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Neuroscience

मल्टी फोटॉन Intracellular सोडियम इमेजिंग CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट की यूवी की मध्यस्थता फोकल uncaging के साथ संयुक्त

doi: 10.3791/52038 Published: October 8, 2014
* These authors contributed equally

Summary

हम पूरे सेल पैच दबाना और माउस मस्तिष्क के तीव्र ऊतक स्लाइस में डेन्ड्राइट और hippocampal न्यूरॉन्स का कांटा में intracellular सोडियम यात्रियों की बहु फोटॉन इमेजिंग के साथ न्यूरो सक्रिय यौगिकों का केन्द्र यूवी प्रेरित फोटो सक्रियण के संयोजन का वर्णन.

Abstract

मल्टी फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ बरकरार ऊतक में मस्तिष्क कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक मापदंडों का विश्लेषण सक्षम है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त, यह व्यापक रूप से dendrites और वृक्ष के समान spines के रूप में छोटे subcellular डिब्बों में गतिविधि से संबंधित कैल्शियम संकेतों का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कैल्शियम यात्रियों के अलावा, synaptic गतिविधि भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी सोडियम संकेत, केवल मामूली समझ रहे हैं, जिनमें से गुण लाती है. यहाँ, हम केंद्रीय न्यूरॉन्स के सेलुलर सूक्ष्म डोमेन में संयुक्त पूरे सेल पैच दबाना और बहु ​​फोटॉन सोडियम इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. इसके अलावा, हम ऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है जो अल्ट्रा वायलेट (यूवी) ग्लूटामेट की -light प्रेरित uncaging, के लिए एक संशोधित प्रक्रिया परिचय. इसके लिए पूरे सेल रिकॉर्डिंग कोर्नु एम्मोनिस उपखंड 1 (सीए 1) के तीव्र ऊतक स्लाइस में पिरामिड न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया गयामाउस हिप्पोकैम्पस. न्यूरॉन्स पैच विंदुक के माध्यम से सोडियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक SBFI से भरा है, और SBFI की बहु फोटॉन उत्तेजना डेन्ड्राइट और आसन्न कांटा के दृश्य सक्षम थे. यूवी प्रेरित फोकल uncaging स्थापित करने के लिए, प्रकाश तीव्रता, यूवी uncaging किरण से प्रभावित मात्रा बीम की स्थिति के साथ ही बंदी परिसर की एकाग्रता सहित कई मानकों का परीक्षण किया और अनुकूलित किया गया. हमारे परिणाम बंदी ग्लूटामेट (MNI-ग्लूटामेट) के साथ कि स्थानीय छिड़काव और dendrites और कांटा में आवक धाराओं और सोडियम यात्रियों में अपने फोकल यूवी uncaging परिणाम दिखाते हैं. टाइम कोर्स और आवक धाराओं और सोडियम संकेतों दोनों के आयाम uncaging नाड़ी की अवधि के साथ सहसंबंधी. इसके अलावा, हमारे परिणाम है कि वे इस मार्ग हालांकि सोडियम बाढ़ से मध्यस्थता कर रहे हैं कि प्रदर्शन, intracellular सोडियम संकेतों ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए ब्लॉकर्स की उपस्थिति में अवरुद्ध कर रहे हैं कि दिखा. संक्षेप में, हमारे विधि के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता हैबरकरार मस्तिष्क के ऊतकों में फोकल रिसेप्टर सक्रियण द्वारा प्रेरित intracellular सोडियम संकेतों की जांच.

Introduction

ऐसे बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में प्रकाश सूक्ष्म तकनीक में हाल ही के सुधार उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ बरकरार ऊतक में मस्तिष्क कोशिकाओं के रूपात्मक और शारीरिक मापदंड के अध्ययन के लिए सक्षम है. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयुक्त, इन तकनीकों अब व्यापक रूप से अर्थात् ठीक dendrites और वृक्ष के समान spines में, छोटे subcellular डिब्बों में न्यूरॉन्स पर गतिविधि से संबंधित विद्युत संकेतों के साथ ही सहवर्ती कैल्शियम संकेतों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है. कैल्शियम यात्रियों के अलावा, synaptic गतिविधि भी dendrites और कांटा में सोडियम संकेत लाती है, जिनमें से गुण बड़े पैमाने पर बेरोज़गार हैं. ऐसे संकेत [ना +] महत्वपूर्ण डाई विरंजन या तस्वीर वाली क्षति 1,2 के बिना लंबी अवधि के लिए मैं यात्रियों की ऑन लाइन माप में सक्षम बनाता है जो intracellular सोडियम की दो photon इमेजिंग ([ना +] मैं) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.

[ना +] मैं की इमेजिंग के लिए जैसे कोरोना ग्रीन या Asante नाट्रियम ग्रीन 3,4 उपलब्ध हैं. ना + इमेजिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट जांच सोडियम बाध्यकारी benzofuran isophthalate (SBFI) है. यह अच्छी तरह से ज्ञात कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई Fura-2 के लिए इसी तरह की एक ratiometric, यूवी उत्साहित डाई और (जैसे 5,6) कई प्रकार की कोशिकाओं में पारंपरिक ना + इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है. रोमांचक डाई और उसके प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने का अलग संभावनाएं हैं. उच्च अस्थायी समाधान (यानी एक उच्च इमेजिंग फ्रेम दर) स्थानिक जानकारी के साथ संयोजन में की आवश्यकता है, SBFI एक उच्च गति प्रभारी के साथ पकड़ा एक क्सीनन चाप दीपक या एक उच्च शक्ति प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) डिवाइस और अपने उत्सर्जन के साथ उत्साहित हो सकते हैं -coupled डिवाइस (सीसीडी) कैमरा 7,8. गहरी ऊतक में अधिक से अधिक स्थानिक संकल्प के लिए, बहु फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी चुनाव 9 की विधि है. अपेक्षाकृत कम क्वांटम कुशल(- 2 मिमी 0.5), और एक तेज microelectrode 10 या पैच पिपेट 1 के माध्यम से SBFI की झिल्ली अभेद्य फार्म का सीधा लोडिंग SBFI की ncy अपेक्षाकृत उच्च डाई सांद्रता जरूरी.

SBFI का प्रयोग, कृंतक हिप्पोकैम्पस की तीव्र ऊतक स्लाइस में प्रदर्शन के पहले काम मुख्य रूप से 1,2 रिसेप्टर्स ionotropic NMDA के माध्यम से सोडियम की आमद की वजह से हैं जो CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की dendrites और कांटा में गतिविधि से संबंधित सोडियम यात्रियों का प्रदर्शन किया. और अधिक विस्तार में इस तरह के स्थानीय सोडियम संकेतों के गुणों के अध्ययन के लिए, रिसेप्टर एगोनिस्ट के आवेदन के द्वारा पोस्टअन्तर्ग्रथनी रिसेप्टर्स की विशिष्ट सक्रियण पसंद की एक अच्छी तरह से अनुकूल विधि है. Presynaptic गतिविधि और ट्रांसमीटर रिहाई की नकल करने के लिए, आवेदन अपेक्षाकृत संक्षिप्त होना और स्थानीय उत्तेजना सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित करना चाहिए. यह, हालांकि, बरकरार ऊतक में काफी चुनौतीपूर्ण साबित होता है. एक ठीक इत्तला दे दी पिपेट का उपयोग रिसेप्टर एगोनिस्ट के स्थानीय दबाव आवेदन बहुत फोकल एपी सक्षम बनाता हैतह, लेकिन (जैसे एक डेन्ड्राइट या वृक्ष के समान spines के रूप में उदाहरण के लिए) ब्याज की संरचना के आंदोलन के उत्पादन के लिए संभावित जोखिम मेजबान, और इस प्रकार उच्च संकल्प इमेजिंग hinders. न्यूरो सक्रिय पदार्थों के योणोगिनेसिस की उपयुक्तता उनके बिजली के गुणों पर निर्भर करता है और उच्च वर्तमान आयाम के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर कलाकृतियों का उत्पादन हो सकता है.

इन बाधाओं को नाकाम करने के लिए एक तरह से तस्वीर सक्रिय यौगिकों और उनके फ़्लैश photolysis का रोजगार है. असल में, दो अलग सिद्धांतों बंदी पदार्थों की तस्वीर वाली सक्रियण के लिए उपयोग किया जाता है: लेजर 12 के साथ संयोजन में स्कैनिंग मॉड्यूल को रोजगार आई) चौड़े क्षेत्र फ्लैश photolysis 11 और द्वितीय) फोकल uncaging. व्यापक क्षेत्र फ्लैश photolysis हित के व्यापक क्षेत्रों को सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जैसे एक पूरे सेल, फोकल uncaging विशेष रूप से छोटे सेलुलर डिब्बों को प्रोत्साहित करने के लिए कार्यरत है. वर्तमान अध्ययन में हम पूरे सेल पैच दबाना और बहु ​​पी के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शनऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है जो ग्लूटामेट की यूवी प्रकाश प्रेरित uncaging, के लिए एक संशोधित प्रक्रिया के साथ संयुक्त डेन्ड्राइट और केंद्रीय न्यूरॉन्स का कांटा में hoton सोडियम इमेजिंग,.

Protocol

इस अध्ययन सख्त हेनरिक Heine विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ, जर्मनी के संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, साथ ही यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक (86/609 / ईईसी) में किया गया. (: O52 / 05 संस्थागत अधिनियम संख्या) सभी प्रयोगों हेनरिक Heine विश्वविद्यालय डसेलडोर्फ, जर्मनी के पशु की देखभाल और उपयोग सुविधा में पशु कल्याण कार्यालय द्वारा भेजी और अनुमोदित किया गया. जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार (Tierschutzgesetz, लेख 4 और 7), मस्तिष्क के ऊतकों की शवपरीक्षा हटाने के लिए कोई औपचारिक अतिरिक्त अनुमोदन आवश्यक था.

प्रायोगिक पशुओं की इच्छामृत्यु, लक्जमबर्ग: तीव्र स्लाइस की पीढ़ी के लिए, चूहों में प्रकाशित यूरोपीय आयोग की सिफारिश के बाद (decapitated जल्दी से सीओ 2 के साथ anaesthetized थे और यूरोपीय समुदाय, 1997 के सरकारी प्रकाशनों के लिए कार्यालय, आईएसबीएन 92-827-9694 -9).

1. तैयारीसमाधान

  1. 95% 2 हे और साथ bubbled 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 6 2 MgCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 NaHCO 3, और 20 ग्लूकोज,: (मिमी में) युक्त विच्छेदन के लिए कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) तैयार करें 5% सीओ 2, 7.4 का एक पीएच में जिसके परिणामस्वरूप.
  2. (मिमी में) युक्त प्रयोगों के लिए ACSF तैयार: 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 1 2 MgCl, 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 NaHCO 3, और 95% 2 हे और 5% सीओ 2 के साथ bubbled 20 ग्लूकोज,, जिसके परिणामस्वरूप 7.4 की एक पीएच में.
  3. 150 KMeSO 3, 12.5 हाइड्रोक्सी एथिल piperazine एटैन सल्फोनिक एसिड (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, 1.25 इथाइलीन ग्लाइकॉल tetraacetic एसिड (EGTA), 5 मिलीग्राम एटीपी, 0.5 NA-: intracellular समाधान (आईसीएस) (मिमी में) युक्त तैयार जीटीपी. 7.3 पीएच को समायोजित करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर के स्टोर aliquots.
  4. डबल आसुत पानी में सोडियम बाध्यकारी benzofuran isophthalate (SBFI) नमक पतला और 5 μl की aliquots तैयारएक 10 मिमी शेयर समाधान की.
  5. पिघलना आईसीएस 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में SBFI शेयर समाधान जोड़ने और. भंवर और सूक्ष्म छानना (0.22 माइक्रोन). प्रयोग में इस्तेमाल किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें. फ्रिज और केवल एक दिन के लिए उपयोग न करें.
  6. डबल आसुत जल में मिश्रित भंग करके 50 मिमी की MNI ग्लूटामेट शेयर समाधान तैयार है. सामान्य ACSF में 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता MNI ग्लूटामेट शेयर समाधान पतला. प्रयोग में इस्तेमाल किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें. फ्रिज और केवल एक दिन के लिए उपयोग न करें. तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर, प्रयोग में इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं जो स्टोर aliquots,.

ऊतक के 2 विच्छेदन

नोट: कृंतक मस्तिष्क की तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी पहले 13,14 विस्तार से वर्णित किया गया था. संक्षेप में, निम्नलिखित प्रोटोकॉल वर्तमान अध्ययन में कार्यरत था.

  1. कत्ल के बाद तेजी से खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें.
  2. इसके तत्काल बाद एक पेट्री डिश में मस्तिष्क जगहठंडा विच्छेदन ACSF साथ midline के साथ एक बाण के समान कटौती के प्रदर्शन से एक गोलार्द्ध काटना और.
  3. एक अवरुद्ध सतह के रूप में वांछित अभिविन्यास में एक दूसरी कट प्रदर्शन और superglue के साथ एक vibratome के काटने के मंच पर इस देते हैं.
  4. चैम्बर काटने और तत्व ठंडा लो कक्ष में मस्तिष्क अनुभाग के साथ फ्रीजर और जगह काटने चरण से बाहर vibratome की (दोनों -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा). तब कक्ष में ठंडा तत्व डाला और ठंडा विच्छेदन ACSF में ऊतक डूब. तैयारी को स्थिर करने के लिए, एक अगर जेल के साथ ऊतक ब्लॉक का मुकाबला कर सकते हैं.
  5. Vibratome साथ हिप्पोकैम्पस के 250 माइक्रोन मोटी, parasagittal स्लाइस काटें. सभी एसीएस तरल पदार्थ हर समय bubbled हैं सुनिश्चित करें.
  6. टुकड़ा करने की क्रिया के बाद, सामान्य ACSF साथ एक बीकर में एक जाल पर ऊतक रखने के लिए और 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. फिर कमरे के तापमान पर रखना.

हार्डवेयर की 3 तैयारी


चित्रा प्रकाश रास्तों और बहु फोटॉन इमेजिंग, लेजर स्कैनिंग यूवी फ़्लैश photolysis, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से मिलकर. बहु फोटॉन किरण (लाल) रिग की प्रयोगात्मक नियंत्रण दिखा 1 योजना एक स्पंदित, ट्यून करने योग्य अवरक्त (आईआर) लेजर द्वारा निर्मित है (Tisa). यह लेजर शक्ति और उसके प्रशासन की अवधि का नियंत्रण सक्षम है, जो सभी के लिए एक यांत्रिक शटर, एक Pockels 'सेल, और आईआर डिटेक्टर (बीम तीव्रता का पता लगाने), गुजरता है. फ्लिप में / फ्लिप बाहर वैकल्पिक लेजर डायोड लेजर बीम की बुनियादी संरेखण के लिए कार्यरत है. किरण विस्तारक एक अत्यंत व्यापक वापस फोकल विमान के साथ उद्देश्यों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है. रिमोट नियंत्रित एन डी फिल्टर पहिया अलावा या बजाय लेजर बीम शक्ति को नियंत्रित करने के लिए Pockels 'सेल का इस्तेमाल किया जा सकता है. स्कैन सिर पारित करने के बाद, स्पंदित आईआर प्रकाश नमूना करने के लिए निर्देशित किया है. फेंकनाटेड प्रतिदीप्ति प्रकाश (हल्का हरा) बाहरी या आंतरिक photomultiplier डिटेक्टरों (PMTs) द्वारा या तो एकत्र किया जाता है. बाहरी डिटेक्टरों पूरी तरह से एक उच्च आवृत्ति स्विच (पीएमटी नियंत्रक) के माध्यम से आंतरिक PMTs साथ सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं. uncaging किरण (हल्का नीला) एक यूवी ठोस राज्य के लेजर (DPSS यूवी लेजर) द्वारा निर्मित है. यह तो एक प्रकाश गाइड द्वारा महामारी प्रतिदीप्ति कंडेनसर के शीर्ष पीठ पर galvo संचालित स्कैनिंग इकाई को निर्देश दिया है. सटीक स्थिति uncaging स्थान या क्षेत्र (इमेजिंग और uncaging बीम के बीच रंगीन विपथन) इमेजिंग सॉफ्टवेयर से छवि निर्यात से सक्षम है. इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, और फ्लैश photolysis तुल्यकालन के लिए समय प्रबंधन इलेक्ट्रॉनिक रूप से नियंत्रित किया जाता है. transillumination डिटेक्टर (टीएल-पीएमटी) ऊतक के भीतर pipettes की स्थिति के प्रलेखन के लिए जरूरत की है. कंट्रोल यूनिट और संशोधित किया गया है जो इमेजिंग सिस्टम के सॉफ्टवेयर, नियंत्रण और अन्य सभी उपकरणों सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता हैसिस्टम को चलाने की जरूरत है. "रिवाज" लेखकों द्वारा अनुकूलित / बनाया गया है और निर्माण कर रहे थे के रूप में सिस्टम घटकों लेबल. कुछ घटक कस्टम गठन बहु फोटॉन प्रणाली की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया गया और "संशोधित" के रूप में चिह्नित कर रहे हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. बहु फोटॉन प्रणाली के घटकों पर स्विच करें. टेस्ट और अवरक्त लेजर बीम संरेखण समायोजित.
    1. बजाय एक उद्देश्य के लिए एकत्रित चश्मे में flipping द्वारा नियंत्रण किरण स्थिति. किरण की हड्डी उखड़ गई है, तो पेरिस्कोप में दर्पण से यह फिर से समायोजित. चश्मे के एकत्रित विमान इमेजिंग जबकि उद्देश्य के पीछे फोकल हवाई जहाज़ के रूप में एक ही स्तर पर होना चाहिए ध्यान दें.
    2. स्पेक्ट्रोमीटर पर स्विच और किरण की बहु फोटॉन विशेषताओं के लिए जाँच करें.
    3. निम्न मान के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर के मापदंडों सेट: चुनें(उच्च फ्रेम दर और उच्च स्थानिक संकल्प, क्रमशः के लिए 2.5 का एक कारक ज़ूम के साथ छोटे क्लिप बक्से) सेल का अवलोकन छवियों के लिए 512 x 512 पिक्सल के एक फ्रेम आकार. तेजी से मोड और XYT को स्कैन मोड में सेट इमेजिंग गति. जेड कदम बाद में प्रदर्शन किया deconvolution के लिए स्थानिक नमूना आवश्यकताओं से मेल विस्तृत ढेर के लिए 1 अवलोकन के ढेर के लिए माइक्रोन और 0.2 माइक्रोन होना चाहिए.
  2. और फोटो मल्टीप्लायरों (PMTs) -: (16 μW ≈ 14 उद्देश्य के तहत अंतिम शक्ति) Pockels 'सेल की सेटिंग बदलकर बहु ​​फोटॉन लेजर बीम (790 एनएम) तीव्रता को समायोजित.
  3. पर स्विच और उद्देश्य लेंस के तहत एक फ्लोरोसेंट नमूना स्लाइड रखकर uncaging प्रणाली जांचना.
    1. दूरबीन का उपयोग करना, यूवी प्रकाशिकी का ध्यान समायोजित और स्थानिक UGA स्कैन सिर पर ध्यान केंद्रित इकाई द्वारा रोजगार अधिकतम व्यास में 2 माइक्रोन के आकार के लिए यूवी लेजर हाजिर सीमा.
    2. Uncaging इकाई नियंत्रण softwar के अंशांकन दिनचर्या शुरूई.
      1. प्रतिदीप्ति एक सीसीडी कैमरा के साथ कब्जा कर लिया है, जबकि इसकी स्कैन सीमा के भीतर कई बिंदुओं को यूवी लेजर सेट करें. प्रत्येक बिंदु पर यूवी लेजर स्थान पर क्लिक करके, सॉफ्टवेयर में समन्वय के लिए एक निश्चित के अनुरूप करने के लिए बिजली उत्पन्न करनेवाली स्कैन दर्पण की स्थिति को समायोजित.

चित्रा 2
उत्तेजना, उत्सर्जन और uncaging किरण पथ की विशेषताओं illustrating चित्रा 2 विस्तृत योजना. आईआर उत्तेजना किरण (लाल) माइक्रोस्कोप की महामारी प्रतिदीप्ति कंडेनसर और उद्देश्य के लिए में filer बुर्ज स्तर पर dichroic दर्पण के संयोजन बीम गुजरता नमूना तक पहुँचने. uncaging किरण (नीला) स्कैनिंग मील इकाई ध्यान केंद्रित संधान और किरण को एक क्वार्ट्ज ऑप्टिकल प्रकाश फाइबर के माध्यम से दिया और फिर बाद में निर्देशित हैस्कैनिंग इकाई में rrors, बीम के संयोजन dichroic दर्पण के लिए एक dichroic दर्पण से गुजरता है. यहाँ यह उत्तेजना स्कैनिंग बीम के साथ संयुक्त है. नमूना से उत्सर्जित प्रकाश इमेजिंग स्कैन सिर की ओर विपरीत अभिविन्यास में उत्तेजना स्कैनिंग किरण पथ के पथ का अनुसरण. कैमरा पैच पिपेट का दृश्य नियंत्रण के लिए और लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ संयोजन में uncaging बीम की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है () नहीं दिखाया. हरे प्रकाश पथ अन्य अनुप्रयोगों के साथ काम का हो सकता है जो एक वैकल्पिक महामारी प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रतिनिधित्व करता है.

      1. फोकल अनुप्रयोगों हासिल करने के मौके मोड में फ्लैश photolysis प्रणाली का प्रयोग करें. सुनिश्चित करें कि (उद्देश्य के नीचे बिजली की औसत: 0.55 मेगावाट) uncaging बीम का केन्द्र समायोजन व्यास में 1.5 माइक्रोन (XY विस्तार) के एक स्थान आकार में परिणाम एक Z-स्तर पर तैनात एक फ्लोरोसेंट स्लाइड में पता चला है कि करने के लिए संगत एक ऊतकटुकड़ा () नहीं दिखाया.
    1. uncaging स्थान की सटीक स्थिति uncaging- और इमेजिंग-कंप्यूटर के बीच एक नेटवर्क कनेक्शन के माध्यम से इमेजिंग सिस्टम की एक छवि के आयात से हासिल की है.
      1. एक स्क्रीन धरनेवाला सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, लगातार इमेजिंग सॉफ्टवेयर (बजाय कैमरे फ़ीड) के फ्रेम से बाहर पढ़ने के लिए और congruently इमेजिंग और uncaging फ्रेम समायोजित. फ्लैश इकाई में एक संदर्भ छवि पूरे प्रयोग के दौरान उचित समायोजन सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर से हर 10 वें फ्रेम निर्यात.

चित्रा 3
चित्रा uncaging स्थान के 3 समायोजन: ठीक uncaging स्थान, uncaging सॉफ्टवेयर (हरी फ्रेम) में आयात किया जाता इमेजिंग सॉफ्टवेयर (पीला फ्रेम) के एक स्क्रीन शॉट की स्थिति है.पूरे CA1 पिरामिड सेल की (संतृप्त पिक्सल: काला पिक्सल, लाल, नीले) पीले सीमा के भीतर छोड़ दिया छवि एक उच्च न्यूनतम कोडित छवि का प्रतिनिधित्व करता है. छवि uncaging सॉफ्टवेयर (हरी "एक्स" एस) के अंशांकन ग्रिड से मढ़ा जाता है. सही करने के लिए, सेल के एक बढ़ाया हिस्सा मढ़ा uncaging स्थान (रेड क्रॉस) के साथ दिखाया गया है. पीला हाजिर uncaging बीम का स्वतः मढ़ा छवि है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. लक्ष्य क्षेत्र को बंदी परिसर के वितरण के लिए micromanipulators, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी घटक है, और दबाव आवेदन उपकरण चालू करें.
  2. बंदी यौगिकों के स्थानीय छिड़काव के लिए एक केंद्र के दबाव आवेदन डिवाइस स्थापित करें. इन पदार्थों के स्नान छिड़काव की तुलना में यह काफी लागत कम हो जाएगा. एसी की एक खींचें रोकने के लिए दिए गए वायुमंडलीय दबाव को पकड़े दबाव को समायोजित करेंमें एस एफ या आवेदन पिपेट से बंदी पदार्थों के रिसाव.
    नोट: दबाव आवेदन डिवाइस पिपेट धारक में एक बेहद सटीक और ultrafast सूक्ष्म वाल्व मेजबान. यह कम से कम आवेदन के दबाव को काम करने के लिए सक्षम बनाता है और इसलिए बंदी परिसर के साथ स्थानीय छिड़काव के दौरान एक न्यूनतम करने के लिए आंदोलन कलाकृतियों कम कर देता है.
  3. आग पॉलिश borosilicate ग्लास केशिकाओं का उपयोग पूरे सेल पैच दबाना और स्थानीय छिड़काव के लिए pipettes खींचो. Pipettes ~ 1 माइक्रोन का एक टिप व्यास और आर ≈ 3 MΩ (कश्मीर Meso 3 आधारित आईसीएस के साथ निर्धारित मान) का एक प्रतिरोध करना चाहिए था.
  4. प्लेस प्रयोगात्मक स्नान में टुकड़ा और एक ग्रिड के साथ यह प्रत्यय (चित्रा -4 ए, बी) (250 माइक्रोन मोटी प्लैटिनम फ्रेम,, शल्य तंतुओं के साथ फैला 40 माइक्रोन ओवर ड्राफ्ट). टुकड़ा हस्तांतरण के लिए (टूटे टिप के पक्ष में चूषण गेंद) एक औंधा, टिप टूट, और आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. झुकने और टुकड़ा के किसी भी अन्य कठोर निपटने बचें.
  5. चित्रा 4
    चित्रा खुर्दबीन मंच पर प्रयोगात्मक स्नान और स्नान की स्थिति के 4 अवयव. (ए) प्रयोगात्मक स्नान एक चुंबकीय धातु की अंगूठी से घिरा हुआ है जो स्नान कक्ष में ही (नीला) वर्ग के होते हैं. ट्यूबिंग खारा (ACSF) के साथ स्नान के निरंतर छिड़काव सुनिश्चित करता है. नीचे पकड़ और टुकड़ा ठीक करने के लिए ग्रिड स्नान कक्ष में डाल दिया है. स्नान कक्ष के भीतर तैनात (बी) तीव्र टुकड़ा तैयारी. टुकड़ा ग्रिड के धागे से तय हो गई है. (सी) पोजिशनिंग और माइक्रोस्कोप चरण में प्रायोगिक स्नान की ज्यामिति प्रयोगों के दौरान.

    1. ACSF साथ टुकड़ा छिड़कना स्थायी रूप से खुर्दबीन मंच पर स्नान प्लेस और.

    4 पूरे सेल पैच clamping

    1. SBFI युक्त और बंदी परिसर के साथ स्थानीय छिड़काव पिपेट लोड आईसीएस के साथ लोड पैच पिपेट. इसी micromanipulators को pipettes संलग्न. स्नान में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें. आप सिर मंच (CF चित्रा 4C) को नुकसान से बचने के लिए स्थायी रूप से आधारित हैं कि सुनिश्चित करें.
    2. स्नान में दोनों pipettes लोअर और हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र के ऊपर रख दें. ACSF साथ आईसीएस के कमजोर पड़ने से बचने के लिए पैच पिपेट (+40 मिलीबार) को कोमल दबाव लागू करें.
    3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पैच पिपेट की भरपाई संभावित क्षतिपूर्ति.
    4. आईआर डीआईसी वीडियो माइक्रोस्कोपी रोजगार पैच विंदुक के साथ एक CA1 पिरामिड सेल दृष्टिकोण. एक गीगा मुहर प्राप्त किया जाता है जब तक कोमल चूषण लागू करें. एक कोशिका दूसरी ओर ओर uncaging बीम में से एक हाथ की ओर और कम बिखरने और क्षीणन पर बरकरार सेल आकारिकी सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ा की सतह के नीचे 30 -70 माइक्रोन स्थित है जो की सोमा चुनें.
    5. तेजी से क्षमता के लिए क्षतिपूर्ति. तोड़ membranई और खुला सेल पूरे सेल विन्यास हासिल करने के लिए.
    6. धीमी क्षमता और श्रृंखला प्रतिरोध के लिए क्षतिपूर्ति.
    7. सेल इमेजिंग प्रयोगों शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए SBFI-आईसीएस के साथ dialyzed करने की अनुमति.

    5 मल्टी फोटॉन इमेजिंग और उत्तेजना

    चित्रा 5
    चित्रा 5 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल. एक प्रयोग, (लाल चिह्न (ᴨ) और लाल रेखा द्वारा इंगित) एक ट्रिगर नाड़ी को प्रारंभ करने के लिए एक साथ इमेजिंग (नीला), इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (हरा), और बंदी के प्रशासन के शुरू करने के लिए सेट किया गया है समय बिंदु 0 सेकंड में यौगिक (पीला). इस पहली अवधि के दौरान, इमेजिंग किरण पूरी तरह से (नीले प्रकाश) मंद जाना चाहिए. 4.5 सेकंड (धराशायी लाइन) के बाद, बंदी परिसर के स्थानीय छिड़काव समाप्त होता है और इमेजिंग किरण अपने wor के लिए सेट किया जाना चाहिएडाटा अधिग्रहण (नीला) के लिए राजा तीव्रता. पीला फ़्लैश ने संकेत दिया, 300 मिसे: 1.5 सेकंड बाद में (समय बिंदु 6 सेकंड), एक दूसरे ट्रिगर नाड़ी दिया यूवी फ्लैश इकाई (फ्लैश की अवधि initializes, जो (लाल चिह्न (ᴨ) और लाल रेखा ने संकेत दिया है) ) और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और इमेजिंग प्रोटोकॉल में मार्करों सेट.

    1. कार्रवाई क्षमता का वोल्टेज gated सोडियम चैनल की सक्रियता और पीढ़ी को रोकने के लिए ACSF को tetrodotoxin (TTX, 500 एनएम) जोड़ें.
    2. बहु फोटॉन उत्तेजना का उपयोग और SBFI प्रतिदीप्ति परिणामस्वरूप सेलुलर आकृति विज्ञान कल्पना और प्रयोग के लिए एक काँटेदार डेन्ड्राइट का चयन करें. एक उच्च संकल्प पर छवियों के लिए ज़ूम और डेन्ड्राइट के चारों ओर एक क्लिप बॉक्स जगह.
    3. बंदी ग्लूटामेट युक्त 10 μl ACSF साथ एक मानक पैच विंदुक भरें. दबाव आवेदन प्रणाली को पिपेट कनेक्ट और यह micromanipulator को देते हैं.
    4. डेन्ड्राइट के पास बंदी यौगिक (~ 30 माइक्रोन) के साथ विंदुक रखें. अनुमति देने के लिए विंदुक स्थितिचुनाव के डेन्ड्राइट के कुशल स्थानीय छिड़काव. Uncaging लेजर समायोजित बंद uncaging स्थान स्थान - हित की संरचना करने के लिए (~ 1 2 माइक्रोन).
    5. चुना डेन्ड्राइट पर ब्याज और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आसन्न कांटा के सेट क्षेत्रों के.
    6. ब्याज के क्षेत्र दृष्टिकोण और focally कम दबाव के साथ कई सेकंड (<3 साई) के लिए बंदी परिसर इंजेक्षन. ट्रिगर संकेत के माध्यम से पैच दबाना और (790 एनएम बहु फोटॉन उत्तेजना पर) प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग शुरू करो.
      नोट: बंदी परिसर के स्थानीय छिड़काव के दौरान, उत्तेजना बीम पूरी तरह से विरंजन रोकने के लिए मंद है.
    7. बंदी परिसर के स्थानीय छिड़काव बंद करो. SBFI के कुशल उत्तेजना सक्षम और uncaging (uncaging अवधि 300 मिसे) प्रारंभ करने में एक यूवी फ़्लैश लागू करने के लिए दो photon लेजर की तीव्रता में वृद्धि.
    8. SBFI प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी. SBFI प्रतिदीप्ति वापस आधारभूत बरामद होने के बाद रिकॉर्डिंग बंद करो.

    6 फार्माकोलॉजी

    1. रिसेप्टर ब्लॉकर्स रोजगार, बंदी ग्लूटामेट की यूवी फ़्लैश photolysis द्वारा पैदा की धाराओं और / या सोडियम संकेतों की पीढ़ी में ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की भागीदारी का परीक्षण करने के लिए.
      1. AMPA रिसेप्टर अवरोधक cyano-nitroquinoxaline-Dione (CNQX, 10 माइक्रोन) और TTX (ऊपर देखें) के अलावा NMDA रिसेप्टर अवरोधक एमिनो phosphonopentanoate (APV, 50 माइक्रोन) युक्त ACSF में स्विच करें और कम से कम 10 के लिए टुकड़ा छिड़कना मि.
      2. दोहराएँ उत्तेजना प्रक्रिया (5.4 और 5.5 देखें.)
    2. अवरोधकों 'प्रभाव के उलटने
      1. केवल TTX युक्त सामान्य ACSF पर वापस जाएं.
      2. 20 मिनट के लिए टुकड़ा छिड़कना.
      3. दोहराएँ उत्तेजना प्रक्रिया (5.4 और 5.5 देखें.).

    7 आकृति विज्ञान

    1. प्रदर्शन मापन के लिए क्लिप बॉक्स क्षेत्र सेट की एक XYZ ढेर रिकार्ड. इस ढेर oversample है कि सुनिश्चित करेंस्थानिक (पिक्सेल प्रति कम से कम 0.2 मीटर) इष्टतम छवि deconvolution सक्षम करने के लिए विकास और छवि गुणवत्ता और संकल्प को बढ़ाने के लिए.
    2. सेल आकारिकी का आकलन करने के लिए पूरे सेल की एक XYZ ढेर रिकार्ड.
    3. भागो deconvolution एल्गोरिथ्म.

Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, हम तीव्र माउस हिप्पोकैम्पस ऊतक स्लाइस की CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में सोडियम निर्भर फ्लोरोसेंट रंजक SBFI साथ सेलुलर सोडियम गतिशीलता की बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन. इसके अलावा, हम न्यूरो सक्रिय यौगिकों की लेजर स्कैनिंग आधारित uncaging (जैसे बंदी ग्लूटामेट) और सेलुलर सूक्ष्म डोमेन के लिए लक्षित कर अपने सटीक के साथ इस इमेजिंग तकनीक गठबंधन करने के लिए कैसे दिखा.

पैच विंदुक के माध्यम से SBFI साथ लोड हो रहा है न्यूरॉन्स ठीक डेन्ड्राइट और बहु फोटॉन उत्तेजना को रोजगार से सटे कांटा (चित्रा 6A, बी, डी और चित्रा 7A) सहित पूरे सेल के दृश्य सक्षम होना चाहिए.

चित्रा 6
चित्रा 6 सोडियम संकेतों और बंदी ग्लूटामेट की फ्लैश photolysis द्वारा प्रेरित synaptic धाराओं. (ए) मैक्सिमपैच पिपेट (पीपी) के माध्यम से SBFI के साथ भरी हुई एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन के अल प्रक्षेपण छवि. बॉक्स बी एल.पी. में बढ़े हुए दिखाया क्षेत्र बंदी ग्लूटामेट की स्थानीय छिड़काव के लिए पिपेट की स्थिति और अभिविन्यास इंगित करता है इंगित करता है. (बी) के आसन्न वृक्ष के समान spines के साथ एक डेन्ड्राइट के ऑप्टिकल वर्गों के ढेर की उच्च शक्ति अधिकतम प्रक्षेपण. ऑप्टिकल वर्गों के ढेर Z-संरेखण और deconvolution कराना पड़ा. रेड क्रॉस uncaging बीम का लक्ष्य क्षेत्र को इंगित करता है. नारंगी बिंदीदार रेखा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दर्ज किया गया था जिसमें से ब्याज के क्षेत्र रूपरेखा बनाती है. (पीला फ़्लैश द्वारा इंगित) बंदी ग्लूटामेट की फ्लैश photolysis द्वारा प्रेरित धारा (कम पंक्ति) आवक सोडियम संकेत (ऊपरी पंक्ति) और दैहिक: बॉक्स वाम डी (सी) में बढ़े हुए दिखाया क्षेत्र को इंगित करता है. लाल रेखा प्रयोगात्मक डेटा की एक फिट का प्रतिनिधित्व करता है. ग्रे क्षेत्र अवधि का प्रतिनिधित्व करता है जो uncaging फ्लैश (300 मेंबंदी ग्लूटामेट साथ पूर्व छिड़काव के बिना, एक ही यूवी फ़्लैश न तो SBFI उत्सर्जन में बदलाव, और न ही एक आवक वर्तमान पैदा (डी) वाम:. मिसे) सही SBFI प्रतिदीप्ति इमेजिंग बाधित. डेन्ड्राइट और बगल के उच्च शक्ति छवि बगल बी में चित्रित के रूप में, उल्टे ग्रे मूल्यों के साथ एक ही छवि कांटा. बिंदीदार रेखा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दर्ज की गई थी, जिसमें ब्याज के क्षेत्रों से संकेत मिलता है. रेड क्रॉस uncaging बीम का स्थानीयकरण इंगित करता है अधिकार:. बंदी ग्लूटामेट की यूवी फ़्लैश photolysis द्वारा प्रेरित सोडियम यात्रियों. ब्लू ट्रेस: ​​डेन्ड्राइट में सोडियम संकेत; लाल ट्रेस: ​​uncaging स्थल के निकट तीन कांटा से प्रतिक्रिया औसत; हरी ट्रेस: ​​तीन दूर कांटा से प्रतिक्रिया औसत. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें.

कैद के साथ स्थानीय छिड़काव के बादग्लूटामेट, एक डेन्ड्राइट के करीब एक यूवी फ़्लैश लागू करने intracellular सोडियम एकाग्रता (चित्रा 6C, डी और चित्रा 7B) में वृद्धि को दर्शाती है, SBFI की प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में एक क्षणिक कमी हुई. इसी समय, एक आवक वर्तमान सोमा (चित्रा 6C और चित्रा 7B) में दर्ज की गई थी. यूवी फ्लैश की अवधि बढ़ाने प्रणाली अच्छी तरह से अपनी गतिशील सीमा के भीतर और uncaging न ही सेलुलर न होने की प्रतिक्रियाओं संतृप्त किया गया था कि यह दर्शाता है कि दोनों धाराओं और सोडियम संकेतों (नहीं दिखाया डेटा) आवक हासिल की आयाम में वृद्धि हुई. बंदी ग्लूटामेट साथ पूर्व perfused नहीं किया गया था जो स्लाइस के समान या उससे अधिक समय की अवधि का एक यूवी फ्लैश के आवेदन, इन संकेतों ग्लूटामेट की uncaging (चित्रा 6C) के कारण होते हैं यह दर्शाता है कि SBFI प्रतिदीप्ति और न ही आवक धाराओं में परिवर्तन हासिल कभी नहीं. इसके अलावा, इन परिणामों imaging- और uncaging घटकों का कोई परस्पर निर्भरता यू मनाया जाता है पता चलता है किहमारे प्रयोगात्मक शर्तों nder. सोडियम संकेत भी वृक्ष के समान spines (चित्रा 6D) में पता लगाया जा सकता है. हम केवल ग्लूटामेट uncaging के साथ एक एकल रीढ़ की उत्तेजना को प्राप्त करने का प्रयास नहीं किया था, शिखर आयाम कांटा दूर आगे माता पिता डेन्ड्राइट (चित्रा 6D) के रूप में लगभग समान प्रतिदीप्ति परिवर्तन से पता चला है, जबकि uncaging स्थान के करीब कांटा में थोड़ा अधिक हो जाती थी.

अंत में, हम ग्लूटामेट की uncaging के जवाब में dendrites और कांटा में सोडियम बाढ़ के लिए मार्ग का अध्ययन किया. यह अंत करने के लिए, हम क्रमशः AMPA- और NMDA-उप प्रकार, सोडियम पारगम्य, ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए चयनात्मक ब्लॉकर्स हैं जो CNQX और APV, कार्यरत हैं. हमारे परिणाम ग्लूटामेट प्रेरित intracellular सोडियम संकेतों और हासिल दैहिक धाराओं इन ब्लॉकर्स (चित्रा 7B) की उपस्थिति में छोड़े गए थे कि दिखा. ब्लॉकर्स के धोने से बाहर होने पर, संकेत आ रहे हैं. यह था दर्शाताग्लूटामेट की टी uncaging intracellular सोडियम यात्रियों और आवक धाराओं में जिसके परिणामस्वरूप, dendrites और कांटा में सोडियम की आमद मध्यस्थता जो CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स, पर ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स सक्रिय.

चित्रा 7
पैदा सोडियम संकेतों और आवक धाराओं के 7 चित्रा भेषज प्रोफ़ाइल. सोमा के साथ संलग्न (ए) पैच पिपेट (पीपी) के साथ SBFI से भरे CA1 पिरामिड न्यूरॉन (बी) वाम:. सोडियम क्षणिक और एक डेन्ड्राइट में बंदी ग्लूटामेट की तस्वीर वाली सक्रियण द्वारा प्रेरित दैहिक वर्तमान और संलग्न कांटा केंद्र:. के साथ छिड़काव ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर ब्लॉकर्स CNQX और APV सोडियम संकेत और uncaging द्वारा प्रेरित आवक वर्तमान दोनों को रोकता अधिकार:. ब्लॉकर्स के धोने से बाहर होने पर, संकेत बहाल कर रहे हैं. लाल रेखा प्रतिनिधिप्रयोगात्मक डेटा की एक फिट टीएस. ग्रे क्षेत्र uncaging फ्लैश (300 मिसे) SBFI प्रतिदीप्ति इमेजिंग बाधित जिसमें अवधि का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान अध्ययन SBFI छोटे सेलुलर डिब्बों में intracellular सोडियम यात्रियों की दो photon इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि पता चलता है. यह SBFI की मात्रा दक्षता सोडियम एकाग्रता में जगह कम 15 और रिश्तेदार परिवर्तन शारीरिक गतिविधि के साथ काफी छोटे होते है, तथापि, कि ध्यान में रखा जाना है. इस प्रकार, ठीक प्रक्रियाओं में ना + यात्रियों के उच्च संकल्प माप एक अपेक्षाकृत कठिन काम है, और कई परीक्षणों के binning या औसत संतोषजनक संकेतों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, सोडियम यात्रियों के कैनेटीक्स विस्तारित समय अवधि के लिए रिकॉर्ड करने के लिए यह अनिवार्य बना, आश्चर्यजनक रूप से धीमी गति से कर रहे हैं. इस अवलोकन न्यूरोनल डेन्ड्राइट में और astrocytes में सोडियम यात्रियों की monoexponential क्षय कमरे के तापमान 1,2,6 पर 10 सेकंड की सीमा में बड़ी क्षय समय स्थिरांक की विशेषता थी जहां पहले के अध्ययनों में उन से मेल खाती है. सोडियम यात्रियों इस प्रकार एक बहुत धीमी समय सह लागू करने लगते हैंurse और कैल्शियम यात्रियों में 16 की तुलना में ज्यादा बड़ा क्षय समय स्थायी.

इन कमियों के अलग सेट, सोडियम इमेजिंग न्यूरोनल उप डोमेन के शारीरिक गुणों की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित होता है. उदाहरण के लिए, सोडियम इमेजिंग में या करीबी सक्रिय synapses को उत्तेजक synaptic गतिविधि पर नजर रखने के लिए सेवा कर सकते हैं. सोडियम अनिवार्य रूप से 8,17 बफर नहीं है, क्योंकि गतिविधि प्रेरित सोडियम यात्रियों रैखिक synaptic ग्लूटामेट रिहाई की एक विस्तृत श्रृंखला से संबंधित या exogenously ग्लूटामेट लागू कर रहे हैं. वे इसलिए न्यूरोनल glutamatergic गतिविधि के प्रत्यक्ष और निष्पक्ष संकेतक का प्रतिनिधित्व करते हैं. इसके अलावा, सोडियम सूचक रंजक उच्च कश्मीर डी '(SBFI कश्मीर डी 25 की सीमा मिमी 1 में है) दिखा रहे हैं. (- 1 मिमी आमतौर पर 0.5), उच्च कश्मीर डी के रंगों को खुद S के लिए buffers के रूप में कार्य नहीं है मतलब है कि यहां तक कि पर्याप्त चमक को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल अपेक्षाकृत उच्च intracellular डाई सांद्रता मेंघृणा. नतीजतन, वे कैल्शियम के प्रति संवेदनशील रंगों कोशिकाओं 18 में शुरू कर रहे हैं जब हमेशा एक चिंता का विषय है, जो सोडियम यात्रियों के आयाम और न ही समय पाठ्यक्रम बिगाड़ना नहीं है. यह इस प्रकार का पता चला संकेत intracellular सोडियम में "असली" परिवर्तन का एक अच्छा उपाय का प्रतिनिधित्व करते हैं कि माना जा सकता है. अपनी धीमी समय पाठ्यक्रम तो न्यूरॉन्स में सोडियम के लिए intracellular प्रसार के लिए वेग पहले 19 ग्रहण की तुलना में काफी छोटा होता है कि निकलता है.

कांटा और dendrites में उत्तेजक synaptic प्रसारण और सोडियम बाढ़ रास्ते के गुणों को संबोधित प्रयोगों के सफल क्रियान्वयन के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता पोस्टअन्तर्ग्रथनी संरचनाओं की एक तेजी से और अत्यधिक स्थानीयकृत सक्रियण के शामिल है. यह एक रीढ़ की प्रत्यक्ष आसपास या बंदी यौगिकों के फ्लैश photolysis द्वारा एक डेन्ड्राइट में ग्लूटामेट या ग्लूटामेट एगोनिस्ट की तेजी और स्थानीय आवेदन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. फ्लैश photolysis नहीं यंत्रवत् दामा करता हैजीई ऊतक, आंदोलन कलाकृतियों से मुक्त है और अच्छी तरह से संबंधित सवालों की जांच के लिए (जैसे स्थानीय कैल्शियम संकेतन) की स्थापना की है. uncaging मौके का व्यास XY विमान में 1.5 माइक्रोन था. Uncaging दोनों कांटा में एक काँटेदार डेन्ड्राइट प्रेरित सोडियम संकेतों के करीब है और माता पिता डेन्ड्राइट. संकेत uncaging हाजिर करने के लिए करीब कांटा में सबसे बड़ा होने की प्रवृत्ति जबकि, माता पिता डेन्ड्राइट में आयाम और कांटा आगे भी दूर uncaging स्थान के प्रत्यक्ष आसपास के क्षेत्र में उन लोगों के लिए नहीं बल्कि इसी तरह के थे. Uncaging आवक धाराओं आयाम में वृद्धि हुई जिसके दौरान 300 मिसे के लिए प्रदर्शन किया था. Uncaged ग्लूटामेट आगे दूर uncaging मौके से वृक्ष के समान क्षेत्रों और कांटा पर ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और सोडियम बाढ़ को सक्रिय करने, एक ही समय अवधि के दौरान ऊतकों में दूर तक फैला हुआ है हो सकता है.

सेल स्नान समाधान के माध्यम से प्रशासित बंदी यौगिकों के photolysis के लिए एक यूवी लेजर का उपयोग तब होती है जब एक आंतरिक समस्या'आंतरिक छानने' है. क्योंकि पिंजरे के उच्च अवशोषण की दर से, पराबैंगनी प्रकाश उत्तेजना साइट 20,21 करने के उद्देश्य से जिस तरह से साथ दृढ़ता से तनु है. इस से बचने के लिए एक व्यवहार्य तरीका ही इसके अलावा कम से कम करने के लिए जरूरी बंदी यौगिक की मात्रा कम हो जाती है जो उत्तेजना साइट के लिए प्रतिबंधित है कि पिंजरे के साथ स्थानीय छिड़काव है. यूवी लेजर स्कैनिंग की मध्यस्थता uncaging, पास बुनियादी लाल दो फोटोन की तुलना में uncaging 22 उत्तेजना की सटीकता Z-अक्ष में वृद्धि हुई है, जिसका मुख्य कारण स्थानिक अधिक सटीक है. दूसरी ओर, कारण, दो photon उत्तेजना के साथ कार्यरत एक उच्च बंदी परिसर की एकाग्रता या बहुत अधिक है, या तो संभावित phototoxic प्रकाश तीव्रता आवश्यक हैं के रूप में लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया पिंजरों के छोटे पार अनुभाग के लिए. इसके अलावा, दो photon uncaging उपकरण में एक बहुत अधिक निवेश जरूरी है; दूसरों के बीच में, एक अतिरिक्त आईआर लेजर प्लस आवश्यक ऑप्टिकल घटकों की जरूरत है,.

SBFI और MNI-ग्लूटामेट दोनों समान तरंगदैर्ध्य रेंज में उत्तेजनीय हैं. इस uncaging फ्लैश और / या आईआर किरण द्वारा ग्लूटामेट की एक सतत uncaging द्वारा SBFI की विरंजन, जिसके परिणामस्वरूप पराबैंगनी uncaging लेजर और SBFI या आईआर इमेजिंग लेजर और MNI-ग्लूटामेट की एक अनपेक्षित परस्पर निर्भरता को जन्म दे सकती है. चित्रा 6C में दिखाया गया है हालांकि, न तो खुद और न ही बहु फोटॉन इमेजिंग द्वारा एक यूवी फ्लैश हमारे प्रयोगात्मक शर्तों के तहत इस तरह के पारस्परिक प्रभाव के कारण होता है.

यहाँ वर्णित एक के समान यूवी फ़्लैश प्रणाली कई अन्य प्रयोगशालाओं में नियमित तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं और अपेक्षाकृत आसानी से किसी भी मौजूदा बहु फोटॉन इमेजिंग माइक्रोस्कोप में शामिल किया जा सकता है. यह photolysis के लिए लेजर बीम को देखने के क्षेत्र में स्वतंत्र रूप से तैनात किया जा सकता है कि लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, प्रणाली एक प्रयोग के दौरान देखने के क्षेत्र में क्रमश: लेजर बीम की एक तेजी से और स्वचालित repositioning और रिहाई मात्रा, सक्षम बनाता है. कहांआर संशोधन को सरल और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के तख्ते congruently इमेजिंग और uncaging फ्रेम को समायोजित करने की सेवा कर सकते हैं, ताकि uncaging स्थान की सटीक स्थिति में सुधार.

साथ में ले ली, ग्लूटामेट की यूवी प्रकाश प्रेरित uncaging के लिए एक संशोधित प्रक्रिया के साथ संयुक्त डेन्ड्राइट और केंद्रीय न्यूरॉन्स का कांटा में पूरे सेल पैच दबाना और बहु ​​फोटॉन सोडियम इमेजिंग,, ऊतक में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की विश्वसनीय और फोकल सक्रियण की अनुमति देता है. यह इस प्रकार बरकरार ऊतक में न्यूरॉन्स में उत्तेजक synaptic प्रसारण की और पोस्टअन्तर्ग्रथनी सोडियम संकेतों के गुणों का विश्लेषण करने के लिए सेवा कर सकते हैं.

Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा. लेखकों वीडियो लेख में इस्तेमाल एक साधन है जो उत्पादन Rapp Optoelectronic (Wedel, जर्मनी), द्वारा ओपन एक्सेस प्रकाशन सक्रिय करने के लिए वित्तीय सहायता प्राप्त किया. कंपनी प्रयोगों में और न ही डेटा को संभालने में और न ही पांडुलिपि लेखन में शामिल न होने की थी.

Acknowledgments

इस अध्ययन के लेखकों एस Durry और सी Roderigo विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए, और एम Dübbert (इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोगशाला, प्राणी संस्थान का शुक्रिया अदा करना चाहते सीआरआर को जर्मन विज्ञान फाउंडेशन (DFG, Ro2327 / 6-1) का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Pockels सेल नियंत्रक और HF स्विच को लागू करने में मदद के लिए कोलोन विश्वविद्यालय, जर्मनी).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Borosilicate-glass capillaries Hilgenberg 1405059 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera Jenoptik ProgRes MF IR-DIC compatible camera
Deconvolution software SVI Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer Ocean Optics USB 4000 Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes VWR cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software Olympus Europe Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller Custom built Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser SpectraPhysics Mai-Tai fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor Custom built
Micromanipulator Burleigh PCS 5000
Microscope/Imaging System Olympus Europe BX51WI/FV300 Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel Newport 50Q04AV.2 UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective Nikon Instruments Europe NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier HEKA EPC-10
Pipette puller Narishige Model PP-830
Pneumatic drug ejection system NPI Electronic PDES-DXH
Pockels cell Conoptics 350-80 LA-BK EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver Conoptics M302-RM High voltage differential amplifier
Shutter Vincent Associates LS6ZM2 ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller Custom built
Shutter driver Vincent Associates Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome Thermo Scientific Microm HM 650 V
Uncaging software Rapp OptoElectronic UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser Rapp OptoElectronic DL-355/10 cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system Rapp OptoElectronic UGA 40 Galvanometric scanning system
Name of Compound Company Catalog Number Comments/
Description
CNQX Sigma Aldrich C-127 AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5 Alfa Aesar J64210 NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt Teflabs OO32
TTX Ascent Scientific Asc-055 Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate Torcis 1490 Caged glutamate released upon UV absobtion

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References

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मल्टी फोटॉन Intracellular सोडियम इमेजिंग CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट की यूवी की मध्यस्थता फोकल uncaging के साथ संयुक्त
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Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. J. Vis. Exp. (92), e52038, doi:10.3791/52038 (2014).More

Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. J. Vis. Exp. (92), e52038, doi:10.3791/52038 (2014).

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