाया गया है हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी ischemia के 21 के बाद और अन्य घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स तरह इस्कीमिक मस्तिष्क में पाया किसी भी अन्य सेल की आबादी का एक सटीक मात्रा का ठहराव के लिए अलग न्युट्रोफिल उप-जनसंख्या के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (monocytes / मैक्रोफेज) और भी जीवित न्यूरॉन्स के आकलन के लिए या यहां तक ​​कि स्ट्रोक के बाद न्यूरोजेनेसिस मात्रा का ठहराव के लिए। लोगों इस्कीमिक क्षेत्र में न्युट्रोफिल मात्रा का ठहराव के लिए 3 टेबल के रूप में दिखाया वांछित क्षेत्र में एक सटीक आकलन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है, उपयुक्त मानकों का चयन है।इन मानकों (ΣQ- साथ गिना कोशिकाओं की कुल संख्या है एन = ΣQ- एक्स 1 / SSF एक्स 1 / ASF एक्स 1 / TSF समीकरण का उपयोग करके कुल सकारात्मक सेल नंबर (एन) की गणना करने के Stereology सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग किया जाएगा fractionator, SSF asf के नमूने अंश क्षेत्र है, और TSF नमूना अंश मोटाई) 5, खंड नमूना अंश है। इस पद्धति अन्य मात्रा का ठहराव तकनीकों की तुलना में धीमी है हालांकि (उदाहरण के लिए, ऊतक, प्रतिनिधि छवियों या क्षेत्र के अनुसार neutrophils की संख्या का densitometry के एमजी द्वारा न्युट्रोफिल मार्कर का विश्लेषण), यह एक निष्पक्ष और एक सटीक प्रदान करता है जो एक ठोस तकनीक होने के लिए फायदा है सेल नंबर की मात्रा का ठहराव।

मस्तिष्क ल्युकोसैट अलगाव दृष्टिकोण पूर्वाग्रह करने की आवश्यकता में विवो धुंधला या आनुवंशिक जोड़तोड़ द्वारा प्रणाली के बिना एक साथ पहचान और कई प्रतिरक्षा सेल उपप्रकार की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। विशेषता माइलॉयड पी से छँटाई इसके बाद सेलopulations या उनके immunomagnetic जुदाई ऐसे जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति पर आगे के अध्ययन के रूप में कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि के साथ प्राप्त न्यूट्रोफिल, monocytes और microglia की सटीक लक्षण वर्णन ऐसे immunohistochemical अध्ययन, मस्तिष्क सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मध्यस्थता कि विभिन्न माइलॉयड कोशिकाओं के लिए विशिष्ट कार्यों के आवंटन की अनुमति देता है कि एक लाभ के रूप में मौजूदा तरीकों के संबंध में उच्च विशिष्टता प्रदान करता है। इसके अलावा, यह आगे रक्त का जन्म मैक्रोफेज (CD11b + CD45 हाय CD68 +) की तरह, उचित लेबल के साथ अन्य मस्तिष्क आबादी चिह्नित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, और यह अन्य सीएनएस विकृतियों या चोट के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। इसलिए इस तकनीक मस्तिष्क में सूजन प्रतिक्रिया की विविधता का पता लगाने के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करता है। इस तकनीक का एक मुख्य सीमा को बदल सकते हैं, जो ताजा मस्तिष्क के ऊतकों से ल्युकोसैट निलंबन की तैयारी पर रहता हैकोशिकाओं या उनके प्रतिजन परिवर्तन की सक्रियता राज्य। इस तकनीक immunohistochemical अध्ययनों की तुलना में एक अधिक विस्तृत गुणात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, यह सेल अलगाव के आधार पर एक कम सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। इस के बावजूद, हमारे सेल अलगाव प्रोटोकॉल की दक्षता अन्य प्रकाशित तरीके 9 के समान है और यह कुशलता से नियंत्रण और MCAO समूहों के बीच या यहां तक कि विभिन्न उपचार 8 के अधीन MCAO समूहों के बीच मस्तिष्क में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या में अंतर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम ऊतक विच्छेदन, ऊतक विघटन की प्रक्रिया, और माइलिन हटाने कर रहे हैं। ऊतक संग्रह के बारे में, एक सामान्य बनाने के कदम की वजह से अलग विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए परिवर्तनशीलता से बचने के लिए (एकत्र ऊतक वजन द्वारा) को शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न MCAO समूहों के बीच सामान्यीकरण भी रोधगलितांश मात्रा के माध्यम से हो सकता है (पहले चुंबकीय आर द्वारा निर्धारितesonance)। इस समस्या को हल करने के लिए एक और तरीका है दोनों इस्कीमिक और नियंत्रण समूहों की पूरी ipsilateral गोलार्द्ध का उपयोग करें, या भी इस्तेमाल किया जानवरों की संख्या कम करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्कीमिक माउस की contralateral गोलार्द्ध उपयोग करने के लिए है। इस दृष्टिकोण प्रत्येक विच्छेदन के बीच मतभेद से बचा जाता है, यह एक मुख्य नुकसान है; एक कमजोर पड़ने कारक विशेष रूप से ipsilateral कॉर्टेक्स के कोर और पेरी-रोधगलितांश क्षेत्रों में स्थित हैं जो माइलॉयड कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं की कुल संख्या बढ़ती जा रही है, लेकिन नहीं द्वारा जोड़ा गया है। ऊतक व्यवधान के बारे में, इस प्रोटोकॉल के मस्तिष्क की कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के लिए कदम, एंजाइमी उपचार से बचने और सतह प्रतिजन परिवर्तन 9,22, भड़काऊ सेल उप-जनसंख्या के आगे गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक आवश्यक मुद्दे को रोकने दिखाता है। ब्याज की सेल निलंबन की तैयारी के अलावा, मस्तिष्क नमूनों से माइलिन हटाने downst साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए एक अत्यधिक की सिफारिश कदम हैऐसे immunomagnetic सेल जुदाई या cytometry, 23,24 प्रवाह के रूप में बीस जिस्ता आवेदन,। यह अलग तरीकों, ऐसे sucrose या Percoll ढ़ाल, या विरोधी माइलिन मोती का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। यहाँ, और सेल पैदावार में सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है माइलिन दूर करने के लिए Percoll उपयोग के साथ संयोजन में मस्तिष्क कोशिका निलंबन अलगाव, यांत्रिक विघटन के लिए विभिन्न तरीकों की तुलना और 25 व्यवहार्यता कि पिछले अध्ययनों पर आधारित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photonic Led F1 WPI 571329-8 Equipment
Temp Controller  Panlab  HB 101/2 Equipment
Volvere GX NSK Ne22L Equipment
Microscope WPI PZMIII-BS Equipment
Stainless Steel Burrs FST 19007-14 Surgical material
Forceps Dumont #5/45  FST 11251-35 Surgical material
Forceps Dumont #5SF FST 11252-30 Surgical material
Suture 6/0 LorcaMarin 55108 Surgical material
Suture 9/0 LorcaMarin 61966 Surgical material
Nikon Eclipse  Nikon TE300 Equipment
Isoflurane Esteve 571329-8 Chemical
Sodium Pentobarbital Vetoquinol 570681 Chemical
Freezing microtome Leica Microsystems GmbH SM2000R Equipment
Superfrost slides Thermo Scientific  2014-07 Lab material
Cresyl violet acetate Sigma C5042 Chemical
Microscope  Nikon Nikon Eclipse TE300 Equipment
XYZ motorized computer stage and controller Ludl electronics Products Equipment
Stereo Investigator System Microbrightfield Version 7.003 software Software
5 ml Tissue Grinder, Potter-Elv with teflon pestle Thomas Scientific 0913X70 Lab Material
Polypropylene 50 ml Oak Ridge Centrifuge Tube Nalgene 3119-0050  Lab material
Percoll Sigma p1644-100 Chemical
RPMI 1640 Lonza BE12-702F Chemical
Beckman Ultracentrifugue Beckman Coulter Equipment
Beckman Coulter ultracentrifuge rotor 45 Ti Beckman Coulter Equipment
BD Sterile Cell Strainer, 40 Micron BD BD 352340 Lab Material
Bovine Serum Albumin Sigma A3733-500G Reagment
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi 130-092-575 Antibody
CD11b-FITC, human and mouse Miltenyi 130-098-085 Antibody
CD45-PE, mouse Miltenyi 130-102-596 Antibody
Anti-Ly-6G-APC, mouse Miltenyi 130-102-936 Antibody
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Ly-6C Biolegend 128012 Antibody
BD FACS Flow BD 342003 Reagment
BD FACSCalibur; 4-color BD 342975 Equipment
BD Cell Quest Pro Software BD Software
FlowJo software Treestar inc. Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8, 401-410 (2012).
  2. Iadecola, C., Anrather, J. The immunology of stroke: from mechanisms to translation. Nat Med. 17, 796-808 (2011).
  3. Ramlackhansingh, A. F., et al. Inflammation after trauma: microglial activation and traumatic brain injury. Annals of Neurology. 70, 374-383 (2011).
  4. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
  5. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, 482-497 (1991).
  6. Charleston, J. S. Estimating cell number in the central nervous system by stereological methods: the optical disector and fractionator. Current Protocols in Toxicology. 12 (Unit 12.6), (2001).
  7. Begega, A., et al. Unbiased estimation of the total number of nervous cells and volume of medial mammillary nucleus in humans. Experimental Gerontology. 34, 771-782 (1999).
  8. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARgamma Agonist Rosiglitazone. Stroke; a. Journal of Cerebral Circulation. 44 (12), 3498-3508 (2013).
  9. Campanella, M., Sciorati, C., Tarozzo, G., Beltramo, M. Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain. Stroke. 33, 586-592 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22, 72-85 (1998).
  11. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174 (2011).
  12. Denker, S. P., et al. Macrophages are comprised of resident brain microglia not infiltrating peripheral monocytes acutely after neonatal stroke. Journal of Neurochemistry. 100, 893-904 (2007).
  13. Ballesteros, I., et al. Rosiglitazone-induced CD36 up-regulation resolves inflammation by PPARgamma and 5-LO-dependent pathways. Journal of Leukocyte Biology. 95 (4), 587-598 (2013).
  14. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc. 150, 117-136 (1988).
  15. Hernández-Jiménez, M., et al. Silent Information Regulator 1 Protects the Brain Against Cerebral Ischemic Damage. Stroke. 44 (8), 2333-2337 (2013).
  16. Gundersen, H. J., et al. The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96, 857-881 (1988).
  17. Godino, M. E. C., et al. Amelioration of ischemic brain damage by peritoneal dialysis. J Clin Invest. 123, 4359-4363 (2013).
  18. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1310-1316 (2012).
  19. García-Yébenes, I., et al. Iron overload, measured as serum ferritin, increases brain damage induced by focal ischemia and early reperfusion. Neurochem Int. 61, 1364-1369 (2012).
  20. Sobrado, M., et al. Synthesis of lipoxin A4 by 5-lipoxygenase mediates PPARgamma-dependent, neuroprotective effects of rosiglitazone in experimental stroke. J Neurosci. 29, 3875-3884 (2009).
  21. Cuartero, M. I., et al. N2 Neutrophils, Novel Players in Brain Inflammation After Stroke: Modulation by the PPARγ Agonist Rosiglitazone. Stroke. 44, 3498-3508 (2013).
  22. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. Journal of Immunological Methods. 194, 71-75 (1996).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Research. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Tham, C. S., Lin, F. F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. International Journal of Developmental Neuroscience : the Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 21, 431-443 (2003).
  25. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).

Tags

चिकित्सा अंक 94 मस्तिष्क ischemia माइलॉयड कोशिकाओं मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) Stereology ऑप्टिकल fractionator प्रवाह cytometry घुसपैठ
क्षणिक या स्थायी मस्तिष्क ischemia के मॉडल में ल्युकोसैट उप-जनसंख्या का Stereological और फ्लो विशेषता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballesteros, I., Cuartero, M. I.,… More

Ballesteros, I., Cuartero, M. I., Moraga, A., de la Parra, J., Lizasoain, I., Moro, M. Á. Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (94), e52031, doi:10.3791/52031 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter