Summary
Vi rapporterer her den robust og effektiv uttrykk for fluorescerende proteiner etter mRNA injeksjon i ubefruktede eggceller av Branchiostoma lanceolatum. Utviklingen av mikroinjeksjon teknikk i denne basal chordate vil bane vei for vidtrekkende tekniske nyvinninger i denne nye modellen systemet, inkludert in vivo avbildning og genspesifikke manipulasjoner.
Introduction
Under utviklingen gir en enkelt celle opphav til en hel organisme i en meget kompleks prosess som involverer både celledelinger og bevegelser. For bedre å forstå de biologiske prinsippene dynamikken i celle atferd, har utviklingsbiologer begynt å bruke fluorescens-basert in vivo imaging teknikker. Spesifikke avdelinger av celler, for eksempel cellemembraner, kan enten bli merket ved behandling med fluorescerende fargestoffer, en tilnærming hemmet av mangel på spesifisitet og vev penetrasjon 1, eller ved den spesifikke innføring i embryo av eksogene mRNA som koder for fluorescerende proteiner 2. Forskjellige teknikker kan brukes for effektiv levering av eksogene forbindelser, slik som mRNA. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, mikroinjeksjon, elektroporering, bombardement med mikropartikler, lipofeksjon, og transduksjon 3,4. Selv om alle disse fremgangsmåter kan brukes for å innføre eksogene forbindelser i enutvikling av embryo, tillater bare mikroinjeksjon anvendelsen av forhåndsdefinerte og presise mengder inn i hver celle 3. Mikroinjeksjon teknikker har blitt beskrevet for alle de store utviklingsmodellsystemer 4 (for eksempel fruktfluer, nematodeormer, sebrafisk, frosker, mus) samt for noen alternative modeller 4, inkludert de som brukes for sammenlignende studier med sikte på å forstå utviklingen av utviklingsmessige mekanismer (f.eks, sjøanemoner, annelid ormer, kråkeboller, ascidian kappedyr, den Lansettfisker amphioxus).
Cephalochordates, som sammen med kappedyr og virveldyr etablere chordate phylum, er spesielt godt egnet modeller for å studere utviklingen av chordatar og spredning av virveldyr fra en virvelløse stamfar 5-8. Den Lansettfisker avstamning avvek veldig tidlig i løpet chordate evolusjon; og bevarte cephalochordates, som er inndelt i tre slekter (Branchiostoma, Asymmetron og Epigonichthys), ligner virveldyr både i form av generelle anatomi og genom arkitektur 5-8. Av de ca 30 arter av cephalochordates som har blitt beskrevet så langt, fem er tilgjengelig for embryologiske og utviklingsstudier 6,9: Asymmetron lucayanum (Bahama Lansettfisker), Branchiostoma floridae (Florida amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (den europeiske amphioxus), Branchiostoma belcheri (den kinesiske amphioxus) og Branchiostoma japonicum (den japanske amphioxus). Modne voksne i tre av disse artene (B. lanceolatum, B. belcheri og B. japonicum) kan induseres å gyte on-demand i hekkesesongen 10,11. I tillegg, i det minste for B. lanceolatum, kan effektiv gyting også bli indusert i kunstig sjøvann 12, og dermed gjør denne spesielle Lansettfisker arter tilgjengelig for laboratoriumtallet som ikke har tilgang til naturlig sjøvann. Kombinasjonen, i B. lanceolatum, av en praktisk og pålitelig tilgang til embryoer med en effektiv leveringsmetode, for eksempel mikroinjeksjon, så langt det eneste levering teknikk utviklet i amphioxus (i både B. floridae og B. belcheri) 13-15, vil muliggjøre utvikling av en roman suite av manipulerende teknikker, inkludert avstamning tracing- og dynamisk celleatferdsbaserte tilnærminger.
En protokoll for effektiv mikroinjeksjon av mRNA for å uttrykke fluorescerende proteiner i B. lanceolatum embryo ble derfor utviklet. Videre, for å gi en grunnleggende verktøykasse for levende avbildning av B. lanceolatum embryoer ble vektorsystemer utviklet som tillater membran-forbundet og kjernefysisk uttrykk for fluorescerende proteiner. For membran målretting, ble forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) smeltet til den menneskelige HRAS CAAX boksen og kjernefysiske lokalisering av mCherry og EGFP varoppnås ved fusjon til sebrafisk histone 2B (H2B) ekson (Figur 1, Supplerende Fil 1). Videre, med det mål å optimalisere protein oversettelse, de Kozak sekvenser og kodonene av konstruksjonene har blitt modifisert og tilpasset bruk i B. lanceolatum. Til sammen vil de injeksjon metode og ekspresjonsvektorene presenteres her tjene som grunnlag for generering av nye eksperimentelle tilnærminger for cephalochordates, særlig analyser bruker den nyeste fluorescens-basert in vivo imaging teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av instrumenter og reagenser
- Overføre Pasteur pipetter
- Generere en rekke overføring Pasteur pipetter med ulike tips diametre ved å trekke 230 mm lange Pasteur pipetter over en flamme på ulike hastigheter. Sørg for at taper er så lenge som mulig for jevn og fin kontroll av aspirasjon.
- Med en diamantspiss, riper i pipetten langs en linje vinkelrett på lengden av pipetten. Med begge hender, trekk pipette parallelt med sin lengde for å generere en sløv kutt. Raskt flamme-polsk pipetten uten å forsegles tuppen.
- Variere diameteren av spissen med fasen av oocyttene / embryoene pipetteres: 300-400 um for unfertilized oocytter (rundt 150 mikrometer i diameter), 600 um for befruktede egg (rundt 500 mikrometer i diameter), 200-400 um for skraverte neurulae. Pipetter med en munn-overvåket aspirasjonsrøret å overføre oocytter / embryoer fra en tallerkentil en annen.
- Kanyler
- Manipulere kapillærer med hansker for å sikre RNase-frie forhold. Bruk borsilikatglass med glødekapillærer med dimensjoner på OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, lengde 10 mm.
- Hvis kapillærer er trukket på den type oppvarming-filament nål avtrekker beskrevet i Materialer List, kan du bruke følgende innstillinger: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Time 60, Trykk 200 eller 300. Ellers sikre at formen, som er avgjørende for vellykkede injeksjoner, er som vist i figur 2 med de følgende egenskaper: 4-8 um ytre spiss diameter, 2 cm taper lengde.
MERK: Nåler kan trekkes før gytesesongen og brukes gjennom hele sesongen.
- 5% fenolrødt stamløsning (4x)
- Forberede frisk før hver gytesesongen.
- I et 0,22 mikrometer filtreringsrøret, veie ut 25 mg av fenolrødt pulver.
- Legg 0,5 ml DNase- og RNase-fritt vann tilrøret som inneholder pulveret.
- Spinn for 3-5 minutter ved 18.000 xg ved romtemperatur for å filtrere-sterilisere løsningen og fjerne krystaller som kan tette kanylen.
- Oppbevar ved 4 ° C eller lagre 250 ul porsjoner ved -20 ° C.
- 0,25 mg / ml poly-lysin løsningen
- Forberede frisk før hver gytesesongen.
- Oppløse 5 mg av poly-L-lysin i 20 ml destillert vann. Butikk 5 ml porsjoner ved -20 ° C.
- Bruk en tint delmengde umiddelbart og bare én gang for å sikre reproduserbar og robust vedheft av ubefruktede egg til poly-lysin-belagt parabolen.
- mRNA-syntese
- Forberede frisk før hver gytesesongen.
- Linear 5 ug DNA av interesse med tilstrekkelig enzym (vanligvis i 2 timer ved 37 ° C). For å kontrollere fullstendigheten av fordøyelsen, drevet 2% i volum av fordøyelsen blanding på en 1% agarose-TBE-gel i TBE-buffer ved 150 W i 20 min.
- Pakk linearized DNA med 25: 24: 1 fenol (pH 8,0) og kloroform: isoamylalkohol. Virvle i 20 sek, sentrifuger i 10 minutter ved 18000 xg og samle den vandige (øvre) fase.
- Ekstraher den vandige fase igjen med 24: 1 kloroform: isoamylalkohol. Virvle i 20 sek, sentrifuger i 10 minutter ved 18000 xg og samle den vandige fase.
- Utfelle det lineariserte DNA med 100: 10: 300 linearisert DNA: 3 M natriumacetat (pH 5,2): 100% etanol over natten ved -20 ° C.
- Sentrifuger i 20 minutter ved 18.000 x g ved 4 ° C. Skyll i 70% etanol.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 18.000 x g ved 4 ° C. La tørke og resuspendere i RNase-fritt vann ved en endelig konsentrasjon på 0,5 ug / ul.
- Transkribere 1 mikrogram av linearisert DNA ved hjelp av en mRNA-syntese kit med riktig polymerase, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Pakk ut mRNA med 5: 1 fenol (pH 4.7): kloroform og ammonium acetat stopp løsning som følger med settet.
- Vortex for 20 sek, centrifuge 10 minutter ved 18000 xg og samle den vandige fase.
- Ekstraher den vandige fase igjen med 24: 1 kloroform: isoamylalkohol. Virvle i 20 sek, sentrifuger i 10 minutter ved 18000 xg og samle den vandige fase.
- Utfelling av mRNA med 100% isopropanol over natten ved -20 ° C.
- Sentrifuger i 20 minutter ved 18.000 x g ved 4 ° C. Skyll i 80% etanol.
- Sentrifuger i 10 minutter ved 18.000 x g ved 4 ° C. La det tørke pellet ved romtemperatur i ikke lenger enn 5-10 minutter som det vil da være vanskelig å resuspendere. Resuspender i DNase- og RNase-fritt vann til en sluttkonsentrasjon på minst 2 ug / ul for å sikre en skikkelig endelige mRNA-konsentrasjon i sprøyteblandingen.
- For å kontrollere kvaliteten og størrelsen av transkripsjonsprodukt, drevet 0,5 ul av mRNA på en RNase-fri 1% agarose-TBE-gel i TBE-buffer ved 150 W i 20 min. Butikk 2 ul porsjoner ved -80 ° C.
- Poly-lysin-belagt retter
MERK: Poly-lysin coated retter brukes til å immobilisere ubefruktede egg under injeksjon.- For hver 35 mm cellekulturpetriskål (5 totalt), dekke bunnen av petriskålen med 1 ml av den tinte 0,25 mg / ml poly-lysin løsning. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- For hver 35 mm cellekultur petriskål (5 totalt), overføre 0,25 mg / ml poly-lysin løsning inn i en annen 35 mm cellekultur petriskål. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Kast 0,25 mg / ml poly-lysin løsning.
- La petriskåler tørr, opp-ned ved romtemperatur i 2 timer.
- Oppbevar poly-lysin-belagte retter innpakket i en plastfolie ved 4 ° C for å unngå forurensning i en uke maksimum.
- Agarose-belagt retter
MERK: De brukes til kultur injisert embryoer. Agarosen gir en pute for de injiserte embryoer og hindrer dem fra å holde seg til bunnen av fatet.- Lage kunstig sjøvann (ASW) med 37-38 g / l commercial salter + 0,25 mM NaHCO3 i omvendt osmose vann.
- Oppløs agarose til en 1% konsentrasjon i 0,22 um-filtrert ASW ved oppvarming av løsningen i en mikrobølgeovn.
- Hugget hell den varme agarose løsning fra en 35 mm petriskål inn i en annen for å sikre en svært tynn agarose belegg av parabolen.
- Oppbevar agarose-overtrukket retter innpakket i Saran vikle ved 4 ° C for å unngå forurensning i en uke maksimum.
- Injeksjon mix og lasting av kanyler
- Om 2 timer før du starter injeksjoner, lage en 2 ul injeksjon mix i RNase- og DNase-fritt vann med sluttkonsentrasjoner på 1 til 1,8 mikrogram / mikroliter av mRNA, 15% glyserol, 1,25% fenolrødt.
MERK: Fenol Røde farger løsning, som tillater overvåking av injeksjons effektivitet og identifisering av vellykket injisert embryoer. Glyserol favoriserer mRNA diffusjon innenfor eggcelle. - Sentrifuger 4 min på 18.000 xg tilpellets krystaller. Hold på is inntil bruk.
- Med en 10 ul pipette, samle 0,5 ul av injeksjonsblandingen, unngå bunnen av røret, hvor krystallene har blitt pelletert.
- Fylle minst to kanyler (i tilfelle en bryter i løpet av injeksjonen) ved å pipettere 0,5 ul dråpe av injeksjonsblandingen ved stor åpning av nålen.
- Installer nålene i en lagringskrukke med væske ved bunnen ved 4 ° C for å unngå fordampning av injeksjonsblandingen. La injeksjons blandingen langsomt å reise til spissen av kanylen i minst 1 time for å minimalisere dannelsen av bobler.
- Lagres ytterligere injeksjon blanding ved -80 ° C i maksimalt tre ytterligere anvendelser, hvoretter mRNA kvaliteten forringes (data ikke vist).
- Om 2 timer før du starter injeksjoner, lage en 2 ul injeksjon mix i RNase- og DNase-fritt vann med sluttkonsentrasjoner på 1 til 1,8 mikrogram / mikroliter av mRNA, 15% glyserol, 1,25% fenolrødt.
2. Innsamling av biologisk materiale, Mikroinjeksjon og Embryo Kultur
- Eggcelle og sperm samling
MERK: Se Theodosiouet al. 12 for en detaljert protokoll for å indusere gyting og for kjønnsceller samling.- Sjokk menn og kvinner i ASW ved 23 ° C i 24 timer.
- En til to timer før solnedgang, overføre de voksne i individuelle kopper i ASW ved 19 ° C fordi de fleste voksne vil gyte 1-2 timer etter solnedgang.
- Skyll 35 mm petriskåler i filtrert ASW og la dem tørke opp-ned for å forhindre at ubefruktede egg fester seg til bunnen av fatet.
- Ved gyting, umiddelbart samle sperm og ubefruktede egg med en 1000 mL pipette.
- Hold sæd og eggceller atskilt fra voksne amphioxus fordi kontakten er skadelig for kjønnscelle helse (data ikke vist).
- Videre unngår oppsiktsvekkende de voksne, noe som fører til bevegelser som forsvinne, og dermed fortynne både spermier og oocytter. For å holde sperm aktiv så lenge som mulig og for å optimalisere befruktning rate, samle sperm så konsentrert som mulig.
- Holdsperm på is i et 1,5 ml rør.
- Overføre ubefruktede egg i filtrert ASW inn de forhånds skylles 35 mm petriskåler.
- Transfer 100-500 ubefruktede egg med en tidligere trukket 300-400 mikrometer overføring Pasteur pipette til en annen 35 mm petriskål for å utføre injeksjonene.
- Gjødsler resten av clutchen som en kontroll for spermier og oocytt kvalitet eller for andre eksperimenter.
- Eggcelle injeksjon
- Installere injeksjonsnålen på mikromanipluatoren ved en 50 ° vinkel i forhold til horisontalplanet.
MERK: Angles på mindre enn 50 ° vil presse de ubefruktede egg rundt på fatet, mens vinkler på mer enn 50 ° ikke vil tillate en hensiktsmessig overvåking av nålen posisjon i forhold til eggcelle. - Under et fluorescerende dissekere omfang med 25x okular, overføre 30 oocytter med 300-400 mikrometer overføring Pasteur pipette på en poly-lysin-belagt skål med filtrert ASW.
- Deponere ubefruktede egg langs en linje for å bæreut injeksjoner i en ordnet måte og å skille injisert fra ikke-injisert eggceller. Injisere små tall (30 oocytter) for å minimalisere eksponeringstiden av oocytter til poly-lysin, som har en tendens til å deformere u-embryoer (data ikke vist).
- Bruk mørke feltet belysning for å gjengi de ubefruktede egg som gjennomsiktig som mulig.
- Med grov bevegelse knute av mikromanipluatoren, bringe kanylen nær en eggcelle.
- Med fin pinsett, kutte åpne nålen på det nivået der spissen begynner å bli buet. Ved pulserende med injektoren, verifisere at rød injeksjon mix er faktisk strømmer ut av nålen.
- Ved 200X forstørrelse og med den fine bevegelse knute av mikromanipluatoren, forsiktig flytte inne i kjernen av eggcelle kanylen.
MERK: Hvis satt inn for overfladisk, vil den injiserte løsning ikke forbli inne i egget. Hvis det er satt for langt, vil eggcelle bli ødelagt. - Injisere med 1-3 pulser av 120 msek duration og 1-10 psi trykk. Hvis nålen er greit nok, injisere med kontinuerlig flyt ved konstant trykk. Sikre at injeksjonsvolumet svarer til 1/5 til 1/3 av volumet av en enkelt oocyte.
- Etter injeksjon, trekk nålen ut raskt for å unngå lekkasje av eggcelle.
- Kontroller at den injiserte løsning forblir innenfor eggcelle og som etter noen sekunder, sprer den injiserte løsning gjennom eggcelle.
- Gå videre til neste eggcelle i kø.
- Holde noen uninjected embryoer fra hver serie som negativ kontroll for å anslå bakgrunnen fluorescens når du skanner for injisert embryoer.
- Installere injeksjonsnålen på mikromanipluatoren ved en 50 ° vinkel i forhold til horisontalplanet.
- Befruktning, utvalg av injisert embryoer og embryo kultur
- Gjødsle ubefruktede egg så snart en serie har blitt injisert. Som eggcelle kvalitet avtar med tiden, injisere og befrukte eggceller innen 1 time etter gyting 12.
- Avhengig av sperm konsentrasjon, legg 1-5 dråper sæd til eggceller ogvirvle parabolen.
MERK: befruktning Konvolutten må bli tydelig på embryoene etter ca 1 min. - Tillate embryoene å løsne fra poly-lysin-belagt fatet, mens injisere en annen serie av ubefruktede egg.
- Overfør embryoene med 600 mikrometer overføring Pasteur pipette inn en agarose-belagt petriskål. Fjern embryoene fra poly-lysin-belagte fatet så snart som mulig, hvis i det hele tatt mulig før 2-cellestadiet.
MERK: Ved langvarig eksponering for poly-lysin, embryoene tendens til å bli tett pakket blastulae, flatet på siden berøre bunnen av fatet. - Ved to-celle til celle 4-trinns velger med et fluorescerende dissekere omfang med DSR filter de med hell-injiserte embryoer, dvs. de med en normal morfologi som oppviser en fenolrødt-avledet rødt fluorescerende signal.
- Hold embryoene i kulturen i filtrert ASW i agarose-belagt petriskåler ved 19 ° C til ønsket scene forin vivo avbilding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor gir grunnlag for mikroinjeksjon av B. lanceolatum eggceller og dermed for innføring i å utvikle B. lanceolatum embryoer av mRNA som koder for fluorescerende proteiner for in vivo avbilding. Selv om teknikken er absolutt robust og pålitelig, forblir hastigheten av vellykkede injeksjoner ved hjelp av denne protokoll variabel (tabell 1). Den meget sannsynlig forklaring på dette faktum interessant er den ekstreme variabilitet av oocytten clutcher: forskjellige partier egg gjør faktisk oppfører seg meget forskjellig, når de utsettes for injeksjonstrykket. Noen av oocytter er ganske elastisk og har en tendens til å flate ut ved bunnen av fatet, mens andre er ganske stiv og forblir runde etter injeksjon. Videre har en del oocytten partier har en tendens til å blåse opp sine chorion membraner ved injeksjon, mens andre rett og slett Lyse (data ikke vist). Ingen åpenbar sammenheng kunne etableres mellom eggcelle atferd ved injeksjon og embryonaleutvikling etter befruktning. Det er således vanskelig å forutse hvilken kategori av oocytter er best egnet for mikroinjeksjon. Men etter befruktning, kan embryo gjennomgår normal utvikling bli identifisert så tidlig som cleavage stadier: 2-celle til 4-cellers stadium embryoer kan betraktes normalt når kontaktflaten mellom blastomeres er liten, mens en komprimert cleavage-trinns embryo, der individuelle celler er vanskelig å skjelne, er definitivt unormal.
I våre hender, har omtrent halvparten av oocytter ikke overleve traumet forårsaket av injeksjonen, og omtrent halvparten av embryoene som overlever injeksjons utviser en spesifikk fluorescerende markør. Dermed regner vi med at med denne injeksjon protokollen, mellom 50 og 120 embryoer kan med hell injisert på en gitt gyte dag gir mellom 15 og 60 merkede embryoer.
Den røde fluorescens av fenolrødt i 2-celle til 4-cellers scene embryoer svært pålitelig markerer embryoer som harblitt riktig injisert, som 100% av embryoer er valgt på denne måte senere å produsere de fluorescerende proteiner kodet av den injiserte mRNA. I tillegg er det en meget klar positiv korrelasjon mellom intensiteten av fenolrødt fluorescens ved 2-cellen til 4-cellestadiet og tidspunktet for inntreden av den fluorescens som produseres av proteiner kodet av den injiserte mRNA. Denne sammenhengen tillater således identifikasjon av disse embryoer som har mottatt den høyeste mengden av mRNA under sprøyteprosessen.
Hvis signalet fra fluorescerende protein kodet av den injiserte mRNA ikke blir oppdaget etter utvalg av Fenol Red-positive embryoer, anbefaler vi å kjøre injeksjons mix på en RNAse fritt gel for å sjekke for mRNA degradering eller fangst (figur 3) . I felt 1 er et intakt mRNA-båndet detektert. Injeksjon av denne blanding resulterte i sterkt fluorescerende signal på embryoet. Tvert imot, i felt 2, som svarer til en annen experiment hvor fenolrødt ble erstattet med Dextran fargestoff i blandingen (se diskusjonen for ytterligere detaljer), synes mRNA å ha blitt fanget av Dextran fargestoff og injeksjon av denne blandingen aldri ført til fluorescerende signal på embryoet.
Ved hjelp av denne teknikken, og mikroinjeksjon våre konstruksjoner (tabell 2 og 3, Supplementary Fil 1) (se omtale), kan vi således reproduserbart fremstille homogent fluorescerende merking hele embryoet med mCherry eller EGFP i kjernen og med EGFP på membranen (figur 4) . Den bildeprotokoll som brukes til å generere figur 4 vil bli beskrevet andre steder (Faure et al., Under forberedelse). Avhengig av mengden av mRNA som injiseres, fluorescerende protein ekspresjon blir typisk detekterbar mellom 16-celle (figur 4A) og 64-celletrinn og forblir detekterbar i det minste inntil slutten av neurula trinn (data ikke vist). Senere stadier har ikke blitt testet. Nuclear signaltypisk ser ut tidligere enn membran signal, eventuelt på grunn av den iboende diffus natur av membranen i forhold til den kompakte natur av kjernen (data ikke vist). Selv om det ikke har blitt overvåket systematisk, embryoer injisert både nukleær og en membran etiketten synes å være mindre enn sunt embryoer injisert utelukkende med et atom EGFP etikett. Intriguingly, synes denne effekten å være uavhengig av den totale mengden av mRNA injisert som den totale mengden av injisert mRNA er den samme, enten det er en eller to mRNA-artene er inkludert i blandingen (data ikke vist).
Figur 1: Konstruer detaljer. Skisser av (A) membranen målrettede EGFP (EGFP: CAAX boks), (B) den atom målrettet EGFP (H2B: EGFP) og (C) den atom målrettet mCherry (H2B: mCherry) konstruerer are vist.
Figur 2: Shape av en representant kanyle. (A) Den taper er ca 2 cm i lengde og nålen kurver på spissen. Skala bar = 2 mm. (B) Forstørrelse av eske området i A. posisjon for klipping nålen (pil) er i kurven av nålen. Tuppen av nålen er indikert av pilspiss. Skala bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Interaksjoner av mRNA og utvalgte fluorescerende fargestoffer (A) Resultater av migreringen av en blanding inneholdende mRNA, og fenolrødt i kolonne 1, ogav mRNA og Texas Rød dekstran (med en sluttkonsentrasjon på 3,3 mg / ml) i felt 2. (B) Resultater av migreringen av en blanding inneholdende mRNA og Oregon Grønn dekstran (med en sluttkonsentrasjon på 3,3 mg / ml) i kjørefelt 3, av mRNA, og FITC-dekstran (med en sluttkonsentrasjon på 3,3 mg / ml) i felt 4 og av mRNA og Rhodamine dekstran (med en sluttkonsentrasjon på 3,3 mg / ml) i felt 5. Gel migrering tid i A og B var annerledes. For ordens skyld, den svarte firkanten i A masker en lysrefleksjon og de stiplede linjene avgrense vandringsveier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 3D-rendering (Amira programvare) av amphioxus embryoer injisert med mRNA som koder for fluorescerende proteiner Bildene er.hentet fra 3D-time-blundere ervervet på en optimalisert Leica SP5 to-foton laserskanning mikroskop (A) 16-celle stadiet embryo uttrykker atom H2B:.. EGFP (B) gastrulastadiet embryo uttrykker atom H2B: mCherry og membranen målrettede EGFP:. CAAX boksen (C) gastrulastadiet embryo uttrykker atom H2B: mCherry og membranen målrettede EGFP: CAAX boks. Den optiske delen viser interne celler med atom mCherry og membranassosiert EGFP signaler. Skala bar = 50 mikrometer.
| Eksperiment nummer | Injisert konstruere mRNA | Antall injisert embryoer | Antall merkede embryoer |
| 1 | H2B: EGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: EGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: EGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: EGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: EGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: EGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: EGFP eller | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boks | |||
| 8 | H2B: EGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: EGFP | 77 | 45 |
| 10 | EGFP: CAAX boks eller | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boks | |||
| 11 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX boks | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + EGFP: CAAX boks | 52 | 16 |
| 13 | EGFP: CAAX boks eller | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + EGFP: CAAX boks | |||
| Total | 906 | 448 | |
| Suksessraten | 49% |
Tabell 1:. Injeksjon suksessrate De injiserte konstruksjoner, antall injiserte embryoer som overlevde injeksjon og antall merket (eller hell injisert) embryoer er angitt, så er den totale prosentandel av vellykkede injeksjoner.
| Konstruere | Posisjon i pCS2 + vektor | Opprinnelige sekvensen | Mutert sekvens |
| pCS2 + EGFP: CAAX boks | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| pCS2 + H2B: EGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | En CC G T C A AC |
Tabell 2:. Tentativ optimalisering av Kozak sekvenser Original og muterte Kozak sekvenser er angitt for hver konstruksjon. De innførte mutasjoner gjenopprette den Kozak-sekvensen til B. lanceolatum aktin genet, som svært tett ligner den til den avgitte teoretisk foretrukne Kozak sekvens av amphioxus (A / CGA / CG / TTC A / GAC atm TG / CT).
| pCS2 + EGFP: CAAX boks | |||
| Opprinnelige kodon | Mutert kodon | Posisjon i pCS2 + vektor | |
| (Brukernivå) | (Brukernivå) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | EGFP sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| pCS2 + H2B: EGFP | |||
| Opprinnelige kodon | Mutert kodon | Posisjon iden pCS2 + vektor | |
| (Brukernivå) | (Brukernivå) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | EGFP sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0.06) | (0.51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Opprinnelige kodon | Mutert kodon | Posisjon i pCS2 + vEctor | |
| (Brukernivå) | (Brukernivå) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | H2B sekvens |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | H2B sekvens | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | mCherry sekvens | ||
| CTA | CT G | 226..228 | H2B sekvens |
| (0.06) | (0.51) | ||
Tabell 3: Tentativ optimalisering av kodonbruk. Originale og muterte kodonene er indikert for hver konstruksjon. Selv om dette ikke har blitt eksperimentelt testet, den introduserte Mutations er ment å optimalisere mRNA oversettelse i amphioxus.
Supplerende Fil 1: Konstruer sekvenser Nukleotidsekvensene av (A) membranen målrettede EGFP. (EGFP: CAAX boks), (B) den atom målrettet EGFP (H2B: EGFP) og (C) den atom målrettet mCherry (H2B : mCherry) konstruksjoner er gitt i sammenheng med pCS2 + vektor ryggrad. De viktigste domener kodet av hver av de konstruerer er angitt i farge: EGFP (grønn), mCherry (rød), membran lokalisering signal fra menneske HRAS (CAAX boks) (cyan blå), sebrafisk histoner 2B ekson (H2B) (gul).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi, for første gang, en detaljert og reproduserbar protokoll for injeksjon av B. lanceolatum eggceller, som etter B. floridae 13,14 og B. belcheri 15, er således den tredje amphioxus art, hvor en slik teknikk er beskrevet. Viktigere protokollen beskrevet her også omfatter beskrivelsen av vektorsystemer er egnet for produksjon av fluorescerende proteiner i B. lanceolatum fra injisert mRNA produsert in vitro (beskrevet nedenfor). Sammen utgjør disse nye verktøyene lar in vivo avbildning av den tidlige utviklingen av amphioxus og analyse av dynamiske celle atferd som ligger til grunn for de tidligste morphogenetic hendelser i embryoet, som spalting og gastrulation.
Generelt, har de mikroinjeksjon teknikk fordelen av å tillate levering, inn i en målcelle, av et forhåndsdefinert volum av en spesifikk forbindelse. Med dette blir sapparatet, er en stor begrensning av denne teknikken begrenset antall celler som kan injiseres under et gitt eksperiment. For eksempel, den protokoll som er beskrevet her for B. lanceolatum gjør at injeksjon av 100 til 120 egg per injeksjon sesjon, hvorav omtrent halvparten vil bli merket (Tabell 3). For B. floridae, tallene er svært like med 500 eller flere egg som kan injiseres per dag, hvorav mer enn 50% vil overleve injeksjonen 13,14. Mens protokollene for injisering B. lanceolatum og B. floridae egg likne hverandre, B. belcheri teknikk er litt annerledes: eggene er plassert på poly-lysin-belagt Dekk og injeksjoner utføres under en invertert mikroskop ved hjelp av en microinjector av et annet merke. Denne tilnærmingen gjør tilsynelatende injeksjon av mellom 200 og 300 B. belcheri egg per injeksjon økt med en overlevelsesrate, etter klekking på neurula scenen, of 89,39% til 95,83% 15. Vurderer forskjellene i protokollene, er det vanskelig å vite om forskjellene i suksessraten skyldes artsrelaterte eller protokollrelaterte forskjeller. En måtte teste de ulike artene parallelt med de ulike protokoller for å svare på dette spørsmålet. Ikke desto mindre, for ytterligere å øke antall oocytter målrettet for levering av eksogene forbindelser, vil andre protokoller må utvikles for amphioxus. Kandidat teknikker inkluderer elektroporering, bombardement med mikropartikler, lipofeksjon, og transduksjon 4. Av notatet, har elektroporering allerede er etablert som en standard teknikk for innføring av eksogene materialet inn befruktede ascidian tunicate egg, en annen virvelløse chordate modellen som brukes for å studere utviklingen av utviklingsmessige mekanismer 8.
For vellykket mikroinjeksjon og etterfølgende in vivo avbildning av fluorescerende proteiner, passendeekspresjonsvektorer er en obligatorisk forutsetning. Mot dette formål, har tre plasmider blitt utviklet og eksperimentelt validert (Figur 1, Supplerende Fil 1): for membran målretting ble EGFP genet smeltet på sin 3 'enden til den menneskelige HRAS CAAX boksen (som resulterer i en EGFP: CAAX boks konstruere ) 16 og for atom målretting, både EGFP og mCherry gener ble sammensmeltet ved deres 5 'ender for å sebrafisk histon 2B (H2B) ekson (som resulterer henholdsvis i en H2B: EGFP og H2B: mCherry konstruktet) 17. Hver og en av disse konstruksjoner er blitt klonet inn i pCS2 + plasmid inneholdende en SV40 sen polyadenyleringssete og SP6 promoter som tillater in vitro avkortet mRNA-syntese 18,19. Videre, med det mål å optimalisere oversettelse av konstruksjonene i B. lanceolatum, har både Kozak sekvenser og kodonene blitt tilpasset ved hjelp av enkle nucleotide mutagenese (tabell 2 og 3, Supplerende File 1). Based på tilnærming av Nakagawa 20, et lite basseng av B. lanceolatum gener ble analysert for å identifisere en foretrukket Kozak-sekvens i denne arten. Den nærmeste kjente naturlig forekommende sekvensen til denne teoretiske sekvens er foretrukket at av B. lanceolatum aktin genet. Kozak-sekvenser av de tre konstruksjoner ble derfor modifisert for å samsvare med denne aktin-gen-sekvensen. Videre kodonbruken av B. lanceolatum ble analysert ved hjelp av kodonbruk databasen 21 og kodoner i konstruksjonene med en lav sannsynlighet for bruk i B. lanceolatum (<10%) ble byttet ut, der det er mulig, med tilsvarende kodonene med en høyere bruk sannsynlighet.
Resultatene av injeksjoner viser at nivået av protein ekspresjon fra disse vektorene er egnet for in vivo bildeanalyser. Gitt at uttrykket utgang av de modifiserte vektorer som ikke har blitt sammenlignet med den til umodifisert konstruksjoner, kan vi ikke conavleiringer på effektiviteten av endringene som ble introdusert i Kozak konsensus og de kodende sekvenser. Det ville sikkert være interessant å teste om disse endringene faktisk har en innvirkning på protein uttrykk nivåer. Langs disse linjene, en fersk analyse basert på microinjections til B. belcheri antyder at andre, ikke-modifiserte vektorer kan også bli brukt for syntesen av mRNA for fluorescerende protein produksjon i amphioxus 15.
Amphioxus inneholder endogene grønne fluorescerende proteiner 22. Embryoene derfor utvise lave nivåer av grønt samt rød fluorescens (våre upubliserte observasjoner). Men disse endogene er ubetydelig med hensyn til fluorescens nivåer som følge av injeksjon av våre mRNA-konstruksjoner. Derfor ikke den endogene fluorescens av amphioxus embryoer ikke forstyrre eksperimentelle observasjonene ved hjelp av fluorescerende kikkert eller multi-laser scanning mikroskop. I tillegg, Injeksjons eksperimenter viser at intensiteten av det eksogene fluorescens generert av mRNA injeksjonen avhenger av den faktiske mengden av injisert materiale, som er direkte korrelert med den endelige konsentrasjon av mRNA som brukes i injeksjonsblandingen. B. lanceolatum embryoer har en tendens til å tolerere en konsentrasjon på opp til 1,8 ug / ul mRNA, selv om det, uavhengig av den aktuelle mRNA-konsentrasjon, synes enkelte mRNA-kombinasjoner for å være mindre tolerert av B. lanceolatum embryoer enn andre. Således gir kombinasjonen av kjerne mCherry og membran EGFP mRNA synes å være mer giftige enn injeksjon av atom EGFP alene.
Texas Red dekstran har tidligere vært brukt som tracer for vellykkede injeksjoner i amphioxus oocytter 13-15. Intriguingly, et fluorescerende signal avledet fra det injiserte mRNA ble aldri oppnådd etter injeksjon av løsninger som inneholder Texas Red dekstran og dette i begge amphioxus oocytter (n = 4 forsøk) og zebrafish embryoer (n = 3 eksperimenter). Når en sprøyteblanding inneholdende in vitro-transkribert mRNA og Texas Rød dekstran lastes på en RNase-fri agarosegel (figur 3, felt 2), er båndet svarende til mRNA fraværende. I motsetning til dette in vitro-transkribert mRNA kan påvises på en RNase-fri agarosegel i nærvær av fenolrødt (figur 3, felt 1). Gitt at det ikke er noe bevis for mRNA degradering på gelen, antyder disse resultatene at Texas Red dekstran har en tendens til å felle mRNA. Når den brukes i en injeksjon løsning, kan Texas Red dekstran dermed hindre oversettelsen av den injiserte mRNA. Etter denne observasjonen ble interaksjoner av andre fargestoffer (FITC dekstran, Rhodamine dekstran og Oregon Grønn dekstran) med mRNA testet, både på RNase-fritt agarosegel og ved injeksjon i B. lanceolatum eller sebrafisk (figur 3). Analysene tyder på at FITC dekstran ikke felle mRNA på gel (Figur 3, lane 4) og fører til fluorescerende protein ekspresjon i sebrafisk (n = 1 eksperiment), men ikke i embryoer fra B. lanceolatum (n = 1 eksperiment) (data ikke vist). Rhodamin dekstran ikke felle mRNA på gel (figur 3, felt 5) og fører til fluorescerende protein ekspresjon i sebrafisk embryoer (n = 1 eksperiment) (data ikke vist), men dens aktivitet kan dessverre ikke testes i B. lanceolatum embryoer. Til slutt, som Oregon Grønn dekstran migrerer på samme nivå som mRNA, mRNA fangst ikke kunne bli vurdert ved agarose-gel (figur 3, felt 3). Denne sistnevnte fargestoff forhindret fluorescerende protein ekspresjon i amphioxus (n = 1 eksperiment), men ikke sebrafisk embryoer (n = 1 eksperiment) (data ikke vist). I sum, tyder disse data på at noen dekstraner effektivt kan hemme translasjon av mRNA injisert. Gitt at dose-respons-eksperimenter ikke ble utført, disse dataene er kvalitative. Forbløffende nok synes dette hemmende effekt å være avhengig avdyrearter (sebrafisk versus amphioxus), som fremhever behovet for ytterligere studier for å forstå mekanismene bak denne effekten. Videre har disse resultatene ring for forberedende analyser, hvis dekstraner skal brukes som farge tracere for injeksjoner.
Utviklingen av mikroinjeksjon teknikk for en gitt modell åpner døren for genspesifikke manipulasjoner. I amphioxus, for eksempel, ble den første beskrivelse av microinjections (i B. floridae) etterfulgt av den vellykkede knockdown av et gen, hox1, ved hjelp av oligonukleotid-morfolino injeksjoner 23,24. Antallet B. lanceolatum embryoer som kan lykkes injiseres hver dag ved hjelp av protokollen som presenteres her er absolutt kompatibelt med denne typen studier. Videre, med disse metodene og de nye konstruksjoner for hånden, kan man nå også designe og utføre høyekspresjonsystemer og knockdown studier ved injeksjon av mRNA av interesse (native eller dominant-negAtive former) eller bruke andre strategier for å forstyrre genuttrykk (for eksempel microRNA- eller shRNA-baserte strategier). Så langt kan amphioxus injeksjoner bare utføres på eggcelle scenen, rett og slett fordi dette er den eneste scenen som effektivt kan immobilisert. Etter injeksjon i oocytter trinn blir molekyl av interesse ubikvitært uttrykt i embryo. Hvis således genekspresjon må endres eller kontrolleres kun i et subsett av celler, DNA-konstruksjoner må injiseres, slik disse er uttrykt mosaically i utviklings amphioxus embryo 15,25-27. DNA-konstruksjon injeksjoner kan også brukes til å teste aktiviteten av regulatoriske områder under amphioxus utvikling i transiente transgene analyser, med den nevnte ulempe med mosaikk ekspresjon 15,25-27.
Til syvende og sist, det amphioxus mikroinjeksjon teknikken åpner også døren for stabil transgenesis, herunder målrettet knock-out eller knock-in av spesifikke genetiske loci. Systems for stabil innføring av eksogent DNA som allerede eksisterer, for eksempel med fisken transposon-baserte Tol2 system som ser ut til å fungere i begge insekter og vertebrater amniote 28. Videre tilnærminger basert på modifiserte sink-finger nukleaser (ZFNs) eller transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (Talens) eller RNA-guidet genom redigeringsverktøy (CRISPR / Cas system) kan brukes til å generere punktmutasjoner og knock-in endringer i spesifikke regioner av genomet 29. Dette arbeidet vil kreve året rundt avl av amphioxus i fangenskap, som allerede har blitt satt opp for B. belcheri 11,30 og B. japonicum 30,31 og er under utvikling for A. lucayanum, B. floridae og amphioxus arter omtalt her, B. lanceolatum 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke våre av "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" for dyrehold. Dette arbeidet ble støttet av midler fra ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 og ANR-11-JSV2-002-01) til Michael Schubert, av EU FP6 stipend "Embryomics" og av ANR stipend "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "til Jean-François Nicolas og Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho er finansiert av en FCT doc (SFRH / BD / 86878/2012).
Forespørsler om vektorene er beskrevet her kan rettes direkte til forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
