Summary
我们在这里报告的强大和高效表达荧光蛋白的mRNA注射后进入披文昌鱼的未受精的卵母细胞。显微注射技术在此基础脊索动物的发展铺平道路，在这个新兴的模型系统深远的技术创新，包括在体内成像和基因特异的操作。
Introduction
在开发过程中，单个细胞产生了一个完整的有机体中高度复杂的过程，涉及到两个细胞分裂和运动。为了更好地了解的细胞行为的动力学所依据的生物学原理，发育生物学家已经开始使用基于荧光的体内成像技术。细胞的特定区室，如细 胞膜，可以通过处理来用荧光染料标记，通过组织穿透1的缺乏特异性和阻碍的方法，或由具体引入的编码荧光蛋白2外源性的mRNA胚胎。不同的技术可用于有效递送外源性化合物，如的mRNA。这些包括，但不限于，微注射，电穿孔，轰击与微粒，脂质转染和转导3,4。虽然所有这些方法可以用于引入外源性化合物成发育中的胚胎，只有微量注射允许预定义的和精确的批量应用到每个单元3。显微注射技术已被描述为所有主要发育模型系统4（ 例如 ，果蝇，线虫，斑马鱼，蛙，小鼠），以及对于某些替代模式4中 ，其中包括那些用于旨在了解发育机制的演化比较研究（ 例如 ，海葵，蠕虫环节动物，海胆，海鞘囊中，文昌鱼文昌鱼）。
Cephalochordates，连同被囊动物和脊椎动物建立脊索动物门，是特别适合的模型来研究脊索动物的演变和脊椎动物从脊椎动物的祖先5-8的多样化。在文昌鱼谱系很早脊索动物进化过程中分道扬镳;和现存cephalochordates，其被细分为三个属（ 麸chiostoma，Asymmetron和Epigonichthys），类似于脊椎动物无论是在整体解剖和基因组架构5-8的条款。已经描述到目前为止的约30种cephalochordates的五个可供胚胎和发育研究6,9：Asymmetron lucayanum（巴哈马文昌鱼）， 文昌鱼floridae（佛罗里达文昌鱼）， 文昌鱼披 （欧洲文昌鱼）， 文昌鱼 （中国的文昌鱼） 文昌鱼与日本血吸虫 （日本文昌鱼）。这三个品种的成熟的成年人（B.披针叶，B.文昌鱼和B.血吸虫 ）可诱导产卵按需在繁殖季节10,11。此外，至少对于B.披 ，高效产卵也可诱发在人造海水12，从而使这个特定文昌鱼物种laborator访问IES没有获得天然海水。的结合，在二披针叶 ，一个方便，可靠地获得胚胎具有高效的交付方法，如显微注射，至今在文昌鱼开发（在B. floridae和B.文昌鱼 ）13-15，只交付技术将使的发展新套件的操控技术，包括血统tracing-和动态细胞行为为基础的方法。
一种协议，它的mRNA的显微注射高效表达的B.荧光蛋白披针叶胚胎，因此开发。此外，提供一个基本的工具包B的实时成像披胚胎，载体系统被开发，使膜相关和荧光蛋白的细胞核表达。用于膜靶向，增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合到mCherry和EGFP的人的HRAS CAAX盒和核定位是由融合到斑马鱼组蛋白2B（H2B）外显子（ 图1中 ，补充文件1）中获得。此外，其目标是优化蛋白质的翻译，所述构建体含有Kozak序列和密码子已被修改，并适于使用在二披针叶 。两者合计，这里介绍的注射方法和表达载体将作为新的实验方法为cephalochordates产生的基础，特别是分析采用最新的基于荧光的体内成像技术。
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Protocol
1.准备仪器及试剂
- 转让巴斯德移液器
- 通过拉动上述火焰以不同的速度230毫米长巴斯德移液器产生一系列转印巴斯德移液器具有不同尖端的直径。确保锥度为尽可能长的愿望光滑细腻的控制。
- 用金刚石划线，划伤沿线吸管垂直于吸液管的长度。用双手拉平行的吸管其长度产生钝剪。快速火焰抛光无密封尖端的吸管。
- 而变化的卵母细胞/胚胎的阶段的尖端的直径要吸：300-400微米为未受精的卵母细胞（约150微米的直径），600微米为受精卵（约在直径500微米），200-400微米对于阴影neurulae。用移液管带口监测的吸管从一个盘转移卵母细胞/胚胎到另一个。
- 注射针头
- 操纵毛细管用手套，以确保无RNase的条件。用硼硅玻璃纤维毛细管的OD1.20毫米，ID0.94毫米，长10 mm尺寸。
- 如果毛细管拉到加热丝针拔了材料清单描述的类型，使用以下设置：热火600，上拉50，速度80，时间60，压力200或300。否则，确保形状，这是对于成功的注射剂是至关重要的，则如图2具有以下属性：4-8微米外尖端直径，2厘米锥形长度。
注：针可在产卵季节前拉和整个赛季的使用。
- 5％酚红储液（4×）
- 准备每个产卵季节前的新鲜。
- 在0.22微米的过滤管，掂量出了酚红粉25毫克。
- 加入0.5毫升DNase-和无RNA酶的水，以含有粉末的管子。
- 旋转3-5分钟，在18000×g离心，在室温下过滤，消毒溶液并除去晶体，可能堵塞注射针。
- 储存在4°C或存储250微升等分在-20℃。
- 0.25毫克/毫升聚 - 赖氨酸溶液
- 准备每个产卵季节前的新鲜。
- 溶解5毫克聚L-赖氨酸在20ml蒸馏水中。商场有5毫升分装于-20℃。
- 立即使用解冻等分试样且仅一次，以确保该卵母细胞与聚赖氨酸包被的培养皿的可重复性和健壮的附着力。
- mRNA合成
- 准备每个产卵季节前的新鲜。
- 线性化5微克的具有足够的兴趣酶的DNA（通常为2小时，在37℃）。检查消化的完整性，在消化混合物的体积上在TBE缓冲液中的1％琼脂糖TBE凝胶在150瓦20分钟运行2％。
- 提取LINEA授权的DNA用25：24：1的苯酚（pH值为8.0）：氯仿：异戊醇。涡旋20秒，离心18000×g离心10分钟，并收集水（上部）相。
- 带24再次萃取水相：1氯仿：异戊醇。涡旋20秒，离心18000×g离心10分钟，并收集水相。
- 沉淀线性的DNA用100：10：300的DNA线性化：3M乙酸钠（pH 5.2）：100％乙醇过夜，在-20℃下。
- 离心20分钟18,000 XG在4℃。冲洗70％的乙醇。
- 离心10分钟，在18000 XG 4℃。让干燥，重悬在无RNA酶的水以0.5微克/微升的最终浓度。
- 转录1微克用mRNA合成试剂盒与适当的线性化聚合酶的DNA，根据生产商的说明。
- 提取的mRNA以5：1的苯酚（pH值4.7）：随试剂盒提供氯仿和醋酸铵终止溶液。
- 涡旋20秒，CEntrifuge在18000×g离心10分钟，并收集水相。
- 带24再次萃取水相：1氯仿：异戊醇。涡旋20秒，离心18000×g离心10分钟，并收集水相。
- 沉淀用100％异丙醇中的mRNA过夜，在-20℃下。
- 离心20分钟18,000 XG在4℃。冲洗在80％的乙醇。
- 离心10分钟，在18000 XG 4℃。让沉淀干燥，在室温下不超过5-10分钟，因为它随后将很难再悬浮。重悬在DNase-和无RNase水以至少2微克/微升的最终浓度，以确保在注入混合体面最终的mRNA浓度。
- 检查转录产物的质量和尺寸，对在TBE缓冲液中的不含RNA酶的1％琼脂糖TBE凝胶上运行0.5微升mRNA的，在150瓦20分钟。店内2微升等分在-80℃。
- 多聚赖氨酸包被的菜
NOTE：聚赖氨酸COA泰德菜肴用过的注射过程中固定的卵母细胞。- 对于每个35毫米细胞培养的培养皿（5个），覆盖培养皿用1ml解冻0.25毫克/毫升聚 - 赖氨酸溶液的底部。在室温下孵育5分钟。
- 对于每个35毫米细胞培养的培养皿（5个），转移为0.25mg / ml聚赖氨酸溶液到另一个35毫米细胞培养的培养皿。在室温下孵育5分钟。
- 丢弃0.25毫克/毫升聚 - 赖氨酸溶液。
- 让培养皿干燥，在室温下颠倒2小时。
- 存储包裹在保鲜膜的聚赖氨酸 - 包被的培养皿在4℃下，以避免污染一周最大。
- 琼脂糖涂层菜
注：它们被用来培养注射的胚胎。琼脂糖提供了一个缓冲用于注射的胚胎和防止它们粘到培养皿的底部。- 让使用37-38克/升通讯人造海水（ASW）ercial盐+ 0.25毫米的NaHCO 3反渗透水。
- 通过加热，在微波的溶液溶解琼脂糖至1％的浓度在0.22微米过滤ASW。
- 迅速倾从一次35毫米的培养皿的温暖琼脂糖溶液成另一个，以便确保在盘子的一个非常薄的琼脂糖涂层。
- 存储包裹在萨兰琼脂糖被覆菜裹，在4℃，以避免污染一周最大。
- 注射混合注射针和装载
- 在开始注射前约2小时，使2微升注射混合在无RNA酶和DNA酶的水与终浓度为1-1.8微克/微升的mRNA，15％甘油，1.25％酚红。
注：酚红颜色的解决方案，它允许监测的注入效率，并成功地注入胚的鉴别。甘油有利于卵母细胞中mRNA的扩散。 - 离心4分钟18000 XG到颗粒晶体。保持在冰上直到使用。
- 用10微升移液管，收集0.5微升注射混合的，从而避免了管，其中该晶体已沉淀的底部。
- 通过吸取注射混合物的0.5微升滴在大开口的针的回填的至少两个注射针的情况下（注射期间1时间）。
- 在4℃下安装在存储罐用液体在底部的针，以防止注射混合的蒸发。让注射混合慢慢行进到注射针的前端为至少1小时，以尽量减少产生气泡。
- 商店额外注射混合在-80℃下的最大的三个附加的用途，在这之后的mRNA品质恶化（数据未示出）。
- 在开始注射前约2小时，使2微升注射混合在无RNA酶和DNA酶的水与终浓度为1-1.8微克/微升的mRNA，15％甘油，1.25％酚红。
2.收集生物材料，显微注射和胚胎培养的
- 卵母细胞和精子采集
注：请参阅Theodosiou等 12诱导产卵和配子收集了详细的方案。- 休克的男性和女性在ASW在23℃24小时。
- 一到两个小时日落之前，在19℃，转移到成年人各个杯ASW，因为大多数成年人都会在日落之后产卵1-2小时。
- 冲洗35毫米培养皿中过滤ASW，让他们干倒，防止卵母细胞粘在盘子的底部。
- 产卵后，立即收集精子和卵母细胞有1000微升吸管。
- 保持精子和卵母细胞从成人文昌鱼分开，因为接触是有害的配子健康（数据未示出）。
- 此外，避免惊心的成年人，这导致了消散的动作，因此稀释，既精子和卵母细胞。保持精子活性尽可能长，并优化受精率，收集精子尽可能地浓缩。
- 保持精子在冰上在1.5ml管中。
- 转移的卵母细胞在过滤ASW到预漂洗35毫米培养皿。
- 转印100-500与先前被拉300-400微米转印巴斯德吸管的卵母细胞，以另外35毫米的培养皿来执行注射。
- 施肥离合器为精子和卵子的质量或其他实验控制的剩余部分。
- 卵母细胞注射
- 在50°角相对于水平平面的安装注射针上的显微。
注：小于50°角将围绕卵母细胞的推盘，而超过50°的角度将不允许针位置相对于卵母细胞的的适当监视。 - 下的荧光解剖范围与25X目镜，转移在含有过滤ASW聚赖氨酸包被的培养皿30的卵母细胞用300-400微米转印巴斯德吸管。
- 存入的卵母细胞沿着线进行注射出在一个有序的方式，并区分非注入卵母细胞注射。注入少量（30卵母细胞），以最大限度地减少卵母细胞，以多聚赖氨酸，这往往会变形发育中胚胎的曝光时间（数据未显示）。
- 使用暗场照明以使卵母细胞作为半透明越好。
- 随着显微的粗动旋钮，将注射针接近卵母细胞。
- 用细镊子，切割，其中尖端开始弯曲程度打开针。通过与喷油脉冲，确认红注射混合实际上是流出针。
- 在200X放大倍数，并与微操作的微动旋钮，轻轻移动的卵母细胞的核内的注射针头。
注：如果插入过表面，注入的解决方案将不会留在卵母细胞内。如果插入太远，卵母细胞会被破坏。 - 注射用1-3脉冲120毫秒durat离子与1-10磅的压力。如果针是足够细，注射用连续流在不断的压力。确保注射体积相当于1/5到单个卵母细胞的体积的1/3。
- 注射后，拔出针头出迅速，以避免在卵母细胞的泄漏。
- 验证注入的解决方案仍然是卵母细胞中，而少数秒钟后，注入的解决方案，在整个传播的卵母细胞。
- 继续前进到线下一个卵母细胞。
- 保持每个系列作为阴性对照在扫描注射的胚胎时估计背景荧光的一些未注射的胚胎。
- 在50°角相对于水平平面的安装注射针上的显微。
- 施肥，选择注射的胚胎和胚胎培养的
- 一旦一个序列已被注射受精的卵母细胞。随着卵母细胞的质量随着时间的推移下降，注入和产卵12后1小时内受精的卵母细胞。
- 根据精子浓度，加1-5滴精子向卵母细胞和漩涡的菜。
注：后约1分钟的施肥信封应该成为胚胎明显。 - 允许胚胎从多聚赖氨酸包被的培养皿分离，同时注入另一系列的卵母细胞。
- 转移的600微米转移巴斯德吸管胚胎成琼脂糖涂层培养皿。如果在所有可能的2细胞期之前尽快除去从多聚赖氨酸包被的培养皿中的胚胎。
注意：如果长时间暴露在聚赖氨酸，胚胎往往成为密集的包装囊胚，扁平的一侧触及盘的底部。 - 在2-细胞至4细胞期，选择用荧光解剖范围与DSR滤波器的成功注射的胚胎， 即，那些具有正常的形态，表现出一个酚红衍生的红色荧光信号。
- 保持在培养的胚胎在过滤ASW琼脂糖包被的培养皿中在19℃，直到所要求的阶段体内成像。
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Representative Results
上文详述的协议提供了基础B的显微注射卵母细胞披针叶 ，因此引进来发展B. mRNA的披胚胎编码荧光蛋白用于体内成像。尽管该技术是肯定健壮和可靠的，使用此协议成功注射的速率保持变量（ 表1）。对于这样一个有趣的事实非常有可能的解释是卵母细胞离合器的极端变异性：不同蛋批次确实表现非常不同，当经受的注入压力。有些卵母细胞是相当有弹性和趋向扁平化在培养皿底部，而有些则是非常僵硬，保持轮后注入。此外，一些卵母批次倾向于膨胀在注射其绒毛膜膜，而另一些简单地裂解（数据未示出）。没有明显的相关性可能卵母细胞行为之间在注射和胚胎成立受精后的发展。因此，这是很难预测其卵母细胞的类别是最适合于显微注射。然而受精后，胚胎发生发育正常，可早鉴定为裂解阶段：2-细胞至4细胞期的胚胎，可认为是正常时的卵裂球之间的接触面小，而一个压实卵裂期胚胎，其中各个细胞难以辨别，肯定是不正常的。
在我们手中，大约一半的卵母细胞引起的注入和大约一半做生存的喷射表现出一个特定的荧光标记的胚胎的创伤不存活。因此，我们估计，与该注射方案，胚在50和120可被成功地注入在给定的一天产卵15和60标记的胚胎之间产生。
的酚红的红色荧光在2-细胞至4细胞期胚胎中非常可靠，标志着有胚胎被正确地注入，以这种方式选择的胚胎的100％的随后产生由注入的mRNA编码的荧光蛋白质。此外，没有酚红的荧光在2-细胞至4细胞期的强度和发病由注入的mRNA编码的蛋白质产生的荧光的时间之间具有非常明显的正相关性。这种相关性从而允许那些已经接收mRNA的最高量在注射过程中的胚胎的识别。
如果选择酚红阳性胚胎后未检测由注入的mRNA编码的荧光蛋白质的信号，建议运行，以便在注射组合上的无RNA酶的凝胶来检查mRNA降解或陷阱（ 图3） 。在泳道1中，一个完整的mRNA带被检测到。注射该组合导致了胚胎强荧光信号。与此相反，在第2道对应于另一个experiment其中酚红替换为葡聚糖染料在混合（见进一步详细讨论）中，mRNA似乎已被这种组合从不导致了胚胎的荧光信号的葡聚糖染料和注射。
使用这种显微注射技术以及我们的构建体（ 表2和3中，补充文件1）（见讨论），我们可以这样重复地产生贯穿在膜与mCherry或eGFP的胚胎在细胞核和eGFP的均匀荧光标记（ 图4） 。摄像协议用 来产生图4将在别处描述（福雷等人，目前正在准备中）。根据mRNA的量注射，荧光蛋白表达通常变得可检测的16细胞（ 图4A）和64细胞阶段之间，并保持检测的至少到晚期神经胚阶段（数据未显示）。后期还没有经过测试。核信号通常出现的潜在的，因为相对于核的紧凑性质，膜的固有漫射性质早于膜信号，（数据未示出）。虽然它没有被监视的系统，胚胎注射两核和膜标签似乎比胚与核的eGFP标记注入独占不太健康。有趣的是，这种效果似乎是独立的mRNA注射的总量，作为注入的mRNA的总量是相同的，一个或两个mRNA种类是否被包括进来（数据未示出）。
图1：构建的细节 。 （一）草图的膜有针对性的绿色荧光蛋白（EGFP：CAAX盒），（B）核靶向绿色荧光蛋白（H2B：EGFP）和（C）的核目标mCherry（H2B：mCherry）构建AR显示如
图2：具有代表性的注射针的形状。 （A）中的锥形的长度为约2cm并在尖端的针的曲线。比例尺= 2毫米。盒装区（B）的放大倍率为A.修剪针（箭头）的位置在针的曲线。针的前端是由箭头指示。比例尺= 500微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：含mRNA和酚红在第1泳道混合的迁移mRNA的相互作用和选择的荧光染料（A）和结果mRNA和德克萨斯红葡聚糖（在3.3毫克/毫升的最终浓度）在泳道含有mRNA和俄勒冈绿葡聚糖（在3.3毫克/毫升终浓度）混合的迁移的车道2.（B）的结果的3，mRNA和FITC葡聚糖（在3.3毫克/毫升终浓度）中的mRNA和罗丹明葡聚糖泳道4和（以3.3毫克/毫升的最终浓度）在泳道5凝胶迁移时间在A和B是不同的。为了清楚起见，黑色的长方形在掩盖了光的反射和虚线划定迁移车道。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：文昌鱼胚胎的3D渲染（阿米拉软件）注入的mRNA编码荧光蛋白图像。从获得上一个优化的Leica SP5双光子激光扫描显微镜3D时的失误萃取（A）的 16个细胞阶段的胚胎表达核H2B：eGFP的（B）的原肠胚期胚胎表达核H2B：mCherry和膜定位的eGFP：CAAX盒（C）的原肠胚期胚胎表达核H2B：mCherry和膜定位的eGFP：CAAX盒。光学部分显示内部细胞核mCherry和膜相关绿色荧光蛋白信号。比例尺= 50微米。
| 实验编号 | 注入的结构基因 | 注射胚胎数 | 标记胚胎数 |
| 1 | H2B：绿色荧光蛋白 | 53 | 23 |
| 2 | H2B：绿色荧光蛋白 | 50 | 31 |
| 3 | H2B：绿色荧光蛋白 | 48 | 20 |
| 4 | H2B：绿色荧光蛋白 | 54 | 24 |
| 五 | H2B：绿色荧光蛋白 | 114 | 47 |
| 6 | H2B：绿色荧光蛋白 | 80 | 46 |
| 7 | H2B：绿色荧光蛋白或 | 62 | 24 |
| H2B：mCherry +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | |||
| 8 | H2B：绿色荧光蛋白 | 87 | 60 |
| 9 | H2B：绿色荧光蛋白 | 77 | 45 |
| 10 | 绿色荧光蛋白：CAAX盒或 | 110 | 51 |
| H2B：mCherry +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | |||
| 11 | H2B：mCherry +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | 45 | 26 |
| 12 | H2B：mCherry +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | 52 | 16 |
| 13 | 绿色荧光蛋白：CAAX盒或 | 74 | 35 |
| H2B：mCherry +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | |||
| 总 | 906 | 448 | |
| 成功率 | 49％ |
表1：注射的成功率的注射构建体，注射的胚胎中存活的注射和标记（或成功注入）胚胎数的数目来表示，为的是成功注射剂的总百分比。
| 构造 | 在PCS2 +矢量位置 | 原始序列 | 突变序列 |
| PCS2 +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| PCS2 + H2B：绿色荧光蛋白 | 82..90 | TCC GAC ACG | 一个 CC 克叔C A AC |
| PCS2 + H2B：mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | 一个 CC 克叔C A AC |
表2：科扎克序列的初步优化原件和突变科扎克序列表示每个结构。所引入的突变恢复B的Kozak序列文昌鱼的理论推断首选Kozak序列的肌动蛋白披针叶基因，这非常类似的（A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT）。
| PCS2 +绿色荧光蛋白：CAAX盒 | |||
| 原始密码 | 突变密码 | 在PCS2 +矢量位置 | |
| （使用级别） | （使用级别） | ||
| GTA | GT 摹 | 154..156 | 绿色荧光蛋白序列 |
| （0.08） | （0.43） | ||
| AGA | AG 摹 | 814..816 | 链接 |
| （0.09） | （0.27） | ||
| PCS2 + H2B：绿色荧光蛋白 | |||
| 原始密码 | 突变密码 | 在位置该PCS2 +矢量 | |
| （使用级别） | （使用级别） | ||
| GTA | GT 摹 | 223..225 | H2B序列 |
| （0.08） | （0.43） | ||
| 289..291 | H2B序列 | ||
| 469..471 | 链接 | ||
| 568..570 | 绿色荧光蛋白序列 | ||
| CTA | CT 摹 | 226..228 | H2B序列 |
| （0.06） | （0.51） | ||
| PCS2 + H2B：mCherry | |||
| 原始密码 | 突变密码 | 在PCS2 + V位置埃克特 | |
| （使用级别） | （使用级别） | ||
| GTA | GT 摹 | 223..225 | H2B序列 |
| （0.08） | （0.43） | ||
| 289..291 | H2B序列 | ||
| 469..471 | 链接 | ||
| 913..915 | mCherry序列 | ||
| CTA | CT 摹 | 226..228 | H2B序列 |
| （0.06） | （0.51） | ||
表3：密码子使用的初步优化 。正本和突变密码子表示每个结构。虽然这还没有被实验测试中，引入穆塔蒂附件是为了优化mRNA翻译文昌鱼。
补充文件1：构建序列 （A）的膜有针对性的绿色荧光蛋白的核苷酸序列。（EGFP：CAAX盒），（B）核靶向绿色荧光蛋白（H2B：EGFP）和（C）的核目标mCherry（H2B ：mCherry）构建体中给出PCS2 +载体主链的情况下。由每个构建体编码的主域示于色：绿色荧光蛋白（绿色），mCherry（红色），来自人HRAS（CAAX盒）膜定位信号（青色蓝色），斑马鱼组蛋白2B的外显子（H2B）（黄色）。
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Discussion
在这篇文章中，我们提出，第一次，详细的和可重复的协议，用于注射的B.卵披针叶 ，其中，经过B. floridae 13,14和B.文昌鱼 15，因此第三文昌鱼物种，其中这样的技术已被描述。重要的是，这里描述的协议也包括载体系统适合于荧光蛋白的B中生产的描述从体外产生的mRNA注入的披 （以下描述）。总之，这些新的工具允许在文昌鱼早期发展和动态的细胞行为背后的最早形态发生事件的胚胎，如裂解和原肠胚形成的分析体内成像。
在一般情况下，显微注射技术具有允许递送入靶细胞，特定的化合物的一个预先定义的体积的优点。有了这个为S.助剂，这种技术的一个主要限制是细胞，它可以在给定的实验中被注入的数量有限。例如，该协议在这里描述为B.披允许注射的每次注射会话100至120鸡蛋，其中约一半将被标记（ 见表3）。对于B. floridae，数量也有500个或更多的卵，可以每天注射，其中超过50％的存活的注射13,14非常相似。而对于注射B.协议和披针叶B. floridae鸡蛋酷似对方，B.文昌鱼技术略有不同：将卵放置在多聚赖氨酸包被的盖玻片和注射执行使用了不同的品牌一个微量倒置显微镜下。这种方法显然是允许喷射之间200和300 B的每次注射的会话文昌鱼卵子与生存率，孵化率在神经胚阶段之后，邻˚F89.39％至95.83％，15。考虑在该协议的不同，它是很难知道在成功率的差别是否是由于物种相关的或协议相关的差异。一会要平行于不同的协议测试不同的物种来回答这个问题。然而，为了进一步提高卵母细胞针对外源性化合物的递送的数量，其他的协议将必须为文昌鱼开发的。候选技术包括电，轰击微粒，脂质体，并转4。值得注意的是，电穿孔已经被确立为标准技术引入外源材料注入受精卵海鞘被囊动物的蛋，用于研究发育机制8的演进另一脊椎动物脊索动物模型。
对于成功的显微注射和随后的体内成像的荧光蛋白，适合表达载体是一个强制性的先决条件。为此，三个质粒已经被开发并实验验证（ 图1，补充文件1）：用于膜靶向，EGFP基因融合在其3'端与人的HRAS CAAX盒（导致的eGFP：CAAX盒构建体）16，并且对于核靶向，两者的eGFP和mCherry基因融合在其5'末端到斑马鱼组蛋白2B（H2B）外显子（产生，分别在一个H2B：EGFP和一个H2B：mCherry构建体）17。这些构建体中的每一个已被克隆到含有SV40晚期聚腺苷酸化位点和一个SP6启动子，允许在体外加帽mRNA合成18,19的PCS2 +质粒中。此外，其目标是优化构建体翻译中B.披 ，既含有Kozak序列和密码子已被使用的单核苷酸突变（ 表2和3中 ，补充文件1），其适于。巴斯经中川20，B的小水池编的方法披基因进行了分析，以确定一个优选的Kozak序列在该物种。最接近已知天然存在的序列，以这一理论优选的顺序是，B的披针叶肌动蛋白基因。这三个构建体的Kozak位序列，因此修改以符合此肌动蛋白基因序列。另外，B的密码子使用使用密码子使用数据库21和密码子的结构与B的低使用率披概率分析披 （<10％）所取代，只要有可能，通过相当于密码子具有更高的使用概率。
该注射剂的结果表明，蛋白表达从这些载体的水平是适合体内显像分析。鉴于改性载体的表情输出尚未与未修饰的构建体相比较，我们不能精读CLUDE上分别在Kozak共有和编码序列引入的修改的效率。这肯定会是有趣的测试这些修改是否确实有蛋白表达水平的影响。沿着这些路线，最近的分析基于显微注射到B.文昌鱼表明其他，未修饰的载体也可用于mRNA的合成荧光蛋白生产中文昌鱼15。
文昌鱼含有内源性绿色荧光蛋白22。因此胚胎显示出绿色的水平低，以及红色荧光（我们的未公开的意见）。然而，这些内源性水平可忽略不计，相对于从注射了表达构建体产生的荧光水平。因此，文昌鱼胚胎的内源性荧光不干扰使用荧光望远镜或多激光扫描显微镜的实验观察。此外中，注射实验表明，通过mRNA的注射所产生的外源荧光的强度取决于注射的材料的实际量，这是直接与mRNA在注入混合使用的最终浓度相关。B.披胚胎倾向于容忍高达1.8微克的浓度/微升的mRNA，尽管独立于实际的mRNA浓度，某些基因的组合似乎是较少由B.耐受胚胎披针叶比其他人。因此，核mCherry和膜的eGFP mRNA的组合似乎比注射单独核的eGFP的毒性更大。
得克萨斯红葡聚糖以前已用作示踪剂成功注射到卵母细胞文昌鱼13-15。有趣的是，从所注入的mRNA衍生的荧光信号注入含有德克萨斯红葡聚糖溶液和此两个文昌鱼的卵母细胞（n = 4的实验）和zebrafi后从未获得SH胚胎（N = 3的实验）。当注射混合含有在体外转录的mRNA和德克萨斯红葡聚糖的是，无RNase的琼脂糖凝胶（ 图3，泳道2）加载，对应于mRNA的频带不存在。与此相反， 在体外转录的mRNA是可检测在酚红（ 图3，泳道1）的存在下，无RNase的琼脂糖凝胶。定，没有证据表明在凝胶mRNA降解，这些结果表明，德克萨斯红葡聚糖趋于陷阱的mRNA。当在注射液中使用，德克萨斯红葡聚糖可能因此防止注入mRNA的翻译。在此之后的观察，其它染料（FITC葡聚糖，罗丹明葡聚糖和俄勒冈绿葡聚糖）与mRNA的相互作用进行了测试，无论在无RNase琼脂糖凝胶和通过注射成B.披或斑马鱼（ 图3）。的分析表明，FITC葡聚糖不捕获的mRNA上的凝胶（ 图3，兰E 4），并导致荧光蛋白表达在斑马鱼（n = 1的实验），但不是在B的胚胎披 （n = 1的实验）（数据未示出）。罗丹明葡聚糖不捕获的mRNA上的凝胶（ 图3，泳道5），并导致荧光蛋白表达在斑马鱼胚胎（n = 1的实验）（数据未示出），但其活性可以目前还不能在B中测试胚胎披针叶 。最后，由于俄勒冈绿葡聚糖迁移在相同的水平与mRNA，mRNA的诱捕无法通过琼脂糖凝胶（ 图3，泳道3）评估。这后一种染料防止荧光蛋白表达在文昌鱼（n = 1的实验），但不斑马鱼胚胎（n = 1的实验）（数据未示出）。总之，这些数据表明，一些葡聚糖可以有效地抑制注射mRNA的翻译。鉴于剂量反应实验，没有进行，这些数据是定性的。有趣的是，这种抑制效果似乎是依赖于动物种类（斑马鱼对文昌鱼），这凸显了需要进一步研究，以了解这背后的作用机制。此外，这些结果要求预备分析，如果葡聚糖是用作彩色示踪剂注射。
对于给定型号的微量注射技术的发展打开门基因特异性操纵。在文昌鱼，例如，显微注射的首次描述（在B中floridae）随后的一个基因，Hox1基因成功击倒，使用吗啉代寡核苷酸注射23,24。 B的数能成功地每天使用这里介绍的协议被注入披胚胎是与这种类型的研究肯定兼容。此外，这些方法和手头的新颖结构，人们现在还可以设计和注射感兴趣的mRNA（本地或显性负的进行表达和击倒研究ative形式），或使用其他策略破坏基因表达（例如microRNA-或shRNA为基础的战略）。到目前为止，文昌鱼注射只能在卵母细胞阶段进行的，仅仅是因为这是能够有效地固定化的唯一阶段。注射卵母细胞阶段之后，感兴趣的分子被广泛表达在胚胎。因此，如果基因表达需要被改变或只监视在小区的子集，DNA构建需要被注入，因为这些都在显影文昌鱼胚胎15,25-27 mosaically表达。 DNA构建体注射剂也可用于在瞬时转基因测定文昌鱼开发期间，以测试调节区的活性，有马赛克表达15,25-27的上述缺点。
最终，文昌鱼显微注射技术也开启了大门稳定的转基因，包括有针对性的基因敲除特定基因位点或敲入。系统S代表的外源DNA的稳定的插入已经存在，例如用鱼座子为基础TOL2系统，这似乎在昆虫和脊椎动物的脊椎动物28起作用。此外，方法的基础上修改的锌指核酸酶（ZFN）或转录激活状效应核酸（TALENS）或RNA引导的基因组编辑工具（CRISPR / CAS系统）可用于产生点突变和敲入在特定的修改基因组29的区域。这些努力将需要常年繁育文昌鱼人工饲养，它已经被设置为B.文昌鱼 11,30和B.血吸虫 30,31，目前正在为开发A. lucayanum，B. floridae和文昌鱼种这里的特色，B. 32 披针叶 。
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Acknowledgments
笔者想承认的“Animalerie中央去伊维特河畔吉夫”的支持畜牧业。这项工作是由ANR（ANR-09-BLAN-0262-02和ANR-11-JSV2-002-01）迈克尔·舒伯特支持基金，由欧盟FP6授予“Embryomics”，并通过了ANR授予“ANR- 10 BLAN-121801开发进程“让 - 弗朗索瓦·尼古拉和纳丁Peyriéras。若昂·伊曼纽尔卡瓦略通过FCT博士奖学金资助（SFRH / BD /二千零一十二分之八万六千八百七十八）。
请求对这里所描述的载体，可以直接给作者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
