Summary
Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.
Abstract
La inyección intravenosa es una forma clínicamente aplicable para entregar agentes terapéuticos. Para roedores adultos y los animales más grandes, las inyecciones intravenosas son técnicamente viables y la rutina. Sin embargo, algunos modelos de ratones puede tener la aparición temprana de la enfermedad con una progresión rápida que hace que la administración de terapias potenciales difícil. La vena temporal (o facial) está justo anterior a la brote del oído en ratones y es claramente visible durante los dos primeros días después del nacimiento a cada lado de la cabeza utilizando un microscopio de disección. Durante esta ventana, la vena temporal puede ser inyectado con volúmenes de hasta 50 l. La inyección es segura y bien tolerada tanto por los cachorros y las presas. Un procedimiento de inyección típico se completa en 1-2 min, después de lo cual el cachorro es devuelto a la jaula de alojamiento. Al tercer día después del parto la vena es difícil de visualizar y el procedimiento de inyección se convierte técnicamente confiables. Esta técnica se ha utilizado para la entrega de virus adeno-asociado (AAV) vectORS, que a su vez pueden proporcionar casi en todo el cuerpo, la expresión transgénica estable para la vida del animal dependiendo del serotipo viral elegido.
Introduction
Entrega de la terapéutica en el sistema nervioso central (SNC) en modelos murinos de enfermedad pediátrica sigue siendo un reto. Los ratones que estados de enfermedad recién nacidos modelo son de tamaño insuficiente y el desarrollo inmaduro, y por lo tanto puede ser difícil de inyectar directamente en estructuras adecuadas en el SNC. Inyección intravascular de agentes terapéuticos es un método no invasivo, bien tolerado para entregar las células, fármacos, o vectores virales para todo el cuerpo, incluyendo el SNC y la retina 1-5 3,5-9. Publicaciones anteriores describen temporal inyección en la vena cara usando un transiluminador 10,11, sin un microscopio de disección 11,12, o que requieren dos personas para inyectar 10. La técnica de inyección descrito en este protocolo es ventajoso porque un solo individuo puede inyectar cachorros, y la fuente de luz para ver la vena temporal no está en contacto con el cachorro, eliminando la necesidad de cinta quirúrgica o la fijación de un cachorro a una superficie fijatal como un transiluminador 11. Entrega de adeno-asociado vector viral serotipo 9 (AAV9) en ratones produce sólida expresión en neuronas y astrocitos en todo el cerebro y la médula espinal (Figura 1). Entrega intravascular de vectores virales en la vena facial temporal superficial se ha utilizado de forma fiable en diversos estudios en ratones recién nacidos para tratar el trastorno neuromuscular pediátrica la atrofia muscular espinal (SMA) 2,4,13,14 y en última instancia el aumento de la vida útil de los ratones tratados.
Inyección intravascular de ratones neonatales también apunta eficazmente el sistema nervioso periférico y los órganos periféricos (Figura 2). Después de la inyección de AAV, la transducción de ganglios de la raíz dorsal, hígado, corazón, músculo esquelético, pulmón, y el plexo mientérico de la tripa se ha observado 1,3,6,7,15. Transducción generalizada del sistema nervioso central y la periferia hace que este método de inyección ideal para enfermedades que requieren expresión global deun transgén, como la enfermedad de 16 y otra de almacenamiento lisosomal enfermedades de Gaucher, la enfermedad de 17,18 Batten y ceroid lipofuscinoses neuronales relacionados, el 19 y el síndrome de Bardet-Biedl, un trastorno multisistémico genética con la aparición de los síntomas que se producen en la primera infancia 20. Inyección intravascular en ratones neonatal también debe ser considerado como un nuevo método de enfermedades pediátricas de todo el sistema de modelado. Esta técnica ha sido traducida a los modelos animales más grandes 5,21 y la inyección intravascular ya existe como un método clínicamente aceptable de la entrega de la terapéutica.
El actual protocolo describe un método simple y eficiente de suministro de agentes a ratones recién nacidos a través de la vena superficial cara temporal a más tardar el día postnatal 2. Inyección puede ser completado por una sola, practica individual y es bien tolerado por tanto las crías y las presas. Los cachorros experimentan angustia mínima y se recuperan rápidamente. Importantemente, la inyección exitosa resultará en la entrega global del agente administrado. Este protocolo es apropiado para la administración de vectores virales, agentes farmacéuticos o células a ratones recién nacidos.
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Protocol
Todos los procedimientos que figuran en el protocolo han sido aprobados Instituto de Uso de Animales y el comité de Atención (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Preparación del espacio de trabajo
- Reunir hielo húmedo para anestesiar a las crías de ratón, una jaula vacía para segregar la presa de la litera, un microscopio de disección, una fuente de luz que se puede colocar en un ángulo a la inyección (uso de una fuente de luz en un 90 ° ángulo con el sitio de la inyección oscurece la vena), una superficie limpia para colocar el animal para la inyección, hisopos de algodón, 3/10 cc jeringa de insulina con 3/8 "30 G aguja (uno por animal) y 1% de colorante azul de Evans ( hecho con tampón fosfato salino) solución (PBS) para la formación.
- Retire la presa a una jaula separada, mientras que la manipulación de los cachorros.
Procedimiento 2. Inyección
- Coloque una sola cría directamente en el hielo húmedo durante 30-60 segundos para anestesiar al animal. No deje tque los animales en el hielo demasiado tiempo debido a un riesgo de complicaciones relacionadas con la hipotermia, incluyendo la fibrilación ventricular, hipoxia tisular y acidosis metabólica.
NOTA: Nuestra experiencia es que 30 a 60 segundos es suficiente para frenar los movimientos de las crías para permitir la inyección. Si se requiere anestesia más profunda, inhalantes tales como 1-2% de isoflurano pueden ser apropiados. - Mientras el animal está en el hielo, cargue la jeringa con 30 l de colorante azul de Evans.
- Cuando el animal está completamente anestesiado, confirmado por la falta de movimiento en el hielo, mientras que todavía respiraba, moverse bajo el microscopio. Para una inyección diestro, enfrentar el hocico del animal a la derecha. Coloque el dedo índice izquierdo en el hocico y el caudal dedo medio izquierdo para el auricular para que el auricular está entre el índice y el dedo medio (Figura 1).
- Examine justo anterior al brote del oído de un capilar superficial que se mueve cuando la piel se manipula. Este capilar no es el objetivo, sin embargoidentificación es importante para la identificación de la vena temporal. A continuación, busque un sombrío vena oscura inferior al capilar que permanece fijo independientemente de la posición de la piel. La vena temporal parece sombrío, corre dorsal a ventral, y se alimenta en la vena yugular (Figura 1).
- Introduzca la vena temporal con la aguja de bisel hacia arriba. Si se inserta correctamente, es posible ver el bisel de la aguja se llenan de sangre a través de la piel. Luego presione el émbolo lenta y la nota de escaldado de la vena por el lado de la cara.
- Deje que la aguja permanezca dentro de la vena por un 10-15 seg añadido para evitar el reflujo de la inyectante.
3. Post-inyección
- Después de una inyección adecuada, el cachorro debe ponerse azul casi de inmediato. Retire la aguja y el uso de fuerza suave para aplicar un hisopo de algodón para el sitio de inyección hasta que los coágulos de sangre.
- Monitorear el cachorro en busca de signos de angustia. Deje que el cachorro 2-3 minutos para recuperarse y se vuelven a calentar, reconocer cuando el cachorro está consciente, de pie y en movimiento, antes de regresar a la jaula. Copa de las crías en las manos enguantadas del investigador para proporcionar calidez apropiada para ayudar en la recuperación si es necesario. Como alternativa, coloque una almohadilla eléctrica bajo la jaula para facilitar el calentamiento del cachorro inyectado. Generalmente después de una inyección de colorante azul de Evans, la eutanasia crías. No incluya tinte al inyectar el material de prueba.
- Coloque el cachorro de nuevo en la jaula de alojamiento y asegúrese de que el cachorro se recubre con ropa de cama y / o nestlet para asegurar reaceptación por la represa.
- Utilice una nueva jeringa y un hisopo de algodón para cada cachorro para mantener la esterilidad.
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Representative Results
Durante una inyección adecuada, la vena debe girar momentáneamente claro, o blanquear. Si la inyección de teñir todo el cachorro debe ponerse azul en cuestión de segundos. Si se ha producido una inyección inadecuada, a menudo hay un bolo subcutáneo concentrada en la cabeza o el cuello y inyectante puede salirse del sitio de inyección. Inyecciones inapropiadas también pueden dar lugar a la aparición de moretones alrededor de la garganta. Los cachorros que reciben inyecciones subcutáneas (es decir, la inyección no estaba completamente entregado en la vena) generalmente no experimentan efectos secundarios con enfermedades y responder de forma rutinaria para el tratamiento como los ratones inyectados correctamente hacen.
Dependiendo de la terapia administrada, la inyección de éxito puede dar lugar a la entrega generalizada para el SNC y órganos periféricos. Cuando la inyección de auto de cortesía serotipo del virus adeno-asociado que expresa la proteína fluorescente 9 verde (GFP) con un β-actina promotor híbrido de pollo (CB) (en conjunto denominado "scAAV9 CB GFP"), transla expresión génica se encuentra en las células gliales y las neuronas a través de múltiples regiones del cerebro y en la médula espinal (Figuras 2A-2C). Inyección intravascular de scAAV9 CB GFP también se traduce en la expresión generalizada en toda la periferia, con expresión notable en el corazón y el tejido hepático (Figuras 3A-3D).
Figura 1: (A) Una plataforma improvisada de inyección a partir de una almohadilla absorbente ("pañal") envuelto alrededor de un bastidor de espuma de poliestireno de 50 ml de embalaje cónica. La plataforma permite al investigador para descansar su mano sobre la mesa al lado de la plataforma. Esto permite que el investigador para llevar a cabo la inyección en un ángulo más plano con respecto a la cría de ratón. (B) Imagen que muestra la inmovilización cachorro entre el primer plano y el dedo medio. (
Figura 2: la expresión de genes del sistema nervioso central después de la inyección intravenosa neonato de auto AAV9 complementaria que expresa la proteína verde fluorescente (GFP scAAV9 CB) día postnatal 1 (P1) crías de ratón se inyectan por vía intravenosa con 1 x 10 11 genomas de vectores (VG) de sí mismo. complementaria (sc) scAAV9 CB GFP. Cuatro semanas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se perfundieron con paraformaldehído al 4%. Se recogieron, en rodajas y se tiñeron para la expresión de GFP tejidos. Expresión de GFP se ve en todo el cerebro, incluyendo el cuerpo estriado anterior (A) through la protuberancia y el cerebelo (B). Células GFP positivas son típicamente neuronas y astrocitos. También se detecta expresión de GFP en la médula espinal (C). Las neuronas motoras espinales y las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal son transducidas eficientemente usando entrega neonato IV. Vasculatura y astrocitos positivo GFP también se observan en toda la materia gris de la médula. Todas las barras de escala = 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: expresión de GFP en los órganos periféricos después de la inyección intravenosa neonatal de auto complementaria AAV9 GFP (GFP scAAV9 CB) inmunofluorescencia GFP es detectable en el corazón de ratón adulto (A) y el hígado (C). (B) y el hígado (D) de los ratones no inyectados. Todas las barras de escala = 100 micras.
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Discussion
Entrega intravascular de agentes para el SNC o en todo el cuerpo es difícil en modelos murinos neonatales de la enfermedad. El protocolo descrito es una forma rápida, relativamente no invasiva para administrar por vía intravenosa soluciones en ratones recién nacidos con los requisitos mínimos de equipamiento. Aunque la vena cara temporal puede ser visto por el ojo desnudo, las inyecciones pueden tener una mayor precisión con el uso del microscopio y fuente de luz de fibra óptica, especialmente para un inyector sin práctica. Inyecciones intravasculares en ratones neonatales tienen una alta tasa de éxito 12, y la transducción de AAV se ha observado en las primeras crías incluso si parte de la inyectante se administra por vía subcutánea. La inyección es bien tolerado por las crías de ratón, y represas en FVB / N o C57BL / 6 antecedentes tolera la manipulación de los cachorros muy bien. Sin embargo, en raras ocasiones las presas pueden destruir camadas enteras. Estas inyecciones se pueden realizar con éxito en ratones tan pequeñas como 0,8 g a través de 1,6 g. Inyección de Alternativan rutas para los ratones recién nacidos han sido publicados por nosotros y otros, incluyendo retro-orbital, intrayugular y 10,15,22 intraperitoneal. Nosotros preferimos la ruta de inyección descrito aquí porque es clínicamente relevante, capaz de ser realizado por un solo experimentador sin requisitos especiales de los equipos y permite una amplia gama de volúmenes a administrar.
Un problema común experimentado al realizar inyecciones es dificultades para ver la vena temporal y por lo tanto mala colocación de la aguja. La fuente de luz de fibra óptica debe ser posicionado a <90 ° y brillante a la baja sobre la cabeza cuando se celebra para una mejor visualización de la vena. Inyectores deben tomar tiempo para ajustar la fuente de luz para satisfacer sus necesidades. Observación vena Temporal se reduce significativamente si los cachorros son demasiado grandes, caracterizado como viejo entonces P2 o superior a 2,0 g. Un segundo problema se puede determinar si el bisel de la aguja ha entrado en la vena. La vena facial temporal es superficial, por lo que se debe tener cuidado para evitar que entra por debajo de la vena. Asegurarse de que el bisel de la aguja está entrando en paralelo a la vena evitará la punción a través de la vena. Colocación de la aguja es mejor verificada mediante inyección lenta de escaldado y posterior de la vena.
La vena temporal superficial es visible a ambos lados de la cabeza. Individuos zurdos pueden encontrar que enfrenta el animal a la izquierda del investigador puede ser ergonómicamente mejor y debe ser determinado para cada investigador individual. En caso de que la vena no ser visible o se mistargeted en los intentos iniciales, la orientación de la vena en el lado opuesto de la cabeza es apropiado. Si la vena se pincha en ambos lados de la cabeza, alguna fuga puede ocurrir a través de el primer sitio durante la inyección en el segundo sitio. Dependiendo de la distancia de trabajo del microscopio, puede ser apropiado para construir una pequeña plataforma en la que para inyectar el animal; por ejemplo, un recipiente de espuma de poliestireno vacío de 50 ml cónicoembalaje del tubo (Figura 1). Esto permite que el investigador a la posición del animal cerca del borde de la plataforma de modo que la mano de inyección del investigador puede descansar directamente sobre la mesa. Esto puede mejorar el ángulo de entrada en la vena y reducir al mínimo la obstrucción de la luz.
Hay algunas limitaciones a la utilidad del protocolo incluyendo el volumen de inyección, la ventana de la edad para las inyecciones y la imprevisibilidad de la respuesta de la presa. Los volúmenes de inyección para cachorros se limitan a 50 l. Hemos dosificado previamente animales con 100 l, pero hemos observado el aumento de la mortalidad relacionada con la inyección en comparación con las inyecciones de menor volumen, pero otros reportan éxito la entrega de 100 l 10,12. Además, se ha sugerido que el aumento de los volúmenes de inyección pueden dañar la barrera hematoencefálica 23. A menudo, el reactivo experimental se mezcla con PBS para mantener un volumen de inyección de 50 l constante. No tenemos conocimiento de estudios examining el efecto del volumen de inyección de propagación a través de los ratones recién nacidos, y se deben realizar estudios empíricos para identificar efectos sobre el volumen de inyección de nuevos reactivos a una dosis determinada. Una segunda limitación es que la vena temporal superficial es fácilmente visible en el primer y segundo día después del parto. Los cambios en el tamaño de los animales, la pigmentación de la piel y el espesor se combinan para ocultar la vena a edades más tardías aunque otros informan que el acceso a la vena a través de postnatal día 6 10,12. Como alternativa, se utilizó ultrasonido guiada inyecciones cardíacas para entregar vector viral para la circulación en P5 y P10 animales 4. Por último, la aceptación de las presas del ratón del procedimiento es impredecible. Hemos tratado FVB / N, C57BL / 6 y ratones B6SJL través de modelos de ratón de la enfermedad y los trastornos del espectro autista neuromusculares. Ratones FVB / N son los más tolerantes, mientras que las tensiones en los C57BL / 6 antecedentes de vez en cuando pueden destruir las crías individuales o camadas enteras, pero esto una ocurrencia rara. Sin embargo, estedebe ser una consideración cuando se planifica para n suficiente para un experimento. La aceptación de la presa puede ser influenciado más por lo que la enfermedad de la cepa de ratón es el modelado. Por ejemplo, un modelo de un trastorno del espectro autista tenía una tasa mucho más alta de rechazo cachorro de lo esperado sobre la base de la cepa de fondo. Fomento de las crías puede ser una consideración si la presa de aceptación es una preocupación. Otros enfoques para limitar el rechazo incluyen la realización de inyecciones en una habitación separada de la presa para limitar el acceso a las crías vocalizaciones ultrasónicas, y frotar la nariz de la presa y / o las crías con un paño humedecido con etanol al 70% para enmascarar cualquier olor investigador. Los cachorros también se deben frotar con ropa de cama sucia para ayudar en la aceptación.
Este protocolo se ha utilizado con éxito para tratar un modelo de ratón de SMA. SMA es una enfermedad neurodegenerativa pediátrica que afecta principalmente a las neuronas motoras inferiores de la médula espinal. Sin tratamiento, este modelo de ratón muere en 15 días después del nacimiento, en promedio. Afinyecciones intravenosas ter de la terapia génica de AAV en ratones 1 día de edad, la supervivencia se extendió a un año, lo que demuestra la seguridad y la tolerabilidad de la inyección protocolo descrito 2,4,14. Resultados similares se obtuvieron también en el mismo modelo de ratón después de la inyección IV SMA de oligonucleótidos antisentido 8,9. Las aplicaciones futuras incluyen la entrega de otras terapias con células y genes, así como la creación de modelos neonatales para los trastornos del desarrollo del sistema nervioso central y la periferia de expresar exógenamente un ADNc o un casete de RNAi 24. La inyección intravenosa es un método clínico aprobado de la entrega; Por lo tanto, la utilización de esta técnica puede ser ventajoso en estudios preclínicos para una variedad de agentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el NINDS, FightSMA y Familias de SMA para el apoyo financiero. Segl con el apoyo de la formación NINDS subvención # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thinpro insulin syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber optic light source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting microscope |
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