Summary
Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling van een enkele cel leidt tot een volledig organisme in een zeer complex proces dat zowel celdelingen en bewegingen omvat. Om beter te begrijpen van de biologische principes van de dynamiek van de cel gedrag, hebben ontwikkelingsbiologen begonnen met fluorescentie gebaseerde in vivo imaging technieken te gebruiken. Specifieke compartimenten van cellen, zoals celmembranen, kan hetzij door behandelingen worden gelabeld met fluorescente kleurstoffen, een benadering gehinderd door een gebrek aan specificiteit en weefselpenetratie 1 of de specifieke introductie in het embryo van exogeen mRNA coderend fluorescente proteïnen 2. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt voor de efficiënte afgifte van exogene verbindingen, zoals mRNA. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, micro-injectie, elektroporatie, beschieting met microdeeltjes, lipofectie en transductie 3,4. Hoewel al deze benaderingen kan worden gebruikt om exogene verbindingen in een ingevoerdontwikkeling van het embryo, alleen micro-injectie kan de toepassing van vooraf gedefinieerde en precieze hoeveelheden in elke cel 3. Micro-injectie technieken zijn beschreven voor alle belangrijke ontwikkelings modelsystemen 4 (bijvoorbeeld, fruitvliegen, nematode wormen, zebravis, kikkers, muizen) en voor sommige alternatieve modellen 4, onder andere gebruikt voor vergelijkende studies gericht op het begrijpen van de evolutie van ontwikkelingsmechanismen (bv, zeeanemonen, annelid wormen, zee-egels, ascidian manteldieren, de Schedellozen amphioxus).
Cephalochordates, die samen met manteldieren en gewervelden vestigen de chordate phylum, zijn bijzonder goed geschikt modellen om de evolutie van chordadieren en de diversificatie van de gewervelde dieren van een ongewerveld voorouder 5-8 te bestuderen. De Schedellozen lineage afweken zeer vroeg tijdens chordate evolutie; en bestaande cephalochordates, die zijn onderverdeeld in drie geslachten (Branchiostoma, Asymmetron en Epigonichthys), lijken op gewervelde dieren, zowel in termen van algemene anatomie en genoom architectuur 5-8. Van de ongeveer 30 soorten cephalochordates die tot nu toe zijn beschreven, vijf zijn beschikbaar voor embryologische en ontwikkelingsstudies 6,9: Asymmetron lucayanum (de Bahama lancetvisje), Branchiostoma Floridae (de amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (de Europese amphioxus), Branchiostoma belcheri (de Chinese amphioxus) en Branchiostoma japonicum (de Japanse amphioxus). Rijpe volwassenen van drie van deze soorten (B. lanceolatum, B. belcheri en B. japonicum) kan worden geïnduceerd om te paaien on-demand tijdens het broedseizoen 10,11. Bovendien, althans voor B. lanceolatum kan een efficiënt paai ook geïnduceerd worden in kunstmatig zeewater 12, waardoor deze bijzondere Schedellozen soort toegankelijk voor laborator makenies die geen toegang tot natuurlijke zeewater hebben. De combinatie, in B. lanceolatum van een gemakkelijke en betrouwbare toegang tot embryo's met een efficiënte levering methode, zoals micro-injectie, tot nu toe de enige afgiftetechniek ontwikkeld amphioxus (zowel B. Floridae en B. belcheri) 13-15, zal de ontwikkeling van een mogelijk roman suite van manipulatieve technieken, waaronder lineage opsporings- en dynamische cel-gedrag-gebaseerde benaderingen.
Een protocol voor de efficiënte micro-injectie van mRNA naar fluorescerende eiwitten in de B. uitdrukken lanceolatum embryo werd dus ontwikkeld. Bovendien, om een basis toolkit voor live beeldvorming van B. bieden lanceolatum embryo, vector systemen ontwikkeld die membraangebonden en nucleaire expressie van fluorescerende eiwitten mogelijk. Voor membraan targeting, versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) werd gefuseerd met de humane HRAS CAAX box en nucleaire lokalisatie van mCherry en eGFP wasverkregen door fusie aan de zebravis histon 2B (H2B) exon (figuur 1, aanvullend bestand 1). Verder met als doel eiwittranslatie optimaliseren, de Kozak sequenties en codons van de constructen werden aangepast en afgestemd op gebruik in B. lanceolatum. Samen zullen de injectiemethode en expressievectoren hier gepresenteerde dienen als basis voor het genereren van nieuwe experimentele benaderingen voor cephalochordates name analyses met de nieuwste fluorescentie gebaseerde in vivo beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de instrumenten en reagentia
- Transfer pasteurpipetten
- Genereren van een reeks van overdracht pasteurpipetten met verschillende diameters tip door te trekken 230 mm lang pasteurpipetten boven een vlam bij verschillende snelheden. Zorg ervoor dat de tapsheid zo lang mogelijk voor vloeiende en nauwkeurige regeling aspiratie.
- Met een diamant schrijver, krassen pipet langs een lijn loodrecht op de lengterichting van de pipet. Met beide handen, trek de pipet parallel aan de lengte van een stompe snit genereren. Snel vlam-polish de pipet zonder het afdichten van de tip.
- Vary de diameter van de tip met de fase van de eicellen / embryo's worden gepipetteerd: 300-400 urn voor onbevruchte eicellen (ongeveer 150 urn in diameter), 600 urn voor bevruchte eieren (ongeveer 500 urn in diameter), 200-400 pm voor gearceerde neurulae. Gebruik pipetten met een mond-gecontroleerd afzuigslang aan eicellen / embryo's van het ene gerechteen andere.
- Injectienaalden
- Manipuleren van de capillairen met handschoenen te zorgen RNase vrije omstandigheden. Gebruik borosilicaatglas met gloeidraad haarvaten met afmetingen van OD 1.20 mm, ID 0,94 mm, lengte 10 mm.
- Als haarvaten worden getrokken van het type verwarming-filament naald puller in de Materials List beschreven, gebruikt u de volgende instellingen: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tijd 60, Pressure 200 of 300. Anders is ervoor te zorgen dat de vorm, dat is cruciaal belang voor injecties, zoals getoond in figuur 2 met de volgende eigenschappen: 4-8 urn buitendiameter tip diameter 2 cm taper lengte.
OPMERKING: Naalden kan voordat de paaitijd worden getrokken en worden gebruikt gedurende het hele seizoen.
- 5% Fenolrood stockoplossing (4x)
- Vers bereid elke paaitijd.
- In een 0,22 pm-filtratie buis, wegen uit 25 mg Fenolrood poeder.
- Voeg 0,5 ml DNase- en RNase-vrij water tede buis met het poeder.
- Spin gedurende 3-5 min bij 18.000 xg bij kamertemperatuur filter steriliseren van de oplossing en verwijderen van kristallen die de injectienaald kunnen verstoppen.
- Bewaar bij 4 ° C en bewaar 250 ul aliquots bij -20 ° C.
- 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing
- Vers bereid elke paaitijd.
- Los 5 mg poly-L-lysine in 20 ml gedestilleerd water. WINKEL 5 ml porties bij -20 ° C.
- Gebruik een ontdooide monster onmiddellijk en éénmalig reproduceerbaar en robuust hechting van de oöcyten de poly-lysine-gecoate schaal verzekeren.
- mRNA-synthese
- Vers bereid elke paaitijd.
- Lineariseren 5 ug DNA van belang met het geschikte enzym (gewoonlijk 2 uur bij 37 ° C). Om de volledigheid van de spijsvertering te controleren, lopen 2% in volume van de spijsvertering mix op een 1% agarose-TBE gel in TBE buffer bij 150 W gedurende 20 minuten.
- Pak de lineatoriseerde DNA met 25: 24: 1 fenol (pH 8,0): chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 sec, centrifuge 10 min bij 18.000 xg en het verzamelen van de waterige (bovenste) fase.
- Extract de waterfase opnieuw met 24: 1 chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 seconden, centrifugeer 10 minuten bij 18000 xg en het verzamelen van de waterige fase.
- Neerslag gelineariseerde DNA met 100: 10: 300 gelineariseerd DNA: 3 M natriumacetaat (pH 5,2) 100% ethanol overnacht bij -20 ° C.
- Centrifugeer 20 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Spoel met 70% ethanol.
- Centrifugeer 10 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Laten drogen en resuspendeer in RNase-vrij water in een eindconcentratie van 0,5 ug / ul.
- Transcribeer 1 ug gelineariseerd DNA met een mRNA-synthese kit met de juiste polymerase, volgens de instructies van de fabrikant.
- Extraheer het mRNA met 5: 1 fenol (pH 4,7): chloroform en ammoniumacetaat stopoplossing die bij de kit.
- Vortex gedurende 20 sec, centrifuge 10 min bij 18.000 xg en verzamel de waterfase.
- Extract de waterfase opnieuw met 24: 1 chloroform: isoamylalcohol. Vortex gedurende 20 seconden, centrifugeer 10 minuten bij 18000 xg en het verzamelen van de waterige fase.
- Neerslag het mRNA 100% isopropanol overnacht bij -20 ° C.
- Centrifugeer 20 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Spoel in 80% ethanol.
- Centrifugeer 10 minuten bij 18.000 xg bij 4 ° C. Laat het pellet droog bij kamertemperatuur niet meer dan 5-10 min als het dan moeilijk te mengen zijn. Resuspendeer in DNase- en RNase-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van ten minste 2 ug / ul een fatsoenlijke uiteindelijke mRNA concentratie injectie mix waarborgen.
- Om de kwaliteit en grootte van het transcriptieproduct controleren, werking 0.5 ul van het mRNA op een RNase-free 1% agarose-TBE gel in TBE buffer bij 150 W gedurende 20 minuten. WINKEL 2 pi aliquots bij -80 ° C.
- Poly-lysine beklede schalen
OPMERKING: Poly-lysine coated gerechten gebruikt om de oöcyten immobiliseren gedurende de injectie.- Voor elke 35 mm celcultuur petrischaal (5 in totaal), bedek de bodem van de petrischaal met 1 ml van het ontdooide 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voor elke 35 mm celcultuur petrischaal (5 in totaal), breng de 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing in een 35 mm celcultuur petrischaal. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Gooi de 0,25 mg / ml poly-lysine oplossing.
- Laat de Petrischalen droge, omgekeerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Bewaar de poly-lysine beklede schotels in een plastic omslag bij 4 ° C om verontreiniging gedurende een week maximaal vermijden.
- Agarose-beklede schalen
OPMERKING: Ze worden gebruikt om de cultuur geïnjecteerde embryo's. De agarose een buffer voor de geïnjecteerde embryo en stopt plakken aan de bodem van de schaal.- Maak kunstmatig zeewater (ASW) met behulp van 37-38 g / l commercial zouten + 0,25 mmol NaHCO3 in omgekeerde osmose water.
- Los agarose tot een concentratie 1% 0,22 urn gefiltreerd ASW door verwarming van de oplossing in een magnetron.
- Snel giet de warme agarose-oplossing van een 35 mm petrischaal in een ander teneinde zeer dunne agarose bekleding van de schaal te waarborgen.
- Bewaar de agarose beklede schalen verpakt in Saran wrap bij 4 ° C om verontreiniging gedurende een week maximaal vermijden.
- Injectie mix en laden van de injectienaalden
- Ongeveer 2 uur voor aanvang van de injecties, maak een 2 pl injectie mix in RNase- en DNase-vrij water met uiteindelijke concentraties van 1-1,8 ug / ul van mRNA, 15% glycerol, 1,25% Fenolrood.
OPMERKING: De fenolrood kleuren oplossing, die controle van de injectierendement en identificatie van succesvolle geïnjecteerde embryo mogelijk maakt. Glycerol gunsten mRNA verspreiding binnen de eicel. - Centrifugeer 4 min bij 18.000 xg tepellet kristallen. Houden op ijs tot gebruik.
- Met een pipet 10 ul, verzamel 0.5 ul van de injectie mengsel, het vermijden van de bodem van de buis, waar de kristallen werden gepelleteerd.
- Backfill tenminste twee injectienaalden (bij een pauze tijdens de injectie) pipetteren 0,5 ul druppel injectie mix in de grote opening van de naald.
- Installeer de naalden in een opslagkruik met vloeistof op de bodem bij 4 ° C om verdamping van de injectie mengsel voorkomen. Laat de injectie mix langzaam te reizen naar de punt van de injectienaald voor ten minste 1 uur tot het ontstaan van luchtbellen te minimaliseren.
- WINKEL extra inbreng mengsel bij -80 ° C gedurende maximaal drie extra toepassingen, waarna het mRNA kwaliteit achteruitgaat (gegevens niet getoond).
- Ongeveer 2 uur voor aanvang van de injecties, maak een 2 pl injectie mix in RNase- en DNase-vrij water met uiteindelijke concentraties van 1-1,8 ug / ul van mRNA, 15% glycerol, 1,25% Fenolrood.
2. Het verzamelen van biologisch materiaal, micro-injectie en Embryo Cultuur
- Eicel en sperma collectie
OPMERKING: Zie Theodosiouet al. 12 voor een gedetailleerd protocol voor het induceren van paai- en voor gameet collectie.- Shock mannen en vrouwen in ASW bij 23 ° C gedurende 24 uur.
- Een tot twee uur voor zonsondergang, overdracht volwassenen in afzonderlijke bekers in ASW bij 19 ° C omdat de meeste volwassenen 1-2 uur paaien na zonsondergang.
- Spoel 35 mm petrischalen gefiltreerd ASW en laat ze drogen ondersteboven te voorkomen dat de eicellen te plakken aan de bodem van de schaal.
- Bij het paaien, onmiddellijk verzamelen van sperma en eicellen met een 1.000 III pipet.
- Houd sperma en eicellen scheiden van volwassen amphioxus omdat het contact is schadelijk voor de gezondheid gameet (gegevens niet getoond).
- Vermijd bovendien verrassende volwassenen, waardoor bewegingen die verdwijnen, en dus verdunnen, zowel sperma en eicellen. Om het sperma actief zolang mogelijk te houden en bevruchtingspercentage optimaliseren, verzamel het sperma zo geconcentreerd mogelijk.
- Houdensperma op ijs in een 1,5 ml buis.
- Transfer eicellen in gefilterd ASW in de pre-gespoeld 35 mm petrischaaltjes.
- Transfer 100-500 eicellen met een eerder getrokken 300-400 um overdracht Pasteur pipet om nog eens 35 mm petrischaal met de injecties uit te voeren.
- Bemest de rest van de koppeling als controle voor sperma en eicel kwaliteit of andere experimenten.
- Eicel injectie
- Installeer de injectienaald op de micromanipulator bij een 50 ° hoek ten opzichte van het horizontale vlak.
OPMERKING: Hoeken van minder dan 50 ° zal de eicellen rond duwen op de schotel, terwijl de hoeken van meer dan 50 ° van een passende controle van de naald positie ten opzichte van de eicel niet zal toestaan. - Onder een tl-dissectie scope met 25X oculair, overdragen 30 eicellen met de 300-400 micrometer overdracht Pasteur pipet op een poly-lysine-gecoate schotel met gefilterd ASW.
- Stort de eicellen langs een lijn te voerenuit injecties in een geordende manier en te onderscheiden geïnjecteerd uit niet-geïnjecteerde oöcyten. Injecteer kleine aantallen (30 eicellen) de belichtingstijd van eicellen poly-lysine, die de neiging heeft zich ontwikkelende embryo's vervormen minimaliseren (gegevens niet getoond).
- Gebruik de donkere veld verlichting om de eicellen te maken zo doorzichtig mogelijk te maken.
- Met de grove beweging knop van de micromanipulator, breng de injectienaald in de buurt van een eicel.
- Met fijne tang, opengesneden de naald op het niveau waar de tip begint te worden gebogen. Door het pulseren met de injector, controleer dan of rode injectie mix is eigenlijk stroomt uit de naald.
- Bij 200X vergroting en de fijne beweging knop van de micromanipulator, beweeg de injectienaald in de kern van de eicel.
OPMERKING: Als er te oppervlakkig geplaatst, wordt de geïnjecteerde oplossing niet in de eicel te blijven. Als te ver geplaatst, wordt de eicel vernietigd. - Injecteren met 1-3 pulsen van 120 msec duration en 1-10 psi. Als de naald is fijn genoeg, te injecteren met continue stroom bij constante druk. Zorg ervoor dat het injectievolume overeenkomt met 1/5 tot 1/3 van het volume van een eicel.
- Na injectie, trek de naald uit snel op lekkage van de eicel te voorkomen.
- Controleer of de geïnjecteerde oplossing blijft binnen de eicel en dat na een paar seconden, de geïnjecteerde oplossing verspreidt door de eicel.
- Ga verder met de volgende eicel in de rij.
- Houd een aantal niet-geïnjecteerde embryo's van elke serie als negatieve controle te schatten de achtergrond fluorescentie bij het scannen voor geïnjecteerde embryo's.
- Installeer de injectienaald op de micromanipulator bij een 50 ° hoek ten opzichte van het horizontale vlak.
- Bevruchting, selectie van geïnjecteerde embryo's en embryo cultuur
- Bevruchten eicellen zodra een serie is geïnjecteerd. Zoals eicelkwaliteit afneemt met de tijd, te injecteren en te bevruchten eicellen binnen 1 uur na de paaitijd 12.
- Afhankelijk van de spermaconcentratie, voeg 1-5 druppels van sperma aan oöcyten enwervelen de schotel.
OPMERKING: De bemesting enveloppe dient duidelijk op het embryo worden na ongeveer 1 minuut. - Laat het embryo los te maken van de poly-lysine-gecoate schaal Injecterend andere reeks oöcyten.
- Breng de embryo's met de micrometer overdracht Pasteur pipet 600 in een agarose gecoate petrischaal. Verwijder het embryo uit de poly-lysine gecoate schaal zo spoedig mogelijk, indien mogelijk voordat de 2-cellig stadium.
OPMERKING: Bij langdurige blootstelling aan polylysine, de embryo meestal opeengepakt blastulae, afgeplat aan de zijde contact met de bodem van de schaal worden. - Bij de 2-cel 4-cellig stadium, selecteert met een fluorescerende dissectie scope met DSR filter het succes geïnjecteerde embryo's, dat wil zeggen die met een normale morfologie een fenolrood-afgeleide rood fluorescerend signaal vertonen.
- Houd de embryo's in de cultuur in gefilterd ASW in-agarose gecoate petrischalen bij 19 ° C tot de gewenste podium voorin vivo beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hierboven beschreven verschaft de basis voor de micro-injectie van B. lanceolatum eicellen en dus ook voor het binnenbrengen in het ontwikkelen van B. lanceolatum embryo van mRNA coderend fluorescerende eiwitten in vivo beeldvorming. Hoewel de techniek zeker robuust en betrouwbaar, het percentage succesvolle injecties met dit protocol uiteenloopt (tabel 1). De zeer waarschijnlijke verklaring voor deze intrigerende feite de extreme variabiliteit van eicel koppelingen: verschillende batches ei inderdaad gedragen zich heel anders, wanneer onderworpen aan de injectiedruk. Sommige eicellen vrij elastisch en hebben de neiging om plat op de bodem van de schaal, terwijl andere zeer stijf en blijft rond bij injectie. Bovendien zijn sommige eicel batches neiging hun chorion membranen na injectie blazen, terwijl anderen gewoon Lyse (gegevens niet getoond). Geen duidelijke correlatie kon worden vastgesteld tussen oöcyt gedrag bij injectie en embryonaleontwikkeling na de bevruchting. Het is dus moeilijk te voorspellen welke categorie van eicellen is het meest geschikt voor micro-injectie. Maar na bevruchting embryo ondergaat normale ontwikkeling kunnen reeds geïdentificeerd als splitsing fasen: 2-cel 4-cellig stadium embryo kan normaal worden beschouwd bij het contactoppervlak tussen de blastomeren klein is, terwijl een verdichte splitsing stadium embryo, waarin individuele cellen zijn moeilijk te onderscheiden, is zeker abnormaal.
In onze handen, weet ongeveer de helft van de eicellen niet overleven het trauma veroorzaakt door de injectie en ongeveer de helft van de embryo's die wel overleven de injectie vertonen een specifieke fluorescent label. Daarom schatten we dat dit injectieprotocol, tussen 50 en 120 embryo's geïnjecteerd worden met succes op een bepaalde dag paai waarbij tussen 15 en 60 gelabeld embryo.
De rode fluorescentie van het fenolrood in 2-cel 4-cellig stadium embryo's zeer betrouwbaar markeert embryo's die moetengoed geïnjecteerd, als 100% van de embryo deze manier geselecteerde vervolgens produceren fluorescerende eiwitten waarvoor de geïnjecteerde mRNA. Daarnaast is er een duidelijk positieve correlatie tussen de intensiteit van het fenolrood fluorescentie op de 2-cel 4-cellig stadium en het tijdstip van aanvang van de fluorescentie door de eiwitten waarvoor de geïnjecteerde mRNA. Deze correlatie maakt het dus de identificatie van de embryo's die tijdens het injectieproces de hoogste hoeveelheid mRNA ontvangen.
Als het signaal van het fluorescente proteïne gecodeerd door het geïnjecteerde mRNA niet gedetecteerd na selectie van fenolrood-positieve embryo aanbeveling de injectie mengsel op RNase-free gel lopen om te controleren mRNA degradatie of trapping (figuur 3) . In baan 1, wordt een intacte mRNA band gedetecteerd. Injectie van het mengsel tot sterk fluorescentiesignaal in de embryo. Integendeel, in laan 2 die overeenkomt met andere Experiment waarin fenolrood werd vervangen Dextran kleurstof in het mengsel (zie bespreking voor meer details), het mRNA lijkt te zijn gevangen door de Dextran kleurstof en injectie van dit mengsel nooit tot fluorescent signaal in het embryo.
Met deze micro-injectie techniek en onze constructen (tabellen 2 en 3, aanvullend bestand 1) (zie bespreking), we kunnen dus reproduceerbaar produceren homogeen fluorescentielabelling gehele embryo mCherry of eGFP in de kern en eGFP op het membraan (figuur 4) . De beeldvormingstechniek die voor productie van figuur 4 elders beschreven (Faure et al., In voorbereiding). Afhankelijk van de hoeveelheid mRNA geïnjecteerd fluorescent eiwit expressie wordt gewoonlijk detecteerbaar tussen 16-cellen (Figuur 4A) en 64-cel stadium en blijft detecteerbaar ten minste de late neurula stadium (gegevens niet getoond). Latere fasen zijn niet getest. Nucleaire signaaltypisch lijkt eerder dan membraan signaal, mogelijk vanwege de intrinsiek diffuse aard van het membraan ten opzichte van de compacte aard van de kern (gegevens niet getoond). Hoewel het niet systematisch bewaakt embryo geïnjecteerd met zowel een nucleair en een membraan label lijken minder gezond dan embryo uitsluitend ingespoten met een eGFP label nucleair zijn. Intrigerend Dit effect lijkt onafhankelijk te zijn van de totale hoeveelheid mRNA geïnjecteerd als de totale hoeveelheid ingespoten mRNA is hetzelfde, of een of twee mRNA species zijn opgenomen om de mix (gegevens niet getoond).
Figuur 1: Construct details. Schetsen van (A) het membraan gericht eGFP (eGFP: CAAX doos), (B) de nucleaire-gerichte eGFP (H2B: eGFP) en (C) de nucleaire-gerichte mCherry (H2B: mCherry) construeert are getoond.
Figuur 2: Vorm van een representatieve injectienaald. (A) De conus is ongeveer 2 cm lang en de naald bochten aan het uiteinde. Schaal bar = 2 mm. (B) Vergroting van de boxed gebied A. De positie voor het knippen van de naald (pijl) is in de bocht van de naald. De punt van de naald wordt aangegeven door de pijlpunt. Schaal bar = 500 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3:. Interacties van mRNA en geselecteerde fluorescerende kleurstoffen (A) Resultaat van de migratie van een mengsel dat mRNA en fenolrood in laan 1 enmRNA en Texas Red dextran (bij een uiteindelijke concentratie van 3,3 mg / ml) in laan 2 (B) resultaat van de migratie van een mengsel dat mRNA en Oregon Green dextran (bij een uiteindelijke concentratie van 3,3 mg / ml) in laan 3 van mRNA en FITC dextran (bij een uiteindelijke concentratie van 3,3 mg / ml) in baan 4 en mRNA en Rhodamine dextran (bij een uiteindelijke concentratie van 3,3 mg / ml) in laan 5. Gel migratietijd in A en B was anders. Voor de duidelijkheid, de zwarte rechthoek in A maskers een lichtreflectie en de gestreepte lijnen bakenen de migratie rijstroken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Het 3D teruggeven (Amira software) van amphioxus embryo geïnjecteerd met mRNA's die coderen voor fluorescerende eiwitten Beelden zijn.gewonnen uit 3D tijd-vervalt verworven op een geoptimaliseerde Leica SP5 2-foton laser scanning microscoop (A) 16-cellig stadium embryo uitdrukken nucleaire H2B:.. eGFP (B) gastrulastadium embryo uitdrukken nucleaire H2B: mCherry en het membraan-gerichte eGFP. CAAX doos (C) gastrulastadium embryo tot expressie nucleaire H2B: mCherry en het membraan gerichte eGFP: CAAX box. Het optische gedeelte toont interne cellen met nucleaire mCherry en membraan-geassocieerde eGFP signalen. Schaal bar = 50 micrometer.
| Experiment nummer | Geïnjecteerd construct mRNA | Aantal geïnjecteerde embryo | Aantal gelabelde embryo |
| 1 | H2B: eGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: eGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: eGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: eGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: eGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: eGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: eGFP of | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX doos | |||
| 8 | H2B: eGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: eGFP | 77 | 45 |
| 10 | eGFP: CAAX doos of | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX doos | |||
| 11 | H2B: mCherry + eGFP: CAAX doos | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + eGFP: CAAX doos | 52 | 16 |
| 13 | eGFP: CAAX doos of | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + eGFP: CAAX doos | |||
| Totaal | 906 | 448 | |
| Slagingspercentage | 49% |
Tabel 1:. Injection succespercentages Injecteer constructen, het aantal geïnjecteerde embryo's de injectie en het aantal gemerkte (of met succes geïnjecteerd) overleefden embryo zijn aangegeven, evenals de algehele percentage succesvolle injecties.
| Construeren | Positie in de pCS2 + vector | Oorspronkelijke volgorde | Gemuteerde sequentie |
| pCS2 + eGFP: CAAX doos | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| pCS2 + H2B: eGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | Een CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | Een CC G T C A AC |
Tabel 2:. Voorlopig optimalisatie van Kozak sequenties Original en gemuteerde Kozak sequenties zijn geïndiceerd voor elk construct. De geïntroduceerde mutaties herstellen van de Kozak sequentie van de B. lanceolatum actine gen, die zeer lijkt op die van de afgeleide theoretische voorkeur Kozak sequentie amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC ATG TG / CT).
| pCS2 + eGFP: CAAX doos | |||
| Originele codon | Gemuteerde codon | Positie in de pCS2 + vector | |
| (Gebruiksniveau) | (Gebruiksniveau) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | eGFP opeenvolging |
| (0,08) | (0.43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0.27) | ||
| pCS2 + H2B: eGFP | |||
| Originele codon | Gemuteerde codon | Positie inde pCS2 + vector | |
| (Gebruiksniveau) | (Gebruiksniveau) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B opeenvolging |
| (0,08) | (0.43) | ||
| 289..291 | H2B opeenvolging | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | eGFP opeenvolging | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B opeenvolging |
| (0.06) | (0.51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Originele codon | Gemuteerde codon | Positie in de pCS2 + vEctor | |
| (Gebruiksniveau) | (Gebruiksniveau) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B opeenvolging |
| (0,08) | (0.43) | ||
| 289..291 | H2B opeenvolging | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | mCherry opeenvolging | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B opeenvolging |
| (0.06) | (0.51) | ||
Tabel 3: Voorlopige optimalisering van het codongebruik. Origineel en gemuteerde codons zijn geïndiceerd voor elk construct. Hoewel dit niet experimenteel getest, de geïntroduceerde Mutations zijn bedoeld om mRNA translatie optimaliseren amphioxus.
Aanvullende Bestand 1: Construct sequenties De nucleotide sequenties van (A) het membraan gericht eGFP. (EGFP: CAAX doos), (B) de nucleaire-gerichte eGFP (H2B: eGFP) en (C) de nucleaire-gerichte mCherry (H2B : mCherry) constructen worden in het kader van de pCS2 + vector backbone. De belangrijkste domeinen gecodeerd door elk van de constructen zijn aangegeven in kleur: eGFP (groen), mCherry (rood), membraan lokalisatiesignaal van humane HRAS (CAAX box) (cyaan blauw), zebravis histon 2B exon (H2B) (geel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we voor het eerst een gedetailleerde en reproduceerbare protocol voor de injectie van B. lanceolatum eicellen die na B. Floridae 13,14 en B. belcheri 15, dus de derde amphioxus soorten waarvan dergelijke techniek is beschreven. Belangrijk is het protocol beschreven hier ook de beschrijving van vectorsystemen geschikt voor de productie van proteïnen B. lanceolatum van geïnjecteerde mRNA geproduceerd in vitro (hieronder beschreven). Samen vormen deze nieuwe tools kunnen in vivo beeldvorming van de vroege ontwikkeling van amphioxus en analyse van dynamische cel gedrag dat de vroegste morfogenetische gebeurtenissen ten grondslag liggen in het embryo, zoals klieving en gastrulatie.
In het algemeen, de micro-injectie techniek heeft het voordeel dat de levering in een doelcel, van een vooraf bepaald volume van een specifieke verbinding. Met zijnde ssteun, een belangrijke beperking van deze techniek is de beperkte aantal cellen dat in een bepaald experiment worden geïnjecteerd. Bijvoorbeeld, het protocol hier beschreven voor B. lanceolatum maakt de injectie van 100 tot 120 eitjes per injectiesessie, waarvan ongeveer de helft is vermeld (Tabel 3). Voor B. Floridae de aantallen zeer vergelijkbaar met 500 of meer eieren die kunnen worden geïnjecteerd per dag, waarvan meer dan 50% zal de injectie 13,14 overleven. Hoewel de protocollen voor het injecteren B. lanceolatum en B. Floridae eieren lijken op elkaar, het B. belcheri techniek is iets anders: de eieren worden onder een omgekeerde microscoop met een microinjectie van een ander merk op met poly-lysine beklede dekglaasjes geplaatst en injecties worden uitgevoerd. Deze aanpak maakt het blijkbaar de injectie van tussen de 200 en 300 B. belcheri eieren per injectie sessie met een overlevingskans, na het uitkomen van het neurula stadium, of 89,39% tot 95,83% 15. Gezien de verschillen in de protocollen, is het moeilijk om te weten of de verschillen in slaagkans gevolg zijn soortgerelateerde of protocol gerelateerde verschillen. Men zou de verschillende soorten testen parallel met de verschillende protocollen voor deze vraag. Niettemin verder te verhogen het aantal eicellen gericht voor de afgifte van exogene verbindingen, zullen andere protocollen moeten worden ontwikkeld amphioxus. Kandidaat technieken omvatten elektroporatie, beschieting met microdeeltjes, lipofectie en transductie 4. Van de nota, is elektroporatie reeds ingevoerd als een standaard techniek voor de introductie van exogene materiaal in bevruchte ascidian manteldier eieren, andere ongewervelde chordate model dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de evolutie van ontwikkelingsstoornissen mechanismen 8.
Voor succesvolle micro-injectie en de daaropvolgende in vivo beeldvorming van fluorescerende eiwitten, geschiktexpressie vectoren zijn een verplichte voorwaarde. Om dit te bereiken zijn drie plasmiden werden ontwikkeld en experimenteel bevestigd (figuur 1, aanvullend bestand 1): voor membraan targeting, EGFP gen werd gefuseerd aan het 3'-uiteinde aan de menselijke HRAS CAAX box (resulterend in een eGFP: CAAX box construct ) 16 en, nucleaire targeting zowel de eGFP en mCherry genen gefuseerd aan hun 5'-uiteinden de zebravis histon 2B (H2B) exon (resulterend in respectievelijk een H2B: eGFP en H2B: mCherry construct) 17. Elk van deze constructen werd gekloneerd in de pCS2 + plasmide dat een late SV40 polyadenylatieplaats en een SP6-promotor waarmee in vitro capped mRNA-synthese 18,19. Verder met als doel de vertaling van de constructen optimaliseren B. lanceolatum zowel de Kozak sequenties en de codons zijn aangepast enkelvoudige nucleotide mutagenese (tabellen 2 en 3, aanvullend bestand 1). Based op de aanpak van Nakagawa 20, een klein zwembad van B. lanceolatum genen werd geanalyseerd om een gewenste Kozak sequentie identificeren deze soort. De dichtstbijzijnde bekende natuurlijk voorkomende sequentie om deze theoretische voorkeursvolgorde is dat de B. lanceolatum actine gen. De Kozak sequenties van de drie constructen werden derhalve aangepast om deze actine gensequentie passen. Bovendien, het codongebruik van B. lanceolatum werd geanalyseerd met behulp van het codongebruik databank 21 en codons in de constructen met een laag verbruik waarschijnlijkheid in B. lanceolatum (<10%) werden vervangen, waar mogelijk, door gelijkwaardige codons met een hoger verbruik waarschijnlijkheid.
De resultaten van de injecties blijkt dat het niveau van eiwitexpressie van deze vectoren geschikt voor in vivo beeldvorming analyses. Aangezien de expressie uitgang van de gemodificeerde vectoren is niet vergeleken met die van het ongemodificeerde constructen, kunnen we niet conclude op de efficiëntie van de wijzigingen die in het Kozak consensus en de coderende sequenties zijn geïntroduceerd. Het zou zeker interessant zijn om te testen of deze wijzigingen inderdaad een impact hebben op eiwit expressie niveaus hebben. Langs deze lijnen, een recente analyse op basis van micro-injecties in B. belcheri suggereert dat andere ongemodificeerde vectoren ook worden gebruikt voor de synthese van mRNA voor fluorescerend eiwit productie amphioxus 15.
Amphioxus bevat endogene groen fluorescerende eiwitten 22. De embryo's vertonen derhalve lage groene en rode fluorescentie (onze niet gepubliceerde waarnemingen). Echter, deze endogene niveaus verwaarloosbaar ten opzichte van de fluorescentie niveaus als gevolg van de injectie van mRNA onze constructen. Daarom is de endogene fluorescentie van amphioxus embryo's niet storen experimentele waarnemingen met fluorescerende verrekijker of multi-laser scanning microscoop. BovendienDe injectie experimenten blijkt dat de intensiteit van de fluorescentie gegenereerd door exogene mRNA injectie hangt af van het aantal geïnjecteerde materiaal, dat direct is gecorreleerd met de uiteindelijke concentratie van mRNA in de injectie mix. B. lanceolatum embryo meestal een concentratie tot 1,8 ug / ul mRNA, hoewel onafhankelijk van de werkelijke concentratie mRNA, mRNA sommige combinaties lijken minder getolereerd door B. tolereren lanceolatum embryo's dan anderen. Dus de combinatie van nucleaire mCherry en membraan eGFP mRNA bleek meer toxisch dan de injectie van nucleaire eGFP alleen.
Texas Red dextran is eerder gebruikt als een tracer voor succesvolle injecties in amphioxus 13-15 oöcyten. Intrigerend is een fluorescent signaal afkomstig van de geïnjecteerde mRNA niet na injectie van oplossingen met Texas Red dextran en dit zowel amphioxus oocyten (n = 4 experimenten) en zebrafi verkregensh embryo's (n = 3 experimenten). Wanneer een injectie mengsel dat in vitro getranscribeerd mRNA en Texas Red dextran op RNase-free agarose gel (figuur 3, laan 2) wordt geplaatst, de band die overeenkomt met het mRNA is afwezig. Daarentegen, in vitro getranscribeerde mRNA detecteerbaar op een RNase-free agarosegel in aanwezigheid van fenolrood (figuur 3, laan 1). Aangezien er geen bewijs voor mRNA degradatie op de gel, suggereren deze resultaten dat Texas Red dextran neigt te controleren mRNA. Bij gebruik in injectievloeistof kan Texas Red dextran aldus verhinderen dat translatie van het mRNA geïnjecteerd. Na deze waarneming werden de interacties van andere kleurstoffen (FITC dextran, Rhodamine dextran en Oregon Green dextran) met mRNA getest, zowel RNase-free agarose gels en door injectie in B. lanceolatum of zebravis (figuur 3). De analyses blijkt dat FITC dextran niet val mRNA op gel (figuur 3, lane 4) en leidt tot fluorescerend eiwit expressie in zebravis (n = 1 experiment), maar niet bij embryo's van B. lanceolatum (n = 1, experiment) (gegevens niet getoond). Rhodamine dextran niet val mRNA op gel (figuur 3, laan 5) en leidt tot fluorescerend eiwit expressie in zebravis embryo's (n = 1, experiment) (gegevens niet getoond), maar de activiteit kan helaas niet worden getest B. lanceolatum embryo's. Ten slotte de Oregon Green dextran migreert op hetzelfde niveau als het mRNA, mRNA trapping kon niet worden beoordeeld door agarose gel (figuur 3, laan 3). Deze laatste kleurstof voorkomen fluorescerend eiwit expressie in amphioxus (n = 1 experiment), maar niet zebravisembryo's (n = 1, experiment) (gegevens niet getoond). Samengevat suggereren deze gegevens dat sommige dextranen efficiënt remmen de translatie van mRNA geïnjecteerd. Gezien het feit dat de dosis-respons experimenten niet werden uitgevoerd, zijn deze gegevens kwalitatieve. Intrigerend dit remmende effect lijkt afhankelijk te zijnde diersoort (zebravis versus amphioxus), die de noodzaak van verdere studies naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan dit effect te begrijpen belicht. Bovendien zijn deze resultaten pleiten voor voorbereidende analyses als dextranen worden gebruikt als kleur tracers voor injecties.
De ontwikkeling van de micro-injectie techniek voor een bepaald model opent de deur voor genspecifieke manipulaties. In amphioxus bijvoorbeeld de eerste beschrijving van micro-injecties (in B. Floridae) werd gevolgd door de succesvolle knock-down van een gen, hox1, met morfolino oligonucleotide injecties 23,24. Het aantal B. lanceolatum embryo's die met succes dagelijks worden geïnjecteerd via het protocol hier gepresenteerde zeker verenigbaar met dit type studie. Bovendien, met deze methoden en de roman constructies bij de hand, kan men nu ook ontwerpen en uitvoeren van overexpressie en knock-down studies door injectie van mRNA van belang (native of dominant-negtieve vormen) of gebruik maken van andere strategieën voor het verstoren van genexpressie (bijvoorbeeld microRNA- of shRNA-gebaseerde strategieën). Tot nu toe kan amphioxus injecties alleen worden uitgevoerd in het stadium eicel, omdat dit de enige stap die efficiënt kunnen worden geïmmobiliseerd. Na injectie in de eicel stadium, wordt het molecuul van belang alomtegenwoordig uitgedrukt in het embryo. Dus als genexpressie moet worden gewijzigd of slechts gecontroleerd in een subset van cellen, moet DNA constructen worden geïnjecteerd, aangezien deze mosaically uitgedrukt in ontwikkelingslanden amphioxus embryo 15,25-27. DNA construct injecties kunnen ook worden gebruikt om de activiteit van regulerende gebieden te testen gedurende amphioxus ontwikkeling voorbijgaande transgene assays met voornoemde nadeel mozaïek expressie 15,25-27.
Uiteindelijk is de amphioxus micro-injectie techniek opent ook de deur voor stabiele transgenese, met inbegrip van de gerichte knock-out of knock-in van specifieke genetische loci. Systeems voor stabiele insertie van exogeen DNA bestaan, bijvoorbeeld met fish-transposon gebaseerde Tol2 systeem lijkt te functioneren in zowel insecten en vertebraten amniote 28. Bovendien benade- gemodificeerde zinkvinger nucleasen (ZFNs) of transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) of RNA geleide genoom bewerkingsgereedschappen (CRISPR / CAS systeem) kan worden gebruikt om puntmutaties te genereren en knock-in veranderingen in specifieke gebieden van het genoom 29. Deze inspanningen zullen het hele jaar door kweken van amphioxus in gevangenschap, die reeds is ingesteld voor B. vereisen belcheri 11,30 en B. japonicum 30,31 en wordt momenteel ontwikkeld voor A. lucayanum, B. Floridae en de amphioxus soorten hier aanbevolen, B. lanceolatum 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de steun van de "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" te erkennen voor de veehouderij. Dit werk werd ondersteund door fondsen van ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 en ANR-11-JSV2-002-01) aan Michael Schubert, door de Europese Unie KP6 subsidie "Embryomics" en door de ANR subsidie "ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-proces "aan Jean-François Nicolas en Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wordt gefinancierd door een FCT doctoraatsbeurs (SFRH / BD / 86878/2012).
Verzoeken om de hier beschreven vectoren kunnen rechtstreeks worden gericht aan de auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
