Intravenösa injektioner i Neonatal Möss

Summary

Djurmodeller av barnsjukdomar kan uppleva tidig debut och aggressivt sjukdomsprogression. Kliniskt relevant terapi leverans till unga musmodeller kan vara tekniskt svårt. Detta protokoll beskriver en icke-invasiv intravenös injektion metod för nyfödda möss inom de två första postnatala dagar i livet.

Abstract

Intravenös injektion är ett kliniskt tillämpligt sätt för att leverera terapeutiska medel. För vuxna gnagare och större djur, intravenösa injektioner är tekniskt möjliga och rutin. Dock kan vissa musmodeller har tidig debut av sjukdomen med en snabb progression som gör administrationen av potentiella terapier svårt. Den tidsmässiga (eller ansiktsbehandling) venen precis främre till öronsnäckorna i möss, och är väl synlig för de två första dagarna efter födseln på vardera sidan av huvudet med hjälp av en dissekera mikroskop. Under det här fönstret, kan den tidsmässiga ven injiceras med volymer upp till 50 pl. Injektionen är säkert och tolereras väl av både valparna och dammarna. En typisk injektionsproceduren är klar inom 1-2 minuter, varefter valpen återförs till hemmaburen. Genom den tredje postnatal dag är venen svårt att visualisera och injektionsproceduren blir tekniskt opålitlig. Denna teknik har använts för leverans av adeno-associerat virus (AAV) vectorer, vilket i sin tur kan ge nästan kroppstäckande, stabilt transgenuttryck för livet av djuret beroende på den virala serotyp valt.

Introduction

Leverans av läkemedel till det centrala nervsystemet (CNS) i musmodeller av barnsjukdomar är fortfarande en utmaning. Möss som modell nyfödda sjukdomstillstånd är undermåliga och utvecklingsmässigt omogna och därför kan vara svårt att direkt injicera i lämpliga strukturer inom CNS. Intravaskulär injektion av terapeutiska medel är en icke-invasiv, väl tolererad metod för att leverera celler, läkemedel, eller virala vektorer till hela kroppen inklusive CNS ^1-5 och retina ^3,5-9. Tidigare publikationer beskriver tidsmässiga ansikts ven injektion med en transilluminator ^10,11, utan en dissektion mikroskop ^11,12, eller som kräver två personer för att injicera ^10. Den injektionsteknik beskrivs i detta protokoll är fördelaktigt eftersom en enskild individ kan injicera valpar, och ljuskällan för att se den temporala ven inte röra valpen, vilket eliminerar behovet av kirurgtejp eller fastsättning av en valp till en fast ytasåsom en transilluminator ^11. Leverans av adeno-associerad viral vektor serotyp 9 (AAV9) i möss ger robust uttryck i neuroner och astrocyter i hela hjärnan och ryggmärgen (fig 1). Intravaskulär leverans av virala vektorer i det ytliga tidsmässiga ansikts ven har ett tillförlitligt används i olika studier på neonatala möss för behandling av barn neuromuskulär sjukdom spinal muskelatrofi (SMA) ^2,4,13,14 och slutligen ökade livslängden hos behandlade möss.

Intravaskulär injektion av neonatala möss också effektivt riktar det perifera nervsystemet och perifera organ (Figur 2). Efter injektion av AAV har transduktion av dorsala rotganglier, lever, hjärta, skelettmuskel, lunga, och plexus myentericus av tarmen iakttagits ^1,3,6,7,15. Utbredd transduktion av CNS och periferi gör denna metod för injektion idealisk för sjukdomar som kräver global expression aven transgen, såsom Gauchers sjukdom ¹⁶ och andra lysosomala lagringssjukdomar ^17,18, Batten sjukdom och relaterade neuronala ceroid lipofuscinoses, ¹⁹ och Bardet-Biedl syndrom, en genetisk multisystem sjukdom med debut av symtom som förekommer i den tidiga barndomen ^20. Intravaskulär injektion i neonatal möss bör också betraktas som en ny metod för modellering hela systemet barnsjukdomar. Denna teknik har översatts till större djurmodeller ^5,21 och intravaskulär injektion redan existerar som en kliniskt acceptabel metod för att leverera läkemedel.

Den nuvarande protokollet beskriver en enkel, effektiv metod för att ge medel till neonatala möss genom den ytliga tidsmässiga ansikts ven senast postnatal dag 2. Injektion kan fyllas i av en enda, övade individuellt och tolereras väl av både valparna och dammarna. Valpar upplever minimal stress och återhämta sig snabbt. Importantly kommer lyckad injektion resultera i globala leverans av medlet administreras. Detta protokoll är lämpligt för leverans av virala vektorer, farmaceutiska medel eller celler till nyfödda möss.

Protocol

Alla förfaranden som anges i protokollet har godkänts Institute for Animal Användning och skötsel kommitté (IACUC) i Ohio State University.

1. Framställning av Arbetsyta

1. Samla våt is för att söva musungar, en tom bur att segregera dammen från kullen, ett dissektionsmikroskop, en ljuskälla som kan placeras i en vinkel på injektionen (användning av en ljuskälla vid en 90 °   vinkel mot injektionsstället skymmer ven), en ren yta att placera djuret för injektion, bomullspinnar, 3/10 spruta cc insulin med 3/8 "30 G nål (en per djur) och 1% Evans Blue Dye ( göras med fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) lösning för utbildning.
2. Ta dammen till en separat bur medan manipulera valparna.

2. Injektion Tillvägagångssätt

1. Placera en enda valp direkt på våt is under 30-60 sekunder för att söva djuret. Lämna inte tHan djur på is för länge på grund av en risk för hypotermi relaterade komplikationer inkluderande ventrikelflimmer, hypoxi och metabolisk acidos.
   OBS: Vår erfarenhet är att 30-60 sekunder är tillräckligt för att bromsa pup rörelser för att medge injektion. Om djupare anestesi krävs, kan inhalationsmedel, såsom 1-2% isofluran vara lämplig.
2. Medan djuret är på is, ladda sprutan med 30 pl Evans blått färgämne.
3. När djuret är helt sövda, bekräftas av brist på rörelse på isen samtidigt andas, flytta den i mikroskop. För en högerhänt injektion, möta djurets nosparti till höger. Placera den vänstra pekfingret på nosen och vänster långfinger kaudalt om öronsnäckorna så att öronsnäckorna är mellan pekfingret och långfingret (Figur 1).
4. Undersök precis främre till öronsnäckorna för en ytlig kapillär som rör sig när huden är manipulerad. Denna kapillär är inte målet, menidentifiering är viktigt för temporal ven identifiering. Nästa, hitta en mörk, skuggig ven sämre än kapillären som förblir fast oavsett hudens position. Den tidsmässiga ven verkar skuggiga, kör rygg till ventrala och matas in i halsvenen (Figur 1).
5. Skriv in den tidsmässiga ven med nålen avfasning upp. Om korrekt insatt, är det möjligt att se nålen avfasning fylls med blod genom huden. Sedan tryck in kolven långsamt och notera blekning av venen längs sidan av ansiktet.
6. Låt nålen att stanna kvar i venen för en extra 10-15 sek för att förhindra backflöde av injicerings.

3. Post-injektion

1. Efter en ordentlig injektion ska valpen bli blå nästan omedelbart. Ta bort nålen och använda milt våld för att tillämpa en bomullspinne på injektionsstället tills blodproppar.
2. Övervaka valpen för tecken på ångest. Låt valpen 2-3 min för att återhämta sig och rewarm, recognize när valpen är vid medvetande, upprätt och flytta, innan han återvände till buren. Cup valparna i utredarens handskar på händerna för att ge lämplig värme för att underlätta återhämtningen om det behövs. Alternativt, placera en värmedyna under buren för att underlätta uppvärmningen den injicerade valpen. Generellt efter Evans blått färgämne injektion avliva valpar. Ta inte med färgämne vid injektion testmaterial.
3. Placera valpen tillbaka in i buren och se till att valpen är belagd med sängkläder och / eller nestlet att säkerställa reacceptance av dammen.
4. Använd en ny spruta och bomullstuss för varje valp att bibehålla sterilitet.

Representative Results

Under en ordentlig injektion ska venen momentant vrid klart, eller blanchera. Om injicera färga hela valpen ska bli blå inom några sekunder. Om en felaktig injektion har skett, finns det ofta en koncentrerad subkutan bolus i huvud eller hals och injiceringsmedlet kan läcka ut från injektionsstället. Felaktiga injektioner kan även resultera i uppkomsten av blåmärken runt halsen. Valpar som får subkutana injektioner (dvs. injektionen inte var helt levereras i venen) generellt upplever inga sjuka biverkningar och rutinmässigt svarar på behandling som de ordentligt injicerade möss gör.

Beroende på terapi som avges, kan lyckad injektion resultera i omfattande leverans till CNS och perifera organ. Vid injicering av själv gratis adenoassocierat serotyp 9 uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) med en kyckling β-aktin hybridpromotor (CB) (tillsammans kallade "scAAV9 CB GFP"), transgenexpression finns i gliaceller och neuroner i flera hjärnregioner och i ryggmärgen (Figur 2A-2C). Intravaskulär injektion av scAAV9 CB GFP leder också utbrett uttryck genom hela periferin, med märkbar uttryck i hjärta och levervävnad (Figur 3A-3D).

Figur 1: (A) En provisorisk injektion plattform gjord av en absorberande dyna ("blöja") lindad runt en frigolitställ från 50 ml koniska förpackningar. Plattformen möjliggör för forskaren att vila sin hand på bordet intill plattformen. Detta gör det möjligt för forskaren att utföra injektionen vid ett flackare vinkel i förhållande till mus-valp. (B) Bild som visar pup immobilisering mellan förgrunden och långfinger. ( Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Centrala nervsystemet genuttryck efter nyfödda intravenös injektion av själv kompletterande AAV9 uttrycker grönt fluorescerande protein (scAAV9 CB GFP) Förlossnings dag 1 (P1) musungar injicerades intravenöst med 1 x 10 ¹¹ vektorgenom (VG) av själv-. komplementär (sc) scAAV9 CB GFP. Fyra veckor efter injektionen avlivades mössen och perfuserades med 4% paraformaldehyd. Vävnader samlades, skivad och färgas för GFP uttryck. GFP-uttryck ses i hela hjärnan, inklusive den främre striatum (A) rakt igenomh de pons och cerebellum (B). GFP-positiva celler är typiskt neuroner och astrocyter. GFP-uttryck detekteras också i ryggmärgen (C). Spinal motoriska nervceller och dorsalrotsganglier nervceller effektivt omvandlade använder nyfödda IV leverans. GFP positiva kärl och astrocyter ses också i hela spinal grå. Alla skal staplar = 200 m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: GFP-uttryck i perifera organ efter neonatal intravenös injektion av självkomplementär AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP-immunfluorescens är detekterbar i den vuxna musen hjärta (A) och lever (C). (B) och lever (D) i uninjected möss. Alla skal staplar = 100 nm.

Discussion

Intravaskulär tillförsel av medel till CNS eller i hela kroppen är svårt i neonatala musmodeller av sjukdomen. Den beskrivna protokollet är en snabb, relativt icke-invasiv metod för att intravenöst administrera lösningar till neonatal möss med minimala krav på utrustning. Även den tidsmässiga ansikte ven kan ses med blotta ögat, kan injektioner har större noggrannhet med användning av mikroskopet och fiberoptiska ljuskällan, speciellt för en ovan injektor. Intravaskulära injektioner i neonatala möss har ett bra resultat ^12, och AAV transduktion har observerats i tidiga valpar, även om en del av injicerings administreras subkutant. Injektionen tolereras väl av de musungar och dammar på FVB / N eller C57BL / 6 bakgrunder tolerera manipulering av valparna mycket väl. Men i sällsynta fall dammar kan förstöra hela kullar. Dessa injektioner kan utföras framgångsrikt i möss så små som 0,8 g genom 1,6 g. Alternativa injection vägar för nyfödda möss har publicerats av oss och andra inklusive retroorbital, intrajugular och intraperitoneal ^10,15,22. Vi föredrar den injektionsväg beskrivs här eftersom det är kliniskt relevant, kunna utföras av en enda försöksledaren utan några speciella krav på utrustning och medger ett brett spektrum av volymer som skall administreras.

Ett vanligt problem som upplevs när du utför injektioner är problem med att se den temporala ven och därmed felplacering av nålen. Den fiberoptiska ljuskällan ska placeras vid <90 ° och lysande nedåt på huvudet när hålls för bästa visning av venen. Injektorer bör ta tid att anpassa ljuskällan att passa deras behov. Temporal ven observation avsevärt minskas om valpar är för stora, karaktäriseras som äldre än P2 eller högre än 2,0 g. Ett annat problem kan vara att bestämma om nålen avfasning har kommit in i venen. Den tidsmässiga ansikts ven är SuperFisiella, så man måste vara försiktig för att undvika att gå in under venen. Att se till att nålen avfasning går in parallellt med venen förhindrar punktering genom venen. Nålplacering bäst verifieras genom långsam injektion och efterföljande blekning av venen.

Den ytliga temporala venen syns på vardera sidan av huvudet. Vänsterhänta personer kan finna att vända djuret mot utredarens vänster kan vara ergonomiskt bättre och bör bestämmas för varje enskild utredare. Borde venen inte vara synlig eller mistargeted på inledande försök, med inriktning venen på motsatt sida av huvudet är lämpligt. Om ven punkteras på båda sidor av huvudet, kan visst läckage uppkomma genom den första platsen under injektion in i den andra platsen. Beroende på arbetsavstånd av mikroskopet, kan det vara lämpligt att bygga en liten plattform att injicera djuret; till exempel, en tom Styrofoam behållare från 50 ml koniskttube förpackning (figur 1). Detta gör att utredaren att placera djuret nära kanten av plattformen så att utredarens injektions handen kan vila direkt på bordet. Detta kan förbättra vinkeln träder i venen och minimera ljus obstruktion.

Det finns några begränsningar för nyttan av protokollet, inklusive injektionsvolym, fönstret för injektionsvätskor ålder och oförutsägbarheten dammen svaret. Injektionsvolymer för valpar är begränsade till 50 pl. Vi har tidigare doserade djuren med 100 l, men har observerat en ökad injektion relaterad dödlighet jämfört med lägre volym injektioner, men andra rapporterar framgångsrikt leverera 100 ^ ^10,12. Vidare har det föreslagits att ökad injektionsvolymer kan skada blod-hjärnbarriären ^23. Ofta den experimentella reagens blandas med PBS för att bibehålla en konstant 50 ^ il injektionsvolym. Vi känner inte till studier examining effekten av injektionsvolymen på spridning i hela nyfödda möss och empiriska studier bör genomföras för att identifiera effekter på injektionsvolym för nya reagenser vid en given dos. En andra begränsning är att den ytliga tidsmässiga ven är väl synlig på den första och andra postnatal dagar. Ändringar i djurets storlek, hudpigmentering och tjocklek kombineras för att skymma venen i senare åldrar om andra rapport åtkomst venen genom postnatal dag 6 ^10,12. Alternativt använde vi ultraljud guidad hjärt injektioner för att leverera virusvektor till cirkulationen i P5 och P10 djur ^4. Slutligen är godkännande av mus dammar av förfarandet oförutsägbara. Vi har behandlat FVB / N, C57BL / 6 och B6SJL möss över musmodeller av neuromuskulära sjukdomar och autismspektrumstörningar. FVB / N-möss är de mest toleranta medan påfrestningar på C57BL / 6 bakgrund ibland kan förstöra enstaka valpar eller hela kullar, men detta är en sällsynt företeelse. Men dettabör vara en faktor när man planerar för tillräcklig n för ett experiment. Dam acceptans kan vidare påverkas av vilken sjukdom musstammen är modellering. Till exempel, en modell av en autismspektrumstörning hade en mycket högre valp avvisande än väntat baserat på bakgrundsstammen. Främja valpar kan vara en ersättning om damm acceptans är ett bekymmer. Andra metoder för att begränsa avstötning inkluderar utför injektioner i ett separat rum från dammen för att begränsa tillgången till råttvalpars ultraljud läten och att gnida dammen näsa och / eller valparna med en trasa fuktad med 70% etanol för att maskera någon utredare doft. Valpar bör smörjas med smutsiga sängkläder för att underlätta acceptans.

Detta protokoll har framgångsrikt använts för att behandla en musmodell av SMA. SMA är en pediatrisk neurodegenerativ sjukdom som främst drabbar mindre motoriska nervceller i ryggmärgen. Utan behandling dör denna musmodell med 15 dagar efter födseln i genomsnitt. AfTER intravenösa injektioner av AAV genterapi i 1 dag gamla möss, var överlevnaden förlängdes till ett år, att demonstrera säkerheten och tolerabiliteten av det beskrivna injektionsprotokollet ^2,4,14. Liknande resultat erhölls också i samma SMA musmodell efter intravenös injektion av antisensoligonukleotider ^8,9. Framtida tillämpningar omfattar leverans av andra cell och genterapier, samt skapandet av neonatala modeller för utvecklingsstörning i CNS och i periferin att exogent uttrycker en cDNA eller en RNAi kassett ^24. Intravenös injektion är en godkänd klinisk metod för leverans; Därför kan användning av denna teknik vara fördelaktig i prekliniska studier för en mängd olika medel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope