Summary
Vi rapporterer her den robuste og effektiv ekspression af fluorescerende proteiner efter mRNA injektion i ubefrugtede oocytter fra Branchiostoma lanceolatum. Udviklingen af mikroinjektion teknik i denne basale chordate vil bane vejen for vidtgående tekniske innovationer i denne nye model, herunder in vivo imaging og gen-specifikke manipulationer.
Introduction
Under udvikling, en enkelt celle giver anledning til en hel organisme i en meget kompleks proces, der involverer både celledelinger og bevægelser. For bedre at forstå de biologiske principper dynamikken i celle adfærd, har udviklingsmæssige biologer begyndt at bruge fluorescens-baserede in vivo imaging teknikker. Specifikke rum i celler, såsom cellemembraner, kan enten mærkes ved behandlinger med fluorescerende farvestoffer, en fremgangsmåde hæmmes af en mangel på specificitet og vævspenetration 1, eller af den specifikke indførelse i embryo af exogene mRNA'er koder fluorescerende proteiner 2. Forskellige teknikker kan anvendes til effektiv levering af exogene forbindelser, såsom mRNA'er. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, mikroinjektion, elektroporation, bombardement med mikropartikler, lipofektion og transduktion 3,4. Selv om alle disse fremgangsmåder kan anvendes til at indføre eksogene forbindelser i enudviklende embryo, kun mikroinjektion tillader anvendelse af foruddefinerede og nøjagtige mængder i hver celle 3. Mikroinjektionsteknikker er blevet beskrevet for alle større udviklingsmæssige modelsystemer 4 (fx bananfluer, nematoder orme, zebrafisk, frøer, mus) samt for nogle alternative modeller 4, herunder dem, der anvendes til komparative undersøgelser med henblik på at forstå udviklingen i udviklingsmæssige mekanismer (fx søanemoner, Ledorme orme, søpindsvin, søpung sækdyr, den cephalochordate amphioxus).
Cephalochordates, som sammen med sækdyr og hvirveldyr etablere chordate phylum, er særligt velegnede modeller til at studere udviklingen af chordater og diversificering af hvirveldyr fra en hvirvelløse forfader 5-8. Den cephalochordate slægt afveg meget tidligt under chordate evolution; og bevarede cephalochordates, som er opdelt i tre slægter (Branchiostoma, Asymmetron og Epigonichthys), ligner hvirveldyr både med hensyn til den samlede anatomi og genom arkitektur 5-8. Af de omkring 30 arter af cephalochordates der er blevet beskrevet indtil nu, fem er til rådighed for embryologiske og udviklingsmæssige undersøgelser 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahamas lancelet), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (den europæiske amphioxus) Branchiostoma belcheri (kinesisk amphioxus) og Branchiostoma japonicum (japansk amphioxus). Modne voksne tre af disse arter (B. lanceolatum, B. belcheri og B. japonicum) kan induceres til at gyde on-demand i ynglesæsonen 10,11. Desuden, i det mindste for B. lanceolatum kan effektiv gydning også induceres i kunstig havvand 12 og derved gøre denne særlige cephalochordate art tilgængelige for LABORATORerne, der ikke har adgang til naturligt havvand. Kombinationen, i B. lanceolatum, af en praktisk og pålidelig adgang til fostre med en effektiv levering metode, såsom mikroinjektion, indtil videre den eneste levering teknik udviklet i amphioxus (i både B. floridae og B. belcheri) 13-15, vil gøre det muligt at udvikle en roman suite af manipulerende teknikker, herunder afstamning tracing- og dynamisk celleopførsel tilgange.
En protokol for effektiv mikroinjektion af mRNA'er til at udtrykke fluorescerende proteiner i B. lanceolatum embryo blev derfor udviklet. Desuden at give en grundlæggende værktøjskasse til levende billeddannelse af B. lanceolatum embryoner blev vektorsystemer udviklet, der tillader membran-associeret og nuklear ekspression af fluorescerende proteiner. For målretning membran blev forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) fusioneret til den humane HRAS CAAX kasse og kernelokalisering af mCherry og eGFP varopnået ved fusion til zebrafisk histon 2B (H2B) exon (figur 1, Supplerende fil 1). Desuden, med det mål at optimere protein translation, Kozak-sekvenser og kodoner af konstruktionerne er blevet modificeret og tilpasset til brug i B. lanceolatum. Tilsammen vil de injektion metode og ekspressionsvektorer præsenteret her tjene som grundlag for generering af nye eksperimentelle tilgange til cephalochordates, bl.a. analyser ved hjælp af den nyeste fluorescens-baserede in vivo imaging teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af instrumenter og reagenser
- Overførsel Pasteur-pipetter
- Generer en række overførsel Pasteur-pipetter med forskellige tip diameter ved at trække over en flamme ved forskellige hastigheder 230 mm lange Pasteur-pipetter. Sørg for, at tilspidsning er så længe som muligt for glat og fin kontrol med aspiration.
- Med en diamant Skriveren ridse pipetten langs en linie vinkelret på længden af pipetten. Med begge hænder, træk pipetten parallelt med sin længde for at generere en stump snit. Hurtigt flamme-polish pipetten uden at smelte spidsen.
- Varier diameter af spidsen med den fase af oocytterne / embryoner, der skal pipetteres: 300-400 um for ubefrugtede oocytter (ca. 150 um i diameter), 600 um for befrugtede æg (ca. 500 um i diameter), 200-400 um for skraveret neurulae. Brug pipetter med en mund-overvåget aspiration rør til at overføre oocytter / embryoner fra en skåltil en anden.
- Kanyler
- Manipulere kapillærer med handsker for at sikre RNase-fri betingelser. Brug borosilikatglas med endeløse kapillærer med dimensioner på OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, længde 10 mm.
- Hvis kapillærer er trukket på den type opvarmning-filament nål aftrækker beskrevet i Materialer List, skal du bruge følgende indstillinger: Heat 600, Træk 50, Velocity 80, Time 60, tryk 200 eller 300. Ellers sikre, at formen, som er afgørende for vellykket injektioner, er som vist i figur 2 med de følgende egenskaber: 4-8 um yderste spids diameter 2 cm taper længde.
BEMÆRK: Nåle kan trækkes før gydetiden og anvendes i hele sæsonen.
- 5% phenolrødt stamopløsning (4x)
- Forbered frisk før hver gydeperioden.
- I et 0,22 um filtrering rør afvejes 25 mg phenolrødt pulver.
- Tilsæt 0,5 ml DNase- og RNase-frit vand tilrøret med pulveret.
- Spin i 3-5 min ved 18.000 xg ved stuetemperatur for at filtrere-sterilisere opløsningen og fjerne krystaller, der kunne tilstoppe injektionsnålen.
- Opbevares ved 4 ° C eller opbevares 250 pi alikvoter ved -20 ° C.
- 0,25 mg / ml poly-lysin opløsning
- Forbered frisk før hver gydeperioden.
- Opløses 5 mg poly-L-lysin i 20 ml destilleret vand. Store 5 ml alikvoter ved -20 ° C.
- Brug en optøet alikvot straks og kun én gang for at sikre reproducerbar og robust adhæsion af oocytterne til poly-lysin-coatede skålen.
- mRNA-syntese
- Forbered frisk før hver gydeperioden.
- Linearisere 5 ug DNA af interesse med en passende enzym (sædvanligvis i 2 timer ved 37 ° C). For at kontrollere fuldstændigheden af fordøjelsen, køre 2% i volumen af fordøjelsen mix på en 1% agarose-TBE gel i TBE-buffer ved 150 W i 20 min.
- Uddrag linearized DNA med 25: 24: 1 phenol (pH 8,0): chloroform: isoamylalkohol. Vortex i 20 sekunder, centrifugeres 10 minutter ved 18.000 xg og indsamle den vandige (øvre) fase.
- Den vandige fase ekstraheres igen med 24: 1 chloroform: isoamylalkohol. Vortex for 20 sec, centrifugeres 10 minutter ved 18.000 xg og den vandige fase opsamles.
- Præcipiter det lineariserede DNA med 100: 10: 300 lineariseret DNA: 3 M natriumacetat (pH 5,2): 100% ethanol natten over ved -20 ° C.
- Centrifuger i 20 minutter ved 18.000 xg ved 4 ° C. Skyl i 70% ethanol.
- Centrifuger i 10 minutter ved 18.000 xg ved 4 ° C. Lad tørre og resuspender i RNase-frit vand ved en endelig koncentration på 0,5 pg / pl.
- Transskribere 1 ug lineariseret DNA under anvendelse af et mRNA-syntese kit med passende polymerase ifølge producentens anvisninger.
- Ekstraher mRNA med 5: 1 phenol (pH 4,7): chloroform og ammoniumacetat stopopløsning der leveres med kittet.
- Vortex i 20 sekunder, centrifuge 10 minutter ved 18.000 xg og indsamle den vandige fase.
- Den vandige fase ekstraheres igen med 24: 1 chloroform: isoamylalkohol. Vortex for 20 sec, centrifugeres 10 minutter ved 18.000 xg og den vandige fase opsamles.
- Udfælde mRNA med 100% isopropanol natten over ved -20 ° C.
- Centrifuger i 20 minutter ved 18.000 xg ved 4 ° C. Skyl i 80% ethanol.
- Centrifuger i 10 minutter ved 18.000 xg ved 4 ° C. Lad pillen tørre ved stuetemperatur i længere end 5-10 min, da det så vil være vanskeligt at resuspendere. Resuspender i DNase- og RNase-frit vand til en slutkoncentration på mindst 2 pg / pl for at sikre en ordentlig endelig mRNA koncentration i injektion mix.
- For at kontrollere kvaliteten og størrelsen af transkriptionsproduktet, køre 0,5 pi af mRNA på en RNase-fri 1% agarose-TBE gel i TBE-buffer ved 150 W i 20 min. Store 2 pi alikvoter ved -80 ° C.
- Poly-lysin-coatede skåle
BEMÆRK: Poly-lysin CoAted retter anvendes til at immobilisere oocytterne under injektion.- For hver 35 mm cellekultur petriskål (5 i alt), dække bunden af petriskålen med 1 ml af den optøede 0,25 mg / ml poly-lysin opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- For hver 35 mm cellekultur petriskål (5 i alt), overføre 0,25 mg / ml poly-lysin opløsningen i en anden 35 mm cellekultur petriskål. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Kassér 0,25 mg / ml poly-lysin opløsning.
- Lad petriskåle tør, hovedet ved stuetemperatur i 2 timer.
- Opbevar poly-lysin-coatede skåle indpakket i en plastfolie ved 4 ° C for at undgå kontaminering af en maksimal uge.
- Agarose-coatede skåle
BEMÆRK: De anvendes til kultur injiceret embryoner. The agarose tilvejebringer en stødpude for de injicerede embryoner og forhindrer dem i at klæbe til bunden af skålen.- Gør kunstigt havvand (ASW) under anvendelse af 37-38 g / L commercial salte + 0,25 mM NaHCO3 i omvendt osmosevand.
- Opløs agarose til en koncentration på 1% i 0,22 um-filtreret ASW ved opvarmning af opløsningen i en mikrobølgeovn.
- Hurtigt hælde den varme agaroseopløsning fra en 35 mm petriskål i en anden for at sikre en meget tynd agarose coating af skålen.
- Opbevar agarose-coatede skåle indpakket i Saran wrap ved 4 ° C for at undgå kontaminering af en maksimal uge.
- Injektion mix og lastning af injektionsnålene
- Omkring 2 timer før start injektionerne, lave en 2 pi injektion mix i RNase- og DNase-frit vand med endelige koncentrationer på 1-1,8 pg / pl af mRNA, 15% glycerol, 1,25% Phenol Red.
BEMÆRK: Phenol Red farver løsningen, som tillader overvågning af injektionen effektivitet og identifikation af held injicerede embryoner. Glycerol favoriserer mRNA diffusion i oocyt. - Centrifugen 4 minutter ved 18.000 xg tilpellet krystaller. Hold på is indtil brug.
- Med en 10 pi pipette, indsamle 0,5 pi af injektion mix, undgå bunden af røret, hvor krystallerne er blevet pelleteret.
- Efterfylde mindst to injektionsnåle (i tilfælde af en pauser under injektionen) ved pipettering af 0,5 pi dråbe injektion blanding ved den store åbning af nålen.
- Installer nåle i et lager krukke med væske på bunden ved 4 ° C for at forhindre fordampning af injektionen mix. Lad injektion mix langsomt rejser til spidsen af kanylen i mindst 1 time for at minimere skabelsen af bobler.
- Store ekstra injektion blanding ved -80 ° C i maksimalt tre yderligere anvendelser, hvorefter mRNA forringes (data ikke vist).
- Omkring 2 timer før start injektionerne, lave en 2 pi injektion mix i RNase- og DNase-frit vand med endelige koncentrationer på 1-1,8 pg / pl af mRNA, 15% glycerol, 1,25% Phenol Red.
2. Indsamling af biologisk materiale, Mikroinjektion og Embryo Kultur
- Oocyt og sæd kollektion
Bemærk: Se Theodosiouet al. 12 for en detaljeret protokol til at inducere gydning og gamet samling.- Shock hanner og hunner i ASW ved 23 ° C i 24 timer.
- En til to timer før solnedgang, overføre voksne i individuelle kopper i ASW ved 19 ° C, da de fleste voksne vil yngle 1-2 timer efter solnedgang.
- Skyl 35 mm petriskåle i filtreret ASW og lad dem tørre på hovedet for at forhindre oocytter klistrer til bunden af skålen.
- Efter gydning, straks samle sperm og oocyter med en 1.000 pi pipette.
- Hold sperm og oocyter adskilt fra voksne amphioxus fordi kontakten er skadeligt for gamet sundhed (data ikke vist).
- Desuden undgår overraskende voksne, hvilket fører til bevægelser, spreder og dermed fortynde, både sæd og oocytter. For at holde sperm aktive så længe som muligt og at optimere fertilisationsraten, indsamle sperm så koncentreret som muligt.
- Holdsperm på is i et 1,5 ml rør.
- Overfør oocytter i filtreret ASW i de forud skyllet 35 mm petriskåle.
- Overførsel 100-500 oocytter med en tidligere trukket 300-400 um transfer Pasteur pipette til en anden 35 mm petriskål til at udføre injektioner.
- Befrugte resten af koblingen som en kontrol for sæd og ægcelle kvalitet eller til andre forsøg.
- Oocyt injektion
- Installer kanylen på mikromanipulator ved en 50 ° vinkel i forhold til det vandrette plan.
BEMÆRK: Vinkler på mindre end 50 ° vil skubbe oocytterne rundt på skålen, mens vinkler på mere end 50 ° ikke vil tillade en passende overvågning af nålen position i forhold til ægget. - Under en fluorescerende dissekere omfang med 25x okularer, overfører 30 oocytter med 300-400 um transfer Pasteur pipette på en poly-lysin-coatede fad indeholder filtreret ASW.
- Depositum oocytterne langs en linje til at bæreud injektioner på en overskuelig måde og til at skelne injiceret fra ikke-injicerede oocytter. Injicer mindre mængder (30 oocytter) for at minimere eksponeringstiden af oocytter til poly-lysin, som har tendens til at deformere udviklingslandene embryoner (data ikke vist).
- Brug mørkefeltbelysning at gøre oocytterne som gennemskinnelig som muligt.
- Med den grove bevægelse knop mikromanipulator, bringe kanylen tæt på en oocyt.
- Med fine tænger, skar nålen på det niveau, hvor spidsen begynder at være buet. Ved at pulsere med injektoren kontrollere, at røde injektion blanding er faktisk flyder ud af nålen.
- På 200X forstørrelse og med den fine bevægelse knop af mikromanipulator, bevæger forsigtigt kanylen inde i kernen af oocyt.
BEMÆRK: Hvis indsat for overfladisk, vil den injicerede løsning ikke forblive inde i ægget. Hvis der er indsat for langt, vil oocyt blive ødelagt. - Injicer med 1-3 pulser af 120 msek Varighion og 1-10 psi tryk. Hvis nålen er fint nok, injicere med kontinuerlig strøm ved konstant tryk. Sørg for at injektionsvolumen svarer til 1/5 til 1/3 af volumenet af en enkelt oocyt.
- Efter injektion, træk nålen ud hurtigt for at undgå lækage af oocyt.
- Kontroller, at den injicerede løsning forbliver inden oocytten og efter et par sekunder, den injicerede løsning breder sig i hele oocyt.
- Gå videre til den næste oocyt på linje.
- Hold nogle uinjicerede embryoner af hver serie som negativ kontrol for at vurdere baggrunden fluorescens ved scanning for injicerede embryoner.
- Installer kanylen på mikromanipulator ved en 50 ° vinkel i forhold til det vandrette plan.
- Befrugtning, udvælgelse af injicerede embryoner og embryo kultur
- Befrugte oocytter, så snart en serie er blevet injiceret. Som oocyt kvalitet aftager med tiden, injicere og befrugte oocytter inden for 1 time efter æglægningen 12.
- Afhængigt af koncentrationen af sædceller tilsættes 1-5 dråber af sæd til oocytterne oghvirvel fadet.
BEMÆRK: befrugtning kuvert skal fremgå på embryoner efter ca. 1 min. - Lad embryoner at løsne sig fra poly-lysin-coatede skålen, mens injektion anden serie af oocytter.
- Overfør embryoner med 600 um overførsel Pasteur pipette ind i en agarose-coatede petriskål. Fjern embryoner fra poly-lysin-coatede skålen snarest muligt, hvis det overhovedet er muligt inden 2-celle stadiet.
BEMÆRK: I tilfælde af langvarig udsættelse for poly-lysin, embryonerne tendens til at blive tæt pakket blastulae, fladtrykt på siden rører bunden af skålen. - Ved 2-celle til 4-celle stadiet vælge med et fluorescerende dissektionsmikroskop med DSR filter de succes-injicerede embryoner, dvs., dem med en normal morfologi som udviser en phenolrødt afledt rødt fluorescerende signal.
- Hold embryoner i kultur i filtreret ASW i agarose-coatede petriskåle ved 19 ° C, indtil den ønskede scene forin vivo-billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor giver grundlag for mikroinjektion af B. lanceolatum oocytter og dermed for indslæbning udvikle B. lanceolatum embryoner af mRNA, der koder for fluorescerende proteiner til in vivo billeddannelse. Selvom teknikken er helt sikkert robust og pålidelig, satsen for succesfulde injektioner ved hjælp af denne protokol forbliver variabel (tabel 1). Den meget sandsynlige forklaring på dette spændende kendsgerning er den ekstreme variation i oocyt koblinger: forskellige æg partier rent faktisk opfører sig meget forskelligt, når det udsættes for pres injektionen. Nogle oocytter er temmelig elastisk og har tendens til at flade i bunden af skålen, mens andre er helt stiv og forbliver rundt ved injektion. Endvidere har nogle oocyt partier tendens til at puste deres chorion membraner efter injektion, mens andre simpelthen lyserer (data ikke vist). Kunne oprettes Ingen indlysende sammenhæng mellem oocyt adfærd efter injektion og embryonaleudvikling efter befrugtningen. Det er således vanskeligt at forudse, hvilken kategori af oocytter er bedst egnet til mikroinjektion. Men efter befrugtningen, kan fostre undergår normal udvikling identificeres så tidligt som spaltningsprodukter faser: 2-celle til 4-celle stadiet embryoner kan betragtes som normal, når kontaktfladen mellem blastomerer er lille, mens et komprimeret spaltning-stadie embryo, hvor de enkelte celler Det er vanskeligt at skelne, er absolut unormalt.
I vores hænder, har omkring halvdelen af oocytterne ikke overleve traumer forårsaget af injektion og ca. halvdelen af de embryoner, der overlever injektionen udviser en specifik fluorescerende mærke. Således estimerer vi, at med denne injektionsprotokol, mellem 50 og 120 embryoner held kan injiceres på en given gydning dag giver mellem 15 og 60 mærkede embryoner.
Den røde fluorescens af phenolrødt i 2-celle til 4-celle embryoer meget pålideligt markerer embryoner, derkorrekt injiceret, som 100% af embryoner udvalgt på denne måde efterfølgende producerer de fluorescerende proteiner kodet af det injicerede mRNA. Derudover er der en meget klar positiv korrelation mellem intensiteten af phenolrødt fluorescens ved 2-celle til 4-celle stadiet og tidspunktet for indtræden af fluorescens produceret af proteinerne kodet af det injicerede mRNA. Denne korrelation tillader således identifikationen af disse embryoner, der har modtaget den højeste mængde af mRNA under injektionsprocessen.
Hvis signalet fra det fluorescerende protein, der kodes af det injicerede mRNA ikke detekteres efter udvælgelsen af phenolrødt-positive embryoner, anbefaler vi at køre injektion mix på en RNAse-fri gel for at kontrollere for mRNA nedbrydning eller indfangning (figur 3) . I bane 1, der registreres et intakt mRNA band. Injektion af denne blanding førte til stærk fluorescerende signal i embryoet. Tværtimod, i bane 2, som svarer til en anden eksperimenterendet hvor Phenol Red blev erstattet med Dextran farvestof i mix (se diskussionen for yderligere detaljer), mRNA synes at være blevet fanget af Dextran farvestof og injektion af denne blanding aldrig ført til fluorescerende signal i embryoet.
Ved anvendelse af denne mikroinjektion teknik og vores konstruktioner (Tabel 2 og 3, Supplerende fil 1) (se diskussion), kan vi således reproducerbart producere homogent fluorescerende mærkning hele embryoet med mCherry eller eGFP i kernen og med eGFP på membranen (figur 4) . Den billeddannende protokol anvendes til at frembringe figur 4 vil blive beskrevet andetsteds (Faure et al., Under udarbejdelse). Afhængig af mængden af mRNA injiceret, fluorescerende protein ekspression typisk bliver påviselig mellem 16-celle (figur 4A) og 64-celle stadier og forbliver påviselige mindst op til den sene neurula etape (data ikke vist). Senere faser er ikke blevet testet. Nuklear signaltypisk forekommer tidligere end membran signal potentielt grund af den iboende diffuse natur af membranen i forhold til den kompakte natur af kernen (data ikke vist). Selv om det ikke er blevet overvåget systematisk, embryoner injiceret med både en nuklear og en membran etiket ser ud til at være mindre sunde end embryoner injiceret udelukkende med nuklear eGFP etiket. Interessant denne virkning synes at være uafhængig af den totale mængde af mRNA injiceret som den totale mængde af injiceret mRNA er den samme, uanset om en eller to mRNA-arter er inkluderet til mix (data ikke vist).
Figur 1: Construct detaljer. Skitser af (A) membranen målrettede eGFP (eGFP: CAAX boks), (B) Nukleare målrettede eGFP (H2B: eGFP) og (C) det nukleare målrettede mCherry (H2B: mCherry) konstruerer are vist.
Figur 2: Form af en repræsentativ injektionsnål. (A) tilspidsning er ca. 2 cm i længden og nålen krummer på spidsen. Scale bar = 2 mm. (B) forstørrelse af den indrammede areal i A. Positionen for klipning nålen (pil) er kurven for nålen. Spidsen af nålen er angivet ved pilespids. Scale bar = 500 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Interaktioner af mRNA og udvalgte fluorescerende farvestoffer (A) Resultat af migrationen af en blanding indeholdende mRNA og phenolrødt i bane 1 ogaf mRNA og Texas Red dextran (ved en slutkoncentration på 3,3 mg / ml) i bane 2. (B) Resultat af migrationen af en blanding indeholdende mRNA og Oregon Green dextran (ved en slutkoncentration på 3,3 mg / ml) i bane 3, af mRNA og FITC dextran (ved en slutkoncentration på 3,3 mg / ml) i bane 4 og mRNA og rhodamin dextran (ved en slutkoncentration på 3,3 mg / ml) i bane 5. Gel migration tid i A og B var anderledes. Af hensyn til klarheden den sorte firkant i A-masker en lys refleksion og de stiplede linier afgrænse migrationen baner. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4: 3D rendering (Amira software) af amphioxus embryoner injiceret med mRNA, der koder for fluorescerende proteiner Billeder er.udvundet af 3D tidspunkter bortfalder erhvervet på en optimeret Leica SP5 2-foton laser-scanning mikroskop (A) 16-celle stadie embryo udtrykker nukleare H2B:.. eGFP (B) gastrula stadie embryo udtrykker nuklear H2B: mCherry og membranen målrettede eGFP:. CAAX boks (C) gastrula stadie embryo udtrykker nuklear H2B: mCherry og membranen målrettet eGFP: CAAX kassen. Den optiske afsnit viser interne celler med nukleare mCherry og membranassocierede eGFP signaler. Scale bar = 50 um.
| Eksperiment nummer | Indsprøjtet konstruktion mRNA | Antal injicerede embryoner | Antal mærkede embryoner |
| 1 | H2B: eGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: eGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: eGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: eGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: eGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: eGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: eGFP eller | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX kasse | |||
| 8 | H2B: eGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: eGFP | 77 | 45 |
| 10 | eGFP: CAAX boks eller | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX kasse | |||
| 11 | H2B: mCherry + eGFP: CAAX kasse | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + eGFP: CAAX box | 52 | 16 |
| 13 | eGFP: CAAX boks eller | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX kasse | |||
| Total | 906 | 448 | |
| Succes rate | 49% |
Tabel 1:. Injektion succesrater De injicerede konstruktioner, er antallet af injicerede embryoner, der overlevede injektionen, og antallet af mærkede (eller held injiceret) embryoner er angivet, som er den samlede procentdel af succesfulde injektioner.
| Construct | Position i pCS2 + vektor | Oprindelige sekvens | Muterede sekvens |
| pCS2 + eGFP: CAAX kasse | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| pCS2 + H2B: eGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
Tabel 2:. Foreløbig optimering af Kozak sekvenser Original og muterede Kozak sekvenser er angivet for hver konstruktion. De indførte mutationer inddrive Kozak-sekvens for B. lanceolatum actin genet, som meget ligner den for den udledte teoretiske foretrukne Kozak-sekvens af amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).
| pCS2 + eGFP: CAAX kasse | |||
| Original codon | Muterede codon | Position i pCS2 + vektor | |
| (Forbrug niveau) | (Forbrug niveau) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | eGFP sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| pCS2 + H2B: eGFP | |||
| Original codon | Muterede codon | Position iden pCS2 + vektor | |
| (Forbrug niveau) | (Forbrug niveau) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | eGFP sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0,06) | (0,51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Original codon | Muterede codon | Placering i pCS2 + vektor | |
| (Forbrug niveau) | (Forbrug niveau) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | mCherry sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0,06) | (0,51) | ||
Tabel 3: Foreløbig optimering af kodonanvendelse. Original og muterede kodoner er angivet for hver konstruktion. Selvom dette ikke er blevet eksperimentelt testede den indførte Mutations er beregnet til at optimere mRNA-translation i amphioxus.
Supplerende Fil 1: Construct sekvenser Nukleotidsekvenserne af (A) membranen målrettet eGFP. (EGFP: CAAX boks), (B) Nukleare målrettede eGFP (H2B: eGFP) og (C) det nukleare målrettede mCherry (H2B : mCherry) konstruktioner er givet i forbindelse med pCS2 + vektorrygraden. De vigtigste domæner kodes af hver af konstruktionerne er vist i farve: eGFP (grøn), mCherry (rød), membranlokalisering signal fra human HRAS (CAAX boks) (cyan blå), zebrafisk histon 2B exon (H2B) (gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi for første gang, en detaljeret og reproducerbar protokol til injektion af B. lanceolatum oocytter, som efter B. floridae 13,14 og B. belcheri 15, er således den tredje amphioxus arter, for hvilke der er beskrevet en sådan teknik. Vigtigere er det, protokollen beskrevet her, omfatter også beskrivelsen af vektorsystemer egnede til fremstilling af fluorescerende proteiner i B. lanceolatum fra injicerede mRNA fremstillet in vitro (beskrevet nedenfor). Tilsammen udgør disse nye værktøjer giver in vivo billeddannelse af den tidlige udvikling af amphioxus og analyse af dynamiske celle adfærd, der ligger til grund for tidligste morfogenetiske begivenheder i embryonet, såsom spaltning og gastrulation.
Generelt mikroinjektion teknik har den fordel at tillade levering, i en målcelle, et foruddefineret mængde af en specifik forbindelse. Med dette er sstøtte, en væsentlig begrænsning ved denne teknik er det begrænsede antal celler, der kan injiceres i en given eksperiment. For eksempel protokollen beskrevet her for B. lanceolatum tillader injektion af 100 til 120 æg pr injektion session, hvoraf omkring halvdelen vil blive mærket (tabel 3). For B. floridae, tallene er meget ens med 500 eller flere æg, der kan injiceres pr dag, hvoraf mere end 50% vil overleve injektionen 13,14. Mens protokoller til indsprøjtning B. lanceolatum og B. floridae æg tæt op ad hinanden, B. belcheri teknik er lidt anderledes: æggene er placeret på poly-lysin-coatede dækglas og injektioner udføres under et omvendt mikroskop ved hjælp af en mikroinjektor af et andet mærke. Denne fremgangsmåde tilsyneladende tillader injektion af mellem 200 og 300 B. belcheri æg pr injektion session med en overlevelsesrate, efter klækning på neurula stadium, of 89,39% til 95,83% 15. I betragtning af de forskelle i protokollerne, er det svært at vide, om forskellene i succesrater skyldes arter-relaterede eller protokol-relaterede forskelle. Man skal teste de forskellige arter parallelt med de forskellige protokoller at besvare dette spørgsmål. Ikke desto mindre, yderligere at øge antallet af oocytter målrettet til levering af exogene forbindelser, vil andre protokoller skulle udvikles til amphioxus. Ansøgeres teknikker indbefatter elektroporering, bombardement med mikropartikler, lipofektion og transduktion 4. Notatet er elektroporation allerede etableret som en standard teknik til indførelse af eksogent materiale i befrugtede søpung tunicate æg, brugte en anden hvirvelløse chordate model til at studere udviklingen i udviklingsmæssige mekanismer 8.
For vellykkede mikroinjektion og efterfølgende in vivo-afbildning af fluorescerende proteiner, der er egnetekspressionsvektorer er en obligatorisk forudsætning. Til det formål har tre plasmider blevet udviklet og eksperimentelt valideret (figur 1, Supplerende fil 1): for målretning membran blev eGFP genet fusioneret ved sin 3'-ende til den humane HRAS CAAX boks (hvilket resulterer i en eGFP: CAAX box-konstruktion ) 16 og for nuklear targeting både EGFP og mCherry gener blev fusioneret i deres 5'-ender til zebrafisk histon 2B (H2B) exon (henholdsvis resulterer i en H2B: eGFP og H2B: mCherry konstrukt) 17. Hver af disse konstruktioner er blevet klonet ind i pCS2 + plasmid indeholdende et SV40 sen polyadenyleringssted og en SP6 promotor, der muliggør in vitro udjævnede mRNA-syntese 18,19. Desuden, med det mål at optimere translation af konstruktionerne i B. lanceolatum har begge Kozak sekvenser og kodonerne blevet tilpasset ved hjælp af enkelt nukleotid mutagenese (tabel 2 og 3, Supplerende fil 1). Based på den fremgangsmåde ved Nakagawa 20, en lille pulje af B. lanceolatum gener blev analyseret for at identificere en foretrukken Kozak-sekvens i denne art. Den nærmeste kendte naturligt forekommende sekvens til denne teoretiske foretrukne sekvens er, at B. lanceolatum actin-genet. Kozak sekvenser for de tre konstruktioner blev derfor modificeret til at matche dette actin gensekvens. Endvidere kodonanvendelsen B. lanceolatum blev analyseret under anvendelse af kodonanvendelse database 21 og kodoner i konstruktionerne med et lavt forbrug sandsynlighed i B. lanceolatum (<10%) blev erstattet, hvor det er muligt, i tilsvarende kodoner med højere forbrug sandsynlighed.
Resultaterne af injektionerne viser, at niveauet af protein-ekspression fra disse vektorer er egnet til in vivo-afbildning analyser. Eftersom ekspressionen output af de modificerede vektorer ikke er blevet sammenlignet med umodificerede konstruktioner, kan vi ikke con, kan nævnes af effektiviteten af de ændringer, der blev indført i Kozak konsensus og de kodende sekvenser. Det ville sikkert være interessant at teste, om disse ændringer faktisk have en indvirkning på proteinekspressionsniveauer. Langs disse linjer, en nylig analyse baseret på mikroinjektioner til B. belcheri antyder, at andre, ikke-modificerede vektorer kan også anvendes til syntese af mRNA for fluorescerende protein produktion i amphioxus 15.
Amphioxus indeholder endogene grønt fluorescerende proteiner 22. Embryonerne udviser derfor lave grøn samt rød fluorescens (vores upublicerede observationer). Men disse endogene niveauer er ubetydelig med hensyn til niveauer af fluorescens som følge af injektion af vores mRNA konstruktioner. Derfor er den endogene fluorescens amphioxus embryoner ikke forstyrre eksperimentelle observationer ved hjælp af fluorescerende kikkert eller flere laser scanning mikroskoper. DesudenDe injektion eksperimenter viser, at intensiteten af det eksogene fluorescens genereret af mRNA injektion afhænger den faktiske mængde af indsprøjtet materiale, som er direkte korreleret med den endelige koncentration af mRNA anvendes i injektion mix. B. lanceolatum embryoner tendens til at tolerere en koncentration på op til 1,8 pg / pl mRNA, selv uafhængigt af den faktiske mRNA koncentration nogle mRNA kombinationer synes at være mindre tolereret af B. lanceolatum embryoner end andre. Kombinationen af nuklear mCherry og membran eGFP mRNA'er syntes at være mere toksiske end injektion af nukleare eGFP alene.
Texas Red dextran er tidligere blevet anvendt som et sporstof for vellykkede injektioner i amphioxus oocytter 13-15. Interessant nok blev et fluorescerende signal afledt fra det injicerede mRNA aldrig opnået efter injektion af opløsninger indeholdende Texas Red dextran og dette i begge amphioxus oocytter (n = 4 forsøg) og zebrafish embryoner (n = 3 eksperimenter). Når en injektion blanding indeholdende in vitro transkriberet mRNA og Texas Red dextran er indlæst på et RNase-frit agarosegel (figur 3, bane 2), båndet svarende til mRNA er fraværende. I modsætning hertil mRNA in vitro transkriberet kan detekteres på en RNase-fri agarosegel i nærværelse af phenolrødt (figur 3, bane 1). Da der ikke er noget bevis for mRNA nedbrydning på gelen antyder disse resultater, at Texas Red dextran tendens til at fælde mRNA. Når det bruges i en injektion løsning, måske Texas Red dextran dermed forhindre oversættelsen af den injicerede mRNA. Efter denne observation, blev interaktionerne mellem andre farvestoffer (FITC dextran, rhodamin dextran og Oregon Green dextran) med mRNA testet både RNase-fri agarosegeler og ved injektion i B. lanceolatum eller zebrafisk (figur 3). Analyserne viser, at FITC dextran ikke fælde mRNA på gel (figur 3, LANE 4) og fører til fluorescerende protein ekspression i zebrafisk (n = 1 eksperiment), men ikke i embryoner fra B. lanceolatum (n = 1 eksperiment) (data ikke vist). Rhodamin dextran ikke fælde mRNA på gel (figur 3, bane 5) og fører til fluorescerende protein ekspression i zebrafisk embryoer (n = 1 eksperiment) (data ikke vist), men dens aktivitet kan desværre ikke testes i B. lanceolatum embryoner. Endelig, som Oregon Green dextran vandrer på samme niveau som mRNA, mRNA trapping kunne ikke vurderes ved agarosegel (figur 3, bane 3). Sidstnævnte farvestof forhindret fluorescerende protein ekspression i amphioxus (n = 1 eksperiment), men ikke zebrafisk embryoner (n = 1 eksperiment) (data ikke vist). I sum, antyder disse data, at nogle dextraner effektivt kan inhibere translation af injiceret mRNA. Da dosis-respons forsøg, der ikke blev gennemført, er disse data kvalitative. Interessant denne inhiberende virkning synes at være afhængig afdyreart (zebrafisk versus amphioxus), der fremhæver behovet for yderligere undersøgelser for at forstå mekanismerne bag denne effekt. Desuden kalder disse resultater til forberedende analyser, hvis dextraner skal bruges som farve sporstoffer til injektioner.
Udviklingen af mikroinjektion teknik til en given model åbner døren for genspecifikke manipulationer. I amphioxus, for eksempel den første beskrivelse af mikroinjektioner (i B. floridae) blev efterfulgt af en vellykket knockdown af et gen, hox1 anvendelse morpholino oligonucleotid injektioner 23,24. Antallet af B. lanceolatum embryoner, der med succes kan injiceres dagligt brug af protokollen præsenteres her er helt sikkert kompatibel med denne type undersøgelse. Desuden vil der med disse metoder og de nye konstruktioner ved hånden, kan man nu også designe og udføre overekspression og knockdown studier ved injektion af mRNA'er af interesse (native eller dominant-negtive former) eller bruge andre strategier for at forstyrre genekspression (fx microRNA- eller shRNA-baserede strategier). Indtil videre kan amphioxus injektioner kun udføres på oocyt stadium, fordi det er den eneste fase, der effektivt kan immobiliseres. Efter injektion på oocyt stadium er molekylet af interesse udtrykkes ubikvitært i embryoet. Således, hvis genekspression skal ændres eller overvåges kun en delmængde af celler må DNA-konstruktioner, der skal injiceres, da disse udtrykkes mosaically i udviklingslandene amphioxus embryo 15,25-27. DNA-konstruktion injektioner kan også anvendes til at teste aktiviteten af regulatoriske regioner under amphioxus udvikling forbigående transgene assays med den førnævnte ulempe mosaik ekspression 15,25-27.
I sidste ende er amphioxus mikroinjektion teknik åbner også døren for stabil gensplejsning, herunder målrettede knock-out eller knock-in af specifikke genetiske loci. Systems for stabil insertion af eksogen DNA allerede eksisterer, for eksempel med fisk transposon-baseret Tol2 system, der synes at fungere i både insekter og amniote hvirveldyr 28. Endvidere tilgange baseret på modificerede zinkfinger-nukleaser (ZFNs) eller transkriptionsaktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) eller RNA-styrede genom redigeringsværktøjer (CRISPR / Cas-system) kan anvendes til at generere punktmutationer og knock-in modifikationer i specifikke regioner af genomet 29. Denne indsats vil kræve avlen året rundt af amphioxus i fangenskab, som allerede er blevet sat op til B. belcheri 11,30 og B. japonicum 30,31 og er ved at blive udviklet til A. lucayanum, B. floridae og amphioxus arter featured her, B. lanceolatum 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den støtte fra "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" for dyrehold. Dette arbejde blev støttet af midler fra ANR (ANR-09-Blan-0262-02 og ANR-11-JSV2-002-01) til Michael Schubert, som Den Europæiske Union FP6 tilskud "Embryomics" og af ANR tilskud "ANR- 10-Blan-121801 Dev-processen "til Jean-François Nicolas og Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho er finansieret af en FCT ph.d. stipendium (SFRH / BD / 86878/2012).
Anmodning om vektorerne er beskrevet her, kan rettes direkte til forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
