新生児マウスにおける静脈注射

Summary

小児疾患の動物モデルは、早期発症と積極的な疾患の進行を体験することができます。臨床的に若いマウスモデルに関連する治療送達は技術的に困難であることができる。このプロトコルは、人生の最初の2日以内に出生後の新生児マウスのための非侵襲的静脈内注入法を説明しています。

Abstract

静脈内注射は、治療薬を提供するために臨床応用可能な方法である。大人の齧歯類および大型動物の場合は、静脈内注射は技術的に可能と日常的なものである。しかし、いくつかのマウスモデルは、潜在的な治療薬の投与が困難に急速進行性疾患の早期発症を持つことができる。時間的（または顔面）静脈がちょうどマウスにおいて、耳の芽の前方および解剖顕微鏡を用いて、頭部の両側に、出生後、明らかに最初の2日間は表示されている。このウィンドウ中に、一時的な静脈を50μlまでの容量で注射することができる。注射は安全で忍容子犬やダムの両方によって許容される。典型的な注射手順は子犬をホームケージに戻された後、1〜2分以内に完了する。第生後によって静脈視覚化が困難であり、注入手順は、技術的に信頼できないとなる。この技術は、アデノ随伴ウイルス（AAV）のvectの送達のために使用されている順番に選択されたウイルスの血清型に応じて、動物の生活のため、ほぼ身体全体で、安定的な導入遺伝子発現を提供することができます論理和をとり、。

Introduction

小児疾患のマウスモデルにおいて、中枢神経系（CNS）への治療薬の送達は課題である。モデル新生児疾患状態が過小と発生的に未熟であるため、直接CNS内の適切な構造体に注入することが困難であることをマウス。治療薬の血管内注入がCNS ^1-5および^3,5-9網膜を含む全身への細胞、薬物、またはウイルスベクターを送達するための非侵襲性、忍容性が良好な方法である。以前の刊行物は、解剖顕微鏡^11,12なしで、イルミ^10,11を使用して、一時的な顔の静脈注射、または記述^10を注入する二人の個人を必要とする。一個人が子犬を注入することができ、光源が時間的静脈子犬に触れていない表示する、サージカルテープの必要性や、固定表面への子犬の付着を排除するため、このプロトコルに記載注入技術が有利であるイルミ¹¹など。マウスでのアデノ随伴ウイルスベクター血清型9（AAV9）の送達は、脳や脊髄（ 図1）を通じて、ニューロンおよびアストロサイトでの強い発現を生成します。浅側頭動脈顔面静脈へのウイルスベクターの血管内送達は、確実に、小児神経筋疾患脊髄性筋萎縮症^{（SMA）2,4,13,14を}治療するための新生仔マウスの様々な研究で使用され、最終的に処理されたマウスの寿命を増加している。

新生児マウスの血管内注入も効果的に末梢神経系および末梢器官（ 図2）標的とする。 AAVの注入後、後根神経節、肝臓、心臓、骨格筋、肺、および腸の筋層間神経叢の形質導入は^{、1,3,6,7,15}観察され^ている。 CNSおよび末梢の広範な伝達は、グローバルな表現を必要とする疾患の注入のこの方法は最適ですそのようなゴーシェ病¹⁶および他のリソソーム蓄積症^17,18、バッテン病と関連する神経細胞セロイド^{lipofuscinoses、19}およびバルデ·ビードル症候群、幼児²⁰で発生する症状の発症との遺伝的多臓器障害などのトランスジーン、。新生仔マウスへの血管内注入はまた、モデリングシステム全体の小児疾患の新規な方法と考えるべきである。この手法は、より大きな動物モデル^5,21に翻訳され、血管内注射は、すでに治療薬を送達することが臨床的に許容される方法として存在する。

現在のプロトコルは、生後2日目注射より遅くとも浅側頭顔静脈から新生児マウスに薬剤を送達しない、シンプルで効率的な方法を記述する単一完成させることができる、個々の練習、よく子犬やダムの両方によって許容されている。子犬は、最小限の苦痛を経験し、迅速に回復。 ImportanTLY、成功した注射が投与された薬剤のグローバルなデリバリーになります。このプロトコルは、ウイルスベクター、新生マウスに薬剤または細胞の送達に適している。

Protocol

プロトコールに記載されているすべての手順は、オハイオ州立大学の動物使用とケア委員会（IACUC）研究所承認されている。

ワークスペースの調製

1. ごみ、解剖顕微鏡、90℃で注入（光源の使用に対してある角度で配置することができ、光源からのダムを分離するために、空のケージの仔マウスを麻酔湿式氷を集める 注射部位に角度静脈を不明瞭）、注射のために動物を配置する清浄な表面、綿棒、3/8 "30 G針（動物あたり1つ）および1％エバンスブルー色素（と3/10 ccのインスリン注射器訓練のためのリン酸緩衝生理食塩水（PBS））溶液を用いて作った。
2. 子犬を操作しながら、別々のケージにダムを削除します。

2.注入手順

1. 動物を麻酔30-60秒間濡れた氷の上に直接、単一の子犬を置きます。トン放置しないでください彼による心室細動、組織低酸素および代謝性アシドーシスなどの低体温症に関連する合併症の危険性への氷の上で動物が長すぎる。
   注：私たちの経験は、30〜60秒の注入を可能にするために、子犬の動きを遅くするのに十分であることである。深い麻酔が必要な場合、そのような1〜2％イソフルランなどの吸入剤が適切であり得る。
2. 動物が氷の上ですが、エバンスブルー染料30μlのシリンジをロードします。
3. 動物が完全に麻酔されたとき、まだ呼吸しながら、氷の上での動きの欠如によって確認された顕微鏡下に移動します。右利きの注射のために、右に動物の銃口に直面しています。耳の芽は人差し指と中指（ 図1）の間になるよう、耳の芽に銃口を左人差し指と左中指の尾を置きます。
4. 皮膚が操作されたときに移動する表面的な毛細血管のための耳の芽にちょうど前方を調べます。このキャピラリーはしかし、対象ではありません識別は、時間的な静脈認証のために重要である。次に、関係なく、肌の位置の固定されたままでキャピラリーに劣って暗い、闇の静脈を探します。時間的な静脈が影の表示され、腹側に背を実行し、頸静脈（ 図1）に供給されます。
5. 針のベベルを上にして一時的な静脈を入力してください。正しく挿入された場合は、針のベベルを皮膚を介して血液を充填見ることができる。その後、ゆっくりとプランジャーを押し下げるとノートでは、顔の側を下静脈のブランチング。
6. 針が注入物質の逆流を防ぐために追加された10〜15秒間の静脈内にとどまることを可能にする。

3.ポストインジェクション

1. 適切な注入後、子犬は、ほとんどすぐに青色に変わるはずです。針を外して、血の塊になるまで注射部位に綿棒を適用するために穏やかな力を使用しています。
2. 苦痛の徴候のために子犬を監視します。子犬2-3 minは回復しrewarmすることを許可する、R子犬がケージに戻る前に、意識的な直立と移動しているときecognize。カップは研究者の手袋をはめた手の中に子犬は、必要に応じて、回復を支援するために、適切な暖かさを提供します。代わりに、注入された子犬を温める容易にするために、ホームケージの下に加熱パッドを配置。一般的にエバンスブルー色素注入後、子犬を安楽死させる。試験材料を注入する際に染料を含めないでください。
3. バックホームケージに子犬を置き、子犬がダムによってreacceptanceを確保するために、寝具、および/またはnestletでコーティングされていることを確認してください。
4. 無菌性を維持するために、各子犬のための新しい注射器と綿棒を使用してください。

Representative Results

適切な注入中に、静脈が瞬​​間的にクリア、または湯通し有効にしてください。染料注入した場合、全子犬が数秒以内に青色に変わるはずです。不適切な注入が発生した場合、頭部または頸部および注入物質中の濃縮皮下ボーラス注射部位から漏出してもよいことが多い。不適切な注射はまた、喉の周りにあざが出現する可能性があります。皮下注射を受けるの仔（ すなわち 、注射が完全に静脈内に配信されなかった）、一般的に全く病気の副作用を経験しておらず、日常的に適切に注射したマウスがそうであるように治療に反応する。

配信療法に応じて、成功した注射は、CNSおよび末梢器官への広範な配信をもたらすことができる。ニワトリβアクチンハイブリッドプロモーター（CB）と緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する自己相補的アデノ随伴ウイルス血清型9を注入すると、トランス（共に「scAAV9 CB GFP」ともいう）遺伝子発現は、多数の脳の領域を横切るグリア細胞およびニューロンおよび脊髄（ 図2A-2C）内に見出される。 scAAV9 CB GFPの血管内注入は、心臓および肝臓組織（ 図3A〜3D）の顕著な発現と、周にわたって広範な発現を生じる。

図1：（A）吸収剤パッド（「おむつ」）から作られた間に合わせの注入·プラットフォームは、50ミリリットルコニカルパッケージから発泡スチロールのラックに巻き付ける。プラットフォームは、研究者は、プラットフォームに隣接したテーブルの上に手を休ませることができます。これは研究者がマウスの子犬へのフラットな角度で注入を実行することができます。前面と中指の間に子犬の固定化を示す（B）の画像。（ この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：緑色蛍光タンパク質（scAAV9 CB GFP）を発現する自己相補性AAV9の新生児の静脈内注射後の中枢神経系の遺伝子発現生後1日目（P1）仔マウスは、静脈内に自己の1×10 ¹¹ベクターゲノム（VG）を注射した補完的（SC）scAAV9 CB GFP。 4週間注射後、マウスを4％パラホルムアルデヒドで屠殺し、灌流した。組織は、収集スライスし、GFP発現について染色した。 GFP発現は、前線条体を含む脳全体に認められる（A）throug時間橋および小脳（B）。 GFP陽性細胞は、典型的には、ニューロンおよびアストロサイトである。 GFP発現は、脊髄（C）で検出される。脊髄運動ニューロンと脊髄後根神経節ニューロンを効率的に新生児のIV送達を用いて形質導入する。 GFP陽性血管系およびアストロサイトはまた、脊髄灰白質全体に見られる。 =200μmの全てのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：自己相補性AAV9 GFP（scAAV9 CB GFP）の新生児の静脈内注射後の末梢器官におけるGFP発現は 、GFPの蛍光抗体法は、成体マウスの心臓（A）および肝臓（C）に検出可能である（B）及び肝臓（D）には存在しない。すべてのスケールバー=100μmである。

Discussion

CNSまたは全身の薬剤の血管内送達は、疾患の新生児マウスモデルでは困難である。記載されているプロトコルは、静脈内に、最小限の設備要件を新生児マウスにソリューションを管理するための迅速、比較的非侵襲的な方法です。時間的な顔の静脈が肉眼で見ることができるが、注射は、特に経験の乏しいインジェクタ、顕微鏡および光ファイバ光源を用いて、より高い精度を有することができる。新生児マウスにおける血管内注入は、高い成功率^12を有し、AAV形質導入は、注入物質の一部が皮下に投与される場合でも、初期の仔で観察されている。注射はよく仔マウスによって許容され、FVB / NまたはC57BL / 6背景上のダムは非常によく仔の操作を容認されている。しかし、まれにダムは全体同腹仔を破壊することができます。これらの注射は正常に1.6グラム0.8〜gと小さいマウスで行うことができる。代替充血nの新生児マウスのルートは、米国および眼窩後、intrajugularおよび腹腔内^10,15,22を含む他のユーザーによって公開されている。それは特別な機器要件を単一の実験者によって実行することが臨床的に関連することができ、投与されるべきボリュームの広い範囲を可能にするので、我々は、ここで説明する射出通路を好む。

注射を行う際に共通の問題は、経験した一時的な静脈、したがって、針の誤配置を見ることが困難なことである。光ファイバ光源は、90°<に位置し、静脈の最高の視聴のために開催されて頭の上に下向きに輝いする必要があります。インジェクタは、彼らのニーズに合わせて、光源を調整するために時間を取る必要があります。子犬が大きすぎる場合、時間的静脈観察を著しくP2次に古いまたは2.0 gを超えるものとして特徴付け、減少する。針のベベルが静脈に入った場合に、第2の問題は、決定されてもよい。一時的な顔面静脈はsuperfiです金融ので注意が静脈の下に入力しないように注意する必要があります。針のベベルが静脈に平行に入っていることを保証することは、静脈から穿刺防止します。針の配置が最適ゆっくり注入および静脈の後続のブランチングすることによって検証される。

浅側頭静脈は頭の両側に表示されている。左利きの個体は、研究者の左に動物に面する人間工学的に優れていることができ、各個々の研究者のために決定されるべきであることを見出すことができる。静脈が見えてはならないか、最初の試みにmistargetedされ、頭部の反対側に静脈を標的とすることは適切である。静脈が頭部の両側にパンクしている場合は、いくつかの漏れが第二のサイトへの注入時に最初のサイトを通じて発生する可能性があります。顕微鏡の作動距離に応じて、動物に注入するために小さなプラットフォームを構築することが適切であり得る。を50mlの円錐形から、例えば、空の発泡スチロール容器チューブ包装（ 図1）。これは研究者の注入手がテーブルの上に直接、休むことができるように、研究者がプラットフォームの端の近くに動物を配置することができます。これは、静脈への進入角度を改善し、光障害物を最小限に抑えることができる。

注入量、注入の年齢ウィンドウとダム応答の予測不可能性を含めたプロトコルの有用性にはいくつかの制限があります。子犬のための注入容量は50μlに制限されています。我々は以前に100μlを動物に投与しているが、低容量注入と比較して増加した注射関連の死亡率を観察しているが、他は正常に100μlの^10,12を提供^し報告している。さらに、増加した注入量は、血液脳関門^23に損傷^を与える可能性が示唆されている。多くの場合、実験試薬は一定の50μlの注入体積を維持するために、PBSと混合される。私たちは、研究の気づいていないexamini新生児マウス全体に広がる上、注入量の影響をngの、そして実証研究は、与えられた用量での新しい試薬のための注入量への影響を特定するために行われるべきである。第二の制限は、浅側頭静脈は、第1および第2の生後日に簡単に表示されているということです。動物のサイズ、皮膚の色素沈着や厚みを変更しても、他の人が生後6日目^10,12を通して静脈にアクセスして報告しますが、後で年齢で静脈をあいまいにするために組み合わせる。代わりに、我々は、P5およびP10の動物⁴に循環するウイルスベクターを提供するために超音波ガイド心臓注射を使用していました。最後に、手順のマウスダムの受け入れは予測できません。我々は、神経筋疾患のマウスモデルと自閉症スペクトラム障害を越えFVB / N、C57BL / 6およびB6SJLマウスを治療している。 FVB / Nマウスは、C57BL / 6バックグラウンド上の株は時折、個々の子犬または全体リットルを破壊することができますしながら、最も寛容であるが、このまれな出来事。しかし、この実験のための十分なnについて計画する際に考慮すべきである。ダムの受け入れをさらにマウス系統モデリング何である疾患により影響され得る。例えば、自閉症スペクトラム障害のモデルは、バックグラウンド系統に基づいて予想よりも子犬拒絶反応のはるかに高い率を示した。ダムの受け入れが懸念される場合は、子犬を育てることは考慮することができる。拒絶反応を制限する他のアプローチは、超音波発声をPUPへのアクセスを制限するためにダムとは別の部屋での注射の実行などがあり、そして布でダムの鼻および/または仔をこするために、任意の捜査官の香りをマスクする70％エタノールで湿らせた。子犬も受け入れを支援するために汚れた寝具でこすっされるべきである。

このプロトコルは、成功してSMAのマウスモデルを治療するために使用されてきた。 SMAは、主に脊髄の下位運動ニューロンに影響を及ぼし、小児神経変性疾患である。治療せずに、このマウスモデルは、平均して、生後15日までに死亡した。 AF1日齢のマウスでのAAV遺伝子治療のTER静脈内注射は、生存率が記載され注入プロトコル^2,4,14の安全性と忍容性を実証し、1年に延長された。同様の結果はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド^8,9のIV注射後の同じSMAのマウスモデルで得られた。将来のアプリケーションは、他の細胞および遺伝子治療の配信だけでなく、外因的cDNAまたはRNAiカセット^24を表現するCNSおよび末梢の発達障害のための新生児モデルの作成 ​​が含まれています。静脈注射は、引渡しの承​​認された臨床メソッドです。従って、この技術の利用は、種々の薬剤のための前臨床試験において有利であり得る。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope