Summary
Vi beskriver kombinasjonen av brennvidde UV-indusert foto-aktivering av nevro-aktive forbindelser med hel-celle patch-clamp og multi-foton avbildning av intracellulære natrium transienter i dendritter og pigger av hippocampus nevroner i akutte vev skiver av musen hjernen.
Abstract
Multi-foton fluorescens mikroskopi har muliggjort analyse av morfologiske og fysiologiske parametere av hjerneceller i intakt vev med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinert med elektrofysiologi, er det mye brukt til å studere aktivitetsrelaterte kalsium signaler i små subcellulære avdelinger som dendritter og dendrittutløperne. I tillegg til kalsium-transienter, synaptisk aktivitet induserer også postsynaptiske natrium signalene, egenskapene av disse er bare marginalt forstått. Her beskriver vi en metode for kombinert hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium bildebehandling i cellulære mikro domener av sentrale nerveceller. Videre introduserer vi en modifisert prosedyre for ultrafiolett (UV)-lys-indusert uncaging av glutamat, som tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev. For å oppnå dette, ble hel-celle opptak utført på Cornu Ammonis underavdeling 1 (CA1) pyramidale nevroner i akutte vev skiver avmuse hippocampus. Nevronene ble fylt med natrium-sensitive fluorescerende fargestoff SBFI gjennom patch-pipette, og multi-foton eksitasjon av SBFI aktivert visualisering av dendritter og tilstøtende pigger. For å etablere UV-indusert fokal uncaging ble flere parametere inkludert lysintensitet, volum påvirkes av UV uncaging strålen, posisjonering av strålen, så vel som konsentrasjonen av den testede forbindelse i bur og optimalisert. Våre resultater viser at lokal perfusjon med bur glutamat (MNI-Glutamat) og sitt midt UV-uncaging resultat i indre strømninger og natrium transienter i dendritter og pigger. Tidsforløpet og amplitude av både innover strømmer og natrium signaler korrelerer med varigheten av uncaging puls. Videre viser våre resultater at intracellulære natrium signalene blir blokkert i nærvær av blokkere for ionotrofiske glutamatreseptorer, noe som viser at de er mediert av natriuminnstrømning men denne veien. Oppsummert gir vår metode et pålitelig verktøy forundersøkelse av intracellulære natrium signaler indusert av fokal reseptoraktivering hos intakte hjernevev.
Introduction
Nylige forbedringer i lys mikroskopiske teknikker som multi-foton mikroskopi har aktivert studiet av morfologiske og fysiologiske parametere av hjerneceller i intakt vev med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinert med elektrofysiologi, er disse teknikkene nå mye brukt for å analysere aktiviteten messige elektriske signalene på nerveceller, så vel som kalsium samtidige signaler i små subcellulære rom, nemlig i fine dendritter og dendrittutløperne. I tillegg til kalsium-transienter, synaptisk aktivitet induserer også natrium signaler i dendritter og pigger, egenskaper som er lite utforsket. Slike signaler kan analyseres ved to-foton avbildning av intracellulær natrium-([Na +] i), som gjør det mulig for on-line-måling av [Na +] i transienter i lengre perioder uten signifikant fargestoff bleking eller foto-skade 1,2.
For avbildning av [Na +] i f.eks Corona Grønn eller Asante Natrium Grønn 3,4. Den mest brukte fluorescerende probe for Na + bildebehandling er natrium-bindende benzofuran isoftalat (SBFI). Det er et ratiometrisk, UV-spent fargestoff som ligner den kjente kalsium-sensitive fura fargestoff-2, og har vært anvendt for konvensjonelle Na + avbildning i mange celletyper (for eksempel 5,6). Det finnes forskjellige muligheter for å eksitere fargestoff og samle dens fluorescens. Hvis høy tidsoppløsning (dvs. en høy bildebehandling bildefrekvens) er nødvendig i kombinasjon med romlig informasjon, kan SBFI være glade med en xenon arc lampe eller en høy effekt light-emitting diode (LED) enheten og dens utslipp oppdages med en høy hastighet kostnad -koblet enhet (CCD)-kamera 7,8. For maksimal romlig oppløsning dypt i vev, er multi-foton laser scanning mikroskop metoden for valg 9. Den relativt lave quantum effektiv vNCY av SBFI nødvendiggjør forholdsvis høye fargestoffkonsentrasjoner (0,5 til 2 mm), og direkte lasting av den membran-ugjennomtrengelig form av SBFI via en skarp microelectrode 10 eller lapp pipette 1.
Bruke SBFI, tidligere arbeid utført i akutte vev skiver av de gnager hippocampus demonstrert aktivitetsrelaterte natrium transienter i dendritter og pigger av CA1 pyramidale nevroner som i hovedsak forårsaket av tilstrømningen av natrium gjennom ionotropiske NMDA reseptorer 1,2. For undersøkelse av egenskapene til slike lokale natrium signaler i mer detalj, er spesifikk aktivering av postsynaptiske reseptorer ved anvendelse av reseptor-agonister en velegnet metode for valg. Å etterligne presynaptisk aktivitet og senderen utgivelsen, bør søknaden være relativt kortfattet og fokusert for å aktivere lokal stimulering. Dette, men viser seg å være ganske vanskelig i intakt vev. Lokalt trykk anvendelse av reseptor agonister ved hjelp av en tynn pipette gir svært focal application, men er vert for den potensielle risikoen for å produsere bevegelse av strukturen av interesse (f.eks eksempel en dendrite eller dendrittutløperne), og dermed hindrer bildebehandling med høy oppløsning. Egnetheten iontoforese av nevro-aktive stoffer, avhenger av deres elektriske egenskaper og høy strøm amplituder kan produsere cellulære gjenstander i tillegg.
En måte å omgå disse hindringene er ansettelse av foto-aktivert forbindelser og deres flash fotolyse. I utgangspunktet er to ulike prinsipper som brukes for foto-aktivering av bur stoffer: I) Wide-field flash fotolyse 11 og II) focal uncaging ansette skanning moduler i kombinasjon med laser 12. Mens bredt felt flashfotolyse benyttes for å aktivere større regioner av interesse, for eksempel en hel celle, er fokal uncaging anvendes for å spesifikt stimulere små cellulære avdelinger. I den foreliggende undersøkelse viser vi en fremgangsmåte for hel-celle patch-clamp og multi-pHoton natrium avbildning i dendritter og pigger av sentrale neuroner, i kombinasjon med en modifisert prosedyre for UV-lysindusert uncaging av glutamat, som tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev.
Protocol
Denne studien ble utført i henhold til de institusjonelle retningslinjer Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf, Tyskland, samt EU direktiv (86/609 / EEC). Alle forsøkene ble kommunisert til og godkjent av Animal Welfare Kontoret ved Animal Care og bruk Facility av Heinrich Heine Universitetet Düsseldorf, Tyskland (institusjonell handling Nummer: Ø52 / 05). I samsvar med den tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz, artikkel 4 og 7), var det ikke nødvendig med formell tilleggs godkjenning for postmortem fjerning av hjernevev.
For generasjon av akutte skiver, ble musene bedøvet med CO 2 og raskt halshugget (etter anbefaling fra Europakommisjonen publiserte i: Avliving av forsøksdyr, Luxembourg: Kontoret for offisielle publikasjoner De europeiske fellesskap, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).
1. Utarbeidelse avLøsninger
- Forbered kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for disseksjon inneholdende (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, og 20 glukose, boblet med 95% O 2 og 5% CO 2, noe som resulterer i en pH på 7,4.
- Forbered ACSF for eksperimenter som inneholder (i mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, og 20 glukose, boblet med 95% O2 og 5% CO2, noe som resulterer på en pH-verdi på 7,4.
- Forbered intracellulær løsning (ICS) inneholdende (i mM): 150 KMeSO 3, 12,5 hydroksy etyl piperazin etan-sulfonsyre (HEPES), 40 KCl, 5 NaCl, 1,25 etylenglykoltetraeddiksyre (EGTA), 5 Mg-ATP, 0,5 Na GTP. Juster pH til 7,3. Oppbevar aliquoter av 1 ml ved -20 ° C.
- Fortynne natrium-bindende benzofuran isoftalat (SBFI) -Salt i dobbel-destillert vann og forberede porsjoner av 5 mLav en 10 mM stamløsning.
- Tin ICS og tilsett SBFI stamløsning ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Vortex og mikro-filtratet (0,22 mikrometer). Oppbevar ved 4 ° C inntil benyttet i forsøket. Ikke frys og bare bruke for en dag.
- Forbered MNI glutamat stamløsning av 50 mM ved oppløsning av forbindelsen i dobbel-destillert vann. Fortynn MNI glutamat stamoppløsning til en endelig konsentrasjon på 5 mM i normal ACSF. Oppbevar ved 4 ° C inntil benyttet i forsøket. Ikke frys og bare bruke for en dag. Oppbevar aliquoter, som ikke umiddelbart benyttes i forsøket, ved -20 ° C.
2. Disseksjon av Tissue
MERK: Utarbeidelse av akutte hippocampus skiver av gnager hjernen ble beskrevet i detalj tidligere 13,14. I korte trekk, ble følgende protokoll anvendes i den foreliggende studie.
- Etter halshogging, raskt fjerne hjernen fra skallen.
- Umiddelbart plassere hjernen i en petriskålmed iskald disseksjon ACSF og dissekere en halvkule ved å utføre en sagittal kutt langs midtlinjen.
- Utfør en andre kutt i ønsket orientering som en blokkerende overflate og feste dette til skjære stadium av en vibratome med superlim.
- Ta skjærekammeret og kjøleelement (begge holdt ved -20 ° C) av vibratome ut av fryseren og sted skjæretrinn med hjerne seksjon i kammeret. Deretter satte kjøleelement i kammeret og senk vev i iskaldt disseksjon ACSF. For å stabilisere forberedelser, kan man ønsker å motvirke vevsblokk med agar gel.
- Skjær 250 mikrometer tykke, parasagittal skiver av hippocampus med vibratome. Sørg for at alle ACS væsker er boblet til enhver tid.
- Etter kutting, holde vevet på en maske i et begerglass med vanlig ACSF og inkuber ved 34 ° C i 30 min. Deretter holder ved romtemperatur.
3. Utarbeidelse av maskinvare
Figur 1. Reaksjonsskjema som viser lysbanene og eksperimentell kontroll av riggen består av multi-foton avbildning, laser-scanning UV flashfotolyse, og elektrofysiologi. Multifotonstråle (rød) fremstilles ved en pulset, avstembar infrarød (IR-) laser (Tisa). Den passerer en mekanisk lukker, en Pockels-'cellen, og at IR-detektoren (deteksjon av stråleintensitet), som alle gjør det mulig kontroll av lasereffekten og dens administrasjon varighet. Flip-in / flip-out valgfri laserdiode er ansatt for enkel justering av laserstrålen. Bjelken ekspander kan anvendes i kombinasjon med målene med et ekstremt bredt rygg-fokalplan. Den fjernstyrte ND filterhjul kan benyttes i tillegg eller i stedet for Pockels-cellen for å 'kontrollere laserstråleeffekt. Etter å ha passert skannerhodet, blir pulset IR-lys ledet til prøven. Emitted fluorescens lys (lys grønn) samles enten av eksterne eller interne fotomultiplika detektorer (PMTs). De eksterne detektorer er fullstendig synkronisert med de interne PMTs via en høyfrekvens-bryter (PMT kontroller). Den uncaging strålen (lyseblå) er produsert av en UV solid-state laser (DPSS UV-Laser). Det er deretter sendt til den galvo-drevet skanning enhet øverst bak på epi-fluorescens kondensator ved en lett guide. Den nøyaktige posisjonering (kromatisk aberrasjon mellom avbildning og uncaging stråle) av uncaging sted eller område er aktivert av bilde eksport fra bildebehandlingsprogrammer. Tidspunktet management for å synkronisere bildebehandling, elektrofysiologi, og blitsen Lyse er elektronisk styrt. Den transilluminasjon detektor (TL-PMT) er behov for dokumentasjon av posisjoneringen av pipettene i vevet. De styringer og programvare for bildesystem, som har blitt modifisert, blir brukt for å kontrollere og synkronisere alle andre apparaternødvendig for å drive systemet. Systemkomponenter merket som "tilpasset" ble designet og bygget / tilrettelagt av forfatterne. Noen komponenter ble tilpasset for å møte kravene i custom-build multi-foton-systemet og er merket som "endret". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Slå på komponenter av multi-foton-systemet. Teste og justere infrarød laserstråle justering.
- Kontroll bjelke posisjonering ved å bla i sentre prisme i stedet for et mål. Hvis strålen er forstuet, re-justere den ved speilene i periskopet. Legg merke til at sentreringsplanet av prismet må være på samme nivå som den tilbake fokalplanet av tittel mens avbildning.
- Slå på spektrometer og kontroller for de multi-foton karakteristikker av bjelken.
- Sett parameterne for bildebehandling på følgende verdier: Velgen rammestørrelse på 512 x 512 piksler for oversiktsbilder av cellen (mindre klippet bokser med en zoomfaktor på 2,5 for høy bildefrekvens og høy romlig oppløsning, henholdsvis). Sett bildehastigheten til rask modus og skannemodus til XYT. Z-stepping bør være en mikrometer for oversikt stabler og 0,2 mikrometer for detaljerte stabler å matche romlige prøvetaking krav til deconvolution utført senere.
- Juster multi-foton laserstråle (790 nm) intensitet ved å endre innstillingene for Pockels 'celle (endelig makt under målsettingen: ≈ 14 - 16 μW) og foto-multiplikatorer (PMTs).
- Slå på og kalibrere uncaging system ved å plassere et fluorescerende prøven skyve under objektivet.
- Ved hjelp av kikkerten, justere fokus for UV-optikk og romlig begrense UV laser spot til en størrelse på 2 mikrometer i diameter på maksimalt ved å bruke fokuseringsenheten ved UGA skannehodet.
- Start kalibreringsrutinen til uncaging enhet kontroll software.
- Sett UV laser til flere punkter i sitt frekvensområde, mens fluorescens er tatt med et CCD-kamera. Ved å klikke på UV-laserpunkt ved hvert punkt, justere plasseringen av de galvaniske scan speil for å svare til en bestemt koordinat i programvaren.
Figur 2. Detaljert ordningen illustrerer egenskapene til eksitasjon, emisjon og uncaging stråleveier. IR eksitasjon stråle (rød) passerer strålen kombinere dikroiske speil på nivået til Filer turret i epi-fluorescens kondensator av mikroskopet og målet å når prøven. Den uncaging stråle (blå) er levert via en kvarts optisk lys fiber til collimation og strålen fokuseringsenhet og deretter senere guidet til skanning mirrors i skanneenhet, sender et dikroisk speil til det strålesammensett dikroiske speil. Her er det kombinert med eksitasjon skannestrålen. Den avgitte lys fra prøve følger banen eksitasjon skannestrålens bane i den motsatte retningen mot avbildningsskannerhodet. Kameraet er brukt for visuell kontroll av plasteret pipette og for posisjonering av uncaging strålen i kombinasjon med konfokal laser scanning mikroskop (ikke vist). Det grønne lyset bane representerer en eventuell epi-fluorescens-belysning som kan være i bruk med andre applikasjoner.
- Bruk blitsen fotolyse system i spot modus for å få brenn applikasjoner. Påse at fokal justering av uncaging stråle (gjennomsnittlig effekt under mål: 0,55 mW) resulterer i en punktstørrelse på 1,5 pm i diameter (xy utvidelse) som åpenbart ved en fluorescerende lysbilde plassert i en z-nivå som tilsvarer den i en vevskive (ikke vist).
- Den nøyaktig posisjonering av uncaging stedet oppnås ved import av et bilde av imaging system via en nettverksforbindelse mellom uncaging- og bildebehandling-datamaskiner.
- Ved hjelp av en skjerm grabben programvare, kontinuerlig lest opp rammene av bildebehandlingsprogrammer (i stedet for kameraet feed) og justere bilde og uncaging rammer congruently. Eksportere hver 10. frame fra bildebehandlingsprogrammer som et referansebilde i flashenhet for å sikre riktig justering under hele forsøket.
Figur 3. Justering av uncaging stedet: For nøyaktig plassere uncaging spot, et skjermbilde av bildebehandlingsprogrammer (gul ramme) er importert inn i uncaging programvare (grønn ramme). Denvenstre bildet innenfor den gule rammen representerer en Hi-Lo kodet bilde (blå: sorte piksler, red: mettet piksler) av hele CA1 pyramidecelle. Bildet blir overdekket av kalibrerings gitteret på uncaging programvare (green "X" s). Til høyre er en forstørret del av cellen vist med kledde uncaging spot (rødt kryss). Den gule flekk er den automatisk kledde bildet av uncaging strålen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Slå på micromanipulators, elektrofysiologiske komponenter og spyling enhet for levering av bur forbindelsen til målområdet.
- Installer et fokus spyling enhet for lokal perfusjon av bur forbindelser. Dette vil redusere kostnadene enormt i forhold til badekaret perfusjon av disse stoffene. Juster holder trykket til den gitte atmosfærisk trykk for å hindre at et drag av vekselstrømSF inn i eller en lekkasje av bur stoffer fra søknad pipette.
MERK: Trykket program enheten vert for en svært presis og lynraske mikro-ventil i pipetten holderen. Dette gjør det mulig å anvende minimale påføringstrykk og derfor reduserer bevegelse gjenstander til et minimum under den lokale perfusjon med den innestengte forbindelsen. - Trekk pipetter for hel-celle patch-clamp og lokal perfusjon med eld-polert borsilikatglass kapillærer. Pipetter bør ha en spiss diameter på ~ 1 mikrometer og en motstand på R ≈ 3 mÊ (verdiene bestemt med K-Meso 3 basert ICS).
- Plasser skive i den eksperimentelle bad og fest det med et rutenett (platina ramme 250 mikrometer tykt, spredte med kirurgiske filamenter, od 40 mikrometer) (figur 4A, B). Bruk en invertert, tip-brutt, og ild-polert Pasteur pipette (sugepasning på siden av den brukne spiss) for skive overføring. Unngå bøying og eventuelle andre harde håndtering av stykket.
- Plasser bad på mikroskopet scenen og permanent perfuse skive med ACSF.
- Load patch pipette med ICS inneholder SBFI og laste lokal perfusjon pipette med bur sammensatte. Fest pipetter til tilsvarende micromanipulators. Plasser referanseelektrode i badekaret. Sørg for at du er jordet permanent for å unngå skader på hodet scenen (jf figur 4C).
- Senk begge pipetter til bad og plassere dem over hippocampus CA1 regionen. Påfør lett trykk til patch pipette (40 mbar) for å unngå utvanning av ICS med ACSF.
- Kompenser forskyvningen potensialet av plasteret pipetten ved hjelp av elektrofysiologi programvare.
- Nærme seg en CA1 pyramide celle med patch pipette ansette IR-DIC videomikroskopi. Påfør lett sug inntil en Giga-tetning oppnås. Velge en celle soma som ligger 30 -70 mikrometer under overflaten av stykket for å sikre intakt cellemorfologi på den ene side, og lav spredning og demping av den uncaging trålen på den annen side.
- Kompensere for rask kapasitet. Break membrane og åpen celle for å oppnå hel-celle konfigurasjonen.
- Kompensere for treg kapasitet og seriemotstand.
- Tillat den celle som skal dialyseres med SBFI-ICS i minst 30 min før de bildedannende eksperimenter.
- Legg tetrodotoxin (TTX, 500 nM) for å ACSF å hindre aktivering av spenningsstyrte natriumkanaler og generering av aksjonspotensialer.
- Visualisere mobilnettet morfologi ved hjelp av multi-foton eksitasjon og resulterende SBFI fluorescens og velge en spiny dendrite for eksperimentet. Zoom inn for bilder med høyere oppløsning og plassere et klipp boks rundt dendrite.
- Fyll en standard patch pipette med 10 mL ACSF inneholder bur glutamat. Koble pipetten til trykksøknadssystem og fest den til mikromanipluatoren.
- Plasser pipette med bur sammensatte nær dendrite (~ 30 mikrometer). Plasser pipette for å tillateeffektiv lokal perfusjon av dendrite av valget. Juster uncaging laser: plassere uncaging sted nær (~ 1 - 2 mikrometer) til strukturen av interesse.
- Set regioner av interesse på den valgte dendrite og tilstøtende pigger ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer.
- Approach regionen av interesse og focally injisere bur sammensatt for flere sek med lavt trykk (<3 PSI). Begynn patch clamp og fluorescens opptak (ved 790 nm multi-foton eksitasjon) via trigger signal.
MERK: Under den lokale blodgjennomstrømming i bur sammensatte, er eksitasjon strålen helt nedtonet for å unngå bleking. - Stopp lokal perfusjon av bur sammensatte. Øk intensiteten av to-foton laser for å muliggjøre effektiv eksitasjon av SBFI og bruke en UV flash å initial uncaging (uncaging varighet 300 msek).
- Overvåke endringer i SBFI fluorescens. Stoppe registreringen etter SBFI fluorescens har kommet seg tilbake til baseline.
- For å teste involvering av ionotrofiske glutamat reseptorer i generering av strøm og / eller natrium signaler fremkalt av UV flash fotolyse av bur glutamat, ansetter reseptorblokkere.
- Bytt til ACSF som inneholder AMPA-reseptorblokker cyano-nitroquinoxaline-dion (CNQX, 10 mM) og NMDA-receptor blokkering amino-phosphonopentanoate (APV, 50 pM) i tillegg til TTX (se ovenfor) og perfuse stykke i minst 10 min.
- Gjenta stimuleringsprosedyren (se 5.4 og 5.5.)
- Reversibiliteten av hemmere 'effekter
- Bytt tilbake til normal ACSF inneholder bare TTX.
- Perfuse skive i 20 min.
- Gjenta stimuleringsprosedyren (se 5.4 og 5.5.).
- Spill inn en XYZ-stack av klippet box-regionen sett for de utførte målinger. Sørg for at denne bunken er oversampled romlig (minst 0,2 mikrometer per piksel) for å muliggjøre optimal bilde deconvolution og for å øke bildekvaliteten og oppløsningen.
- Spill inn en XYZ-stack av hele cellen for å vurdere cellemorfologi.
- Kjør deconvolution algoritme.
Figur 4. Komponenter i den eksperimentelle bad og posisjonering av badet på objektbord. (A) Den eksperimentelle bad består av badekaret kammeret selv (blå firkant), som er omgitt av et magnetisk metallring. Slangen sikrer kontinuerlig perfusjon av badekaret med saltvann (ACSF). Rutenettet å holde nede og fikse stykket er satt i badekaret kammeret. (B) Akutt skive forberedelse plassert i badekaret kammeret. Den skive er fast ved trådene av nettet. (C) for posisjonering og geometrien av den eksperimentelle bad på objektbord under forsøkene.
4. Hel-celle Patch-klem
5. Multi-foton bildebehandling og stimulering
Figur 5. Eksperimentell protokollen. For å initialisere et eksperiment, en triggerpuls (merket med en rød sign (ᴨ) og den røde linjen) er satt til samtidig starte imaging (blå), elektrofysiologi (grønn), og administrasjonen av bur Forbindelse (gul) ved tidspunkt 0 sekunder. Under denne første periode, bør avbildningsstråle være helt dimmes (lys blå). Etter 4,5 sek (stiplet linje), er den lokale blodgjennomstrømming i bur sammensatte avsluttet og bilde strålen bør settes til sin working intensitet for datafangst (blå). 1,5 sek senere (tidspunkt 6 sek), en andre triggerpuls er gitt (angitt med røde tegn (ᴨ) og den røde linje), som initialiseres UV flashenheten (varigheten av flash: 300 msek; angitt av den gule flash ) og setter markører i elektrofysiologi og bildeprotokollen.
6. Farmakologi
7. Morfologi
Representative Results
I denne studien, viser vi en prosedyre for multi-foton mikroskopi av cellulære natrium dynamikk med natrium-avhengige fluorescerende fargestoff SBFI i CA1 pyramidale nevroner av akutt mus hippocampus vev skiver. Videre viser vi hvordan du kan kombinere dette avbildningsteknikk med laser-scanning-baserte uncaging av nevro-aktive forbindelser (f.eks bur glutamat) og dens nøyaktig skyting og cellulære mikro domener.
Henter neuroner med SBFI gjennom patch-pipette muliggjorde visualisering av hele cellen inkludert fine dendritter og tilstøtende ryggrader ved anvendelse av multi-foton eksitasjon (Figur 6A, B, D og figur 7A).
Figur 6. Natrium signaler og synaptiske strømmer indusert av flash fotolyse av bur glutamat. (A) Maximal projeksjon bilde av en CA1 pyramide nevron lastet med SBFI via lappen pipette (PP). Boksen angir området vist utvidet i B. LP indikerer posisjon og orientering av pipetten for lokal perfusjon av bur glutamat. (B) Høy effekt maksimal projeksjon av en stabel av optiske deler av en dendrite med tilstøtende dendrittutløperne. Stabler av optiske seksjoner gikk z-justering og deconvolution. Den røde kors indikerer målområdet av uncaging strålen. Den oransje stiplet linje markerer regionen av interesse som fluorescensemisjonen ble registrert. Boksen angir området vist utvidet i D. (C) Venstre: Sodium signal (øverste rad) og somatisk innover strøm (nederste rad) indusert av flash fotolyse av bur glutamat (angitt med gul flash). Den røde linjen representerer et anfall av eksperimentelle data. Det grå området representerer den perioden der uncaging flash (300msek) hindret avbildning av SBFI fluorescens Høyre:. Uten pre-perfusjon med bur glutamat, det samme UV-flash verken vakte en endring i SBFI utslipp, og heller ikke en indre strøm (D) Venstre:. Høy effekt bilde av dendrite og tilstøtende spines som avgrenset i B. Ved siden av, det samme bildet med inverterte grå verdier. De stiplede linjene indikerer regionene av interesse der fluorescens utslipp ble registrert. Det røde korset indikerer lokalisering av uncaging bjelke Høyre:. Sodium transienter indusert av UV-flash fotolyse av bur glutamat. Blå strek: natrium signaler i dendrite; red trace: gjennomsnitt respons fra tre pigger i tilknytning til uncaging sted; grønne kurven: gjennomsnitt respons fra tre fjerne pigger. Vennligst klikk her for en større versjon av dette tallet.
Etter lokal perfusjon med burglutamat, påføring av et UV-flash nær en dendritt resulterte i en forbigående reduksjon i fluorescensemisjonen fra SBFI, som reflekterer en økning i den intracellulære natriumkonsentrasjon (figur 6C, D og figur 7B). På samme tid, ble en innover strøm føres til soma (figur 6C og figur 7B). Ved å øke varigheten av UV flash resultert i økende amplituder av både den fremkalte strømmer innover og natrium-signaler (data ikke vist), noe som indikerer at systemet var godt innenfor det dynamiske området og at hverken uncaging eller cellulære responser var mettet. Anvendelse av et UV-flash identisk eller lengre varighet til stykker som ikke hadde blitt pre-perfusert med bur glutamat, ikke fremkalte endringer i fluorescens SBFI heller innover strømninger, noe som indikerer at disse signaler er på grunn av den uncaging av glutamat (figur 6C). Dessuten, disse resultater viser at ingen gjensidige avhengighet imaging- og uncaging komponenter er observert under våre eksperimentelle forhold. Natrium-signaler kan også detekteres i dendrittutløperne (figur 6D). Mens vi ikke forsøke å oppnå stimulering av en enkelt ryggraden bare med glutamat uncaging tendens peak amplituder å bli noe høyere i pigger nær uncaging spot, mens pigger lenger unna viste nesten identiske fluorescens endringer som forelder dendrite (figur 6D).
Endelig studerte vi veien for natriuminnstrømning i dendritter og pigger som reaksjon på uncaging av glutamat. For dette formål anvendes vi CNQX og APV, som er selektive blokkere for natrium-gjennomtrengelig, ionotropiske glutamatreseptorer av AMPA- og NMDA-subtype, respektivt. Våre resultater viser at glutamat-indusert intracellulær natrium-signaler og de fremkalte somatiske strømmer ble utelatt i nærvær av disse blokkere (figur 7b). Ved utvasking av de stopper blir signalene gjenvinnes. Dette viser that uncaging av glutamat aktiverer ionotrofiske glutamat reseptorer på CA1 pyramidale nevroner, som medierer tilstrømningen av natrium i dendritter og pigger, noe som resulterer i intracellulære natrium transienter og innover strømninger.
Figur 7. Farmakologisk profilen fremkalt natrium signaler og innover strømninger. (A) SBFI fylte CA1 pyramide nevron med patch pipette (PP) festet til soma (B) Venstre:. Sodium forbigående og somatisk gjeldende indusert av foto-aktivering av bur glutamat i en dendrite og festet pigger Center:. Perfusjons med ionotrofiske glutamat reseptorblokkere CNQX og APV hemmer både natrium signalet og innover gjeldende indusert av uncaging Høyre:. Ved utvasking av blokkere, er signalene gjenopprettet. Den røde linjen representants et anfall av eksperimentelle data. Det grå området representerer den perioden der uncaging flash (300 msek) hindret avbildning av SBFI fluorescens. Vennligst klikk her for en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne studien viser at SBFI er godt egnet for to-foton avbildning av intracellulære natrium transienter i små cellulære avdelinger. Det må tas i betraktning, men at Quantum effektiviteten av SBFI er ganske lave 15 og relative endringer i natriumkonsentrasjonen er ganske liten med fysiologisk aktivitet. Således er høyoppløselig måling av Na + transienter i fin prosesser relativt kjedelig oppgave, og binning eller midling av flere forsøk kan være nødvendig for å oppnå tilfredsstillende signaler. I tillegg, kinetikken av natrium transienter er overraskende langsom, noe som gjør det obligatorisk å ta opp i lengre tidsperioder. Denne observasjon stemmer overens med de i tidligere studier, hvor monoexponential nedbrytning av natrium transienter i neuronale dendritter og i astrocytter ble karakterisert ved store nedbrytning tidskonstanter i området fra 10 sek ved romtemperatur 1,2,6. Natrium transienter dermed synes å utøve en mye tregere tid coUrse og mye større nedbrytning tidskonstanter som sammenlignet med kalsium-transienter 16.
Sett av disse ulempene, beviser natrium bildebehandling å være et verdifullt verktøy for etterforskningen av fysiologiske egenskaper av nevronale underdomener. For eksempel kan natrium-avbildning tjene til å overvåke eksitatorisk synaptisk aktivitet ved eller i nærheten av aktive synapser. Fordi natrium er i det vesentlige ikke er buffret 8,17, er aktivitets-induserte transienter natrium lineært relatert til et bredt spekter av synaptiske glutamatfrigi eller eksogent glutamat anvendt. De dermed representerer direkte og objektive indikatorer på nevronale glutamaterg aktivitet. Videre natrium indikatorfargestoffer oppviser høy K d 's (SBFI største K d er i området fra 25 mM 1). Selv ved den relativt høye intracellulære konsentrasjoner fargestoff som brukes for å oppnå tilstrekkelig lysstyrke (vanligvis 0.5 - 1 mM), den høye K d 's antyde at de fargestoffer som i seg selv ikke virker som buffere for sOdium. Følgelig har de ikke forvrenge amplitude eller tidsforløpet av natrium transienter, som alltid er et problem når kalsiumfølsomme fargestoffer blir introdusert inn i cellene 18. Det kan dermed antas at de oppdagede signalene representerer et godt mål på den "ekte" endringer i intracellulær natrium. Deres langsom tid selvfølgelig medfører da at hastigheten for intracellulær diffusjon for natrium i nevroner er mye mindre enn tidligere antatt 19.
En viktig forutsetning for en vellykket gjennomføring av forsøkene adressering egenskapene av eksitatoriske synaptisk transmisjon og natrium tilstrømningen trasé til pigger og dendrittene er dannelse av et fast og sterkt lokalisert aktivering av postsynaptisk strukturer. Dette kan oppnås ved rask og lokal påføring av glutamat eller glutamatagonister i umiddelbar nærhet av en rygg eller et dendritt ved flashfotolyse av bur forbindelser. Flash fotolyse ikke mekanisk damage vevet, er fri for bevegelse gjenstander og er godt etablert for etterforskningen av relaterte spørsmål (f.eks lokale kalsium signalisering). Diameteren på uncaging punktet var 1,5 mikrometer i xy-planet. Uncaging nær en spiny Dendritt indusert natrium signaler i begge pigger og foreldre dendrite. Mens signalene tendens til å være størst i pigger nærmest uncaging spot, amplitudene i den overordnede dendrite og pigger lenger unna var fortsatt ganske lik de i direkte nærhet av uncaging spot. Uncaging ble utført for 300 msek der innover strøm økte i amplitude. Uncaged glutamat kan ha diffundert inn i vevet i løpet av samme tidsperiode, aktivering ionotrofiske glutamatreseptorer og natriuminnstrømning på dendrittiske regioner og pigger lenger bort fra uncaging flekk.
Et iboende problem som oppstår ved bruk av en UV-laser for fotolyse av bur forbindelser administreres gjennom cellen badeløsningener 'indre filtrering'. På grunn av den høye absorption rate av buret, er UV-lys dempes sterkt underveis fra målet til stimulering nettstedet 20,21. En mulig måte å unngå dette på er lokal perfusjon med bur som er begrenset bare til stimulering side, som dessuten reduserer mengden bur forbindelsen som trengs til et minimum. Som sammenlignet med UV-laser-scanning-mediert uncaging, nær-infrarød to-foton uncaging 22 er romlig mer nøyaktig, fordi nøyaktigheten av stimuleringen øker i z-aksen. På den annen side, på grunn av det lille tverrsnitt av vanlig brukte bur for lengre bølgelengder som anvendes til to-foton-eksitasjon, enten en høy konsentrasjon av den innestengte forbindelse eller svært høy, er potensielt fototoksiske lysintensiteter som trengs. Også nødvendig to-foton uncaging en mye høyere investering i utstyr; blant andre, er en ytterligere IR-laser pluss de nødvendige optiske komponenter, trengte.
Både SBFI og MNI-glutamat er hissige i samme bølgelengdeområde. Dette kan føre til en utilsiktet interdependency av UV uncaging laser og SBFI eller IR bildebehandling laser og MNI-glutamat, som resulterer i bleking av SBFI av uncaging blits og / eller en kontinuerlig uncaging av glutamat ved IR-strålen. Imidlertid, som vist i figur 6C, verken en UV flash i seg selv eller multifoton avbildning forårsaket slike gjensidige virkninger under våre eksperimentelle betingelser.
UV-blitz-systemer som ligner på det som beskrives her, brukes rutinemessig i mange andre laboratorier og kan relativt lett bli innarbeidet i alle eksisterende multi-foton bildebehandling mikroskop. Det har den fordelen at laserstrålen for fotolyse kan plasseres fritt i synsfeltet. I tillegg gir systemet en rask og automatisert reposisjonering av laserstrålen, og volumet frigjøring, hhv, i synsfeltet løpet av et eksperiment. Our modifikasjon forenkler og forbedrer nøyaktig posisjonering av uncaging spot, slik at rammene i bildebehandlingsprogrammer kan tjene til å justere bilde og uncaging rammer congruently.
Tatt sammen, hel-celle patch-clamp og multi-foton natrium avbildning i dendritter og pigger av sentrale neuroner, i kombinasjon med en modifisert prosedyre for UV-lysindusert uncaging av glutamat, tillater pålitelig og fokal aktivering av glutamat-reseptorer i vev. Det kan således tjene til å analysere egenskapene til eksitatorisk synaptisk transmisjon og av postsynaptiske natrium-signaler i nevroner i intakt vev.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. Forfatterne har mottatt økonomisk støtte slik at Open Access Publisering av Rapp optoelektroniske (Wedel, Tyskland), som produserer et instrument som brukes i videoen artikkelen. Selskapet var verken involvert i forsøkene heller ikke i datahåndtering og heller ikke i manuskriptet skriftlig.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et stipend fra det tyske Science Foundation (DFG, Ro2327 / 6-1) til CRR Forfatterne ønsker å takke S. Durry og C. Roderigo for ekspert teknisk assistanse, og M. Dübbert (Electronics Laboratory, Zoologisk Institutt , Universitetet i Köln, Tyskland) for å få hjelp i gjennomføringen av Pockelscellen kontrolleren og HF-switch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
- Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
- Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
- Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
- Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
- Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
- Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
- Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
- Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
- Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
- Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
- Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
- Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
- Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
- Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
- Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
- Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
- Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
- Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).
