Summary
Vi beskriver kombinationen af brændvidde UV-induceret foto-aktivering af neuro-aktive forbindelser med hel-celle patch-clamp og multi-foton billeddannelse af intracellulære natrium transienter i dendritter og pigge af hippocampusneuroner i akutte vævssnit med musen hjernen.
Abstract
Multi-foton fluorescens mikroskopi har gjort det muligt at analysere morfologiske og fysiologiske parametre for hjerneceller i ubeskadiget væv med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Kombineret med elektrofysiologi, er det almindeligt brugt til at studere aktivitetsrelaterede calcium-signaler i små subcellulære rum såsom dendritter og dendritiske pigge. Ud over calcium transienter, synaptisk aktivitet inducerer også postsynaptiske natrium signaler, hvis egenskaber som kun er marginalt forstået. Her beskriver vi en metode til kombineret hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium billeddannelse i cellulære mikro domæner af centrale neuroner. Endvidere introduceres en modificeret procedure for ultraviolet (UV)-lys-induceret uncaging af glutamat, som giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet. Til dette formål blev helcelle-optagelser udført på Cornu Ammonis underafsnit 1 (CA1) pyramidale neuroner i akutte vævssnit afmusehippocampus. Neuroner blev fyldt med natrium-fluorescensfarvestof SBFI gennem patch-pipette og multi-foton excitation af SBFI aktiveret visualisering af dendritter og tilstødende pigge. At etablere UV-induceret fokal uncaging blev adskillige parametre, herunder lysintensitet, volumen påvirkes af UV uncaging stråle, anbringelse af strålen samt koncentrationen af den bur forbindelsen testet og optimeret. Vores resultater viser, at den lokale perfusion med bur glutamat (MNI-glutamat) og dens brændvidde UV-uncaging resultat i indadgående strømme og natrium transienter i dendritter og pigge. Tidsforløb og amplituden af både aktiv strømme og natrium signaler korrelerer med varigheden af uncaging puls. Vores resultater viser endvidere, at intracellulære natrium signaler er blokeret i nærvær af blokkere til ionotropiske glutamatreceptorer, viser, at de er medieret af natrium tilstrømning selvom denne vej. Sammenfattende vores metode giver et pålideligt værktøj tilundersøgelse af intracellulære natrium signaler induceret af fokal receptoraktivering i intakt hjernevæv.
Introduction
Seneste forbedringer i lysmikroskopiske teknikker såsom multi-foton mikroskopi har gjort det muligt at studere morfologiske og fysiologiske parametre for hjerneceller i ubeskadiget væv med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Kombineret med elektrofysiologi, er disse teknikker nu i vid udstrækning anvendes til at analysere aktivitetsafhængige elektriske signaler på neuroner samt ledsagende calcium-signaler i små subcellulære rum, nemlig i fine dendritter og dendritiske pigge. Ud over calcium transienter, synaptisk aktivitet inducerer også natrium signaler i dendritter og pigge, hvis egenskaber er stort set uudforsket. Sådanne signaler kan analyseres ved to-foton billeddannelse af intracellulære natrium ([Na +] i), som gør det muligt on-line måling af [Na +] i transienter i længere perioder uden væsentlig farvestof blegning eller foto-skade 1,2.
Til billeddannelse af [Na +] i fx corona Grøn eller Asante Natrium Green 3,4. Den mest almindeligt anvendte fluorescerende probe til Na + billeddannelse er natrium-bindende benzofuran isophthalat (SBFI). Det er en ratiometrisk, UV-ophidset farvestof ligner den velkendte calcium-sensitive farvestof fura-2 og har været ansat til konventionel Na + billeddannelse i mange celletyper (fx 5,6). Der er forskellige muligheder for spændende farvestoffet og indsamle dets fluorescens. Hvis høj tidsmæssig opløsning (dvs. en høj billeddannelse frame rate) er påkrævet i kombination med geografisk information, kan SBFI være ophidset med en xenon bue lampe eller en høj effekt lys-dioder (LED) enhed og dens emission detekteres med en høj hastighed afgift -coupled enhed (CCD) kamera 7,8. For at opnå maksimal rumlig opløsning dybt i vævet, multi-foton laser scanning mikroskopi er den foretrukne metode 9. Den relativt lave kvante efficieNCY af SBFI kræver relativt høje farvestofkoncentrationer (0,5 - 2 mm), og direkte belastning af membran-uigennemtrængelige form af SBFI via en skarp mikroelektrode 10 eller patch pipette 1.
Brug SBFI, tidligere arbejde udført i akutte vævssnit af gnaver hippocampus demonstrerede aktivitetsrelaterede natrium transienter i dendritter og pigge af CA1 pyramideneuroner som hovedsageligt forårsaget af tilstrømningen af natrium gennem ionotropiske NMDA-receptorer 1,2. Til undersøgelse af egenskaberne af sådanne lokale natrium signaler i mere detaljeret, specifik aktivering af postsynaptiske receptorer ved anvendelse af receptoragonister er en velegnet metode til valg. At efterligne præsynaptiske aktivitet og transmitterfrigivelse må anvendelse være relativt kortfattet og fokuseret på at muliggøre lokal stimulation. Dette viser sig dog at være ganske udfordrende i ubeskadiget væv. Lokalt pres anvendelse af receptoragonister hjælp af en spids pipette gør meget omdrejningspunkt apdelsen, men er vært den potentielle risiko for at producere bevægelse af strukturen af interesse (f.eks såsom en dendritceller eller dendritiske spidser), og hindrer således høj opløsning billeddannelse. Egnethed iontoforese af neuro-aktive stoffer afhænger af deres elektriske egenskaber og høje aktuelle amplituder kan producere cellulære artefakter så godt.
En måde at omgå disse hindringer er ansættelse af foto-aktiverede forbindelser og deres flash-fotolyse. Dybest set, er to forskellige principper, der anvendes til foto-aktivering af bur stoffer: I) Wide-field flash fotolyse 11 og II) brændvidde uncaging anvender scanning moduler i kombination med lasere 12. Mens bredt felt flash fotolyse anvendes til at aktivere større regioner af interesse, fx en hel celle, omdrejningspunkt uncaging ansat til specifikt at stimulere små cellulære rum. I den foreliggende undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til helcelle-patch-clamp og mulHoton natrium billeddannelse i dendritter og udløberne af centrale neuroner, kombineret med en modificeret procedure UV-lysinduceret uncaging af glutamat, som giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland, såvel som Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv (86/609 / EØF). Alle forsøg blev meddelt til og godkendt af Animal Welfare Office på Animal Care og brug facilitet i Heinrich Heine University Düsseldorf, Tyskland (institutionel handling nummer: ø52 / 05). I overensstemmelse med den tyske dyreværnsloven (Tierschutzgesetz, artikel 4 og 7), var det ikke nødvendigt formelt yderligere godkendelse til obduktion fjernelse af hjernevæv.
Til generering af akutte skiver blev mus bedøvet med CO 2 og hurtigt halshugget (efter henstilling fra Europa-Kommissionen offentliggjorde i: Aflivning af forsøgsdyr, Luxembourg: Kontoret for Officielle Publikationer De Europæiske Fællesskaber, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).
1. Fremstilling afLøsninger
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for dissektion, der indeholder (i mM): 125 NaCI, 2,5 KCI, 0,5 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO4 26. NaHCO3 og 20 glucose, gennemboblet med 95% O2 og 5% CO 2, hvilket resulterer i en pH-værdi på 7,4.
- Forbered ACSF til eksperimenter, der indeholder (i mM): 125 NaCI, 2,5 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO4 26. NaHCO3 og 20 glucose, gennemboblet med 95% O2 og 5% CO2, hvilket resulterer i et pH på 7,4.
- Forbered intracellulære opløsning (ICS) indeholdende (i mM): 150 KMeSO 3, 12,5 hydroxy ethylpiperazin ethansulfonsyre (HEPES), 40 KCI, 5 NaCl, 1,25 ethylenglycol tetraeddikesyre (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na- GTP. PH justeres til 7,3. Opbevar portioner på 1 ml ved -20 ° C.
- Natrium-bindende benzofuran- isophthalat (SBFI) -Salt Fortynd i dobbelt-destilleret vand og forberede portioner på 5 mikroliteraf en 10 mM stamopløsning.
- Optø ICS og tilføj SBFI stamopløsning til en slutkoncentration på 1 mM. Vortex og mikro-filtratet (0,22 um). Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse i eksperimentet. Må ikke nedfryses igen og kun bruge én dag.
- Forbered MNI glutamat stamopløsning på 50 mM ved at opløse forbindelsen i dobbelt-destilleret vand. MNI glutamat stamopløsning til en endelig koncentration på 5 mM i normal ACSF fortyndes. Opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse i eksperimentet. Må ikke nedfryses igen og kun bruge én dag. Store portioner, der ikke umiddelbart anvendes i forsøget, ved -20 ° C.
2. Dissektion af Tissue
BEMÆRK: forberedelse af akutte hippocampusskiver af gnaverhjerne blev beskrevet i detaljer tidligere 13,14. I korte træk blev følgende protokol anvendt i den foreliggende undersøgelse.
- Efter halshugning hurtigt fjerne hjernen fra kraniet.
- Umiddelbart placere hjernen i en petriskålmed iskold dissektion ACSF og dissekere en halvkugle ved at udføre en sagittal snit langs midterlinien.
- Udfør en anden nedskæring i den ønskede orientering som et blokerende overflade og vedhæfte denne til opskæring fase af et vibratome med superlim.
- Tag skære kammeret og køleelement (begge holdt ved -20 ° C) i vibratome ud af fryseren og sted skære scenen med hjerne sektion i kammeret. Derefter sætte køleelement i kammeret og dykke væv i iskold dissektion ACSF. For at stabilisere præparatet, kan man ønsker at imødegå vævsblok med agargel.
- Skær 250 um tykke, parasagittal skiver af hippocampus med vibratom. Sørg for, at alle ACS væsker boblede på alle tidspunkter.
- Efter udskæring, holde væv på en maske i et bæger med den normale ACSF og inkuberes ved 34 ° C i 30 min. Derefter holde ved stuetemperatur.
3. Fremstilling af hardware
Figur 1. Skema som viser lys stier og eksperimentel styring af riggen bestående af multi-foton billedbehandling, laser-scanning UV flash fotolyse, og elektrofysiologi. Den multi-foton stråle (rød) er produceret af en pulserende, indstillelig infrarød (IR) laser (Tisa). Den passerer en mekanisk lukker, en Pockets 'celle, og IR-detektor (detektion af stråle intensitet), som alle gør det muligt kontrol af laseren magt og dets administration varighed. Flip-in / flip-ud valgfri laserdiode er ansat til grundlæggende tilpasning af laserstrålen. Strålen expander kan anvendes i kombination med målene med en meget bred back-brændplanet. Den fjernstyret ND filter hjul kan anvendes som supplement til eller i stedet for Pockets 'celle at kontrollere laserstråle magt. Efter at have passeret scanningen hovedet, er den pulserede IR-lys guidet til modellen. Udsenderted fluorescens lys (lys grøn) opsamles enten af eksterne eller interne Fotomultiplikatorrør detektorer (PTM'er). De eksterne detektorer er fuldt synkroniseret med de interne PMT'er via en højfrekvent kontakt (PMT-controller). Den uncaging stråle (lyseblå) er produceret af en UV solid-state laser (DPSS UV-laser). Det er derefter rettet mod galvo-drevne scanning enhed øverst bagsiden af epi-fluorescens svaler med en lysleder. Den præcise positionering (kromatisk aberration mellem billedbehandling og uncaging stråle) i uncaging stedet eller område er aktiveret af billedet eksport fra imaging software. Timingen ledelse til synkronisering af billedbehandling, elektrofysiologi, og flash fotolyse er elektronisk styret. Den gennemlysning detektor (TL-PMT) har behov for dokumentation af positioneringen af pipetter i vævet. Styreenhederne og software af billeddannende system, der er blevet modificeret, anvendes til at styre og synkronisere alle andre enhedernødvendig for at drive systemet. Systemkomponenter mærket som "custom" er designet og bygge / tilpasset af forfatterne. Nogle komponenter blev tilpasset til at opfylde kravene i den brugerdefinerede-build multi-foton-system og er mærket som "modificeret". Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tænd komponenter af multi-foton-system. Test og juster infrarød laserstråle tilpasning.
- Kontrol stråle positionering ved at vende i den centrerende prisme i stedet for et mål. Hvis strålen er forvredet, re-justere det ved spejle i periskopet. Bemærk, at den centrerende plan prismet skal være på samme niveau som bagsiden brændplan mål, mens billeddannelse.
- Tænd for spektrometer og kontrollere for de multi-foton karakteristika strålen.
- Indstil parametre af imaging software til følgende værdier: Vælgen ramme på 512 x 512 pixels for oversigtsbilleder af cellen (mindre klip bokse med en zoom-faktor på 2,5 for høj frame rate og høj rumlig opløsning, henholdsvis). Indstil billedbehandling hastighed til hurtig mode og scanning til XYT. Z-stepping bør være 1 um til oversigt stakke og 0,2 um for detaljerede stakke til at matche rumlige krav til deconvolution udført senere prøvetagning.
- Juster multi-foton laserstråle (790 nm) intensitet ved at ændre indstillingerne for Pockets »cell (endelig magt under målet: ≈ 14-16 pW), og foto-multiplikatorer (PTM'er).
- Tænd og kalibrere uncaging system, ved at placere en fluorescerende prøve dias under objektivet.
- Brug af kikkert, justere fokus af UV optik og rumligt begrænse UV laserpunkt til en størrelse på 2 um i diameter ved maksimum ved at anvende fokusering enheden ved UGA scanning hoved.
- Start kalibrering rutine i uncaging enhed kontrol Software.
- Indstil UV-laser til flere punkter inden for dens scanning rækkevidde, mens fluorescens registreres med et CCD-kamera. Ved at klikke på UV laserpunkt ved hvert punkt, justere placeringen af de galvaniske scanning spejle til at svare til et bestemt koordinatsystem i softwaren.
Figur 2. Detaljeret skema, der illustrerer de særlige kendetegn ved excitation, emission og uncaging strålebaner. IR exciteringsstrålen (rød) passerer strålen kombinerer dichroiske spejl på det niveau til filer kanontårn i epi-fluorescens kondensator af mikroskopet og det mål, der nå prøven. Den uncaging stråle (blå) er leveret via en kvarts optisk lys fiber til kollimation og stråle fokus enhed og efterfølgende ledes til scanning kmrrors i scanning enhed, passerer en dikroisk spejl til strålen kombinerer dichroiske spejl. Her kombineres med excitation skanderingsstrålen. Det udsendte lys fra prøven følger banen for excitation skanderingsstrålen vej i den modsatte retning mod billeddannelse scanning hovedet. Kameraet anvendes til visuel kontrol af patch-pipetten og positionering af uncaging bjælke i kombination med konfokal laser scanning mikroskop (ikke vist). Det grønne lys sti betegner en eventuel epi-fluorescens-belysning, der kan være brug med andre applikationer.
- Brug blitzen fotolyse system i stedet tilstand for at få fokale applikationer. Sørg for, at den centrale justering af uncaging stråle (gennemsnitlig effekt under målet: 0,55 mW) resulterer i et spot størrelse på 1,5 um i diameter (xy udvidelse) som afsløret på en fluorescerende dias placeret i en z-niveau, der svarer til den for et vævskive (ikke vist).
- Den nøjagtige placering af uncaging stedet opnås ved import af et billede af den billeddannende system via en netværksforbindelse mellem uncaging- og billedbehandling-computere.
- Ved hjælp af en skærm grabber software løbende oplæste for rammerne af det imaging software (i stedet for kameraets foder) og juster billedbehandling og uncaging rammer coach. Eksporter hver 10. ramme fra imaging software som reference billede i flashen for at sikre korrekt justering under hele forsøget.
Figur 3. Justering af uncaging plet: For præcist at placere uncaging stedet, et skærmbillede af imaging software (gul ramme) indføres i uncaging software (grøn ramme). Denvenstre billede i den gule ramme repræsenterer en Hi-Lo kodet billede (blå: sorte pixels, rød: mættede pixel) af hele CA1 pyramideformede celle. Billedet er overlejret af kalibreringen gitter uncaging software (grøn "X" s). Til højre er en forstørret del af cellen vises med overlejret uncaging plet (rødt kryds). Den gule plet er den automatisk overlejret billede af uncaging stråle. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Tænd mikromanipulatorer, elektrofysiologi komponenter og trykpåføringsanordning for levering af bur forbindelsen til målområdet.
- Installer et samlingspunkt trykpåføringsanordningen til lokal perfusion af bur forbindelser. Dette vil reducere omkostningerne enormt sammenlignet med bad perfusion af disse stoffer. Juster holde trykket til den givne atmosfærisk tryk for at forhindre en træk ACSF ind i eller en lækage af bur stoffer fra ansøgningen pipette.
BEMÆRK: trykpåføringsanordningen vært for en meget præcis og ultrahurtig mikro-ventil i pipetteholder. Dette gør det muligt at ansætte minimale påsætningstryk og derfor reducerer bevægelse artefakter til et minimum i den lokale perfusion med det bur forbindelse. - Træk pipetter til hel-celle patch-clamp og lokal perfusion ved hjælp af brand-poleret borosilikatglas kapillærer. Pipetter bør have en spids diameter på ~ 1 um og en modstand på R ≈ 3 MOhm (værdier bestemt med K-Meso 3 -baseret ICS).
- Placer skive i den eksperimentelle bad og anbringer det med et gitter (platin ramme 250 um tyk, kalibreres med kirurgiske filamenter, od 40 um) (figur 4A, B). Brug en omvendt, tip-brudt, og brand-poleret Pasteurpipette (sugning bold ved siden af den brudte spids) for skive overførsel. Undgå at bøje og enhver anden barske håndtering af udsnittet.
- Placer bad på mikroskopbordet og permanent perfundere skive med ACSF.
- Indlæs patch pipette med ICS indeholder SBFI og indlæse den lokale perfusion pipette med bur forbindelse. Vedhæft pipetter til tilsvarende mikromanipulatorer. Placer referenceelektrode i bad. Sørg for at du har jordforbindelse permanent at undgå skader på hovedet etape (jf figur 4C).
- Sænk begge pipetter i bad og placere dem over hippocampus CA1 regionen. Påfør let tryk patch pipette (+40 mbar) for at undgå en udvanding af ICS med ACSF.
- Kompensere for offset potentiale patch-pipetten ved hjælp elektrofysiologi softwaren.
- Nærme sig en CA1 pyramideformet celle med patch pipette anvender IR-DIC video mikroskopi. Anvend mild sugning indtil en Giga-tætning opnås. Vælg en celle soma, som ligger 30 -70 um under overfladen af den del at sikre intakt celle morfologi på den ene side, og lav spredning og dæmpning af uncaging stråle på den anden side.
- Kompensere for hurtig kapacitet. Break membrane og åbne celler for at opnå helcelle-konfiguration.
- Kompensere for langsom kapacitet og serie modstand.
- Lad cellen skal dialyseres med SBFI-ICS i mindst 30 minutter, før du starter de billeddannende eksperimenter.
- Tilføj tetrodotoxin (TTX, 500 nM) til ACSF at forhindre aktivering af spændingsafhængige natriumkanaler og generering af action potentialer.
- Visualiser cellulær morfologi ved hjælp af multi-foton excitation og deraf SBFI fluorescens og vælge en tornet dendritceller til eksperimentet. Zoom ind for billeder med en højere opløsning og placere et klip boks omkring dendritceller.
- Fyld en standard patch-pipette med 10 pi ACSF indeholdende bur glutamat. Slut pipetten til presset ansøgningssystem og fastgøre den til mikromanipulator.
- Placer pipette med bur forbindelse nær dendritceller (~ 30 um). Anbring pipetten at tilladeeffektiv lokal perfusion af dendritceller valg. Juster uncaging laser: placere uncaging stedet tæt (~ 1 - 2 um) til strukturen af interesse.
- Sæt regioner af interesse på den valgte dendritceller og tilstødende pigge ved hjælp af imaging software.
- Approach regionen af interesse og fokalt injicere bur forbindelse til flere sekunder med lavt tryk (<3 PSI). Start patch clamp og fluorescens optagelser (ved 790 nm multi-foton excitation) via triggersignal.
BEMÆRK: I løbet af lokal perfusion af bur forbindelsen er exciteringsstrålen helt dæmpes for at forhindre blegning. - Stop den lokale perfusion af bur forbindelse. Øge intensiteten af den to-foton laser til at muliggøre en effektiv excitation af SBFI og anvende en UV flash at initialisere uncaging (uncaging varighed 300 ms).
- Overvåge ændringer i SBFI fluorescens. Stop optagelsen efter SBFI fluorescens har genvundet tilbage til baseline.
- For at teste inddragelse af ionotropiske glutamatreceptorer i dannelsen af de strømninger og / eller natrium-signaler fremkaldt af UV-flash-fotolyse af bur glutamat, ansætte antagonister.
- Skift til ACSF indeholdende AMPA-receptorblokker cyano-nitroquinoxalin-dion (CNQX, 10 uM), og NMDA-receptor-blokker amino-phosphonopentanoate (APV, 50 uM) i tillæg til TTX (se ovenfor) og perfundere skive for mindst 10 min.
- Gentag stimulering procedure (se 5.4 og 5.5.)
- Reversibilitet af inhibitorer 'effekter
- Skift tilbage til normal ACSF kun indeholder TTX.
- Perfundere skive i 20 min.
- Gentag stimulering procedure (se 5.4 og 5.5.).
- Optag en XYZ-stak af klippet box-region sæt for de udførte målinger. Sørg for, at denne stak er oversampled rumligt (mindst 0,2 um per pixel) for at muliggøre optimal billedkvalitet dekonvolution og øge billedkvalitet og opløsning.
- Optag en XYZ-stak af hele cellen til at vurdere celle morfologi.
- Kør dekonvolution algoritme.
Figur 4. Komponenter i den eksperimentelle bad og positionering af badet på mikroskopbordet. (A) Den eksperimentelle bad består af badkammeret selv (blå firkant), som er omgivet af en magnetisk metalring. Slangen sikrer kontinuerlig perfusion af badet med saltvand (ACSF). Gitteret at holde nede og løse skive er sat ind i badet kammeret. (B) Akut forberedelse skive placeret inden badet kammeret. Skiven er fastgjort ved trådene i gitteret. (C) Positionering og geometri af den eksperimentelle bad på mikroskopbordet under forsøgene.
4. Hele-celle Patch-fastspænding
5. Multi-foton billedbehandling og stimulering
Figur 5. forsøgsprotokol. Sådan initialiserer et eksperiment, et triggerimpuls (angivet med rødt skilt (ᴨ), og den røde linje) er indstillet til samtidig starte imaging (blå), elektrofysiologi (grøn) og administration af bur forbindelse (gul) på tidspunkt 0 sek. Under denne første periode bør imagografistrålen være helt dæmpes (lyseblå). Efter 4,5 sekunder (stiplet linie), er den lokale perfusion af bur forbindelsen afbrudt, og imagografistrålen bør indstilles til dets workonge til dataopsamling (blå) intensitet. 1,5 sek bagefter (tidspunkt 6 sek), en anden triggerimpuls er givet (angivet med rødt skilt (ᴨ) og den røde linje), som initialiserer UV-flash-enhed (varighed af flash: 300 ms; angivet af den gule blitz ) og fastsætter markører i elektrofysiologi og imaging-protokollen.
6. Farmakologi
7. Morfologi
Representative Results
I den foreliggende undersøgelse viser vi en fremgangsmåde til multi-foton mikroskopi af cellulære natrium dynamik med natrium-afhængige fluorescerende farvestof SBFI i CA1-pyramidale neuroner i akut mus hippocampale vævssnit. Desuden viser vi hvordan man kan kombinere denne billeddannelse teknik med laser-scanning-baserede uncaging af neuro-aktive forbindelser (f.eks bur glutamat), og dets præcise målretning til cellulære mikro-domæner.
Henter neuroner med SBFI gennem patch-pipetten aktiveret visualisering af hele cellen, herunder fine dendritter og tilstødende pigge ved at ansætte flere fotonexcitation (figur 6A, B, D og figur 7A).
Figur 6. Natrium signaler og synaptiske strømme induceret ved flash-fotolyse af bur glutamat. (A) Maximal projektion billede af en CA1 pyramideformede neuron fyldt med SBFI via patch-pipetten (PP). Boksen viser området vist forstørret i B. LP angiver positionen og orienteringen af pipetten for lokal perfusion af bur glutamat. (B) Høj effekt maksimal projektion af en stak af optiske sektioner af en dendritceller med tilstødende dendritiske pigge. Stakke af optiske sektioner undergik z-tilpasning og dekonvolution. Den røde kryds angiver målområdet af uncaging stråle. Den orange stiplede linje afgrænser området af interesse, hvorfra fluorescensemission blev registreret. Boksen viser området vist forstørret i D. (C) Venstre: Natrium signal (øverste række) og somatisk indad strøm (nederste række) fremkaldt ved flash fotolyse af bur glutamat (angivet med gult blink). Den røde linje repræsenterer et anfald af de eksperimentelle data. Det grå område repræsenterer den periode, hvor den uncaging blitz (300ms) hindret billeddannelse af SBFI fluorescens højre:. Uden præ-perfusion med bur glutamat, den samme UV-blitz hverken fremkaldte en ændring i SBFI emission, og heller ikke en indadgående strøm (D) Venstre:. høj effekt billede af dendritceller og tilstødende pigge som afgrænset i B. Sideløbende, det samme billede med omvendt grå værdier. De stiplede linier angiver områder af interesse, hvor fluorescensemissionen blev registreret. Den røde kryds angiver lokaliseringen af uncaging stråle højre:. Sodium transienter induceret af UV-flash-fotolyse af bur glutamat. Blå spor: natrium signaler i dendritceller; rød spor: gennemsnit af responsen fra tre pigge støder op til uncaging stedet; grøn spor: gennemsnit af responsen fra tre fjerne pigge. Klik her for en større version af dette tal.
Efter lokal perfusion med burglutamat, anvendelse af en UV-blitz tæt på en dendritceller resulterede i et forbigående fald i fluorescensemission af SBFI, afspejler en stigning i den intracellulære natriumkoncentration (figur 6C, D og figur 7B). Samtidig blev en indadgående strøm registreres soma (Figur 6C og figur 7B). Øge varigheden af UV-flash medført stigende amplituder af både den fremkaldte indad strømme og natrium-signaler (data ikke vist), hvilket indikerer, at systemet var godt inden for sin dynamiske område, og at hverken uncaging eller cellulære reaktioner blev mættet. Anvendelse af en UV-blitz identisk eller længere varighed til skiver, som ikke havde været præ-perfunderet med bur glutamat, aldrig fremkaldte ændringer i SBFI fluorescens eller indadgående strømme, hvilket indikerer, at disse signaler på grund af uncaging af glutamat (figur 6C). Desuden viser disse resultater, at der ikke indbyrdes afhængighed imaging- og uncaging komponenter observeres under vores eksperimentelle betingelser. Natrium signaler kan også påvises i dendritiske spidser (figur 6D). Mens vi ikke har forsøgt at opnå stimulering af en enkelt rygrad kun med glutamat uncaging, spidsamplituder tendens til at være lidt højere i pigge tæt på uncaging stedet, mens pigge længere væk udviste næsten identiske fluorescensændringer som forælder dendritceller (6D).
Endelig undersøgte vi vejen for natrium indstrømning i dendritter og pigge i respons på uncaging af glutamat. Til dette formål anvendte vi CNQX og APV, der er selektive blokkere for de natrium-gennemtrængelige, ionotrope glutamatreceptorer af AMPA- og NMDA-undertypen hhv. Vores resultater viser, at glutamat-induceret intracellulær natrium signaler og de udløste somatiske strømninger var udeladt i tilstedeværelsen af disse blokkere (figur 7b). Ved udvaskning af de blokkere signalerne genvindes. Dette viser THAt uncaging af glutamat aktiverer ionotropiske glutamatreceptorer på CA1 pyramideformede neuroner, der medierer tilstrømningen af natrium i dendritter og pigge, hvilket resulterer i intracellulære natrium transienter og indadgående strømme.
Figur 7. farmakologiske profil af fremkaldte natrium signaler og indadgående strømme. (A) SBFI fyldt CA1 pyramideformet neuron med patch pipette (PP) er fastgjort til soma (B) Venstre:. Natrium forbigående og somatisk strøm induceret af foto-aktivering af bur glutamat i en dendritceller og vedhæftede pigge Center:. Perfusion med ionotrope glutamat-antagonister CNQX og APV hæmmer både natrium signal og indadgående strøm induceret af uncaging Højre:. Efter udvaskning af blokkere signalerne gendannet. Den røde linje repræsents et anfald af de eksperimentelle data. Det grå område repræsenterer den periode, hvor den uncaging blitz (300 ms) hindret billeddannelse af SBFI fluorescens. Klik her for en større version af dette tal.
Discussion
Den foreliggende undersøgelse viser, at SBFI er velegnet til to-foton-billeddannelse af intracellulære natrium transienter i små cellulære rum. Det skal holdes for øje, dog, at kvante effektivitet SBFI er temmelig lav 15 og relative ændringer i natrium koncentrationen er ganske små med fysiologisk aktivitet. Således høj opløsning måling af Na + transienter i fine processer er en relativt kedelig opgave, og Binning eller gennemsnitsberegning af flere forsøg, kan være nødvendig for at opnå tilfredsstillende signaler. Desuden kinetik natrium transienter er overraskende langsomt, hvilket gør det obligatorisk at optage i længere tidsperioder. Denne observation svarer til dem, der i tidligere studier, hvor monoeksponentiel henfald af natrium transienter i neuronale dendritter og i astrocytter blev præget af store henfald tidskonstanter i størrelsesordenen 10 sekunder ved stuetemperatur 1,2,6. Natrium transienter synes således at lægge en meget langsommere tid coUrse og meget større henfald tidskonstanter sammenlignet med calcium transienter 16.
Braklægning disse ulemper, natrium billeddannelse viser sig at være et værdifuldt værktøj til undersøgelse af fysiologiske egenskaber af neuronale underdomæner. For eksempel kan natrium billeddannelse tjene til at overvåge excitatorisk synaptisk aktivitet ved eller tæt på aktive synapser. Fordi natrium i det væsentlige ikke bufferet 8,17, er aktivitet-induceret natrium transienter lineært relateret til en bred vifte af synaptisk glutamatfrigivelse eller eksogent anvendt glutamat. De repræsenterer dermed direkte og upartiske indikatorer for neuronal glutamaterg aktivitet. Desuden natrium indikatorfarvestoffer udviser høj Kd 's (SBFI s Kd er i området fra 25 mM 1). Selv ved de relativt høje intracellulære farvestofkoncentrationer anvendes til at opnå tilstrækkelig lysstyrke (sædvanligvis 0,5-1 mM), den høje K d 's betyde, at farvestofferne ikke selv fungere som buffere til sodium. Derfor har de ikke fordrejer amplituden eller tidsforløbet af natrium transienter, som er altid en bekymring, når calcium-følsomme farvestoffer indføres i cellerne 18. Det kan således antages, at de påviste signaler repræsenterer en god målestok for den "rigtige" ændringer i intracellulær natrium. Deres langsomme tidsforløb så indebærer, at hastigheden til intracellulær diffusion for natrium i neuroner er meget mindre end tidligere antaget 19.
En kritisk forudsætning for en vellykket gennemførelse af forsøg omhandler egenskaberne af excitatoriske synaptiske transmission og natrium tilstrømning veje i pigge og dendritter er induktion af en hurtig og meget lokal aktivering af postsynaptiske strukturer. Dette kan opnås ved hurtig og lokal anvendelse af glutamat eller glutamat agonister i umiddelbar nærhed af en rygrad eller en dendritceller ved flash fotolyse af bur forbindelser. Flash fotolyse ikke mekanisk damage vævet, er fri bevægelighed artefakter og er veletableret til undersøgelse af relaterede spørgsmål (f.eks lokale calcium signalering). Diameteren af uncaging stedet var 1,5 um i xy-planet. Uncaging tæt på et tornede dendritceller inducerede natrium-signaler i begge pigge og moderselskabet dendritceller. Betragtninger signalerne tendens til at være størst i pigge tættest på uncaging stedet, amplituder i moderselskabet dendritceller og pigge længere væk var stadig temmelig ligner dem i umiddelbar nærhed af uncaging stedet. Uncaging blev udført i 300 msek hvorunder indadgående strømme steg i amplitude. Uncaged glutamat kan have spredt i vævet i den samme periode, aktivering ionotrope glutamatreceptorer og natrium tilstrømning på dendritiske regioner og udløberne længere væk fra uncaging stedet.
Et iboende problem, der opstår ved brug af en UV-laser til fotolyse bur indgivne forbindelser gennem cellen badopløsningener "indre filtrering". På grund af den høje absorptionshastighed af buret, er UV-lys dæmpes kraftigt undervejs fra målet til stimulering webstedet 20,21. En mulig måde at undgå dette er lokal perfusion med buret, der er begrænset kun til stimulering site, som desuden nedsætter mængden af bur forbindelse, der behøves til et minimum. I forhold til UV-laser-scanning-medieret uncaging, nær-infrarød to-foton uncaging 22 er rumligt mere præcist, navnlig fordi nøjagtigheden af stimulering øges i z-aksen. På den anden side, på grund af det lille tværsnit af almindeligt anvendte bure til længere bølgelængder, som er beskæftiget med to-foton excitering, enten en høj koncentration af det bur forbindelsen eller meget høj, der er brug for potentielt fototoksiske lysintensiteter. Også to-foton uncaging nødvendiggør en langt større investeringer i udstyr; blandt andre, er en yderligere IR-laser plus de nødvendige optiske komponenter, som er nødvendige.
Både SBFI og MNI-glutamat er samledes i samme bølgelængdeområde. Dette kan føre til en utilsigtet indbyrdes afhængighed af UV uncaging laser og SBFI eller IR-billeddannelse laser og MNI-glutamat, hvilket resulterer i blegning af SBFI af uncaging flash og / eller en kontinuerlig uncaging af glutamat ved den infrarøde stråle. Som vist i figur 6C, hverken UV-blitz med sig selv eller multi foton billeddannelse forårsaget sådanne gensidige virkninger under vore eksperimentelle betingelser.
UV-flash-systemer ligner den her beskrevne, anvendes rutinemæssigt i mange andre laboratorier og kan relativt let kan inkorporeres i en eksisterende multi-foton billedbehandling mikroskop. Det giver den fordel, at laserstrålen til fotolyse kan placeres frit i synsfeltet. Desuden er systemet giver mulighed for en hurtig og automatisk positionering af laserstrålen og frigivelse volumen, henholdsvis i synsfeltet i et eksperiment. Our modifikation forenkler og forbedrer præcis positionering af uncaging stedet, således at rammerne for den billeddannende software kan tjene til at justere billedbehandling og uncaging rammer coach.
Taget sammen helcelle-patch-clamp og multi-foton natrium billeddannelse i dendritter og udløberne af centrale neuroner, kombineret med en modificeret procedure UV-lysinduceret uncaging af glutamat, giver pålidelig og fokal aktivering af glutamatreceptorer i vævet. Det kan således tjene til at analysere egenskaberne af excitatorisk synaptisk transmission og postsynaptiske natrium-signaler i neuroner i den intakte væv.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. Forfatterne modtaget økonomisk støtte muliggør Open Access Offentliggørelse af Rapp Optoelektroniske (Wedel, Tyskland), som fremstiller et instrument, der anvendes i videoen artiklen. Den selskabet ikke var involveret i forsøgene og heller ikke i håndteringen af data og heller ikke i manuskriptet skriftligt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra den tyske Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) til CRR Forfatterne ønsker at takke S. Durry og C. Roderigo for teknisk assistance, og M. Dübbert (Elektronik Laboratory, Zoologisk Institut , University of Köln, Tyskland) som hjælp i gennemførelsen af Pockets cellen controlleren og hf.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
- Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
- Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
- Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
- Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
- Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
- Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
- Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
- Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
- Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
- Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
- Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
- Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
- Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
- Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
- Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
- Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
- Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
- Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).
