Summary
Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.
Introduction
Durante o desenvolvimento, uma única célula dá origem a um organismo inteiro num processo altamente complexo que envolve ambos os movimentos e divisões celulares. Para melhor compreender os princípios biológicos subjacentes a dinâmica do comportamento celular, os biólogos do desenvolvimento começaram a usar em técnicas de imagem vivo à base de fluorescência. Compartimentos específicos de células, como as membranas celulares, ou podem ser marcados por meio de tratamentos com corantes fluorescentes, uma abordagem dificultada por uma falta de especificidade e de penetração no tecido 1, ou pela introdução específica para o embrião de mRNAs exógenos que codificam proteínas fluorescentes 2. Técnicas diferentes podem ser usadas para a entrega eficiente de substâncias exógenas, tais como ARNm. Estes incluem, mas não se limitam a, microinjecção, electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução de 3,4. Apesar de todas estas abordagens podem ser utilizadas para introduzir compostos exógeno numadesenvolvimento do embrião, só microinjeção permite a aplicação de quantidades pré-definidas e precisas em cada célula 3. Técnicas de microinjeção foram descritas para todos os principais sistemas modelo de desenvolvimento 4 (por exemplo, moscas de frutas, vermes nematóides, peixe-zebra, sapos, ratos), bem como para alguns modelos alternativos 4, incluindo aqueles usados para estudos comparativos que visam a compreensão da evolução dos mecanismos de desenvolvimento (por exemplo, anêmonas do mar, vermes anelídeos, ouriços do mar, tunicados de ascídias, o anfioxo cephalochordate).
Cephalochordates que, juntamente com tunicados e vertebrados estabelecer o filo dos cordados, particularmente modelos bem adequado para estudar a evolução de cordados e da diversificação de vertebrados de um ancestral invertebrado 5-8. A linhagem cephalochordate divergiram muito cedo durante a evolução cordados; e cephalochordates existentes, que são subdivididas em três gêneros (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), se assemelham vertebrados tanto em termos de anatomia geral e arquitetura do genoma 5-8. Dos cerca de 30 espécies de cephalochordates que foram descritas até agora, cinco estão disponíveis para estudos de embriologia e desenvolvimento: 6,9 Asymmetron lucayanum (o lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (o anfioxo Florida), Branchiostoma lanceolatum (o anfioxo Europeia), Branchiostoma belcheri (o anfioxo chinês) e Branchiostoma japonicum (o anfioxo japonês). Adultos maduros de três destas espécies (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) podem ser induzidas a desovar sob demanda durante a época de reprodução 10,11. Além disso, pelo menos para B. lanceolatum, desova eficiente pode também ser induzida em água do mar artificial 12, tornando esta espécie cephalochordate particulares acessível para laborators que não têm acesso à água do mar natural. A combinação, em B. lanceolatum, de um acesso conveniente e confiável para embriões com um método de entrega eficiente, como a microinjeção, até agora a única técnica de entrega desenvolvido em anfioxo (em ambos B. floridae e B. belcheri) 13-15, permitirá o desenvolvimento de um novela conjunto de técnicas de manipulação, incluindo tracing- linhagem e abordagens baseadas em comportamento de células dinâmica.
Um protocolo para a microinjecção eficiente de ARNm para expressar as proteínas fluorescentes na B. lanceolatum embrião foi, portanto desenvolvido. Além disso, para fornecer um conjunto de ferramentas de base para geração de imagens ao vivo de B. embriões lanceolatum, foram desenvolvidos sistemas de vectores que permitem a associada à membrana e expressão nuclear de proteínas fluorescentes. Para segmentação membrana, maior proteína verde fluorescente (eGFP) foi fundido com a caixa CAAX humano HRAS e localização nuclear de mCherry e eGFP foiobtido por fusão para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (Figura 1, complementar do ficheiro 1). Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução da proteína, as sequências Kozak e codões das construções tenham sido modificados e adaptados para uso em B. lanceolatum. Tomados em conjunto, o método de injecção e vectores de expressão aqui apresentados servem como uma base para a geração de novas abordagens experimentais para cephalochordates, nomeadamente as análises usando o mais recente de fluorescência com base em técnicas de imagiologia in vivo.
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Protocol
1. Preparação de aparelhos e reagentes
- Transferir pipetas Pasteur
- Gerar uma série de pipetas de transferência Pasteur com diferentes diâmetros de ponta, puxando 230 milímetros de comprimento pipetas Pasteur acima de uma chama em velocidades diferentes. Certifique-se de que a vela é o maior tempo possível para um controlo suave e multa de aspiração.
- Com um estilete de diamante, arranhar a pipeta ao longo de uma linha perpendicular ao comprimento da pipeta. Com as duas mãos, puxe a pipeta paralelo ao seu comprimento para gerar um corte contuso. Rapidamente chama-polonês a pipeta sem lacrar a ponta.
- Variar o diâmetro da ponta com a fase dos oócitos / embriões de ser pipetado: 300-400 mm para oócitos não fertilizados (cerca de 150 um de diâmetro), 600 um, para os ovos fertilizados (cerca de 500 um de diâmetro), de 200-400 pm para neurulae chocado. Usar pipetas com um tubo de aspiração monitorado-boca para transferir oócitos / embriões a partir de um pratopara outro.
- As agulhas de injecção
- Manipular os capilares com luvas de assegurar condições livre de RNase. Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 milímetros, 0,94 milímetros ID, comprimento 10 mm.
- Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento agulha extrator descritas na Lista de Materiais, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, 200 ou 300. Pressão Caso contrário, certifique-se de que a forma, o que é crucial para injecções bem sucedidas, como é mostrado na Figura 2, com as seguintes propriedades: 4-8 um de diâmetro de ponta exterior de 2 cm de comprimento do afunilamento.
NOTA: As agulhas podem ser puxado antes da época de desova e utilizado durante toda a temporada.
- Vermelho de Fenol solução estoque de 5% (4x)
- Prepare fresco antes de cada época de desova.
- Em um tubo de micrometros de filtração de 0,22, pesar 25 mg de Fenol em pó vermelho.
- Adicionar 0,5 ml de DNase e RNase água parao tubo contendo o pó.
- Girar durante 3-5 min a 18,000 xg à temperatura ambiente para filtrar-esterilizar a solução e remover os cristais que poderiam obstruir a agulha da injecção.
- Armazenar a 4 ° C ou armazenar 250 mL alíquotas a -20 ° C.
- 0,25 mg de solução de poli-lisina / ml
- Prepare fresco antes de cada época de desova.
- Dissolve-se 5 mg de poli-L-lisina em 20 ml de água destilada. Loja 5 ml de partes alíquotas a -20 ° C.
- Usar uma alíquota descongelada imediatamente e apenas uma vez para assegurar a aderência reprodutível e robusto dos oócitos para o prato de poli-lisina-revestidas.
- síntese de ARNm
- Prepare fresco antes de cada época de desova.
- Linearizar 5 ug de ADN de interesse com a enzima adequada (normalmente durante 2 horas, a 37 ° C). Para verificar a integridade da digestão, execute 2% em volume da mistura de digestão em um 1% agarose-TBE gel em tampão TBE a 150 W por 20 min.
- Extraia o lineaADN zado com 25: 24: 1 de fenol (pH 8,0): clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase (superior) aquoso.
- Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
- Precipitar o DNA linearizado com 100: 10: 300 DNA linearizado: 3 M de acetato de sódio (pH 5,2): 100% de etanol durante a noite a -20 ° C.
- Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 70%.
- Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar e ressuspender em água isenta de ARNase para uma concentração final de 0,5 ug / uL.
- Transcrever 1 ug de ADN linearizado utilizando um kit de síntese de ARNm com a polimerase apropriada, de acordo com as instruções do fabricante.
- Extrai-se o ARNm com 5: 1 de fenol (pH 4,7): solução de paragem clorofórmio e acetato de amónio fornecido com o kit.
- Vortex durante 20 segundos, centrifuge 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
- Extrai-se a fase aquosa novamente com 24: 1 de clorofórmio: álcool isoamílico. Vortex durante 20 segundos, centrifugar 10 min a 18000 xg e recolher a fase aquosa.
- Precipitar o ARNm com isopropanol a 100% durante a noite a -20 ° C.
- Centrifugar 20 min a 18000 xg, a 4 ° C. Enxágüe em etanol 80%.
- Centrifugar 10 min a 18000 xg, a 4 ° C. Deixar secar o sedimento à temperatura ambiente durante não mais do que 5-10 minutos, uma vez que será então difícil de re-suspender. Ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de pelo menos 2 ug / uL de assegurar uma concentração final de ARNm decente na mistura de injecção.
- Para verificar a qualidade e tamanho do produto de transcrição, 0,5 ul de executar o ARNm sobre um 1% de agarose-TBE-gel de RNase livre em tampão TBE a 150 W durante 20 minutos. Loja 2 mL alíquotas a -80 ° C.
- Pratos revestidos com poli-lisina-
NOTA: Poli-lisina coated pratos são usadas para imobilizar os oócitos durante a injecção.- Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), cobrir o fundo da placa de Petri com 1 ml da solução de poli-lisina descongeladas 0,25 mg / ml. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Para cada 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri (5 no total), transferir a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml em mais 35 mm de cultura de células de uma placa de Petri. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Descartar a solução de poli-lisina a 0,25 mg / ml.
- Deixe as placas de Petri seco, de cabeça para baixo, à temperatura ambiente durante 2 h.
- Armazenar as placas revestidas de poli-lisina-embrulhados num invólucro de plástico a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo.
- Pratos revestidos-Agarose
NOTA: Eles são usados para cultura de embriões injetado. A agarose proporciona uma almofada para os embriões injectados e evita que fiquem coladas ao fundo do prato.- Faça a água do mar artificial (ASW) usando 37-38 g / L commsais ercial + 0,25 mM NaHCO3 em água de osmose reversa.
- Dissolve-se uma concentração de agarose a 1% em 0,22 mm ASW-filtrada por aquecimento da solução em um forno de microondas.
- Verter rapidamente a solução de agarose quente a partir de uma placa de Petri de 35 milímetros para um outro, a fim de assegurar um revestimento de agarose muito fina do prato.
- Armazenar as placas revestidas com agarose embrulhados em Saran a 4 ° C para evitar a contaminação de uma semana no máximo.
- Mistura injecção e carregamento das agulhas de injecção
- Cerca de 2 horas antes de iniciar as injecções, faça uma mistura de 2 ul de injecção em RNase e DNase-livre de água com concentrações finais de 1-1,8 mg / mL de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de vermelho de fenol.
NOTA: As cores de vermelho de fenol, a solução, que permite a monitorização do rendimento de injecção e a identificação dos embriões injectados com sucesso. Glicerol favorece a difusão de ARNm dentro do oócito. - Centrifugar 4 min a 18000 xg paracristais de pelotização. Manter em gelo até o uso.
- Com uma pipeta de 10 uL, recolher 0,5 ul da mistura de injecção, evitando a parte inferior do tubo, onde os cristais foram sedimentadas.
- Backfill, pelo menos, duas agulhas de injecção (no caso de uma pausas durante a injeção) pipetando a queda de 0,5 ul de mix injecção na grande abertura da agulha.
- Instalar as agulhas em um frasco de armazenamento com o líquido na parte inferior a 4 ° C para evitar a evaporação da mistura de injecção. Deixe a mistura lentamente injecção viajar para a ponta da agulha de injecção durante pelo menos 1 hora a minimizar a criação de bolhas.
- Loja mistura injecção adicional a -80 ° C para um máximo de três utilizações adicionais, após o que deteriora a qualidade do mRNA (dados não mostrados).
- Cerca de 2 horas antes de iniciar as injecções, faça uma mistura de 2 ul de injecção em RNase e DNase-livre de água com concentrações finais de 1-1,8 mg / mL de ARNm, 15% de glicerol, 1,25% de vermelho de fenol.
2. coleta de material biológico, Microinjection e cultura de embriões
- Ovócito e espermatozóide coleção
NOTA: Ver Theodosiouet al. 12 para um protocolo detalhado para induzir a desova e para a coleta de gametas.- Machos e fêmeas de choque em ASW a 23 ° C durante 24 horas.
- Uma a duas horas antes do pôr do sol, transferir os adultos em copos individuais em ASW a 19 ° C, porque a maioria dos adultos vai gerar 1-2 horas após o por do sol.
- Enxágüe 35 milímetros placas de Petri em ASW filtrada e deixe-os secar de cabeça para baixo para evitar que os oócitos de degola para o fundo do prato.
- Após a desova, recolher imediatamente espermatozóides e ovócitos com uma pipeta de 1000 mL.
- Manter espermatozóides e oócitos separar amphioxus adulto porque o contacto é prejudicial para a saúde de gâmetas (dados não mostrados).
- Além disso, evitar surpreendente os adultos, que leva a movimentos que dissipam, e, portanto, diluir, tanto de esperma e de oócitos. Para manter o esperma ativo o maior tempo possível e para otimizar a taxa de fertilização, coletar o esperma tão concentrado quanto possível.
- Manteresperma em gelo em um tubo de 1,5 ml.
- Oócitos Transfer in filtrada ASW para as pré-lavadas 35 milímetros placas de Petri.
- Transferência 100-500 ovócitos com uma previamente puxado 300-400 mm transferência Pasteur pipeta para outra 35 milímetros placa de Petri para realizar as injeções.
- Fertilizar o restante da embraiagem como um controlo para a qualidade dos oócitos e esperma ou para outras experiências.
- Injeção de ovócitos
- Instalar a agulha de injecção no micromanipulador a uma 50 ° ângulo em relação ao plano horizontal.
NOTA: Angles de menos de 50 ° vai empurrar os oócitos em torno do prato, enquanto ângulos de mais de 50 ° não permitirá um adequado acompanhamento da posição da agulha em relação ao oócito. - De acordo com um escopo de dissecação fluorescente com 25X oculares, transferir 30 oócitos com a transferência de uma pipeta de Pasteur de 300-400 mm numa placa revestida com poli-lisina-ASW contendo filtrada.
- Deposite os ovócitos ao longo de uma linha de transportarinjecções de fora de uma maneira ordenada e para distinguir injetados a partir de oócitos não injetados. Injectar pequenas quantidades (30 oócitos) para minimizar o tempo de exposição dos oócitos para a poli-lisina, a qual tende a deformar-se os embriões em desenvolvimento (dados não apresentados).
- Use a iluminação de campo escuro para tornar os ovócitos como translúcido possível.
- Com o botão de movimento grosseiro do micromanipulator, trazer a agulha de injeção perto de um ovócito.
- Com uma pinça fina, corte abrir a agulha no nível onde a ponta começa a ser curvada. Pulsando com o injector, verifique se mistura injeção vermelho é, na verdade, que flui para fora da agulha.
- Com uma ampliação de 200X e com o botão de movimento fino do micromanipulador, mover-se suavemente a agulha de injecção no interior do núcleo do oócito.
NOTA: Se inserido muito superficialmente, a solução injetada não permanecerá no interior do oócito. Se inserido muito longe, o oócito será destruído. - Injectar com 1-3 pulsos de 120 mseg Duracião e 1-10 psi de pressão. Se a agulha é suficientemente fina, injectar com fluxo contínuo a pressão constante. Certifique-se de que o volume de injecção corresponde a 1/5 a 1/3 do volume de um único oócito.
- Após a injecção, retire a agulha rapidamente para evitar a fuga do oócito.
- Verificar que a solução injectada permaneça no oócito e que, após alguns segundos, a solução injectada se espalha em todo o oócito.
- Mover para a próxima oócito na linha.
- Mantenha alguns embriões uninjected de cada série como controle negativo para estimar a fluorescência de fundo durante uma verificação de embriões injetados.
- Instalar a agulha de injecção no micromanipulador a uma 50 ° ângulo em relação ao plano horizontal.
- Fertilização, a seleção de embriões injetados e cultura de embriões
- Fertilizar os oócitos assim que uma série ter sido injectado. Como a qualidade do ovócito diminui com o tempo, injetar e fertilizar óvulos dentro de 1 hora após a desova 12.
- Dependendo da concentração espermática, adicione 1-5 gotas de esperma para os oócitos eagite o prato.
NOTA: O envelope fertilização deve tornar-se evidente nos embriões após cerca de 1 min. - Permitir que os embriões para separar a partir do prato de poli-revestido-lisina, durante a injecção outra série de oócitos.
- Transferir os embriões com a 600um transferência pipeta de Pasteur a uma placa de Petri revestidas com agarose. Remover os embriões a partir do prato revestido com poli-lisina-o mais rapidamente possível, se possível, antes da fase de 2 células.
NOTA: Em caso de exposição prolongada a poli-lisina, os embriões tendem a tornar-se blástulas densamente agrupadas, achatado no lado tocar no fundo do prato. - Na fase 2-célula para 4 células, selecione com um escopo de dissecação fluorescente com filtro DSR os embriões com sucesso-injetados, ou seja, aqueles com uma morfologia normal que exibem um sinal fluorescente vermelha Vermelho de Fenol-derivadas.
- Manter os embriões em cultura em filtrada ASW em placas de Petri revestidas com agarose a 19 ° C até à fase desejada deimagem in vivo.
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Representative Results
O protocolo detalhado acima fornece a base para a microinjecção de B. oócitos lanceolatum e, consequentemente, para a introdução em desenvolvimento B. Lanceolatum embriões de ARNm que codificam as proteínas fluorescentes para imagiologia in vivo. Embora a técnica é robusta e fiável, certamente, a taxa de injecções de sucesso utilizando este protocolo continua a ser variável (Tabela 1). A explicação muito provável para este facto é intrigante a extrema variabilidade das garras de oócitos: lotes diferentes de ovos, de facto se comportar muito diferentemente, quando submetido à pressão de injecção. Alguns oócitos são bastante elástica e tendem a achatar a parte inferior do prato, enquanto que outros são bastante rígidos e permanecer em torno após injecção. Além disso, alguns lotes de oócitos tendem a inflar suas membranas cório após injecção, enquanto que outros simplesmente lise (dados não mostrados). Não foi estabelecida nenhuma correlação evidente entre o comportamento dos oócitos após a injecção e embrionáriasdesenvolvimento após a fertilização. Assim, é difícil prever qual categoria de ovócitos é mais adequado para microinjeção. No entanto após a fertilização, os embriões submetidos desenvolvimento normal pode ser identificado logo em fases de clivagem: 2 de células de embriões de estágio 4-celulares pode ser considerado normal, quando a superfície de contacto entre os blastómeros é pequena, enquanto um embrião em fase de clivagem compactada, em que as células individuais são difíceis de discernir, é definitivamente anormal.
Nas nossas mãos, cerca de metade dos oócitos não sobrevivem ao trauma causado pela injecção e cerca de metade dos embriões que sobrevivem a exposição a injecção de um marcador fluorescente específico. Assim, estima-se que com este protocolo de injeção, entre 50 e 120 embriões pode ser injetado com sucesso em um determinado dia desova rendendo entre 15 e 60 embriões marcados.
A fluorescência vermelha do Vermelho de Fenol em 2-célula para embriões em estágio de 4 células marca de forma muito confiável embriões que têmsido adequadamente injectado, tal como 100% de embriões seleccionados desta maneira, posteriormente produzir as proteínas fluorescentes codificados pelo ARNm injectado. Além disso, existe uma correlação positiva muito clara entre a intensidade de fluorescência de fenol vermelho na fase de 2 células de 4-célula e o tempo de início da fluorescência produzida pelas proteínas codificadas pelo mRNA injectado. Esta correlação permite, assim, a identificação destes embriões que receberam a maior quantidade de ARNm durante o processo de injecção.
Se o sinal da proteína fluorescente codificada pelo ARNm injectado não for detectada após a selecção de embriões de fenol vermelho-positivos, recomenda-se rodar a mistura num gel de injecção livre de ARNase, a fim de verificar a degradação do mRNA ou aprisionando (Figura 3) . Na pista 1, uma banda de ARNm intacto é detectado. Injecção desta mistura levou a um forte sinal fluorescente no embrião. Pelo contrário, na pista 2 o que corresponde a mais experiment em que o vermelho de fenol foi substituído com corante de Dextrano na mistura (ver discussão para mais detalhes), o ARNm, parece ter sido preso por o corante de Dextrano e injecção desta mistura nunca conduziu a sinal fluorescente no embrião.
Usando esta técnica de microinjeção e as nossas construções (Tabelas 2 e 3, Suplementar Arquivo 1) (ver discussão), podemos, assim, produzir reproducibly marcação fluorescente homogênea em todo o embrião com mCherry ou eGFP no núcleo e com eGFP na membrana (Figura 4) . O protocolo de imagem usado para gerar a Figura 4 serão descritas noutro local (Faure et al., Em preparação). Dependendo da quantidade de ARNm injectado, a expressão da proteína fluorescente torna-se detectável tipicamente entre 16 células (Figura 4A) e os estágios de células de 64 e permanece detectável, pelo menos, até à fase de neurula tardia (dados não mostrados). Fases posteriores não foram testados. Sinal Nuclearnormalmente aparece no início de sinal de membrana, potencialmente em virtude da natureza intrinsecamente difuso da membrana em comparação com a natureza compacta do núcleo (dados não mostrados). Embora não tenha sido sistematicamente monitorizado, os embriões injectados com ambos uma nuclear e uma etiqueta membrana parecem ser menos saudáveis que os embriões injectados com uma etiqueta exclusivamente eGFP nuclear. Curiosamente, este efeito parece ser independente da quantidade total de ARNm injectado como a quantidade total de ARNm injectado é a mesma, quer uma ou duas espécies de ARNm são incluídos para a mistura (dados não mostrados).
Figura 1: Construir detalhes. Esboços de (A) a segmentação por membrana eGFP (eGFP: Caixa CAAX), (B), a nuclear-alvo eGFP (H2B: eGFP) e (C) a nuclear-alvo mCherry (H2B: mCherry) constrói are mostrado.
Figura 2: Forma de uma agulha de injeção representativa. (A) O afunilamento é de cerca de 2 cm de comprimento e as curvas de agulha na ponta. Barra de escala = 2 mm. (B) Ampliação da área de box em A. A posição de grampeamento para a agulha (seta) é na curva da agulha. A ponta da agulha é indicado pela seta. Scale bar = 500 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Interações de mRNA e corantes fluorescentes selecionados (A) O resultado da migração de uma mistura contendo mRNA e Vermelho de Fenol nas faixas 1 edo ARNm e o Texas Red dextrano (a uma concentração final de 3,3 mg / ml) na pista 2. (B) O resultado da migração de uma mistura contendo o ARNm e Verde Oregon dextrano (a uma concentração final de 3,3 mg / ml) na pista 3, de mRNA e FITC dextrano (a uma concentração final de 3,3 mg / ml) na coluna 4 e de ARNm e Rodamina dextrano (a uma concentração final de 3,3 mg / ml) na pista 5. Gel de tempo de migração em A e B foi diferente. Por uma questão de clareza, o retângulo preto em uma mascara uma reflexão da luz e as linhas tracejadas delinear as vias de migração. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: renderização 3D (software Amira) de embriões anfioxo injetados com mRNAs que codificam para proteínas fluorescentes imagens são.extraído de time-lapsos 3D adquiridas em uma Leica SP5 2 fótons microscópio de varredura a laser otimizado fase (A) de 16 células de embriões expressando H2B nuclear.:. eGFP (B) Gástrula fase de embrião expressando H2B nuclear: mCherry ea membrana-alvo eGFP.: caixa CAAX (C) Gástrula fase de embrião expressando H2B nuclear: mCherry e eGFP o segmentada por membrana: Caixa CAAX. A secção óptica mostra células internas com mCherry nuclear e sinais eGFP associada à membrana. Barra de escala = 50 mm.
| Número Experiment | MRNA construção Injetado | Número de embriões injectados | Número de embriões rotulados |
| 1 | H2B: eGFP | 53 | 23 |
| 2 | H2B: eGFP | 50 | 31 |
| 3 | H2B: eGFP | 48 | 20 |
| 4 | H2B: eGFP | 54 | 24 |
| 5 | H2B: eGFP | 114 | 47 |
| 6 | H2B: eGFP | 80 | 46 |
| 7 | H2B: eGFP ou | 62 | 24 |
| H2B: mCherry + eGFP: Caixa CAAX | |||
| 8 | H2B: eGFP | 87 | 60 |
| 9 | H2B: eGFP | 77 | 45 |
| 10 | eGFP: Caixa CAAX ou | 110 | 51 |
| H2B: mCherry + eGFP: Caixa CAAX | |||
| 11 | H2B: mCherry + eGFP: Caixa CAAX | 45 | 26 |
| 12 | H2B: mCherry + eGFP: CACaixa AX | 52 | 16 |
| 13 | eGFP: Caixa CAAX ou | 74 | 35 |
| H2B: mCherry + eGFP: Caixa CAAX | |||
| Total | 906 | 448 | |
| A taxa de sucesso | 49% |
Tabela 1:. As taxas de sucesso de injecção As construções injectados, o número de embriões injectados que sobreviveram à injecção e o número de embriões marcados (ou injectados com sucesso) são indicados, assim como a percentagem total de injecções de sucesso.
| Construir | Posição na pCS2 + vetor | Seqüência Original | Sequência mutada |
| pCS2 + eGFP: Caixa CAAX | 79..87 | GGA TCC ACC | ACC GT C A A C |
| pCS2 + H2B: eGFP | 82..90 | TCC GAC ACG | A CC G T C A AC |
| pCS2 + H2B: mCherry | 82..90 | TCC GAC ACG | A CC G T C A AC |
Tabela 2:. Optimização Tentativa de sequências Kozak original e sequências Kozak de mutantes estão indicados para cada constructo. As mutações introduzidas recuperar a sequência de Kozak do B. gene da actina lanceolatum, que muito se assemelha a de a sequência inferida teórico preferido Kozak de anfioxo (A / CGA / CG / TTC A / GAC atg TG / CT).
| pCS2 + eGFP: Caixa CAAX | |||
| Códon Original | Mutante códon | Posição na pCS2 + vetor | |
| (Nível de utilização) | (Nível de utilização) | ||
| GTA | GT G | 154..156 | seqüência eGFP |
| (0,08) | (0,43) | ||
| AGA | AG G | 814..816 | Linker |
| (0,09) | (0,27) | ||
| pCS2 + H2B: eGFP | |||
| Códon Original | Mutante códon | Posição emo pCS2 + vector | |
| (Nível de utilização) | (Nível de utilização) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | Seqüência H2B |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | Seqüência H2B | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 568..570 | seqüência eGFP | ||
| CTA | CT G | 226..228 | Seqüência H2B |
| (0,06) | (0,51) | ||
| pCS2 + H2B: mCherry | |||
| Códon Original | Mutante códon | Posição na pCS2 + vector | |
| (Nível de utilização) | (Nível de utilização) | ||
| GTA | GT G | 223..225 | Seqüência H2B |
| (0,08) | (0,43) | ||
| 289..291 | Seqüência H2B | ||
| 469..471 | Linker | ||
| 913..915 | seqüência mCherry | ||
| CTA | CT G | 226..228 | Seqüência H2B |
| (0,06) | (0,51) | ||
Tabela 3: otimização Tentativa de uso de códon. Códons originais e mutantes são indicados para cada construção. Embora isso não tenha sido testada experimentalmente, a Mutati introduzidoons são destinadas a otimizar a tradução do mRNA em anfioxo.
Suplementar Arquivo 1: construir sequências As sequências de nucleótidos (A) a segmentação por membrana eGFP. (EGFP: Caixa CAAX), (B), a nuclear-alvo eGFP (H2B: eGFP) e (C) o mCherry nuclear-alvo (H2B : mCherry) construções são dadas no contexto da pCS2 + vector backbone. Os principais domínios codificados por cada uma das construções são indicados na cor: eGFP (verde), mCherry (vermelho), sinal de localização membrana de HRAS (caixa CAAX) humana (azul ciano), peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (amarelo).
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Discussion
Neste artigo, apresenta-se, pela primeira vez, um protocolo detalhado e reprodutível para a injecção de B. oócitos lanceolatum, que, depois de B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, é, assim, a terceira espécie anfioxo, para que uma tal técnica tem sido descritas. É importante notar que o protocolo aqui descrito também inclui a descrição de sistemas de vectores adequados para a produção de proteínas fluorescentes em B. lanceolatum injectados a partir de ARNm produzidos in vitro (descrito abaixo). Juntas, essas novas ferramentas permitem in vivo de imagens do desenvolvimento precoce de anfioxo e análise de comportamentos de células dinâmicas que fundamentam os primeiros eventos da morfogênese no embrião, como a clivagem e gastrulação.
Em geral, a técnica de micro-injecção tem a vantagem de permitir a entrega, para uma célula alvo, de um volume pré-definida de um composto específico. Com este ser sauxílios, uma grande limitação desta técnica é o número limitado de células que podem ser injectados durante uma dada experiência. Por exemplo, o protocolo aqui descrito para B. lanceolatum permite a injecção de 100 a 120 ovos por sessão de injecção, dos quais cerca de metade serão marcadas (Tabela 3). Para B. floridae, os números são muito semelhantes, com 500 ou mais ovos que podem ser injectadas por dia, dos quais mais do que 50% sobrevivem a injecção 13,14. Embora os protocolos para injectar B. lanceolatum e B. ovos floridae se assemelham entre si, o B. belcheri técnica é um pouco diferente: os ovos são colocados em poli-revestido de lisina lamelas e as injeções são realizadas sob um microscópio invertido usando um microinjector de uma marca diferente. Esta abordagem permite, aparentemente, a injecção de entre 200 e 300 B. ovos belcheri por sessão de injeção com uma taxa de sobrevivência, após a eclosão na fase neurula, óf 89,39% a 95,83% 15. Considerando-se as diferenças entre os protocolos, é difícil saber se as diferenças nas taxas de sucesso são devidas a diferenças relacionadas com as espécies ou relacionados com o protocolo. Um teria que testar as diferentes espécies em paralelo com os diferentes protocolos para responder a esta pergunta. No entanto, para aumentar ainda mais o número de oócitos orientadas para a entrega de compostos exógenos, outros protocolos terá de ser desenvolvido para amphioxus. Técnicas candidatas incluem electroporação, bombardeamento com micropartículas, lipofecção e transdução 4. De nota, eletroporação já foi estabelecida como uma técnica padrão para a introdução de material exógeno em ovos fertilizados ascidian tunicados, outro modelo cordados invertebrados usada para estudar a evolução de mecanismos de desenvolvimento 8.
Para microinjecção bem sucedida e subsequente in vivo de imagens de proteínas fluorescentes, adequadovectores de expressão são um pré-requisito obrigatório. Para este fim, três plasmídeos foram desenvolvidos e validada experimentalmente (Figura 1, complementar do ficheiro 1): para direccionamento de membrana, o gene EGFP foi fundida na sua extremidade 3 'para a caixa CAAX HRAS humano (resultando numa eGFP: constructo caixa CAAX ) 16 e, para segmentação nuclear, tanto o eGFP e os genes mCherry foram fundidos a suas extremidades 5 'para o peixe-zebra exão histona 2B (H2B) (resultando, respectivamente, numa H2B: eGFP e um H2B: constructo mCherry) 17. Cada uma destas construções foi clonado no plasmídeo pCS2 + contendo um local de poliadenilação tardio de SV40 e um promotor de SP6 in vitro, permitindo a síntese de ARNm tampado 18,19. Além disso, com o objectivo de optimizar a tradução das construções em B. lanceolatum, ambas as sequências Kozak e os códons foram adaptados usando único nucleotídeo mutagênese (Tabelas 2 e 3, Suplementar arquivo 1). Based sobre a abordagem por Nakagawa 20, uma pequena piscina de B. Lanceolatum genes foi analisada para identificar uma sequência de Kozak preferido nesta espécie. O mais próximo conhecida sequência de ocorrência natural para esta sequência teórica preferida é a do B. Lanceolatum gene da actina. As sequências Kozak das três construções foram, portanto, modificado para coincidir com esta sequência de gene da actina. Além disso, a utilização de codões de B. lanceolatum foi analisada utilizando o banco de dados de uso códon 21 e códons nas construções com uma probabilidade baixa utilização em B. lanceolatum (<10%) foram substituídas, sempre que possível, por códons equivalentes com uma probabilidade mais elevada de utilização.
Os resultados das injecções mostram que o nível de expressão da proteína a partir destes vectores é adequado para análises de imagiologia in vivo. Dado que a produção dos vectores de expressão modificados não foi comparada com a de construções não modificados, que não pode concluir na eficiência das modificações que foram introduzidas na Kozak de consenso e as sequências de codificação. Certamente seria interessante testar se essas alterações de fato ter um impacto sobre os níveis de expressão de proteínas. Ao longo destas linhas, uma análise recente baseada em microinjeções em B. belcheri sugere que outros vectores não modificados, também podem ser utilizados para a síntese de mRNA para a produção de proteína fluorescente em amphioxus 15.
Amphioxus contém proteínas fluorescentes verdes endógenos 22. Os embriões, portanto, apresentam baixos níveis de verde, bem como fluorescência vermelha (nossas observações não publicadas). No entanto, estes níveis endógenos são negligenciáveis em relação aos níveis de fluorescência resultantes da injecção de ARNm nossas construções. Portanto, a fluorescência endógena de embriões anfioxo não perturbe observações experimentais usando binóculos fluorescentes ou microscópios de varredura multi-laser. Além, As experiências de injecção revelaram que a intensidade da fluorescência gerada exógena por injecção de ARNm depende da quantidade real de material injectado, que é directamente correlacionada com a concentração final de ARNm utilizada na mistura de injecção. B. embriões Lanceolatum tendem a tolerar uma concentração de até 1,8 ug / uL ARNm, embora, independente da concentração de mRNA real, algumas combinações de ARNm parecem ser menos tolerada por B. lanceolatum embriões do que outros. Assim, a combinação de mCherry e membrana nuclear eGFP mRNAs parecia ser mais tóxico do que a injecção de eGFP nuclear sozinho.
Texas Red dextrano foi previamente utilizado como um marcador para injecções bem sucedidos em oócitos anfioxo 13-15. Curiosamente, um sinal fluorescente derivado do ARNm injectado nunca foi obtida após injecção de soluções contendo o Texas Red e dextrano esse em ambos os oócitos anfioxo (n = 4 experiências) e zebrafiembriões sh (n = 3 experiências). Quando uma mistura de injecção contendo o ARNm transcrito in vitro e Texas Red dextrano é carregado sobre um gel de agarose livre de RNase (Figura 3, pista 2), a banda correspondente ao ARNm está ausente. Em contraste, o ARNm transcrito in vitro é detectável num gel de agarose livre de RNase, na presença de Vermelho de Fenol (Figura 3, pista 1). Dado que não há nenhuma evidência de degradação do mRNA no gel, estes resultados sugerem que o Texas Red dextrano tende a ARNm armadilha. Quando usado em uma solução para injecção, Texas Red dextrano pode, assim, evitar a tradução do ARNm injectado. Seguindo esta observação, as interacções de outros corantes (FITC dextrano, dextrano e Rodamina Verde Oregon dextrano) com ARNm foram testados tanto em RNase géis de agarose e por injecção nas B. lanceolatum ou peixe-zebra (Figura 3). As análises indicam que FITC dextrano não faz ARNm armadilha em gel (Figura 3, lane 4), e leva à expressão da proteína fluorescente em peixes-zebra (n = 1 experiência), mas não em embriões de B. lanceolatum (n = 1 experimento) (dados não mostrados). Rodamina dextrano não faz ARNm armadilha em gel (Figura 3, pista 5) e leva à expressão da proteína fluorescente em embriões de peixe-zebra (n = 1 experimento) (dados não apresentados), mas a sua actividade não podia ser testada infelizmente em B. embriões lanceolatum. Finalmente, como o dextrano Verde Oregon migra ao mesmo nível que o ARNm, o ARNm trapping não pôde ser avaliado por gel de agarose (Figura 3, pista 3). Este último corante impedido a expressão da proteína fluorescente em amphioxus (n = 1 experiência), mas não os embriões de peixe-zebra (n = 1 experimento) (dados não mostrados). Em suma, estes dados sugerem que alguns dextranos pode inibir eficientemente a tradução do ARNm injectado. Dado que as experiências de dose-resposta não foram realizados, estes dados são qualitativos. Curiosamente, este efeito inibitório parece ser dependenteas espécies animais (peixe-zebra contra anfioxo), que destaca a necessidade de mais estudos para compreender os mecanismos subjacentes a este efeito. Além disso, estes resultados indicam a análises de preparação, se dextranos são para ser utilizados como marcadores de cor para injecções.
O desenvolvimento da técnica de microinjecção para um dado modelo abre a porta para manipulações específicas do gene. Em amphioxus, por exemplo, a primeira descrição de micro-injecções (em B. floridae) foi seguido pela knockdown bem sucedida de um gene, hox1, utilizando injecções morfolino oligonucleotídicos 23,24. O número de B. Lanceolatum embriões que podem ser injectados com sucesso todos os dias utilizando o protocolo aqui apresentado é certamente compatível com este tipo de estudo. Além disso, com esses métodos e as novas construções na mão, pode-se agora também projetar e realizar estudos e superexpressão knockdown pela injeção de mRNAs de interesse (nativo ou dominante-negformas ciar) ou usar outras estratégias para interromper a expressão do gene (por exemplo microRNA- ou estratégias baseadas em shRNA). Até agora, as injecções anfioxo só pode ser realizada na fase dos oócitos, simplesmente porque esta é a única fase que pode eficientemente ser imobilizada. Após a injecção de oócitos no estádio, a molécula de interesse é expressa ubiquamente no embrião. Assim, se a expressão de genes precisa de ser alterada ou monitorado apenas num subconjunto de células, as construções de ADN precisam ser injectado, uma vez que estes são expressos mosaically no embrião em desenvolvimento amphioxus 15,25-27. Injecções construto de DNA pode também ser usado para testar a actividade das regiões reguladoras durante o desenvolvimento amphioxus em ensaios transientes transgénicas, com a desvantagem de expressão 15,25-27 mosaico supramencionado.
Em última análise, a técnica de microinjeção amphioxus também abre as portas para a transgênese estável, incluindo o knock-out alvo ou knock-in de loci genético específico. Sistemas para a inserção estável de ADN exógeno já existe, por exemplo com o sistema à base de transposão Tol2 peixe que parece funcionar em ambos os insectos e vertebrados amniote 28. Além disso, as abordagens baseadas na modificados nucleases de dedos de zinco (ZFNs) ou activadores de transcrição-nucleases como efectoras (TALENS) ou ferramentas de edição genoma de RNA-guiado (CRISPR / sistema Cas) poderia ser usado para gerar mutações pontuais e knock-in modificações específicas regiões do genoma 29. Esses esforços requerem a criação de todo o ano de anfioxo em cativeiro, o que já foi criado para B. belcheri 11,30 e B. japonicum 30,31 e atualmente está sendo desenvolvido para A. lucayanum, B. floridae e as espécies anfioxo destaque aqui, B. lanceolatum 32.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio da "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para criação de animais. Este trabalho foi financiado por fundos da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) para Michael Schubert, pela concessão União Europeia FP6 "Embryomics" e pela concessão ANR "ANR- 10 BLAN-121801 Dev-Process "para Jean-François Nicolas e Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho é financiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Os pedidos de vectores descritos aqui podem ser enviadas diretamente para os autores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | Culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1 L) | Fisher | W21719 | 0.22 μm |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 μm |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | Sigma | A9414 | |
| Phenol Red | Sigma | 114537 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P9155 | |
| H2O, DNase/RNase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH 8 | Sigma | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | Sigma | C0549 | |
| 5:1 phenol pH 4.7:chloroform | Sigma | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200X magnification | Leica | MZ16F | 25X oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Fine forceps | Fine Science Tools GmbH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
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