Abstract
살충 저항은 말라리아 제어 프로그램의 주요 문제가있다. 모기는 말라리아는 열대 지방에 편재하는 문제를 제어하게 신속 환경에서 다양한 변화에 적응. 살충제 내성 인구의 출현은 벡터 모기 제어를위한 새로운 약물 표적 경로 및 화합물의 탐사를 보증합니다. 성적인 약은 잘하지만 많은 곤충에 미치는 영향에 대해 알려진하지, 암 연구에 설립된다. 이 연구는 말라리아 벡터,과 아노 펠 레스 gambiae에, 3 Deazaneplanocin (DZNep), 암 치료를위한 실험 후생 유전 학적 약물의 독성 학적 효과를 조사하기위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 화합물이 치료를 컨트롤을 기준으로 성인 모기의 번식력을 감소하는 반면 사망률과 크기의 감소에서 농도 의존적 증가는 DZNep에 노출 미숙 한 모기에서 관찰되었다. 또한, S의 약물 의존적 감소가 있었다 -치료를 제어 할 수 DZNep 상대에 노출 된 후 모기에 adenosylhomocysteine (SAH) 가수 분해 효소 활동. 이러한 프로토콜은 차례로, 수용성 후생 유전 학적 약물 또는 화합물의 독성 학적 효과를 탐험 독특한 멀티 프롱 접근법을 설명, 실험 약물 여러 독성 엔드 포인트를 평가하는 간단한 단계별 절차 연구원 제공 벡터 모기와 다른 곤충에 대한 관심.
Introduction
말라리아는 세계의 곤충 관련 사망의 가장 많은 책임이있다. 추정 219,000,000가지 경우는 주로 아프리카 1 약 660,000 죽음의 결과로, 매년 전세계에서 발생합니다. 공동의 노력에도 불구하고, 말라리아 프로그램은 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다. 살충 처리 bednets 프로그램 실내 잔류 분사 형태 키 구성 요소는 로컬 인구 살충제에 대한 내성이 이러한 노력을 방해한다. 살충제 저항성 모기 인구의 급속한 증가는 주로 자신의 환경 변화에 신속하게 적응하고 다른 틈새 3,4,5을 악용 할 수있는 말라리아 모기의 능력에 기인한다. 살충제 내성 기존 메커니즘을 극복하기 위해, 신규 살충제 대상 및 차세대 화합물의 탐사가 보증된다. 말라리아 m의 다양한 수명 단계에서 실험 살충제의 효능을 결정하기위한 간단한 단계별 프로토콜osquitoes 크게 이러한 노력을 강화한다.
세포주 및 동물 모델에서 약물 효과의 약리 연구는 세포 및 유기체의 유전 및 생리를 조절하는 데 유용한 도구로 후생 유전 학적 약물의 사용을 설립했다. DNA 메틸화 및 히스톤 변형은 하부 DNA 서열 (6)을 변경하지 않고 다세포 생물의 유전자 발현에 영향을 미치는 후생 유전 학적 메커니즘이다. 메틸화와 같은 번역 후 변형은 세포의 무결성 및 유전자 발현을 유지하는데 중요한 역할을하고, 몇 가지 기본적인 프로세스 7,8,9에 영향을 미칠 수있다. 일부 종의 곤충 연구는 oogenesis을 포함하는 과정에서 후성 유전학의 중요성을 강조하고 세포의 유지 보수 (10)뿐만 아니라, 투여 량 보정 (11) 줄기했다. 그러나, 질병 벡터 이러한 측면은 아직 탐험한다. 모기에이 시스템을 조절하는 화합물을 사용하는 것은에서 우리를 제공 할 수있다새로운 살충제 대상 경로에 명소. 3 Deazaneplanocin (DZNep)는 암의 다양한 형태에 미치는 영향은 12,13,14,15,16을 연구되어왔다 알려진 히스톤 메틸화 억제제이다. DZNep 간접적으로 히스톤 라이신 N의 -methyltransferase을 억제 안정적인 수용성 후생 유전 학적 약물 (EZH2), 포유 동물 세포에서 polycomb 억압 복잡한 2 (PRC2)의 구성 요소입니다. PRC2은 다세포 유기체에서 줄기 세포의 성장을 조절하는데 중요한 역할을하고, 히스톤 메틸화 PRC2 매개 된 유전자 침묵의 중요한 측면이다. 면역 결핍 쥐에서, DZNep가 미리 처리 된 세포는 17 이하 발암 것으로 밝혀졌다. 이 약물은 이러한 EZH2 18 연루되는 비 알코올성 지방간 질환 같은 다른 질병을 연구에 사용되어 가고있다. DZNep는 설립 된 S의 -adenosylhomocysteine (SAH) 가수 분해 효소 억제제 19, 20입니다. SAH에서 가수 분해 효소의 억제 결과SAH의 축적은 다시 사용할 메틸 도너 그룹을 제한하여 메틸화 된 활성의 저해에 이르게. SAH는 대사 경로에서 곤충을 포함한 많은 유기체에 의해 이용되는 아미노산 유도체이다. 최근의 한 연구는 휴면에 영향을 곤충 (21)의 개발이 지연 될 수 있습니다 낮은 용량에서 그 DZNep을 보여 주었다.
여기서, 모기 다양한 수명 단계에서 수용성 화합물의 효과를 조사하기 위해 강력한 프로토콜이 개발되어있다. 이 프로토콜의 세 부분은 미숙 한 모기, 성인 혈액 수유 여성, 성인 남성과 여성 모기의 효소 활성에 수용성 화합물의 효과를 조사하는 방법 등이 포함되어 있습니다. 먼저, DZNep 미성숙 모기 발달과 생존을 연구하기 위해 물에 용해시킨다. 이 약물 노출에 10 배 증가에서 발생하는 차이를 비교하기 위해 두 농도에서 수행됩니다. 성인 여성 모기, DZNep에 약물의 효과를 탐색하려면제세동 양의 혈액에 추가하고 여성에 인공적으로 혈액을 공급한다. 그 후, 다산에 약물의 결과는 조사한다. 마지막으로, 효소 활성 분석은 남성 및 여성 성인 모기 SAH 가수 분해 효소 저해에 DZNep의 효과를 결정하는 지표로서 5,5'- 디티 오비스 (2- 니트로 벤조산) (DTNB)을 사용하여 수행된다. 이 프로토콜은 말라리아 모기과 아노 펠 레스 gambiae로 개발되고 있지만, 쉽게 다른 모기 또는 곤충의 모든 종에 대한 관심의 화합물의 효과를 연구에 적용 할 수있다. 이 프로토콜에 자세히 기술은 효율적으로 물 또는 수성 매체에 제한 또는 전혀 용해도 약물에 적용되지 않을 수 있습니다.
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Protocol
참고 : 프로토콜의 세 부분 유충 모기, 다산의 효과를 연구하는 성인 여성에 DZNep의 혈액 기반의 노출 DZNep 약물의 수성 노출을 설명하고 DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제는 간단한 비색 기술을 사용하여 측정 하였다. 상기 분석의 개략도는도 1에 도시된다.
1. 미성숙 모기 개발 및 생존자 분석 실험
참고 :이 섹션에서는 모기 유충 개발 및 생존에 영향을 미치는 수용성 약물의 사용을 설명합니다.
- 해치 A. 28 ° 증류수 C DH (2 O) 및 후면 그들에게 2 차의 령 유충에서 gambiae 계란.
- 여섯 웰의 DNase, RNAse가없는 세포 배양 접시를 타고 각 웰에 10 ml의 dH보다 2 O를 붓는다.
- 2 차의 령에 모기 유충을 선택하고 잘 당 15 애벌레를 추가합니다. 판에 2 차의 령 유충을 추가하기 전에, P여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 그들을 UT.
- 컬러 코딩 테이프와 라벨 우물은 실험을 랜덤합니다. 각 플레이트 (그림 2)에 시험 농도 당 2 개의 우물을 레이블.
- dH보다 2 O. 1 ml의 0.3 mg을 용해시켜 DZNep 1mM의 DZNep 염산염 (MW = 298.73) 스톡 용액을 준비 0.5 μM과 5.0 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 표시된 우물에 DZNep.HCl의 원액을 추가합니다.
참고 : 원액 4 저장할 수 있습니다 단기간 (한달에 1 일) -20에 대한 C를 ° 장기 (1 개월 이상)에 대한 ° C.
주의 : 전술 한 농도에 대한 스톡 용액을 첨가 크게 웰 물의 볼륨을 변경하지 않을 것이다. 그러나 더 높은 농도의 경우에는, 그 화합물의 불필요한 희석을 피하기 위해 유생 매질에 화합물을 용해시키는 것이 바람직하다. - 각 웰에 플레이크 물고기 음식의 동일한 금액을 추가합니다. 커버 플레이트의 28에서 그들을 품어 인큐베이터에서 C를 °.
- 24 시간 노출 기간 이후 DZNep 처리 및 치료 유충 모기의 사망률을 기록합니다. 제거하고 죽은 애벌레를 폐기합니다. 모든 애벌레 죽을 때까지 매일이 녹음을 반복 또는 번데기 및 성인으로 등장. 그들은 번데기까지 유충의 크기는 격일로, 즉, 0 일, 2, 4, 6, 8을 기록한다.
- 적절한 통계적 분석 소프트웨어를 사용하여 유생 사망률 데이터를 분석한다.
주 : 막대 그래프는 Microsoft Excel에서 사망률 데이터를 표현하는데 사용될 수있다. 다변량 분산 분석 (MANOVA)는 약물의 다른 용량은 모기 유충의 유의 한 차이 생존이 발생할 경우에 계시 등 JMP 또는 SPSS 같은 소프트웨어로 수행.
여성 모기에 인공 공급 장치를 통해 약물을 투여하여 2. 다산 분석
주 :이 섹션은 혈액에 약물의 추가 세부 사항ND 인공 피더 시스템을 사용하여 성인 모기 암컷에게 먹이.
- 제어 및 테스트 케이지에 대한 남성과 여성의 모기 동일한 번호로 성인 모기 케이지를 설정합니다. 여성까지 케이지 모두 면봉에 적신 10 % 설탕 솔루션을 제공 (3~5일은과 아노 펠 레스 gambiae 최적입니다) 공급에 대한 준비가되어 있습니다.
- 2 시간 전에 혈액 공급에, 여성은 배고픈 보장하기 위해 면봉을 제거합니다.
- 역 넓은 바닥 유리 깔때기 (직경 = 50mm, 길이 = 70mm) 및 산업용 접착제로 밀봉 주변의 플라스틱으로 구성이 인공 혈액 피더를 조립합니다. 유입과 물 유출에 대한 커넥터를 통해 두 개의 피더 '출구 (직경 = 10mm)에 플라스틱 튜브 (직경 = 7 mm)를 연결합니다. "제어"와 같은 두 개의 피더 레이블 "5 μM DZNep을."
- 먹이에 대한 프로그램을 설정, 시중에서 판매하는 발열체를 사용하여. "메뉴"에서의 "설정"이동와 "세트 포인트"를 선택하고, 사전로드 된 프로그램이 나타납니다. "SP1"를 선택하고 (37)의 온도를 설정 ° C.
주 : 발열체 투여 혈액 일정한 온도로 유지되는 것을 보장한다. 추가 프로그램 설정 또는 다른 모기 종의 곤충을 위해 사용될 수있다. - 양동이에 물을 채우고 물에 가열 요소를 체험.
- 파라 필름의 정사각형 조각 (50mm × 50 mm)를 잘라 얇은 막상 영화를 만들고 그것을 스트레칭. 파라 필름과 인공 피더의 바닥을 커버. 파라 필름 (50mm X 10mm)의 또 다른 조각을 잘라 늘려서 피더의 가장자리를 밀봉.
- 튜브에 의해 급전선과 발열체를 연결 시스템을 조립한다. 완료되면, 시스템 전환 "SP1"를 선택합니다. 를 눌러 시스템을 시작하려면 "입력".
주 : 물 (37)로 가열 얻을 것이다 C를 ° 그 온도로 유지. - 제 모니터물 양동이에 온도계를 사용하여 물을 전자 온도.
주 : 튜브 커넥터와 혈액의 온도가 37 ℃에서 유지되도록 시스템을 통해 물이 일정한 순환을 유지하는 데 도움 ° C. - 모든 혈액 유출 오염을 제거하는 데 사용되는 10 %의 표백제 용액으로 평평한 바닥 트레이를 입력합니다.
- microcentrifuge 관에 제세동 양의 피 2 ㎖를 추가합니다. "컨트롤"로이 레이블. "5 μM DZNep" "5 μM DZNep"이라는 실험 튜브 DZNep 주식 솔루션 (단계 1.5 참조) .Add 6 μL으로 분류 실험 튜브의 과정을 반복 가볍게 여러 번 반전 혈액과 약물을 혼합한다. 실온에서 튜브 10 분을 품어.
- 피펫을 사용하여, 대응 표시된 피더의 상단에 제어 및 테스트 혈액 2 ㎖를 추가합니다. 표백제 용액에 피펫을 폐기하십시오. 어두운 가방 케이지 커버와 f를 장려하기 위해 주기적으로 케이지에 공기를 호흡먹이에 대한 emales.
- 모기는 약 30 분 동안 먹이를 보자. 공급이 완료되면, 피더 꺼내, 발열체를 끄고 파라 필름 스트립. 약 5 분 동안 표백제 솔루션의 공급을 적시 탈 물에 잘 헹구어.
- 피더를 제거하고 48 시간 동안 케이지에 설탕 물에 면봉을 넣어. 달걀 누워을 용이하게하기 위해 밤새 우리에서 물과 거름 종이를 포함하는 계란 요리를 놓습니다. 각각의 테스트 또는 제어 농도와 각 계란 요리 레이블.
- 스테레오 현미경 계란의 수와 구조를 다음 날 계란 요리를 제거하고 검사합니다. Q-colors5 소프트웨어를 사용하여 이미지를 얻습니다. 계란의 수를 계산합니다. 테스트 및 제어 케이지에서 얻은 달걀의 수의 차이를 분석한다.
주 : 짝 t 검정 계란의 수 (p ≤0.05) 완전히 다르면 결정하는데 사용될 수있다.
모기 효소 억제 3. 생화학 적 분석약물에 의한
주 :이 부분은 성인 남성 및 여성 모기 SAH 가수 분해 효소 저해에 DZNep의 효과를 결정하는 지표로서 DTNB를 이용한 효소 활성 분석을 설명한다.
- dH보다 2 O. 1 L에 HPO 4 나 2 중 14.19 g을 첨가하여 0.1 M 나 2 HPO 4 (인산 나트륨) 용액을 준비 다음에,이 dH보다 O. 1 L로의 NaH 2 PO 4의 13.79 g을 첨가하여, 0.1 M의 NaH 2 PO 4 (인산이 수소 나트륨) 용액을 조제
- pH가 8.5로 0.1 M의 NaH 2 PO 4 용액으로 0.1 M 나 2 HPO 4 솔루션을 적정한다.
참고 :이 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5)의 근무하는 솔루션이 될 것입니다. - 0.3 % 트리톤 X-100을 첨가함으로써 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5)의 균질 용액을 준비한다.
참고 : 균질화 솔루션은 4 O ℃에서 저장 될 수있다 - 홍보epare 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 10ml에 SAH의 6.15 mg을 용해하여 1.6 mM의 SAH (MW = 384.4) 솔루션입니다.
- 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 10ml에 DTNB 6.3 mg을 용해하여 1.6 mM의 DTNB (MW = 396.4) 솔루션을 준비합니다. 사용할 때까지 얼음에 신선한 DTNB 솔루션을 유지합니다.
- 1ml의 DH의 2 O.에서 DZNep 0.3 mg을 용해하여 1 mM의 DZNep.HCl (MW = 298.73) 솔루션을 준비합니다 다음에,이 dH보다 O. 0.002 μM 1,000 μM 농도에서의 일련 DZNep 1mM의 용액을 희석
- DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제를 측정하기 위해, 모기의 원유 효소 추출물을 준비 : 얼음처럼 차가운 0.1 M의 NaH 2 PO 4 (PH 8.5) 포함 0.3 % 트리톤 X-1 ml의 10 비 혈액 공급 모기 성충을 균질화 100, 유리 조직 균질기를 사용. 1.5 ㎖의 microcentrifuge 관에 균질을 전송합니다.
- 4 ℃에서 10,000 XG에서 5 분 동안 균질을 원심 분리기. 청소에 뜨는을 전송1.5 ml의 microcentrifuge 관. SAH 생화학 적 분석을위한 효소 소스로 뜨는을 사용합니다.
- 빈 치료를 위해 (즉, 더 DZNep, 아니 효소), 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB, 100을 추가하지 ㎕의 0.1 M 나 2 HPO 96 웰의 개별 우물 4 (PH 8.5), 평평한 바닥 마이크로.
- 제어 (즉, 아니 DZNep)의 경우, 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB를 추가, 50 ㎕의 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.5) 50 μL 효소 개인 (SAH 가수 분해 효소는 조 추출물에서 얻은) 우물.
- DZNep 치료의 경우, 50 μL 1.6 mM의 SAH, 50 μL 1.6 mM의 DTNB, 개별 우물에 50 μL 효소 50 ㎕를 선택 DZNep 농도를 추가합니다. 치료 및 제어 당 4 반복 실험을 준비합니다.
- 96- 웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 20 초 간격으로 5 분간 405 nm에서 SAH 효소 샘플의 광학 밀도 (OD)를 읽는다.
- 컨트롤에서 빈 OD 빼기ND OD 처리는 각 웰에서 얻은. 다음 식을 이용 SAH 가수 분해 효소 활성을 잔존 백분율을 계산 % 잔류 활성 = (OD 처리 / 제어는 OD) × 100.
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Representative Results
도 1은 분석의 개략도이다; 그것은이 문서에 나와있는 절차의 다양한 단계를 설명합니다. 프로토콜이 모기의 서로 다른 삶의 단계를 기반으로, 여기에 설명 된 실험에 따라야 할 특별한 순서가 없습니다. 사용자는 표본의 가용성에 따라, 동시에 하나 이상의 분석법을 수행하도록 선택할 수있다.
그림 2는 미성숙 모기 개발 및 생존 분석에 대해 설정 한 판을 보여줍니다. 시험 농도 및 반복 실험의 수는 사용자의 요구 및 약물의 가용성에 따라 변경 될 수있다. 미성숙 모기 분석에서, DZNep 1 mM의 스톡 용액을 0.5 μM 및 약물없는 인구 함유 웰과 제어 팬과 함께 5 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 모기를 함유하는 물에 첨가 하였다. 실험은 입증이 더 유충과 번데기의 survDZNep 처리 된 우물에 비해 제어 우물에 ived.
도 3은 실험 기간 동안 말라리아 모기 전반적인 생존에 DZNep의 효과를 나타낸다. 결과는 후생 유전 학적 약물 DZNep은 성장과 발전을 억제하고 미숙 한 모기의 사망률을 유도 것을 보여줍니다. 5 μM로 노출 된 개인의 다수 반면 일 (8)에 의해 사망하는 반면, 0.5 μM로 노출 모기의 대부분은, 실험의 날 (10)에 의해 사망 제어 처리 (NO 약물)의 모기 치사율 남아 영향을받지 여러 실험 8 일에 성인으로 등장. 역 관계는 약물 농도와 모기의 몸 크기 (그림 4) 사이에 관찰되었다.
도 5는 모기 번식력에 DZNep의 효과를 나타낸 것이다. 피가 DZNep를 포함하여 공급 성인 여성 모기는 상당한 reductio을 전시N 가능한 계란의 수의. 그림 5A 제어 케이지 (아무 약물)에서 얻은 달걀을 보여줍니다.도 5b는 테스트 케이지에서 얻은 달걀을 보여줍니다. 테스트 케이지에서 얻은 달걀 많은 수의 색은 어두운이었고, 일반 혈액 공급 모기 암컷 (그림 6)에서 얻은 달걀과 비교했을 때 수레 (exochorion의 공기로 채워진 확장) 부족. 어두운 색깔의 달걀과 함께 수레의 부재는 exochorion 형성에 후성 유전학의 잠재적 인 역할을 나타냅니다.
그림 7은 성인 남성과 여성의 말라리아 모기에 SAH 가수 분해 효소 활동에 DZNep의 효과를 보여줍니다. OD의 DZNep 의존적 감소 DZNep SAH가 가수 분해 효소 활성을 억제 나타내는 제어 처리 (약물 없음)와 비교하여 각각의 약물 치료에 대해 관찰된다.
그림 1 :. 말라리아 모기에 후생 유전 학적 약물을 사용하여 분석의 도식 표현은 계획의 왼쪽 부분은 미숙 한 모기를 사용하여 개발 및 생존 분석을 보여줍니다. 중앙 부분은 성인 여성에게 약을 피가 수유를 통해 생산력 분석을 보여줍니다. 오른쪽 부분은 약물에 의한 효소 억제의 생화학 적 분석을 보여줍니다.
그림 2 : 플레이트가 미성숙 모기 개발 및 생존 분석을 묘사 한 "C"마크 제어 우물을 레이블.. 라벨 "0.5"0.5 μM DZNep와 우물을 보여줍니다. 라벨 "5"5 μM DZNep와 우물을 나타냅니다.
그림 3 : 말라리아 모기의 생존에 DZNep의 효과. 농도 의존적 사망률은 미숙 한 모기로 관찰된다.
. 그림 4 :.. 0.5 μM DZNep (크기 = 4mm) (C) 유충으로 처리 미숙 모기의 개발에 DZNep의 효과 (A) 제어 처리 (크기 = 5mm)에서 유충 (B) 유충은 5 처리 μM DZNep (크기 = 3mm). 모든 유충은 실험 당일에 측정 하였다.
그림 5 :. 제어 처리에서 모기 생산력 계란 접시에 DZNep의 효과는 (어떤 약물) 모기 계란의 훨씬 더 큰 수를 포함하지 않는다 (A) 안돼요5 μM DZNep (B)로 처리 여성의 계란 요리와 레드.
그림 6 : 현미경으로 볼 말라리아 모기 계란 구조에 DZNep의 효과. 제어 처리에서 (A) 계란 (어떤 약물) 모기는 수레와 장미 같은 어셈블리. (B) 계란 수레와 장미 같은 어셈블리 부족 DZNep 5 μM로 처리 된 모기를 표시하지 않습니다.
그림 7 :. 말라리아 모기에 DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제는 DZNep 제어 처리 (아무 약물)에 비해 OD의 감소를 야기한다.
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Discussion
이 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 유생 분석에서,주의 라벨을 정확하게하고 각 시험 농도를 복제 취해 져야한다. 테스트 샘플을 무작위 화하고 각각의 테스트 우물에 약물의 지정된 금액을 추가하면 설정이 실험의 중요한 부분입니다. 96 웰 마이크로 플레이트에 2 차 령 모기 유충을 추가하기 전에, 각 유충은 여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 배치 할 수 있습니다. 탈수를 방지하기 위해, 유충은 즉시 집게의 무딘 쌍을 사용하여 마이크로 우물에 전송해야합니다. 이는 각 웰 마이크로 플레이트에서 물의 양을 보장하고 의도 된 약물의 농도는 유지된다. 자신의 몸 길이를 측정하는 유충을 전송하는 경우, 그것은 고정을 유지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 애벌레를 넣어하는 것이 좋습니다. 다른 화합물은이 프로토콜을 채택 할 경우, 각 케어 첨가 스톡 용액의 양을 결정하기 위해 취해 져야한다잘. 이러한 경우, 종래 직접 각 웰 마이크로 플레이트에서 유충을 물에 첨가 화합물의 계산 된 양을 용해 할 수 있다는 점에서 더 좋다.
혈액 공급 분석의 경우, 모기가 실험 전에 설탕 물을 적어도 2 시간을 제거하여 적절하게 고갈되는 것이 중요합니다. 그렇게하지 않으면 불완전 공급 및 성인 여성 계란 생산에 거의 영향이 발생할 수 있습니다. DZNep 용해하는 데 몇 분 정도 걸립니다 철저한 혼합 및 혈액 내 약물의 균일 한 분포는,뿐만 아니라 중요한 단계입니다. 약물 처리 된 혈액은 즉시 공급되는 경우, DZNep 동일하게 모기 시스템에 분산되지 않습니다. 그것은 강력하게 제세동 피가 더 나은 결과를 위해 (추출 날짜 이후 일주일 이하 IE) 신선한 것이 좋습니다.
관심있는 화합물과 생화학 분석의 성공에 중요 여러 단계가있다. 이 프로토에 사용 된 각 원액의 농도 COL은 DZNep에 최적화되었습니다. 다른 화합물의 프로토콜에 적응하기 위해, 우리는 서로 다른 범위의 pH를 테스트 제안 SAH는 DTNB 농도 및 곤충 샘플 크기는 가장 신뢰할 수있는 결과를 결정한다. 조 효소 추출물의 제조는이 절차에서 가장 많은 시간이 소요 단계입니다. 균질 준비하는 동안 흡광도 판독을 방해 할 수 상층 액에 존재하는 지질로, 이상 10 성인 모기를 사용하는 것이 좋습니다. 이 문제를 피하기 위해, (단일 채널 마이크로 피펫) 상등액 지질의 상부층은 380 단계 후에 제거 될 수있다. 뜨는은 깨끗한 미세 원심 튜브에 전송해야합니다. 단계 3.8 남아있는 점성 지질을 폐기 반복해야합니다. 나머지 상등액 모든 튜브에서 풀링 부드럽게 혼합해야합니다. 멀티 채널 피펫 웰 SAH를 추가 효율성 향상을 위해 사용될 수있다. DTNB은 분석에서의 지표로서 이용되고, 마지막으로 제조하고, 얼음에 보관해야한다.
NT는 ">이 프로토콜은 모기의 다른 성장 단계에서 화합물의 효과를 테스트하는 간단한 단계를 사용자에게 제공한다. 그러나,이 프로토콜의 사용에 약간의 제한이.이 기술은 DZNep의 수용성에 주로 의존있다. 미성숙 유충들이 주변 매체에 용해 된 약물에 노출된다. 화합물 시험되는 경우 수성 매질에 불용성이며,이 프로토콜 덜 효율적인 렌더링 할 수있다. 생산력 시험을위한 우리의 세동 양 혈액 중에 용해 약물 성인 여성을 대상. 이것 실험실 (즉, 모기를 공급하기위한 마우스 또는 기니아 피그를 사용하여) 직접 포유 동물의 피를 모기 식민지 투우사 경우 가능하지 않을 것입니다.이 문서에서 설명 된 다양한 분석의 조합은 곤충 수용성 화합물의 효과를 테스트하는 신규 한 방법을 사용자에게 제공한다. DZNep 주로 암 연구를위한 시험 관내 세포주에 첨가되고; 그러나이 프로토콜은 U있게산이는 생체 내에서 곤충의 다양한 삶의 단계에 어떤 영향을 조사한다. 게다가, 그것은 또한 독성 분석을위한 단계별 지침 연구원을 제공한다. 현재의 문헌에서는, 기술은 곤충 후생 유전 학적 약물의 효과에 관하여 제한된다. 일례로서 DZNep 사용하여, 우리는 잠재적 곤충 방제 제로서 다른 후생 유전 학적 약물 또는 신규 화합물을 탐색쪽으로 단계 전제 조건으로서 이용 될 수있다 절차를 제공한다. 이 프로토콜은 말라리아 모기 위해 개발되었지만, 그것은 DZNep의 효과 또는 다른 모기 또는 곤충 종의 관심있는 수용성 화합물을 테스트하도록 구성 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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