Summary
Dyremodeller for pædiatrisk sygdom kan opleve tidlig debut og aggressiv sygdomsprogression. Klinisk relevant levering terapi til unge musemodeller kan være teknisk vanskeligt. Denne protokol beskriver en ikke-invasiv intravenøs injektion metode til nyfødte mus inden for de første to postnatal levedage.
Abstract
Intravenøs injektion er et klinisk relevant måde at levere terapeutiske midler. For voksne gnavere og større dyr, intravenøse injektioner er teknisk muligt og rutine. Dog kan nogle musemodeller har tidligt indsættende sygdom med en hurtig progression, der gør administration af potentielle terapier vanskelig. Den tidsmæssige (eller facial) venen lige foran øret knop i mus og er klart synlig for de to første dage efter fødslen på begge sider af hovedet ved hjælp af et dissektionsmikroskop. Under dette vindue kan tindingevenen injiceres med volumen op til 50 pi. Indsprøjtningen er sikker og veltolereret af både hvalpe og dæmninger. En typisk injektion procedure er afsluttet inden for 1-2 min, hvorefter pup returneres til bur. Med det tredje postnatal dag venen er vanskeligt at visualisere og injektionsproceduren bliver teknisk upålidelige. Denne teknik er blevet anvendt til levering af adeno-associeret virus (AAV) vectors, hvilket igen kan give næsten kroppen bred, stabil transgenekspression for dyrets levetid afhængigt af viral serotype vælges.
Introduction
Levering af lægemidler til centralnervesystemet (CNS) i murine modeller af pædiatrisk sygdom er fortsat en udfordring. Mus, model nyfødte sygdomstilstande er undermålsfisk og udviklingsmæssigt umodne, og derfor kan være vanskeligt direkte at injicere i relevante strukturer i CNS. Intravaskulær injektion af terapeutiske midler er en ikke-invasiv, veltolereret metode til at levere celler, stoffer eller virusvektorer til hele kroppen, herunder CNS 1-5 og retina 3,5-9. Tidligere publikationer beskriver tidsmæssig ansigt vene injektion ved hjælp af en transilluminator 10,11, uden en dissektion mikroskop 11,12, eller kræver to personer til at injicere 10. Injektion teknikken beskrevet i denne protokol er fordelagtig, fordi en enkelt person kan injicere unger og lyskilden for at få vist tindingevenen ikke rører pup, hvilket eliminerer behovet for kirurgisk tape eller fastgørelsen af en pup til en fast overfladesåsom en transilluminator 11. Levering af adeno-associeret viral vektor serotype 9 (AAV9) i mus producerer robust ekspression i neuroner og astrocytter i hele hjernen og rygmarven (Figur 1). Intravaskulær levering af virale vektorer i den overfladiske tidsmæssige facial vene har været pålideligt anvendes i forskellige undersøgelser i neonatale mus til behandling af den pædiatriske neuromuskulær lidelse spinal muskelatrofi (SMA) 2,4,13,14 og i sidste ende øget levetid behandlede mus.
Intravaskulær injektion af neonatale mus også effektivt rettet mod det perifere nervesystem og perifere organer (figur 2). Efter injektion af AAV har transduktion af dorsalrodsganglier, lever, hjerte, skeletmuskel, lunge, og myenterisk plexus af tarmen blevet observeret 1,3,6,7,15. Udbredt transduktion af CNS og periferien gør denne metode til injektion ideel til sygdomme, der kræver global ekspression afet transgen, såsom Gauchers sygdom 16, og andre lysosomale sygdomme 17,18, Batten sygdom og relaterede neurale ceroid lipofuscinoses, 19 og Bardet-Biedl syndrom, en genetisk multisystem sygdom med debut af symptomer, der forekommer i den tidlige barndom 20. Intravaskulær injektion i neonatale mus bør også betragtes som en ny metode til modellering hele systemet pædiatriske sygdomme. Denne teknik er blevet oversat til større dyremodeller 5,21 og intravaskulær injektion allerede eksisterer som en klinisk acceptabel metode til at levere terapeutiske midler.
Den nuværende protokol beskriver en enkel, effektiv metode til at levere midler til neonatale mus gennem den overfladiske tidsmæssige ansigt vene senest postnatal dag 2. Injektion kan være afsluttet ved en enkelt, praktiseres individuel og tåles godt af både hvalpe og dæmninger. Hvalpe oplever minimal nød og komme sig hurtigt. Vigtigetly vil lykkes injektion resultere i global levering af midlet administreres. Denne protokol er egnet til levering af virale vektorer, farmaceutiske midler eller celler til nyfødte mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er anført i protokollen er blevet godkendt Institute for Animal brug og pleje udvalg (IACUC) på Ohio State University.
1. Fremstilling af Workspace
- Saml is for at bedøve museunger, en tom bur at adskille dæmningen fra kuld, et dissektionsmikroskop, en lyskilde, der kan placeres i en vinkel i forhold til injektion (anvendelse af en lyskilde ved en 90 ° vinkel på injektionsstedet tilslører vene), en ren overflade at anbringe dyret til injektion, vatpinde, 3/10 cc insulinsprøjte med 3/8 "30 G kanyle (per dyr) og 1% Evans blåt farvestof ( fremstillet med phosphatbufret saltvand (PBS)) opløsning til træning.
- Fjern dæmningen til et separat bur, mens manipulere hvalpene.
2. Injektion Procedure
- Placer et enkelt hvalp direkte på våd is i 30-60 sek til bedøve dyret. Efterlad ikke than dyr på is for længe på grund af en risiko for hypotermi relaterede komplikationer, herunder ventrikelflimmer, vævshypoxi og metabolisk acidose.
BEMÆRK: Vores erfaring er, at 30-60 sek er tilstrækkeligt til at bremse ungernes bevægelser, så injektion. Hvis dybere anæstesi er påkrævet, kan inhalanter såsom 1-2% isofluran være passende. - Mens dyret er på is, skal du lægge sprøjten med 30 pi af Evans blåt farvestof.
- Når dyret er fuldt bedøvet, bekræftet ved manglende bevægelse på isen, mens du stadig trækker vejret, flytte den under mikroskopet. For en højrehåndet injektion står dyrets snude til højre. Placer venstre pegefinger på næsepartiet og venstre langfinger caudale til øret opløbet, så øret opløbet er mellem indekset og midterste fingre (figur 1).
- Undersøg lige foran øret bud for en overfladisk kapillær, der bevæger sig, når huden er manipuleret. Denne kapillar er IKKE målet, dogidentifikation er vigtig for tindingevenen identifikation. Dernæst finde en mørk, skyggeagtig vene ringere end kapillarrøret, der forbliver faste uanset hudens position. Tindingevenen synes dunkle, løber dorsale at ventrale og feeds i halsvenen (Figur 1).
- Indtast tindingevenen med nåleaffasningen op. Hvis den er korrekt indsat, er det muligt at se nåleaffasningen fyldes med blod gennem huden. Derpå trykkes stemplet langsomt og notat blanchering af venen ned side af ansigtet.
- Lad nålen forblive inden venen for en ekstra 10-15 sek for at forhindre tilbagestrømning af injektionsstoffet.
3. Post-indsprøjtning
- Efter en ordentlig indsprøjtning, bør hvalpen blaat næsten øjeblikkeligt. Fjern kanylen og bruge blid kraft til at anvende en vatpind til injektionsstedet, indtil blodpropper.
- Overvåg hvalpen for tegn på lidelse. Lad hvalpen 2-3 min at restituere sig og rewarm, recognize når hvalpen er ved bevidsthed, opretstående og bevæger sig, før han vendte tilbage til buret. Cup hvalpene i investigators behandskede hænder til at yde passende varme til støtte i inddrivelse, hvis det er nødvendigt. Alternativt, skal du placere en varmepude under hjemburet at lette opvarmning injicerede hvalp. Almindeligvis efter en Evans blåt farvestof injektion aflive hvalpe. Må ikke indeholde farvestof ved injektion testmateriale.
- Placer pup tilbage i bur og sikre pup er belagt med strøelse og / eller nestlet at sikre reacceptance af dæmningen.
- Brug en ny sprøjte og vatpind for hver hvalp til at opretholde sterilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en ordentlig indsprøjtning, bør venen kortvarigt dreje klar, eller blanchere. Hvis injicere farvestof hele hvalp skal blive blå i løbet af sekunder. Hvis der er sket en forkert indsprøjtning, er der ofte en koncentreret subkutan bolus i hovedet eller halsen og injektionsstof kan sive ud af injektionsstedet. Ukorrekte injektioner kan også resultere i forekomsten af blå mærker omkring halsen. Hvalpe, der modtager subkutane injektioner (dvs. injektionen ikke var fuldt leveret i venen), der generelt oplever ingen skadelige bivirkninger, og rutinemæssigt reagerer på behandling, da korrekt injicerede mus gør.
Afhængigt af terapi, der afgives, kan vellykket injektion resultere i omfattende levering til CNS og perifere organer. Tilfører self gratis adenoassocieret serotype 9 udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) med en kylling β-actin hybrid promotor (CB) (samlet benævnt "scAAV9 CB GFP"), transgenekspression findes i gliaceller og neuroner på tværs af flere områder af hjernen og i rygmarven (figur 2A-2C). Intravaskulær injektion af scAAV9 CB GFP resulterer også i udbredt udtryk i hele periferien, med mærkbar udtryk i hjerte og lever væv (figur 3A-3D).
Figur 1: (A) en improviseret injektion platform er fremstillet af en absorberende pude ("ble") viklet omkring en Styrofoam stativet 50 ml koniske emballage. Platformen tillader investigator hvile deres hånd på bordet støder op til platformen. Dette tillader investigator at udføre injektion med en fladere vinkel i forhold til musen hvalp. (B) billede, der viser Ungen immobilisering mellem for- og midterste fingre. (
Figur 2: Centralnervesystemet genekspression efter nyfødte intravenøs injektion af selv komplementære AAV9 udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP scAAV9 CB) postnatal dag 1 (P1) museunger blev injiceret intravenøst med 1 x 10 11 vektorgenomer (VG) selv-. komplementære (sc) scAAV9 CB GFP. Fire uger efter injektion blev musene aflivet og perfunderet med 4% paraformaldehyd. Væv blev opsamlet, skåret og farvet for GFP-ekspression. GFP-ekspression ses i hele hjernen, herunder den forreste striatum (A) through pons og cerebellum (B). GFP-positive celler er typisk neuroner og astrocytter. GFP-ekspression detekteres også i rygmarven (C). Spinal motoriske neuroner og dorsalrodsganglier neuroner effektivt transduceres hjælp nyfødte IV levering. GFP positive kar og astrocytter ses også hele spinal grå substans. Alle skalapanelerne = 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: GFP-ekspression i perifere organer efter neonatal intravenøs injektion af selv komplementære AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP immunfluorescens er påviselig i den voksne mus hjerte (A) og lever (C). (B) og leveren (D) af ikke-injicerede mus. Alle skalapanelerne = 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravaskulær indgivelse af midler til CNS eller hele kroppen er vanskelig i neonatale murine modeller af sygdom. Den beskrevne protokol er en hurtig, relativt ikke-invasiv måde at intravenøst administrere løsninger til neonatale mus med minimale krav til udstyr. Selvom tidsmæssig ansigt vene kan ses med det blotte øje, kan injektioner har større nøjagtighed ved anvendelse af mikroskopet og fiberoptisk lyskilde, især for en uøvede injektor. Intravaskulære injektioner i neonatale mus har en høj succesrate 12 og AAV transduktion er blevet observeret i begyndelsen hvalpe selv om en del af injektionsstoffet administreres subkutant. Indsprøjtningen er veltolereret af museunger, og dæmninger på FVB / N eller C57BL / 6 baggrunde tolerere manipulation af hvalpene meget godt. Men i sjældne tilfælde dæmninger kan ødelægge hele kuld. Disse injektioner kan udføres vellykket i mus så små som 0,8 g gennem 1,6 g. Alternative injektion mon ruter for nyfødte mus er blevet offentliggjort af os og andre, herunder retroorbital, intrajugular og intraperitoneal 10,15,22. Vi foretrækker injektionsmåde beskrevet her, fordi det er klinisk relevant, kunne udføres af en enkelt experimenter uden krav om særligt udstyr og giver mulighed for en bred vifte af mængder, der skal administreres.
Et fælles problem opleves ved udførelse af injektioner er problemer med at se tindingevenen og derfor fejlplacering af nålen. Den fiber-optisk lyskilde skal placeres ved <90 ° og skinnende ned på hovedet, når der afholdes for bedste visning af venen. Indsprøjtningsdyser bør tage tid til at justere lyskilden, der passer til deres behov. Tindingevenen observation er faldet betydeligt, hvis unger er for store, karakteriseres som ældre end P2 eller større end 2,0 g. Et andet problem kan være at bestemme, om nåleaffasningen er trådt venen. Det tidsmæssige facial vene er SuperFicielle, skal der drages omsorg for at undgå at komme ind under vene så. Sikre, at nåleaffasningen går ind parallelt med venen vil forhindre punktering gennem venen. Nåleplacering bedst kontrolleres ved langsom injektion og efterfølgende blegning af venen.
Den overfladiske tindingevenen er synligt på begge sider af hovedet. Venstrehåndede personer kan opleve, at der vender dyret til investigators venstre kan være ergonomisk bedre og bør bestemmes for hver enkelt investigator. Bør venen ikke være synlig eller mistargeted på indledende forsøg, målretning venen på den modsatte side af hovedet er passende. Hvis venen er punkteret på begge sider af hovedet, kan nogle opstå lækager gennem det første sted under injektion i det andet sted. Afhængigt af arbejderklassen afstand af mikroskopet, kan det være hensigtsmæssigt at bygge en lille platform til at injicere dyret; for eksempel en tom Styrofoam beholder fra 50 ml koniskrør emballage (figur 1). Dette tillader investigator at placere dyret nær kanten af perronen, så investigators intravenøse hånd kan hvile direkte på bordet. Dette kan forbedre vinklen på indrejse i venen og minimere lys obstruktion.
Der er et par begrænsninger for anvendeligheden af protokollen, herunder injektionsvolumenet, alder vinduet til injektioner og uforudsigeligheden af dæmningen respons. Injektionsvolumenet for hvalpe er begrænset til 50 pi. Vi har tidligere doserede dyr med 100 ul, men har observeret øget injektion mortalitet sammenlignet med lavere volumen injektioner, men andre rapporterer kunne yde 100 ul 10,12. Endvidere er det blevet foreslået, at øget injektionsvolumener kan beskadige blodhjernebarrieren 23. Ofte den eksperimentelle reagens blandes med PBS for at opretholde et konstant injektionsvolumen 50 ul. Vi er uvidende om undersøgelser examining effekten af injektion volumen på spredt over hele den nyfødte mus og empiriske undersøgelser bør udføres for at identificere effekter på injektionsvolumen for nye reagenser ved en given dosis. En anden begrænsning er, at den overfladiske tindingevenen er let synlig på det første og andet postnatale dage. Ændringer af dyrets størrelse, hud pigmentering og tykkelse kombinere til at tilsløre vene på senere aldre selvom andre rapporterer adgang til venen gennem postnatal dag 6 10,12. Alternativt brugte vi ultralydvejledt kardiologiske injektioner til at levere viral vektor til kredsløbet i P5 og P10 dyr 4. Endelig accept af musen dæmninger af proceduren er uforudsigelig. Vi har behandlet FVB / N, C57BL / 6 og B6SJL mus tværs musemodeller for neuromuskulære sygdom og autisme spektrum forstyrrelser. FVB / N-mus er de mest tolerante, mens stammer på C57BL / 6 baggrund lejlighedsvis kan ødelægge enkelte hvalpe eller hele kuld, men dette en sjælden begivenhed. Men dettebør være en overvejelse, når de planlægger for tilstrækkelig n til et eksperiment. Dam accept kan yderligere påvirket af, hvad sygdom musen stammen er modellering. For eksempel en model for en autisme spektrum forstyrrelse havde en meget højere pup afvisning end forventet baseret på baggrund stamme. Fremme hvalpe kan være en overvejelse, hvis dæmning accept er en bekymring. Andre metoder til at begrænse afvisning omfatter udførelse af injektioner i et separat rum fra dæmningen til at begrænse adgangen til hvalpenes ultrasoniske lyde, og at gnide dæmningen næse og / eller hvalpe med en klud fugtet med 70% ethanol for at maskere enhver detektiv duft. Hvalpe bør også gnides med beskidte strøelse til støtte i accept.
Denne protokol er blevet anvendt til behandling af en musemodel for SMA. SMA er en pædiatrisk neurodegenerativ sygdom, der primært påvirker motoriske neuroner i rygmarven. Uden behandling, dør denne musemodel med 15 dage efter fødslen i gennemsnit. After intravenøse injektioner af AAV genterapi i 1 dag-gamle mus blev overlevelse forlænges til et år, demonstrerer sikkerheden og tolerabiliteten af den beskrevne injektionsprotokol 2,4,14. Lignende resultater blev også opnået på samme SMA musemodel efter IV injektion af antisense-oligonukleotider 8,9. Fremtidige applikationer omfatter levering af andre celle- og genterapi samt skabelse af neonatale modeller for udviklingsmæssige forstyrrelser i centralnervesystemet og periferien til eksogent udtrykker et cDNA eller et RNAi kassetten 24. Intravenøs injektion er et godkendt klinisk metode til levering; Derfor kan anvendelse af denne teknik være fordelagtigt i prækliniske undersøgelser for en række midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende den NINDS, FightSMA, og familier af SMA til finansiel støtte. Segl er støttet af NINDS uddannelse tilskud # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
- Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
- Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
- Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
- Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
- Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
- Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
- Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
- Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
- Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
- Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).
