Abstract
Resistência inseticida representa um grande problema para os programas de controle da malária. Os mosquitos se adaptar a uma vasta gama de alterações no ambiente rapidamente, tornando a malária controlar um problema omnipresente em países tropicais. O aparecimento de populações resistentes inseticida garante a exploração de novas vias alvo de drogas e compostos para o controle do vetor mosquito. Drogas epigenéticas estão bem estabelecidos na pesquisa do câncer, no entanto, não se sabe muito sobre os seus efeitos sobre os insetos. Este estudo fornece um protocolo simples para examinar os efeitos toxicológicos de 3 Deazaneplanocin A (DZNep), uma droga experimental epigenética para terapia de câncer, no vetor da malária, o Anopheles gambiae. Foi observado um aumento dependente da concentração na mortalidade e diminuem de tamanho em mosquitos imaturos expostos a DZNep, enquanto que o composto diminuiu a fecundidade de mosquitos adultos em relação a tratamentos de controle. Além disso, houve uma diminuição dependente da droga em S -adenosilhomocisteína (SAH) hidrolase em mosquitos actividade após exposição a DZNep tratamentos em relação ao controlo. Estes protocolos fornecem o pesquisador com um procedimento simples, passo-a-passo para avaliar vários parâmetros toxicológicos para uma droga experimental e, por sua vez, demonstrar uma abordagem multifacetada única para explorar os efeitos toxicológicos de drogas ou compostos de epigenéticos solúveis em água interesse contra mosquitos vetores e outros insetos.
Introduction
A malária é responsável pelo maior número de mortes relacionadas com o inseto no mundo. Estima-se que 219 milhões de casos ocorrem anualmente em todo o mundo, resultando em cerca de 660 mil mortes, principalmente na África 1. Apesar dos esforços concertados, os programas da malária enfrentam vários desafios. Enquanto insecticidas tratados com inseticidas e componentes-chave forma pulverização residual interna do programa, a resistência a inseticidas em populações locais impedem esses esforços 2. O rápido aumento da população de mosquitos resistentes inseticida é largamente atribuído à capacidade de os mosquitos da malária para se adaptar rapidamente às mudanças no seu ambiente e explorar diferentes nichos 3,4,5. Para superar os mecanismos existentes de resistência a inseticidas, a exploração de alvos inseticida compostos novos e de última geração se justifica. Um protocolo simples, passo-a-passo para determinar a eficácia de insecticidas experimentais sobre as diversas fases da vida de malária mosquitoes aumentaria significativamente esses esforços.
Os estudos farmacológicos de efeitos de drogas em linhagens de células e modelos animais têm estabelecido o uso de drogas epigenéticas como uma ferramenta útil para a modulação da genética e fisiologia das células e organismos. A metilação do DNA e a modificação da histona são dois mecanismos que afectam epigenética expressão de genes em organismos multicelulares sem alterar a sequência de ADN subjacente 6. Modificações pós traducionais como a metilação desempenham um papel crucial na manutenção da integridade celular e expressão gênica, e pode afetar vários processos fundamentais 7,8,9. Pesquisa em algumas espécies de insetos têm destacado a importância da epigenética nos processos que envolvem oogenesis e haste manutenção de células 10, bem como a compensação de dosagem 11. No entanto, tais aspectos em vetores de doenças estão ainda a ser explorado. Usando um composto para modular o sistema em mosquitos pode nos fornecer emvistas para as novas vias alvo inseticida. 3-Uma Deazaneplanocin (DZNep) é um inibidor de histona-metilação conhecidas, que têm um impacto em vários tipos de cancros têm sido estudados 12,13,14,15,16. DZNep é uma droga solúvel em água estável que epigenética indirectamente inibe a histona-lisina N -metiltransferase (EZH2), um componente do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2) em células de mamíferos. PRC2 desempenha um papel importante na regulação do crescimento das células estaminais em organismos multicelulares, e histona metilação é um aspecto chave do silenciamento de genes mediado PRC2. Em ratinhos imunocomprometidos, as células pré-tratadas com DZNep têm demonstrado ser menos 17 tumorigénico. Esta droga está sendo usada para o estudo de outras doenças, como a doença hepática gordurosa não alcoólica, em que está implicado EZH2 18. DZNep é uma S -adenosylhomocysteine estabelecido (SAH) inibidor hydrolase 19, 20. A inibição da SAH-hidrolase numaacumulação de HAS e, por sua vez, leva à inibição da actividade da metiltransferase, limitando os grupos de doadores de metilo disponíveis. HAS é um derivado de aminoácido utilizado por muitos organismos, incluindo insectos, nas suas vias metabólicas. Um estudo recente mostrou que DZNep em doses baixas podem afetar diapausa e retardar o desenvolvimento dos insetos 21.
Aqui, um protocolo robusto para investigar os efeitos de um composto solúvel em água em vários estágios de vida de mosquitos é desenvolvido. As três partes deste protocolo incluem instruções para examinar os efeitos de um composto solúvel em água na imaturos, fêmeas se alimentam de sangue de adultos, e atividade enzimática do adulto masculino e mosquitos fêmeas. Em primeiro lugar, DZNep é dissolvido em água para estudar o desenvolvimento e sobrevivência de mosquitos imaturos. Isto é realizado em duas concentrações de comparar as diferenças decorrentes de aumento de 10 vezes na exposição de drogas. Para explorar o efeito da droga em adultos mosquitos fêmeas, DZNepé adicionado ao sangue de carneiro desfibrilado e alimentados artificialmente o sangue para o sexo feminino. Subsequentemente, a solução do fármaco na fecundidade é examinada. Finalmente, um ensaio de actividade de enzima é realizado utilizando 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) como um indicador para determinar o efeito de inibição DZNep em HAS hidrolase em adultos, machos e fêmeas de mosquitos. Embora este protocolo é desenvolvida com um mosquito da malária, Anopheles gambiae, ele pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de compostos de interesse em quaisquer espécies de mosquitos ou outros insectos. As técnicas descritas neste protocolo não pode ser eficientemente aplicada a uma droga com pouca ou nenhuma solubilidade em água ou em meio aquoso.
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Protocol
NOTA: As três partes do protocolo de descrever a exposição aquosa do fármaco DZNep para mosquitos larvais, uma exposição à base de sangue de fêmeas adultas DZNep para estudar o seu efeito de fecundidade, e SAH hidrolase inibição por DZNep medida utilizando uma técnica colorimétrica simples. Uma representação esquemática destes ensaios é mostrado na Figura 1.
1. imaturos Mosquito Desenvolvimento e sobrevivência Ensaios
NOTA: Esta seção explica o uso de uma droga solúvel em água, que afeta o desenvolvimento da larva do mosquito e sobrevivência.
- Escotilha A. gambiae ovos a 28 ° C em água destilada (dH2O) e larvas los para 2ª traseira.
- Dê uma DNAse de seis poços, RNAse placa de cultura celular livre e despeje 10 ml dH2O a cada poço.
- Selecione as larvas do mosquito em 2º instar e adicionar 15 larvas por poço. Antes de adicionar larvas 2º ao prato, put-los em uma toalha de papel para 2-3 segundos para remover o excesso de água.
- Poços etiqueta com fitas de diferentes cores para embaralhar experimento. Rotular dois poços para cada concentração de teste em cada placa (Figura 2).
- Prepara-se uma cloridrato DZNep 1 mM (PM = 298,73) solução de estoque de 0,3 mg por dissolução DZNep em 1 ml de dH 2 O. Adicionar solução de estoque de DZNep.HCl a poços marcados para atingir uma concentração final de 0,5 uM e 5,0 uM.
NOTA: A solução-mãe pode ser armazenado a 4 ° C durante curto prazo (1 dia a um mês) ou -20 ° C para o longo prazo (mais de um mês).
NOTA: A adição da solução de estoque para concentrações acima mencionadas não irá alterar o volume de água nos poços significativamente. No entanto, no caso de concentrações muito mais elevadas, é aconselhável dissolver o composto no meio das larvas para evitar qualquer diluição desnecessária do composto. - Adicionar a mesma quantidade de ração de peixe a cada poço. Cobrir a placas e incubar a 28 ° C em uma incubadora.
- Grave a mortalidade para os mosquitos larvais DZNep-tratados e não tratados, após um período de exposição de 24 horas. Retire e elimine qualquer larvas mortas. Repita esta gravação todos os dias até todas as larvas morrem ou pupa e emergem como adultos. Grave o tamanho das larvas de dois em dois dias, isto é, dias 0, 2, 4, 6, 8, até que eles formam ninfas.
- Analisar o desenvolvimento e mortalidade de larvas de dados utilizando um software de análise estatística adequada.
NOTA: Um gráfico de barras pode ser usado para representar os dados de mortalidade no Microsoft Excel. Análise de Variância Multivariada (MANOVA) realizada com um software como o JMP ou SPSS irá revelar se diferentes doses do medicamento resultar em valores diferentes de sobrevivência de larvas de mosquitos.
2. Fecundidade Assay pela administração de drogas por meio Feeder Artificial para fêmeas mosquitos
NOTA: Esta seção detalha a adição da droga para o sangue de umnd alimentando-a mosquitos fêmeas adultas usando um sistema de alimentação artificial.
- Configure gaiolas adulta do mosquito, com igual número de mosquitos machos e fêmeas para controle e gaiola de teste. Fornecer solução de açúcar 10% embebido em bolas de algodão para ambas as gaiolas até as fêmeas estão prontas para a alimentação (3-5 dias é ideal para Anopheles gambiae).
- 2 horas antes da alimentação de sangue, retire as bolas de algodão para garantir as fêmeas estão com fome.
- Montar dois alimentadores sanguíneos artificiais que consistem de uma ampla funil invertido com fundo de vidro (diâmetro = 50 mm, comprimento = 70 mm) e um plástico circundante selada com cola industrial. Anexar tubos de plástico (diâmetro = 7 mm) para duas saídas 'alimentadores (diâmetro = 10 mm) através de conectores para entrada e saída de água. Rotular os dois alimentadores como "Control" e "5 mM DZNep."
- Usando um elemento de aquecimento comercialmente disponíveis, configurar o programa para a alimentação. Em "Menu" vá em "Settings"e selecione "setpoints"; programas pré-carregados aparecerá. Selecione "SP1" e ajustar a temperatura para 37 ° C.
NOTA: O elemento de aquecimento assegura que o sangue administrado é mantida a uma temperatura constante. Configurações adicionais do programa pode ser usado para diferentes espécies de mosquitos ou de insecto. - Encha um balde com água e mergulhe o elemento de aquecimento na água.
- Corte um pedaço quadrado de Parafilm (50 mm x 50 mm) e esticá-la para fazer um filme membranoso fina. Cubra o fundo dos alimentadores artificiais com o Parafilm. Corte outro pedaço de Parafilm (50 mm x 10 mm), esticá-lo e selar as arestas dos alimentadores.
- Montar o sistema, que liga os alimentadores e elemento de aquecimento por os tubos. Depois de concluído, ligar o sistema e selecione "SP1". Pressione "Enter" para iniciar o sistema.
NOTA: A água vai ficar aquecido a 37 ° C e mantida a essa temperatura. - Monitorar the temperatura de água usando um termômetro no balde com água.
NOTA: Os conectores de tubos e ajudar a manter um constante circulação de água através do sistema de modo que a temperatura do sangue continua a 37 ° C. - Encha uma bandeja de fundo plano com uma solução de água sanitária a 10% que será utilizado para descontaminar todos os derramamentos de sangue.
- Adicionar 2 ml de sangue de ovelha desfibrilado a um tubo de microcentrífuga. Rotular isso como "Control". Repetir o processo experimental para o tubo rotulado como "5 uM DZNep" .Add 6 uL de solução de estoque DZNep (ver passo 1.5) para o tubo experimental marcado "5 uM DZNep" Misturar suavemente o sangue e droga invertendo diversas vezes. Incubar o tubo 10 min à temperatura ambiente.
- Usando uma pipeta, adicionar 2 ml de sangue de teste e de controlo para o topo de alimentadores correspondentemente marcados. Descartar a pipeta na solução de água sanitária. Cobrir a gaiola com um saco escuro e respirar ar na gaiola periodicamente para incentivar females para a alimentação.
- Deixe os mosquitos se alimentam por cerca de 30 min. Uma vez que a alimentação estiver concluída, desligue o elemento de aquecimento, tomar as alimentadores fora e tira o Parafilm. Mergulhe o alimentador em solução de água sanitária por cerca de 5 minutos e enxágüe bem em água deionizada.
- Retire os alimentadores e colocar bolas de algodão com água com açúcar nas gaiolas durante 48 horas. Coloque um ovo prato contendo água e papel de filtro nas gaiolas durante a noite para facilitar a colocação de ovo. Escreva em cada ovo prato com a respectiva concentração de teste ou controle.
- Retire o ovo prato dia seguinte e examinar o número ea estrutura dos ovos sob um microscópio estéreo. Obter imagens utilizando o software Q-colors5. Contar o número de ovos. Analise diferença no número de ovos obtidos a partir de gaiolas de teste e de controlo.
NOTA: Um teste t não emparelhado pode ser usado para determinar se o número de ovos são significativamente diferentes (p ≤0.05).
3. Bioquímica Ensaio de Inibição da Enzima Mosquitopor droga
NOTA: Esta seção descreve um ensaio de atividade enzimática utilizando DTNB como um indicador para determinar o efeito da DZNep em SAH inibição hidrolases no homem adulto e mosquitos fêmeas.
- Prepara-se uma solução 0,1 M de Na 2 HPO 4 (fosfato de sódio dibásico), adicionando 14,19 g de Na 2 HPO 4 para 1 L de dH2O Em seguida, preparar uma solução 0,1 M NaH 2 PO 4 (fosfato sódio monobásico) pela adição de 13,79 g de NaH 2 PO 4 a 1 L de dH2O
- Titula-se o M de Na 2 HPO 4 solução a 0,1 com a solução de 4 0,1 M NaH 2 PO a pH 8,5.
NOTA: Esta será a solução estoque de trabalho de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). - Prepara-se uma solução de homogeneização de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) por adição de 0,3% de Triton X-100.
Nota: A solução de homogeneização pode ser armazenado a 4 o C. - Prepare uma solução de HAS 1,6 mM (PM = 384,4) dissolvendo 6,15 mg de HAS em 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
- Prepara-se uma solução 1,6 mM de DTNB (PM = 396,4) por dissolução de 6,3 mg de DTNB em 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Manter a solução DTNB fresco no gelo até o uso.
- Prepara-se uma DZNep.HCl 1 mM (PM = 298,73) em solução através da dissolução de 0,3 mg de DZNep em 1 ml de dH 2 O. Em seguida, dilui-se a solução 1 mM em DZNep uma série de concentrações de 1,000 uM a 0,002 uM em dH 2 O.
- Para medir a inibição da SAH-hidrolase por DZNep, preparar um extracto de enzima em bruto de mosquitos: Homogeneizar a 10 mosquitos adultos não alimentados com sangue em 1 ml de gelo-frio 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contendo 0,3% de Triton X- 100, usando um homogeneizador de tecidos de vidro. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Centrifuga-se o homogenado durante 5 min a 10.000 xg, a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um ambiente limpoTubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilizar o sobrenadante como fonte de enzima para o ensaio bioquímico HAS.
- Para o tratamento em branco (isto é, não DZNep, sem enzima), adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, e 100 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aos poços individuais de uma de 96 poços, microplaca fundo plano.
- Para o controlo (ou seja, não DZNep), adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, 50 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 ul de enzima (SAH-hidrolase obtido a partir de extracto em bruto) para o indivíduo poços.
- Para tratamentos DZNep, adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, 50 ul de enzima e 50 ul seleccionado concentração DZNep para poços individuais. Prepare 4 repetições por tratamento e controle.
- Leia a densidade óptica (DO) das amostras de enzima SAH a 405 nm durante 5 minutos a intervalos de 20 seg utilizando um leitor de microplacas de 96 poços.
- Subtrair o OD em branco de um controlend tratamento OD obtido a partir de cada poço. Calcular a percentagem restante actividade de hidrolase SAH utilizando a seguinte equação:% Actividade Residual = (OD Tratamento / Controlo OD) x 100.
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Representative Results
A Figura 1 é uma representação esquemática dos ensaios; que descreve os vários passos do processo listadas neste artigo. À medida que o protocolo baseia-se em diferentes fases da vida dos mosquitos, não existe uma sequência particular a ser seguido para as experiências aqui detalhadas. O utilizador pode escolher para conduzir um ou mais ensaios, ao mesmo tempo, dependendo da disponibilidade de amostras.
A Figura 2 demonstra o prato criado para o desenvolvimento do mosquito e sobrevivência ensaios imaturos. O número de concentrações de ensaio e replicados podem ser alterados dependendo das necessidades do usuário e disponibilidade de medicamentos. Para o ensaio de mosquitos imaturos, 1 mM de solução de estoque de DZNep foi adicionada a água contendo mosquitos para atingir uma concentração final de 0,5 uM e 5 uM, juntamente com uma panela de controlo com cavidades que continham uma população livre de drogas. O experimento demonstrou que mais larvas e pupas survIVED nos poços de controlo do que nos poços tratados com DZNep.
A Figura 3 ilustra o efeito de DZNep na sobrevivência global de mosquitos da malária durante a experiência. Os resultados demonstram que a droga DZNep epigenética suprime o crescimento e desenvolvimento e induz a mortalidade dos mosquitos imaturos. A maioria dos mosquitos expostos a 0,5 uM morreu no dia 10 da experiência, ao passo que um grande número de indivíduos expostos a 5 uM morreu por dia 8. Em contraste, a mortalidade dos mosquitos do tratamento de controlo (sem fármaco) permaneceu inalteradas e vários surgiu como adultos no dia 8 do experimento. Foi observada uma relação inversa entre a concentração da droga e o tamanho do corpo de mosquito (Figura 4).
A Figura 5 ilustra o efeito de mosquito em DZNep fecundidade. Os mosquitos adultos do sexo feminino alimentados com sangue contendo DZNep exibiu uma reductio significativan no número de ovos viáveis. A Figura 5A mostra ovos obtidos de gaiola de controlo (sem fármaco). A Figura 5B mostra os ovos obtidos de gaiola de teste. Um grande número de ovos provenientes de gaiola de teste eram de cor mais escura e faltava floats (expansões cheios de ar de exocório), quando comparado com ovos provenientes de mosquitos fêmeas alimentadas com sangue normais (Figura 6). A ausência de carros alegóricos, juntamente com os ovos de cores mais escuras indicam o papel potencial da epigenética na formação exocório.
A Figura 7 mostra o efeito sobre a actividade de DZNep SAH hidrolase no adulto do sexo masculino e do sexo feminino mosquitos da malária. A diminuição dependente da DZNep em OD é observada para cada tratamento medicamentoso em relação ao tratamento controle (sem drogas), indicando que DZNep inibe a atividade hydrolase SAH.
Figura 1:. Representação esquemática de ensaios utilizando uma droga epigenética de mosquitos da malária A parte esquerda do esquema mostra o desenvolvimento e sobrevivência ensaios utilizando mosquitos imaturos. A parte central demonstra o ensaio de fecundidade via sangue alimentando a droga para fêmeas adultas. A parte direita descreve o ensaio bioquímico da inibição da enzima pela droga.
Figura 2: Placa que descreve o desenvolvimento de mosquitos imaturos e ensaio de sobrevivência rótulo de "C" poços de controlo marcas.. Rótulo "0.5" mostra poços com 0,5 mM DZNep. Rótulo "5" indica poços com 5 � DZNep.
Figura 3: Efeito da DZNep na sobrevivência de mosquitos da malária. observa-se com os mosquitos imaturos.
Figura 4:... Efeito de DZNep no desenvolvimento de mosquitos imaturos (A) Larva da testemunha (tamanho = 5 mm) (B) Larva tratada com 0,5 fiM DZNep (tamanho = 4 mm) (C) tratados com 5 Larva uM DZNep (tamanho = 3 mm). Todas as larvas foram medidos no mesmo dia da experiência.
Figura 5:. Efeito da DZNep on mosquito fecundidade Prato do ovo da testemunha (sem drogas) mosquitos contém muito maior número de ovos (A) compavermelho com o prato de ovos de fêmeas tratadas com 5 � DZNep (B).
Figura 6: Efeito de DZNep na estrutura de ovo em mosquitos da malária visto sob um microscópio. (a) Os ovos do tratamento controle (sem drogas) mosquitos exibir carros alegóricos e montagens como rosetas. (b) Os ovos dos mosquitos tratados com 5 � DZNep faltam carros alegóricos e montagens como rosetas.
Figura 7:. SAH hidrolase inibição por DZNep em mosquitos da malária DZNep provoca uma diminuição da OD em comparação com o tratamento de controlo (sem fármaco).
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Discussion
Há vários passos vitais para o sucesso da aplicação deste protocolo. Para o ensaio larval, deve ser tomado cuidado para rotular e replicar cada concentração de ensaio corretamente. Randomizing amostras de ensaio e adicionar a quantidade designada de droga para as respectivas cavidades de teste é uma parte importante desta montagem experimental. Antes de adicionar 2 nd larvas de mosquito para a microplaca de 96 poços, cada larva pode ser colocado sobre uma toalha de papel para 2-3 segundos para remover o excesso de água. Para evitar a dessecação, larvas devem ser imediatamente transferidos para os poços das microplacas usando um par de fórceps romba. Isso garante que o volume de água em cada poço da microplaca e concentração de droga permanece como pretendido. Quando a transferência de larvas para medir o comprimento do corpo, recomenda-se colocar as larvas em gelo durante alguns minutos, de modo a mantê-los estacionária. Ao adaptar este protocolo para um composto diferente, deve ser tomado cuidado para determinar a quantidade de solução de estoque a cadabem. Em tais casos, pode ser melhor para dissolver a quantidade calculada de composto em água directamente antes de se adicionar as larvas em cada poço da microplaca.
Para os ensaios de alimentação de sangue, é vital que os mosquitos estão sedentos de forma adequada através da remoção de água com açúcar, pelo menos, 2 horas antes do experimento. Não fazer isso pode resultar na alimentação incompleta e pouco efeito sobre a produção de ovos fêmea adulta. Uma mistura completa e uniforme de distribuição da droga no sangue é um passo importante, bem como, como DZNep leva alguns minutos para dissolver. Se o sangue de drogas tratado é alimentado imediatamente, DZNep não se igualmente distribuídos no sistema de mosquito. Recomenda-se vivamente que o sangue desfibrilado é fresco (ou seja, menos de uma semana desde a data de extração) para obter melhores resultados.
Existem vários passos críticos para o sucesso de um ensaio bioquímico com um composto de interesse. As concentrações de cada solução de estoque utilizados neste proto col foram otimizados para DZNep. Para adaptar o protocolo para um composto diferente, sugerimos testar uma gama de pH diferente, HAS, concentrações DTNB e tamanhos de amostras de insetos para determinar os resultados mais fiáveis. Preparação do extracto de enzima em bruto é o passo mais demorado neste procedimento. Durante a preparação do homogenato é recomendado o uso de não mais do que 10 mosquitos adultos, como lípidos presentes no sobrenadante pode dificultar a leitura de absorvância. Para evitar este problema, a camada superior de lípidos no sobrenadante (utilizando uma micropipeta único canal) pode ser removido após o passo 3.8. O sobrenadante deve ser transferido para um tubo de microcentrífuga limpo. Passo 3.8 deve ser repetido para descartar as restantes lipídios viscosos. O sobrenadante claro restante deverá ser reunidos a partir de todos os tubos e misturado delicadamente. Uma pipeta multi-canal pode ser usado para aumentar a eficiência de adicionar HAS nos poços. DTNB é utilizado como um indicador no ensaio, e devem ser preparados última e mantido em gelo.
nt "> Este protocolo fornece o utilizador com passos simples para testar os efeitos de um composto em diferentes etapas da vida de mosquitos. No entanto, existem algumas limitações na utilização deste protocolo. Esta técnica depende principalmente da solubilidade em água do DZNep. Imaturo larvas estão expostas ao fármaco dissolvido nos seus meios de comunicação vizinhas. Se o composto a ser testado é insolúvel em meio aquoso, que pode tornar este protocolo menos eficiente. Para o ensaio da fecundidade, submetemos os fêmeas adultas a droga dissolvidos no sangue de ovelha desfibrilado. Este não seria possível se um laboratório eleva colónias de mosquito em sangue de mamíferos diretamente (ou seja, utiliza ratinhos ou cobaias para a alimentação de mosquitos).A combinação de diferentes ensaios descritos neste artigo proporciona o utilizador com uma nova maneira de testar os efeitos de um composto solúvel em água em insectos. DZNep é principalmente adicionado às linhas de células in vitro para pesquisa de câncer; no entanto, este protocolo permite que o uSer para examinar quaisquer efeitos sobre diversas fases da vida de um inseto in vivo. Além disso, ele também fornece o pesquisador com orientações passo-a-passo para os ensaios toxicológicos. Na literatura actual, o conhecimento é limitada no que diz respeito aos efeitos de drogas sobre insectos epigenética. Usando DZNep como um exemplo, é proporcionado um processo que pode ser utilizado como um passo de pré-requisito em direcção explorar outras drogas epigenética ou compostos novos como agentes de controle de insectos potenciais. Embora este protocolo é desenvolvido para o mosquito da malária, que pode ser adaptado para testar o efeito de DZNep, ou qualquer composto solúvel em água de interesse, em outras espécies de mosquitos ou de insecto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
- Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
- Sternberg, E. D., Thomas, M. B. Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases. Trends in Parasitology. , (2014).
- Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. 2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae. Malaria Journal. 8, 147 (2009).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).
- Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. Update on Cancer Therapeutics. Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1. Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).
- Conrad, T., Akhtar, A. Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription. Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).
- Miranda, T. B., et al. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation. Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).
- Cui, B., et al. PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep). J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962 (2014).
- Fujiwara, T., et al. 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation. The Journal of Biological Chemistry. , (2014).
- Li, Z., et al. The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer. Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).
- Nakagawa, S., et al. Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells. Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).
- Crea, F., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer. Molecular Cancer. 10, 40 (2011).
- Vella, S., et al. EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD. International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).
- Tan, J., et al. Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells. Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).
- Chiang, P. K., Cantoni, G. L. Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo. Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).
- Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).
