Abstract
Fler photon fluorescensmikroskopi har möjliggjort analys av morfologiska och fysiologiska parametrar hos hjärnceller i intakt vävnad med hög rumslig och temporal upplösning. I kombination med elektrofysiologi, är det allmänt används för att studera aktivitetsrelaterade kalciumsignaler i små subcellulära fack såsom dendriter och Dendritutskotten. Förutom kalcium transienter, synaptisk aktivitet inducerar också postsynaptiska natrium-signaler, vars egenskaper är endast marginellt förstås. Här beskriver vi en metod för kombinerad hel-cell patch-clamp och multifoton natrium avbildning i cellulära mikro domäner centrala neuroner. Vidare introducerar vi ett modifierat förfarande för ultraviolett (UV) -ljus-inducerad uncaging av glutamat, vilket möjliggör tillförlitlig och fokal aktivering av glutamatreceptorer i vävnad. För detta ändamål var helcells-inspelningar utförs på Cornu Ammonis delfältet 1 (CA1) pyramidala neuroner i akuta vävnadsskivor avmus hippocampus. Nervceller fylldes med natrium-känsliga fluorescerande färgämne SBFI genom patch-pipett, och multi-foton-excitation av SBFI gjorde det möjligt för visualisering av dendriter och angränsande ryggar. Att etablera UV-inducerad fokal uncaging har flera parametrar, bland annat ljusintensitet, volym påverkas av UV uncaging trålen, positionering av strålen samt koncentration av bur föreningen testas och optimeras. Våra resultat visar att lokal perfusion med bur glutamat (MNI-glutamat) och dess bränn UV-uncaging resultat i aktiv strömmar och natrium transienter i dendriter och ryggar. Tidsförlopp och amplitud både inåt strömmar och natrium-signaler korrelerar med den tid som uncaging pulsen. Vidare visar våra resultat att intracellulära natriumsignaler blockeras i närvaro av blockerare för jonotropa glutamatreceptorer, vilket visar att de förmedlas av natrium tillströmning även om denna väg. Sammanfattningsvis ger vår metod ett pålitligt verktyg förundersökning av intracellulära natrium signaler inducerade av fokal receptoraktivering i intakt hjärnvävnad.
Introduction
De senaste förbättringarna i lätta mikroskopiska tekniker såsom flera foton mikroskopi har gjort det möjligt att studera morfologiska och fysiologiska parametrar av hjärnceller i intakt vävnad med hög spatial och temporal upplösning. Kombinerat med elektrofysiologi är dessa tekniker nu allmänt används för att analysera aktivitetsrelaterade elektriska signaler på neuroner liksom samtidig kalciumsignaler i små subcellulära fack, nämligen i fina dendriter och Dendritutskotten. Förutom kalcium transienter, synaptisk aktivitet inducerar också natrium signaler i dendriter och ryggar, egenskaper som är i stort sett outforskade. Sådana signaler kan analyseras med två-foton-avbildning av intracellulärt natrium ([Na +] i) som gör det möjligt att on-line-mätning av [Na +] i-transienter under längre tidsperioder utan signifikant färgblekning eller fotoskador 1,2.
För avbildning av [Na +] i- t.ex. corona Grön eller Asante Natrium Grön 3,4. Det mest använda fluorescerande sond för Na + avbildning är natrium-bindande bensofuran isoftalat (SBFI). Det är en ratiometrisk, UV-glada färgämne som liknar den välkända kalciumkänsliga färgämnet fura-2 och har varit anställd för konventionell Na + avbildning i många celltyper (t.ex. 5,6). Det finns olika möjligheter spännande färgämnet och samla sin fluorescens. Om hög tidsupplösning (dvs. en hög bildbildhastighet) krävs i kombination med geografisk information, kan SBFI vara glada med en xenonlampa eller en hög effekt lysdiod (LED)-enhet och dess utsläpp detekteras med en hög hastighet laddning -kopplade enhet (CCD) kamera 7,8. För maximal rumslig upplösning djup i vävnaden, är multi-photon laser scanning microscopy metoden för val 9. Den relativt låga kvant efficieNCY av SBFI nödvändiggör relativt höga färgämneskoncentrationer (0,5 till 2 mM) och direkt lastning av den membran ogenomtränglig form av SBFI via en skarp mikroelektrod 10 eller fläckpipetten 1.
Använda SBFI, tidigare arbete som utförs i akut vävnadsskivor av gnagare hippocampus visade aktivitetsrelaterade natrium transienter i dendriter och ryggar av CA1 pyramidala nervceller som främst orsakas av inflödet av natrium genom jonotropa NMDA-receptorer 1,2. För att studera egenskaperna hos sådana lokala natrium signaler i mer detalj är specifik aktivering av postsynaptiska receptorer genom tillämpning av receptoragonister en väl lämpad metod. För att efterlikna presynaptisk aktivitet och frigör sändare, bör ansökan vara relativt korta och fokuserade för att möjliggöra lokal stimulering. Detta är emellertid visar sig vara ganska utmanande i intakt vävnad. Lokalt tryck tillämpning av receptoragonister med en spetsig pipett möjliggör mycket bränn apkomplikation, men är värd den potentiella risken för att producera rörelse strukturen av intresse (t.ex. såsom en dendrit eller Dendritutskotten), och på så sätt hindrar högupplösta bilder. Lämpligheten jontofores av neuroaktiva ämnen beror på deras elektriska egenskaper och höga ström amplituder kan producera cellulära artefakter också.
Ett sätt att kringgå dessa hinder är anställning av fotoaktiverade föreningar och deras flash fotolys. I grunden är två olika principer som används för fotoaktivering av bur ämnen: I) Wide-field flash fotolys 11 och II) focal uncaging använder skanningsmoduler i kombination med laser 12. Medan brett fält flash fotolys används för att aktivera större regioner av intresse, t ex en hel cell, är fokal uncaging utnyttjas för att specifikt stimulera små cellulära avdelningar. I föreliggande studie visar vi ett förfarande för hel-cell patch-clamp och multi-pHoton natrium avbildning i dendriter och ryggar av centrala neuroner, i kombination med ett modifierat förfarande för UV-ljusinducerad uncaging av glutamat, vilket möjliggör tillförlitlig och fokal aktivering av glutamatreceptorer i vävnad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
- Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
- Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
- Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
- Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
- Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
- Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
- Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
- Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
- Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
- Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
- Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
- Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
- Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
- Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
- Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
- Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
- Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
- Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).
