Summary
Мы описания комбинации фокусным ультрафиолетовым излучением фото-активации нейро-активных соединений с цельноклеточной патч-зажим и мульти-Фотон изображений внутриклеточных переходных натрия в дендритов и шипиков нейронов гиппокампа в острых кусочков ткани мозга мыши.
Abstract
Многофотонная флуоресцентной микроскопии позволило анализ морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, он широко используется для изучения деятельностных сигналы кальция в небольших субклеточных отсеков, таких как дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также вызывает постсинаптические сигналы натрия, свойства которых лишь незначительно понятны. Здесь мы опишем метод комбинированного цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в клеточных микро областях центральных нейронов. Кроме того, мы вводим модифицированный порядок ультрафиолетового (УФ) -light вызванной uncaging глутамата, что позволяет надежную и фокусное активацию рецепторов глутамата в тканях. С этой целью, цельноклеточные записи проводились на Корню Ammonis подразделения 1 (АК1) пирамидальных нейронов в острых кусочков тканигиппокамп мыши. Нейроны были наполнены SBFI флуоресцентным красителем натрия чувствительных через патч-пипетки, и многофотонное возбуждение SBFI включен визуализации дендритов и смежных шипами. Чтобы установить УФ-индуцированного фокусное uncaging, несколько параметров в том числе интенсивности света, объема, пострадавших от УФ uncaging луча, положения пучка, а также концентрации в клетке соединения были испытаны и оптимизированы. Наши результаты показывают, что местное кровоснабжение с клетке глутамата (MNI-глутамат) и его фокусное УФ-uncaging результат в внутрь токов и переходных натрия в дендритов и шипами. Время, конечно, и амплитуда токов как вовнутрь, так и сигналов натрия коррелирует с длительностью импульса uncaging. Кроме того, наши результаты показывают, что внутриклеточные сигналы, натриевые заблокированы в присутствии блокаторов для ионотропных глутаматных рецепторов, демонстрируя, что они опосредованы притока натрия, хотя этого пути. Таким образом, наш метод обеспечивает надежный инструмент дляИсследование внутриклеточных сигналов натрия, вызванных активацией рецептора фокальной в интактной ткани головного мозга.
Introduction
Последние достижения в световой микроскопии методов, таких как многофотонной микроскопии позволили изучение морфологических и физиологических параметров клеток мозга в неповрежденной ткани с высоким пространственным и временным разрешением. В сочетании с электрофизиологии, эти методы в настоящее время широко используется для анализа деятельности, связанных электрических сигналов в нейронах, а также сопутствующих сигналов кальция в небольших субклеточных отсеков, а именно в мелких дендритов и дендритных шипиков. В дополнение к переходных кальция, синаптической активности также индуцирует сигналы натрия в дендритов и шипами, свойства которых в значительной степени неисследованными. Такие сигналы могут быть проанализированы двухфотонного визуализации внутриклеточного натрия ([Na +] I), который позволяет он-лайн измерение [Na +] Я переходных для длительных периодов времени без заметного обесцвечивания красителя или фото-повреждения 1,2.
Для визуализации [Na +] Я например, короны Зеленый или Asante Натрий Зеленый 3,4. Наиболее часто используется флуоресцентного зонда для визуализации Na + является натрий-связывающий бензофурана изофталата (SBFI). Это ратиометрический, УФ-возбужденных краситель аналогично известному кальций-чувствительного красителя фура-2 и был использован для обычного изображения Na + во многих типах клеток (например, 5,6). Существуют различные возможности возбуждения красителя и сбора его флуоресценции. Если высоким временным разрешением (т.е. частота кадров высокой томография) требуется в сочетании с пространственной информацией, SBFI могут возбуждаться с ксеноновой дуговой лампы или высокой мощности светодиодной (LED) устройства и его излучения обнаруженного с высокой скоростью заряда -coupled (ПЗС) камеры 7,8. Для максимального пространственного разрешения глубоко в ткани, многофотонное лазерная сканирующая микроскопия является методом выбора 9. Относительно низкий квантовый efficieNCY из SBFI требует относительно высокие концентрации красителя (0,5 - 2 мм) и прямую загрузку с мембраной непроницаемой виде SBFI через резкого микроэлектрода 10 или патч-пипетки 1.
Использование SBFI, ранее выполненные работы в острых кусочков ткани грызунов гиппокампа показали деятельностных переходные натрия в дендритов и шипами CA1 пирамидальных нейронов, которые в основном вызванные притоком натрия через ионотропного NMDA рецепторов 1,2. Для изучения свойств таких местных сигналов натрия более подробно, удельная активация постсинаптических рецепторов путем применения агонистов рецептора представляет собой хорошо подходит метод выбора. Чтобы имитировать пресинаптическое активность и выделения медиатора, приложение должно быть относительно коротким и сосредоточены для разрешения локальных стимуляции. Это, однако, оказывается довольно сложной задачей в интактной ткани. Приложение Часовой давление агонистов рецептора с помощью пипетки с острым концом позволяет очень фокусное арпликация, но проходит потенциальный риск для получения движение структуре интерес (например, таких, как дендрита или дендритных шипов), и, таким образом, препятствует высокого разрешения изображений. Пригодность ионофореза нейро-активных веществ зависит от их электрических свойств и высокие амплитуды тока может производить сотовые артефакты, а также.
Один из способов обойти эти препятствия является применение фото-активированный соединений и их импульсного фотолиза. В принципе, два разных принципы используются для фото-активации в клетке веществ: I) Широкий поля импульсного фотолиза 11 и II) фокусное uncaging использованием модулей сканирования с лазерами на 12. Хотя широкого поля импульсного фотолиза используется для активации большие области, представляющие интерес, например, целая клетка, фокусное uncaging используется для специально стимулировать небольшие клеточные отсеков. В настоящем исследовании мы демонстрируем порядок цельноклеточная патч-зажим и мульти-рHoton изображений натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, который позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с институциональными руководящими принципами Генрих Гейне университета Дюссельдорфе, Германия, а также директивы Европейского сообщества Совета (86/609 / EEC). Все эксперименты были доведены до сведения и утверждается ведомства по делам животных на уходу и использованию животных фонда Генриха Гейне университета Дюссельдорфа, Германия (институциональной числа акта: O52 / 05). В соответствии с Законом немецкой защиты животных (Tierschutzgesetz, статьи 4 и 7), никакого формального дополнительное утверждение для посмертного удаления ткани мозга не было необходимости.
Для генерации острых ломтиками, мышей анестезировали CO 2 и быстро обезглавил (в соответствии с рекомендацией Еврокомиссии опубликован в: Эвтаназия экспериментальных животных, Люксембург: Бюро официальных публикаций Европейских Сообществ, 1997; ISBN 92-827-9694 -9).
1 ПолучениеРешения
- Подготовка искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) для вскрытия, содержащей (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, и 20 глюкозу, продувают 95% О 2 и 5% СО 2, в результате чего рН 7,4.
- Подготовьте ACSF для экспериментов, содержащих (в мм): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, и 20 глюкозы, пропускают с 95% О 2 и 5% CO2, в результате чего В рН 7,4.
- Подготовка внутриклеточный раствор (ICS), содержащий (в мМ): 150 KMeSO 3, 12,5 гидроксиэтил пиперазин этансульфоновой кислоты (HEPES), 40 KCl, NaCl 5, 1,25 этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (EGTA), 5 мг АТФ, 0,5 Na- GTP. Отрегулируйте рН до 7,3. Магазин аликвоты по 1 мл при -20 ° С.
- Развести натрия связывания бензофурана изофталата (SBFI) -salt в дважды дистиллированной воды и подготовить аликвот 5 мклиз 10 мМ исходного раствора.
- Оттаивания ИКС и добавить SBFI маточного раствора в конечной концентрации 1 мМ. Vortex и микро-фильтрат (0,22 мкм). Хранить при 4 ° С, пока не использовали в эксперименте. Не замораживать и использовать только в течение одного дня.
- Подготовьте MNI глутамат маточного раствора 50 мм путем растворения соединения в дважды дистиллированной воды. Развести MNI глутамата маточного раствора в конечной концентрации 5 мМ в нормальном ACSF. Хранить при 4 ° С, пока не использовали в эксперименте. Не замораживать и использовать только в течение одного дня. Магазин аликвоты, которые не сразу, используемые в эксперименте, при -20 ° С.
2 Рассечение ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка острых срезов гиппокампа головного мозга грызунов была описана ранее 13,14. Короче говоря, следующий протокол был использован в настоящем исследовании.
- После декапитации, быстро удалить мозг от черепа.
- Сразу же место мозг в чашке Петриледяной рассечение ACSF и анализировать полусферу, выполняя сагиттальной разрез по средней линии.
- Выполните второй разрез в нужной ориентации в качестве блокирующего поверхности и прикрепите к режущей стадии vibratome с суперклеем.
- Возьмите камеру дробления и охлаждающим элементом (оба хранили при -20 ° С) в vibratome из морозильной и место резки этапе с разделом мозга в камере. Затем положить охлаждающий элемент в камере и погрузите ткань в ледяной рассечение ACSF. Для стабилизации препарата, может быть желательным, чтобы противостоять тканей блок с агарозном геле.
- Вырезать 250 мкм, парасагиттальной ломтики гиппокампа с vibratome. Убедитесь, что все жидкости СКУД пропускают во все времена.
- После нарезки, держать ткань на сетке в химическом стакане с нормальной ACSF и инкубируют при 34 ° С в течение 30 мин. Тогда держите при комнатной температуре.
3 Получение Hardware
Рис.1 показывает легкие пути и экспериментального контроля буровой установки, состоящей из нескольких фотонов изображений, лазер-сканирующей УФ импульсного фотолиза и электрофизиологии. Многофотонной луча (красный) производится с помощью импульсного, перестраиваемой инфракрасного (ИК) лазера (Тиса). Она проходит механический затвор, ячейки Поккельса ', и ИК-датчик (обнаружение интенсивности пучка), все из которых, позволяет управлять мощности лазера и его продолжительность администрации. Флип-в / из флип-дополнительно лазерный диод используется для основного выравнивания лазерного луча. Расширитель пучка может быть использован в сочетании с целями с очень широким обратно-фокальной плоскости. ND фильтр колеса с дистанционным управлением может быть использован в дополнение или вместо клетки Поккельса 'для управления мощностью лазерного луча. После прохождения головки сканирования, импульсного ИК-света направляется на образец. ИспуститеТед свет флуоресценции (светло-зеленый) собирают либо внешний или внутренних детекторов фотоэлектронных (ФЭУ). Внешние датчики полностью синхронизированы с внутренними ФЭУ с помощью переключателя высокочастотного (контроллера PMT). Uncaging луч (светло-голубой) производится с помощью УФ твердотельного лазера (DPSS УФ-лазер). Затем направляется в Galvo механическим приводом сканирования в правом верхнем задней части эпи-флуоресценции конденсатора по световода. Точное позиционирование (хроматические аберрации между изображениями и uncaging луча) в uncaging месте или области включена по экспорту изображений от ПО для обработки изображений. Руководство сроки для синхронизации изображений, электрофизиологии и флэш-фотолиза с электронным управлением. Детектор просвечивание (TL-PMT) имеет необходимости в документации позиционирования пипеток в ткани. Блоки управления и программное обеспечение системы формирования изображения, который был модифицирован, используется для управления и синхронизации всех других устройствнеобходимы для запуска системы. Компоненты системы помечены как "обычай" были разработаны и построить / адаптированы авторами. Некоторые компоненты были адаптированы для удовлетворения требований заказ сборки системы многофотонной и помечены как "изменение". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Включите компонентов системы мульти-фотонов. Проверьте и отрегулируйте выравнивание инфракрасного лазерного луча.
- Контроль позиционирования луча, листать в центрового призму вместо объективной. Если пучок вывихнул, повторно отрегулируйте его зеркала в перископ. Следует отметить, что центрирующее плоскость призмы должна быть на том же уровне, что и задней фокальной плоскости объектива то время как изображения.
- Включите спектрометра и проверить на нескольких фотонов характеристик пучка.
- Установите параметры обработки изображений в следующих значений: Выберитеразмер кадра 512 х 512 пикселей для обзорных образов клеток (более мелкие клипа коробки с коэффициент увеличения 2,5 для высокой частотой кадров и высоким пространственным разрешением, соответственно). Установить скорость визуализации в быстром режиме и режиме сканирования до XYT. Z-степпинг должен быть 1 мкм для обзорных стеков и 0,2 мкм для подробных стеков, чтобы соответствовать требованиям пространственные выборки для деконволюции, осуществляемом позже.
- Отрегулируйте многофотонное лазерный луч (790 нм) интенсивность, изменяя настройки ячейки Поккельса "(конечная мощность под цели: ≈ 14 - 16 мкВт) и фото-мультипликаторы (ФЭУ).
- Включение и калибровки uncaging систему путем размещения флуоресцентный образец слайд под объективом.
- Использование бинокль, настроить фокус УФ оптики и пространственно ограничить УФ лазерное пятно размером до 2 мкм в диаметре при максимальной используя фокусировки блок во главе сканирования УЗА.
- Запустите калибровки будни uncaging управления агрегата Softwarэ.
- Установка УФ лазер с несколькими точками в пределах его диапазона сканирования, в то время как флуоресценция захвачены с ПЗС-камерой. Нажав на УФ лазерного пятна в каждой точке, настроить позиционирование гальванических зеркал сканирования, чтобы соответствовать определенный координат в программном обеспечении.
Рисунок 2 Подробная схема, иллюстрирующая характеристики возбуждения, испускания и uncaging траекторий лучей. Луч ИК возбуждения (красный) пересекает луч, сочетающий дихроичное зеркало на уровне в системе хранения башне в эпи-флуоресценции конденсатора микроскопа и цели к достичь образца. Uncaging луч (синий) доставляется через кварцевую оптического света волокна к коллимации и балки блок фокусировки и затем впоследствии направляется в сканирующих миrrors в устройство сканирования, передает дихроичное зеркало к лучевой объединения зеркальные. Вот она сочетается со сканирующим возбуждения луча. Излучаемый свет от образца следует по пути на пути луча сканирования возбуждения в противоположном ориентации сканирующей головки изображений. Камера используется для визуального контроля патч-пипетки и позиционирования uncaging пучка в сочетании с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (не показан). Путь зеленый свет означает возможную освещенность эпи-флуоресценции, которая может быть использования с другими приложениями.
- Используйте систему импульсного фотолиза в точечном режиме, чтобы получить координационные приложений. Убедитесь, что фокусное регулировка uncaging пучка (средней мощности под цели: 0,55 мВт) приводит к размере пятна 1,5 мкм в диаметре (ху расширения), обнаруженного на источник флуоресцентного горкой, расположенной на Z-уровня, который соответствует, что из тканейсрез (не показан).
- Точное позиционирование uncaging месте достигается за счет импорта образа системы формирования изображения посредством сетевого соединения между uncaging- и обработки изображений-компьютеров.
- Используя программное обеспечение экран граббер, непрерывно считывать рамках ПО для обработки изображений (вместо корма камеры) и отрегулируйте изображений и uncaging кадров конгруэнтно. Экспорт каждый 10-й кадр из ПО для обработки изображений в качестве опорного изображения в вспышке, чтобы обеспечить надлежащую корректировку в течение всего эксперимента.
Рисунок 3 Регулировка uncaging месте: Чтобы точно позиционировать uncaging пятно, снимок экрана с ПО для обработки изображений (желтой рамкой) импортируется в uncaging программного обеспечения (зеленая рамка).Левое изображение в желтой рамке представляет собой закодированное Привет-Lo изображение (синий: черные пикселей, красный: насыщенный пикселей) всего CA1 пирамидальных клетки. Изображение накладывается калибровочной сетке uncaging программного обеспечения (зеленый "X" с). Справа, увеличенная часть ячейки показана с накладным uncaging месте (красный крест). Желтое пятно является автоматически накладывается образ uncaging луча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Включите микроманипуляторами, компонентов электрофизиологии и устройства для нанесения давление на поставку в клетке соединения к целевому регионе.
- Установите фокусное устройство передачи давления для местного перфузии клетке соединений. Это приведет к снижению расходов чрезвычайно по сравнению с ванной перфузии этих веществ. Отрегулируйте холдинг давление к данному атмосферном давлении, чтобы предотвратить сопротивление переменного токаSF в или утечка в клетке веществ из пипетки приложений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство приложения давления, проводит очень точную и сверхбыстрого микро-клапан в держателе пипетки. Это позволяет использовать минимальные давление приложений и, следовательно, уменьшает артефакты движения к минимуму во время локальной перфузии в клетке соединения. - Потяните пипетки для цельноклеточной патч-зажим и местного перфузии с помощью огневой полировкой боросиликатного стекла капилляров. Пипетки должны иметь диаметр кончика ~ 1 мкм и сопротивление R ≈ 3 МОм (значений, определенных с K-MeSO 3 основанное ICS).
- Место среза в экспериментальной ванной и прикрепить его с сеткой (платина раме толщиной 250 мкм, натянутое с хирургическими нитями, од 40 мкм) (рисунок 4А, Б). Используйте перевернутую, наконечник-сломаны, и огневой полировкой пипетки Пастера (всасывания мяч на стороне сломанной оконечности) для передачи среза. При изгибе и любой другой жесткая обработка среза.
- Поместите ванну на столике микроскопа и постоянно заливать кусочек с ACSF.
- Нагрузка патч пипетки с ICS, содержащих SBFI и загрузки локальных перфузии пипетки с клетке соединения. Прикрепите пипетки в соответствующих микроманипуляторами. Поместите электрод в ванне. Убедитесь, что вы заземлены постоянно, чтобы избежать повреждения голове сцены (см Рисунок 4C).
- Опустите обе пипетки в ванну и поместите их выше области гиппокампа СА1. Нежный давление патч пипетки (+40 мбар), чтобы избежать разбавление ICS с ACSF.
- Компенсировать смещение потенциал патч пипетки с помощью программного обеспечения электрофизиологии.
- Подойдите к СА1 пирамидальной клетки при помощи патч пипетки с использованием ИК-ДИК видеомикроскопия. Нежный всасывание до получения Giga-печать. Выберите ячейку, сому из которых находится 30 -70 мкм ниже поверхности среза для обеспечения нетронутыми морфологии клеток на стороне одной стороны и низкой рассеяния и ослабления uncaging луча на другой стороне.
- Компенсировать быстрого мощности. Перерыв MEMBRANе и с открытыми порами, чтобы получить конфигурацию целой клетки.
- Компенсировать небольшую скорость и сопротивлением.
- Разрешить клетка для диализу с SBFI-ICS, по крайней мере за 30 минут до начала экспериментов визуализации.
- Добавить тетродотоксин (ТТХ, 500 нМ) с ACSF чтобы предотвратить активацию напряжения натриевых каналов и генерации потенциалов действия.
- Представьте клеточной морфологии при возбуждении многофотонное и в результате флуоресценции SBFI и выбрать колючий дендрит для эксперимента. Увеличить для изображений с более высоким разрешением и разместить клип рамку вокруг дендритов.
- Заполните стандартный патч пипетки с 10 мкл ACSF содержащей клетке глутамат. Подключите пипеткой прикладной системы давление и прикрепить ее к микроманипулятора.
- Поместите пипетку с клетке соединения возле дендритов (~ 30 мкм). Расположите пипетку, чтобы позволитьэффективный локальный перфузии дендрита выбора. Отрегулируйте uncaging лазер: расположите uncaging место близко (~ 1 - 2 мкм) в структуре интересов.
- Набор регионы процентов по выбранной дендритов и смежных шипов с помощью обработки изображений.
- Подойдите к области интереса и централизовано вводить клетке соединение для нескольких сек с низким давлением (<3 PSI). Начните патч зажим и флуоресценции записи (на 790 нм возбуждения нескольких фотонов) с помощью сигнала синхронизации.
Примечание: В локальной перфузии в клетке соединения, луч возбуждения полностью серым цветом, чтобы предотвратить обесцвечивание. - Стоп местной перфузии в клетке соединения. Увеличение интенсивности двухфотонного лазера, чтобы обеспечить эффективное возбуждение SBFI и применять УФ вспышку для инициализации uncaging (uncaging продолжительность 300 мс).
- Монитор изменения в флуоресценции SBFI. Остановить запись после флуоресценции SBFI восстановился обратно к исходному уровню.
- Чтобы проверить причастность ионотропных рецепторов глутамата в генерации токов и / или сигналов натрия вызванных УФ-импульсном фотолизе клетке глутамата, используют блокаторы рецепторов.
- Перейти к ACSF содержащей АМРА-рецепторов блокатор циано-нитрохиноксалина-дион (CNQX, 10 мкмоль) и NMDA-рецепторов блокатор амино-phosphonopentanoate (APV, 50 мкМ) в дополнение к ТТХ (см выше) и заливать кусочек по крайней мере 10 мин.
- Повторите процедуру стимуляции (см 5,4 и 5,5.)
- Обратимость эффектов ингибиторов "
- Вернитесь к нормальной ACSF, содержащей только ТТХ.
- Заливать кусочек в течение 20 мин.
- Повторите процедуру стимуляции (см 5,4 и 5,5.).
- Запись XYZ-стек клипа коробка-области набора для проведенных измерений. Убедитесь, что это стек передискретизацииD пространственно (по крайней мере, 0,2 мкм на пиксель), чтобы позволить оптимальную деконволюцию изображения и повысить качество и разрешение изображения.
- Запись XYZ-стек всей клетки для оценки морфологии клеток.
- Запустите алгоритм деконволюции.
Рисунок 4 Компоненты экспериментальной ванной и позиционирования ванны на столике микроскопа. () Экспериментальная ванна состоит из самого (синий квадрат) ванны камеру, которая окружена магнитным металлическим кольцом. Трубка обеспечивает непрерывную перфузию ванны с раствором (ACSF). Сетка удерживать и фиксировать кусочек помещается в ванной камере. (B) Острая подготовка ломтик расположен внутри ванны камере. Срез фиксируется нитей сетки. (С) Позиционирование и геометрия экспериментальной бане при столике микроскопа в ходе экспериментов.
4 Цельноклеточная патч-зажим
5 Многофотонная изображений и стимулирование
Рисунок 5 Протокол эксперимента. Для инициализации эксперимент, запускающего импульса (обозначается красным знаком (ᴨ) и красной линии) устанавливается одновременно запустить томографии (синий), электрофизиологии (зеленый), и администрацию в клетке соединение (желтый) в момент времени 0 сек. В этот первый период, луч визуализация должна быть полностью затемнены (светло-голубой). После 4,5 сек (пунктирная линия), локальная перфузия в клетке соединения завершается, и луч изображения должно быть установлено в его врИнтенсивность король для сбора данных (синий). 1.5 сек после (временная точка 6 сек), второй импульс триггера дается (обозначено красным знаком (ᴨ) и красная линия), который инициализирует УФ вспышки (продолжительность вспышки: 300 мс; указанном желтой вспышкой ) и устанавливает маркеры в электрофизиологических и протокол обработки изображений.
6 Фармакология
7 Морфология
Representative Results
В настоящем исследовании мы демонстрируем порядок многофотонной микроскопии динамики клеточных натрия с SBFI флуоресцентного красителя натрий-зависимого в CA1 пирамидальных нейронов острый мыши ломтиками ткани гиппокампа. Кроме того, мы покажем, как объединить эту технику визуализации с лазерного сканирования на основе uncaging нейро-активных соединений (например, в клетке глутамата) и его точного наведения на сотовые микро-доменов.
Загрузка нейроны с SBFI через патч-пипетки включен визуализацию всей клетки в том числе мелких дендритов и смежных шипов за счет использования возбуждения многофотонной (фиг.6А, В, D и 7А).
Рисунок 6 сигналы натрия и синаптические токи, индуцированные импульсном фотолизе клетке глутамата. () Максималь проекция образ CA1 пирамидальных нейронов загруженной с SBFI через патч пипетки (PP). Коробка показывает область показано в увеличенном виде Б. LP указывает на положение и ориентацию пипетки для местного перфузии в клетке глутамата. (Б) высокой мощности максимальный выступ стопку оптических секций дендрита с соседними дендритных шипов. Стопки оптических секций прошли Z-выравнивание и деконволюции. Красный крестик указывает целевую область uncaging луча. Оранжевый пунктирная линия очерчивает область интереса, из которого флуоресценции был записан. Коробка показывает область показан в увеличенном Д. (С) слева: натрия сигнал (верхний ряд) и соматических внутреннюю тока (нижний ряд), вызванное импульсном фотолизе клетке глутамата (обозначается желтой вспышкой). Красная линия представляет собой подгонку экспериментальных данных. Серая зона представляет собой период, в котором uncaging вспышки (300мсек) не препятствовали визуализации флуоресценции SBFI Справа:. Без предварительной перфузии клетке глутамата, то же самое УФ-вспышки ни вызывали изменения в эмиссии SBFI, ни входящего тока (D) Слева:. Высокая мощность образ дендрита и рядом шипы, как это описано в B. Вместе с тем, тот же образ с перевернутыми значений серого. Пунктирные линии указывают регионы интерес, в котором излучение флуоресценции записанные. Красный крест указывает на локализацию uncaging луча Справа:. Натрий переходные, вызванные УФ-импульсном фотолизе клетке глутамата. Синий след: натриевые сигналы в дендритов; красный след: в среднем отклик от трех шипов, прилегающих к uncaging месте; зеленый след: в среднем отклик от трех дальних шипами. для более полной версии этой фигуры Пожалуйста, нажмите здесь.
После местной перфузии с клеткамиглутамат, применяя УФ-вспышку близко к дендрита привело к уменьшению переходного флуоресцентное излучение SBFI, что отражает увеличение внутриклеточной концентрации натрия (фиг.6С, D и 7В). В то же время, внутрь ток был записан в сомы (фиг.6С и 7В). Увеличение длительности вспышки УФ привело к увеличению амплитуды и вызвала внутрь токов и сигналов натрия (данные не приведены), что указывает, что система была в пределах его динамическом диапазоне, и что ни один, ни uncaging клеточные ответы были насыщены. Применение УФ-вспышкой, идентичной или более длительный срок, чтобы кусочки, которые не были предварительно перфузию клетке глутамата, не вызывал изменений в SBFI флуоресценции ни внутрь токов, что указывает, что эти сигналы обусловлены uncaging глутамата (фиг.6С). Кроме того, эти результаты показывают, что ни взаимозависимость imaging- и uncaging компонентов не наблюдается UNDER наших экспериментальных условиях. Сигналы натрия может быть также обнаружен в дендритных шипов (Рисунок 6d). В то время как мы не пытались добиться стимуляции одной позвоночника только с глутаматом uncaging, пиковые амплитуды имели тенденцию быть немного выше, в колючки, близких к uncaging месте, в то время как шипы дальше показали практически идентичные изменения флуоресценции, как и родительский дендритов (Рисунок 6D).
Наконец, мы изучили путь для притока натрия в дендритов и шипами в ответ на uncaging глутамата. Для этого мы использовали CNQX и APV, которые являются селективными блокаторами для натрий-проницаемой, ионотропных глутамата рецепторы AMPA- и NMDA-подтипа, соответственно. Наши результаты показывают, что глутамат-индуцированный сигналов внутриклеточного натрия и вызвал соматические токи были опущены в присутствии этих блокаторы (фиг.7В). После вымывания из блокаторов, сигналы восстановили. Это показывает, тхат uncaging глутамата активизирует ионотропных рецепторы глутамата на СА1 пирамидальных нейронов, которые опосредуют приток натрия в дендритов и шипами, в результате внутриклеточных переходных натрия и внутрь токов.
Рисунок 7 Фармакологический профиль вызванных сигналов натрия и внутрь токов. () SBFI заполненные CA1 пирамидальных нейронов с патч пипетки (ПП), который прилагается к сомы (B) Слева:. Натрия переходный и соматической ток, индуцированный фото-активации в клетке глутамата в дендрита и прикрепленные шипы Центр:. Перфузии с блокаторы глутаматных рецепторов ионотропные CNQX и APV ингибирует как сигнал натрия и внутреннюю ток, индуцированный uncaging Справа:. После вымывания из блокаторов, сигналы будут восстановлены. Красные представи линиитс приступ экспериментальных данных. Серая зона представляет собой период, в котором uncaging флэш (300 мс) препятствовали визуализации флуоресценции SBFI. для более полной версии этой фигуры Пожалуйста, нажмите здесь.
Discussion
Настоящее исследование показывает, что SBFI хорошо подходит для двухфотонного визуализации внутриклеточных переходных натрия в малых сотовых отсеков. Следует иметь в виду, однако, что квантовая эффективность SBFI довольно низкие 15 и относительные изменения концентрации натрия довольно небольшие с физиологической активности. Таким образом, с высоким разрешением измерение Na + переходных процессов в тонких процессов является относительно трудоемкой задачей, и биннинг или усреднение нескольких испытаний необходимо получить удовлетворительные сигналы. Кроме того, кинетика переходных натрия удивительно медленно, что делает его обязательным для записи в течение длительных периодов времени. Это наблюдение соответствует тем в более ранних исследований, в которых моноэкспоненциален распад переходных натрия в нейрональных дендритов и в астроциты были характерны большие постоянные времени затухания в диапазоне от 10 сек при комнатной температуре в 1,2,6. Переходные натрия, таким образом, кажется, оказывают гораздо медленнее времени сотрудничестваUrse и гораздо более крупные временные распада константы как по сравнению с кальция переходных 16.
Отложите эти недостатки, изображений натрия оказывается ценным инструментом для исследования физиологических свойств нейронов поддоменов. Например, изображения натрия может служить для контроля возбуждающую синаптическую активность на уровне или близко к активных синапсов. Поскольку натрия, по существу, не сохраняются в буфере 8,17, активность индуцированной переходные натрия линейно связаны с широким диапазоном синаптической выпуска глутамата или экзогенно применяются глутамата. Они, следовательно, представляют собой прямые, беспристрастные показатели нейронов глутаматергической деятельности. Кроме того, индикатор натрия красители обладают высокой Уб 'ы (SBFI в Уб находится в диапазоне от 25 мм 1). Даже при относительно высоких концентрациях внутриклеточных красителей, используемых для достижения достаточной яркости (обычно 0,5 - 1 мм), высокой Уб 'ы подразумевает, что сами красители не действуют в качестве буферов для сOdium. Следовательно, они не искажают амплитуду, ни временной ход переходных натрия, который всегда является проблемой, когда кальция чувствительных красителей вводят в клетки 18. Таким образом, можно предположить, что обнаруженные сигналы представляют собой хорошую меру "реальных" изменения внутриклеточного натрия. Их медленное время, конечно, то означает, что скорость диффузии для внутриклеточного для натрия в нейронах значительно меньше, чем предполагалось ранее 19.
Важным условием для успешного проведения экспериментов, касающихся свойств возбуждающих синаптических передачи и притока натрия путей в колючки и дендритов является индукция быстрого и высоко локализованной активации постсинаптических структур. Это может быть получено быстро и местного применения глутамата или глутамата агонистов в непосредственной близости от позвоночника или дендритов по флэш-фотолиза клетке соединений. Импульсный фотолиз не механически DamaGE ткани, свободен от артефактов движения и хорошо известна за расследование связанных с этим вопросов (например, местную сигнализацию кальция). Диаметр uncaging месте был 1,5 мкм в плоскости ху. Uncaging близко к колючий дендритов индуцированных сигналов натрия в обоих шипами и родитель дендритов. В то время как сигналы, как правило, по величине в шипов, ближайших к месту uncaging, амплитуды в родительском дендрита и шипы еще дальше по-прежнему довольно близки к тем, в непосредственной близости от uncaging месте. Uncaging проводили в течение 300 мсек, в течение которого внутренние токи увеличению амплитуды. Uncaged глутамат, возможно, рассеянный в ткани в течение того же периода времени, активации ионотропных рецепторы глутамата и приток натрия на дендритных регионов и шипами дальше от uncaging месте.
Внутренняя проблема, которая возникает при использовании УФ лазер для фотолиза в клетке соединений, вводимых через клеточную растворе ванныявляется «внутренняя фильтрация». В связи с высокой скоростью поглощения клеткой, УФ-излучение ослабляется сильно по пути от объектива к стимуляции сайте 20,21. Еще один вероятный способ избежать этого является локальной перфузии с клеткой, ограниченной только на сайте стимуляции, которая, кроме того, уменьшается количество клетке соединения, необходимая к минимуму. По сравнению с УФ лазерного сканирования опосредованного uncaging, почти инфракрасного двухфотонного uncaging 22 пространственно точнее, в основном потому, что точность стимуляции увеличивается в оси. С другой стороны, в связи с небольшим поперечным сечением, обычно используемых клетках в течение более длинных волн, как работающих с двухфотонном возбуждении, либо высокая концентрация соединения в клетке или очень высокой, потенциально фототоксические интенсивности света необходимы. Кроме того, двухфотонная uncaging требует гораздо выше инвестиции в оборудование; среди прочего, дополнительный ИК лазер плюс обязательные оптические компоненты, необходимы.
Оба SBFI и MNI-глутамата в возбудимых в одинаковом диапазоне длин волн. Это может привести к непреднамеренной взаимозависимости УФ uncaging лазера и SBFI или лазера ИК изображений и MNI-глутамата, в результате отбеливания SBFI по uncaging вспышкой и / или непрерывном uncaging глутамата по ИК-луча. Однако, как показано на рисунке 6С, ни УФ вспышка сама по себе, ни мульти визуализации фотонов не вызвал таких взаимные эффекты в условиях нашего эксперимента.
УФ-флеш систем, подобные описанному здесь обычно используются во многих других лабораториях и может относительно легко быть включены в любой существующий мульти-Фотон изображений микроскопом. Это дает то преимущество, что лазерный луч для фотолиза может быть размещен свободно в поле зрения. Кроме того, система обеспечивает быстрый и автоматизированный изменение положения лазерного луча и объем выпуска, соответственно, в поле зрения во время эксперимента. OuR модификации упрощает и улучшает точность позиционирования uncaging месте, так, чтобы рамы обработки изображений может служить для регулировки изображений и uncaging кадров конгруэнтно.
Взятые вместе, цельноклеточная патч-зажим и визуализации многофотонной натрия в дендритов и шипов центральных нейронов, в сочетании с модифицированной процедуры для УФ-света, вызванного uncaging глутамата, позволяет надежно и фокусное активации глутаматных рецепторов в ткани. Он может, таким образом, служат для анализа свойств возбуждающей синаптической передачи и постсинаптических сигналов натрия в нейронах в неповрежденной ткани.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующие интересы. Авторы получили финансовую поддержку благоприятных открытые публикации доступа по Рапп оптоэлектронные (Ведель, Германия), который производит прибор, используемый в видео статьи. Компания была ни участие в экспериментах, ни в обработке данных, ни в письменной форме рукописи.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом немецкого научного фонда (DFG, Ro2327 / 6-1), чтобы КПП Авторы выражают благодарность С. Durry и С. Родриго для экспертной технической помощи, и М. Dübbert (Electronics Laboratory, Зоологический институт , Кельнский университет, Германия) для помощи в осуществлении контроллер ячейки Поккельса и переключатель HF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate-glass capillaries | Hilgenberg | 1405059 | 75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
| Camera | Jenoptik | ProgRes MF | IR-DIC compatible camera |
| Deconvolution software | SVI | Huygens Pofessional X11 | |
| Fiber optic spectrometer | Ocean Optics | USB 4000 | Miniature fiber optic spectrometer |
| Filter tubes | VWR | cenrifugal filter, 0.2 µm | |
| Imaging software | Olympus Europe | Flowview Ver 5.0c, Tiempo | |
| IR beam power controller | Custom built | Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell | |
| IR laser | SpectraPhysics | Mai-Tai | fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION |
| IR power monitor | Custom built | ||
| Micromanipulator | Burleigh | PCS 5000 | |
| Microscope/Imaging System | Olympus Europe | BX51WI/FV300 | Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified |
| ND filter wheel | Newport | 50Q04AV.2 | UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0 |
| Objective | Nikon Instruments Europe | NIR Apo 60x/1.0w | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Pipette puller | Narishige | Model PP-830 | |
| Pneumatic drug ejection system | NPI Electronic | PDES-DXH | |
| Pockels cell | Conoptics | 350-80 LA-BK | EOM, used as fast switch and for power adjustment |
| Pockels cell driver | Conoptics | M302-RM | High voltage differential amplifier |
| Shutter | Vincent Associates | LS6ZM2 | ALMgF2-coated BeCu blades |
| Shutter controller | Custom built | ||
| Shutter driver | Vincent Associates | Uniblitz VCM D1 | |
| Slicer/Vibratome | Thermo Scientific | Microm HM 650 V | |
| Uncaging software | Rapp OptoElectronic | UGA40 1.1.2.6 + NetCam | |
| UV laser | Rapp OptoElectronic | DL-355/10 | cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION |
| UV laser scanning system | Rapp OptoElectronic | UGA 40 | Galvanometric scanning system |
| Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| CNQX | Sigma Aldrich | C-127 | AMPA receptor antagonist; CAUTION |
| DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION |
| SBFI K+ salt | Teflabs | OO32 | |
| TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION |
| NMI-caged-L-Glutamate | Torcis | 1490 | Caged glutamate released upon UV absobtion |
References
- Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons. Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).
- Rose, C. R., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites. J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).
- Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging. J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).
- Lamy, C., Chatton, J. Y. Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes. NeuroImage. 58, 572-578 (2011).
- Lasser-Ross, N., Ross, W. Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells. Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).
- Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission. Glia. 56, 1138-1149 (2008).
- Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).
- Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma. Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).
- Denk, W., Piston, D., Webb, W. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).
- Jaffe, D., et al. The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
- Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons. J. Vis. Exp. , (2011).
- Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation. J. Vis. Exp. , (2011).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid. J. Vis. Exp. , (2011).
- Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices. J. Vis. Exp. , (2012).
- Minta, A., Tsien, R. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation. Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).
- Despa, S., Bers, D. M. Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering. Biophys. 84, 4157-4166 (2003).
- Regehr, W., Tank, D. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).
- Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. Ionic mobility in muscle cells. Science. 166, 1297-1298 (1969).
- Palma-Cerda, F., et al. New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups. Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).
- Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).
- Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).
