Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder til at vurdere subcellulære afsnit af muskler i Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Skeletmuskel er afgørende for bevægelse og er organernes vigtigste protein butik. Muskel sundhed målinger inden for C. elegans er beskrevet. Potentielle ændringer i muskel struktur og funktion er vurderet ved hjælp af lokaliseret GFP og kationiske farvestoffer.

Abstract

Muskel er en dynamisk væv, der reagerer på ændringer i ernæring, motion og sygdomstilstand. Tabet af muskelmasse og funktion med sygdom og alder er betydelige sundhedsmæssige byrder. Øjeblikket forstår vi lidt om den genetiske regulering af muskel sundhed med sygdom eller alder. Nematoden C. elegans er en etableret model for forståelse af den genomiske regulering af biologiske processer af interesse. Denne orm krop væg muskler vise en stor grad af homologi med musklerne i højere metazoan arter. Da C. elegans er en gennemsigtig organisme, lokaliseringen af GFP til mitochondrier og sarkomerer tillader visualisering af disse strukturer in vivo. Tilsvarende fodring af dyr kationiske farvestoffer, der akkumuleres baseret på eksistensen af en mitokondriemembranpotentiale, det muligt at vurdere mitokondriefunktionen in vivo. Disse metoder, samt vurdering af muskel protein homeostasis, er kombineret med vurdering af hele dyret muskelfunktion, i form af flytning assays, for at muliggøre korrelation af sub-cellulære defekter med funktionelle foranstaltninger muskel ydeevne. Således C. elegans giver en stærk platform med til at vurdere effekten af mutationer, gen knockdown, og / eller kemiske forbindelser ved muskel struktur og funktion. Endelig, som GFP, kationiske farvestoffer, og bevægelse assays vurderes non-invasivt, kan prospektive undersøgelser af muskel struktur og funktion udføres hele livet og dette på nuværende tidspunkt ikke let kan undersøges in vivo i en anden organisme.

Introduction

Muskel er en multifunktionel væv, godt værdsat for sin rolle i bevægelse, postural støtte og stofskifte. Udvikling og vedligeholdelse af sund muskel kræver koordinering af flere cellulære processer og komponenter. Enten gennem skade eller sygdom, kan dysregulation forekomme, hvilket resulterer i ændret muskel struktur og / eller funktion. Age-associeret fald i muskelfunktion præsenterer en betydelig byrde for sundhedspersonale budgetter i den vestlige verden, da muskelmasse 1,2 og især muskelstyrke og udholdenhed 3-5 er negativt korreleret med dødelighed. Målingen af ​​aspekter vedrørende forværrede muskel funktion såsom ændret mitokondriefunktionen eller sarkomeret forstyrrelser, kan give større forståelse af de mekanismer der ligger til grund overordnede muskel udvikling og sundhed.

C aenorhabditis elegans (C. elegans) er en mikroskopisk nematode best er kendt, fordi det var den første flercellede organisme har hele dets genom sekventeret 6, den første til at have gener tavshed ved hjælp af RNAi 7, og den eneste metazoan at have hele sin celle afstamning 8 og 9 neuroanatomien bestemt. C. elegans blev først foreslået som en model for studiet af den genetiske kontrol af adfærd i 1974 af Sydney Brenner 10 og betydningen af dette og efterfølgende arbejde blev anerkendt med den første af tre Nobelpriser tildeles C. elegans forskere. Ca. 35% af C. elegans gener er identificeret orthologer i mennesker, med C. elegans at være en vigtig organisme, der anvendes til at forstå den genetiske kontrol af muskeludviklingen 11. Næsten hver genet i C. elegans genomet kan blive slået ned gennem RNAi 7,12. Således ved at banke ned gener i fuldt udviklede muskler, genetiske komponenter bidrager til repå reguleringen af muskel sundhed kan undersøges med relative enkelhed 13.

Den kombinerede evne til at bruge RNAi, mutanter, og kemiske forbindelser, gør C. elegans et premier-system for at udforske den genetiske regulering 7,14,15 af muskel struktur og funktion med alderen 16 og i sygdomsmodeller 17. Kan måles virkningen af ​​gen knockdown, mutation, og / eller udsættelse for kemiske forbindelser upon muskel struktur og / eller funktion gennem flere aspekter. Her beskriver vi kort enkle teknikker til vurdering af C. elegans muskel struktur og funktion, hvoraf mange kan anvendes i prospektive undersøgelser af muskel sundhed.

Udviklingen af grønt fluorescerende protein (GFP) 18 er aktiveret visualisering af både beliggenheden af specifikke proteiner og den generelle struktur af organeller i C. elegans. Her forklarer vi, hvordan GFP udtrykte speciudtrykkeligt er inden for kropsvæggen muskel mitokondrier, kan kerner eller sarkomerer anvendes til at bestemme, om dystrofi af disse sub-cellulære strukturer er til stede. Som struktur er ikke altid en pålidelig surrogat for funktion, har vi også forklare, hvordan anvendelsen af kationiske farvestoffer in vivo muligt at vurdere forringet mitokondriemembranpotentiale inden muskel. Når farvestofferne anvendes i kombination med GFP, de tillader arkitektur og funktion i en tidsmæssig måde i hele levetiden. Endelig er vi også forklare, hvordan protein homeostasen i muskel kan vurderes, og hvordan alle disse foranstaltninger kan bruges til at korrelere ændringer i hele dyret muskel sundhed via brug af bevægelse assays. Disse teknikker, kombineret med gen knockdown, mutationer og / eller kemiske forbindelser tilvejebringer et kraftfuldt arsenal for at undersøge, hvordan specifikke gener eller forbindelser påvirke muskel sundhed in vivo. De paralleller i struktur, metabolisme og grov funktion af musklen mellem C. elegans ogpattedyr betyde C. elegans er en fremragende model organisme for at forstå regulering af muskler i højere organismer, herunder mennesker.

Protocol

1. Stammer, kultur, og Microscopy

  1. Håndtere og vedligeholde stammer af C. elegans som tidligere beskrevet 19. Stammer er tilgængelige fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    BEMÆRK: stammer, der anvendes i disse forsøg var CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; ham-8 (e1489 IV)) med GFP fusionsproteiner lokaliseret til mitokondrier og kerner; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)), unc-54 :: lacZ V) med GFP fusionsproteiner lokaliseret til den kontraktile apparat og PD55 (ccIs55 (sup-7 (st5); unc- 54 :: lacZ) V) med β-galactosidase-fusionsproteiner lokaliseret til cytosolen.
  2. Komplet RNAi forsøg som tidligere beskrevet for multigenerational RNAi forsøg 13 og få RNAi bakterier fra sekvensen verificeres ORF-RNAi bibliotek konstrueret af Marc Vidal et al. 12.
  3. Konstruere stammer indeholdende <em> CCIS 4251, jls01 eller KKI'er 55 ved hjælp af standard teknikker 20. Brug disse transgener at skabe en stamme til at vurdere mitokondrie netstruktur, myosin organisation eller staten proteostasis hhv. Kryds stammerne til en mutant, hvor man ser på en af ​​disse sub-cellulære rum i ønskes hvert dyr.
  4. Brug PtdIns-3-kinase-inhibitor, LY-294002 (LY) som tidligere beskrevet 21. Kort fortalt tilsættes LY-294002 ved en slutkoncentration på 160 uM oven på tørre OP50-seeded NGM plader.
  5. Tage billeder under anvendelse af et filter for GFP GFP-eksperimenter og et mikroskop med en triple-pass filter, som tillader afbildning af røde, grønne og blå kanaler samtidigt for at vurdere in vivo membranpotentiale med C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, almindeligvis markedsføres som MitoTracker Red CMXRos. Udføre billedanalyse og figur forberedelse i billedbehandling software.

  1. Et minimum af 1 dag før nødvendigt, foretage M9 buffer - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85.56 mM NaCl (slutkoncentrationer), og der steriliseres ved autoklavering. Efter afkøling til 45 ° C, tilsættes steril MgSO 4 til 1 mM efter autoklavering for at forhindre udfældning 22. Lad M9 til afkøling ved 4 ° C og alikvot i 50 ml rør.
  2. På dagen for eksperimentet, tilsættes 3 ml M9-puffer til en enkelt 9 cm plade med et stort antal L1 larver. Vask pladen gentagne gange ved at aspirere M9 væske og pipettering mod overfladen af ​​agaren med pladen holdes i en vinkel.
  3. Vask L1 er fra pladen og derefter overføre M9 til en 10 ml reagensglas med en pipette.
  4. Efterlad i 2,5 minutter for at tillade større voksen og i senere stadier dyr larvernes at falde til bunden af ​​reagensglasset, og de mindre L1 dyrene forbliver nær top af M9 buffer.
  5. Fjern top 500 pi M9 i reagensglasset ved hjælp af en pipette. Fyld derefter M9 indeholdende L1 larver til en ny NGM plade podet med 500 pi OP50 under et dissekere anvendelsesområde.
  6. Typisk, har til formål at overføre ~ 200-300 L1 larver per plade. Overvåg plader dagligt fra voksenalder og om nødvendigt samle dyrene på friske OP50 NGM plader til at forhindre OP50 fødekilde bliver forbrugt.
    BEMÆRK: Dette er normalt 1-3 dråber M9 ved hjælp af en P1000 pipette, selv om dette varierer i høj grad afhængigt af antallet af L1 er på den oprindelige plade.
  7. Hvis der ønskes prospektive undersøgelser i de enkelte dyr, når dyrene nå voksenalderen, plukke enkelte dyr at adskille seedede NGM plader. Overfør dyr hver 24-48 timer at adskille fra larver dyr.

3. Movement assays 19

  1. Et minimum på 2 timer før påbegyndelse af eksperimenter, fjerne en 50 ml alikvot af M9 og tillade at ækvilibrere til stuetemperaturratur.
  2. Pick et enkelt voksent dyr i 50 pi M9 buffer på et objektglas.
  3. Tæl antallet af kroppens bøjninger venstre og højregående i 10 sekunder, hvor den ene mod venstre og en mod højre bøje er lig med ét slag.
  4. Gentag optælling af kroppens streger til opnåelse af i alt mindst 5 målinger fra som i gennemsnit kan tages. Formere disse tal ved seks til at give bevægelsen pr min.
  5. Ved hjælp af en pipette dyret tilbage til petriskål. Denne metode giver mulighed tidsmæssig måling af bevægelse i hele levetiden i C. elegan s.

Figur 1
Figur 1: Movement assays. Når orme plukkes i buffer er en venstregående (A) og en mod højre (B) bøjning lægges sammen for at give en fuldstændig bevægelse(Slagtilfælde).

4. Imaging mitokondrie Networks og sarkomerer i Body Wall Muscle

  1. BEMÆRK: Den samme protokol gælder for billeddannelse af både mitokondrier og sarkomerer.
  2. Synkroniser orme som tidligere beskrevet (afsnit 1), og vokse i 48-60 timer ved 20 ° C, når de vil nå unge voksenliv.
  3. Pick 20 orme (repræsentative af pladen) fra pladerne i 20 pi M9 på et objektglas.
  4. Påfør et dækglas og gå videre til billedet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop under et GFP filter (460-500 nm, blåt lys excitation) på 40X forstørrelse.

5. Vurdering membranpotentialet ved hjælp af en In Vivo Ophobning assay med MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synkroniser CB5600 (afsnit 1), der alle er mærket med GFP i mitokondrierne af muskler, og vokse til den tidlige voksenalder på NGM indeholdende OP50 for 48-60 timer ved 20 ° C.
  2. Tilsæt 100 pi DMSO til 50 ug portion af C 32 H 32 Cl 2 N 2 O at lave en stamopløsning på 940,692 uM.
  3. Tag 1 pi af 940,692 uM stamopløsning og resuspender i 199 pi M9 at skabe et arbejdsmiljø opløsning af 4,70 um (4,70346 uM). Forbered dette i brune 1,5 ml rør, fordi C 32 H 32 Cl 2 N 2 O er lysfølsom.
  4. Forbered 20 gl portioner af 4,70 uM arbejdsopløsning (20 voksne orme pr 20 pi alikvot).
  5. Pick 20 voksne dyr i 20 pi 4,70 iM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O i de brune 1,5 ml rør. Inkuber ved 20 ° C i 1 time.
  6. Efter 1 times inkubation tilsættes 1 ml M9 til de brune 1,5 ml rør indeholdende orme, centrifuge ved 2.000 xg i 10 sek og derefter fjerne supernatanten. Gentag dette vasketrin før opblandes ormen pellet og overføre de resterende 20 μl (indeholdende orme) til et dias til billeddannelse.
  7. Tage billeder af mitokondrier med 40X forstørrelse under anvendelse af et tredobbelt pass filter, der tillader visualisering af både de røde, blå og grønne kanaler samtidigt. Imaging ved hjælp af triple-pass filter viser co-lokalisering af C 32 H 32 Cl 2 N 2 O med GFP lokaliseret til mitokondrierne optræder som orange.
  8. Efter at have taget et billede af den orange mitochondrier, foto-blege dyret i 10 sek ved hjælp af lys med bølgelængde 540/25 nm på maksimale indstillinger med alle filtre fjernet. Dette vil blege røde i mitokondrierne og afslører mitokondrie GFP alene at bekræfte colokalisering i muskel mitokondrier.

6. Vurdering af muskel proteinnedbrydning i C. elegans

  1. Synkroniser PD55s (eller en hvilken som helst stamme indeholdende lacZ transgen) på til NGM plader podet med OP50 (afsnit 1). Vokse til unge voksenliv for 48-60 timer ved 20 ° C.
  2. Pick 20 voksne orme i 20 pi Hedeselskabet 2 O på et objektglas. Vær omhyggelig med at forsøge og pluk kun ormen og ikke eventuelle bakterier med pick. Mærk mikroskopobjektglasset i blyant.
  3. Placer i ekssikkator i 30 minutter for at tørre og knække neglebånd af dyrene. Sikre en tæt forsegling på ekssikkator hjælp fedt omkring tætningen.
  4. Tjek udtørringen har været effektiv under et dissekere anvendelsesområde (Figur 2).
  5. Nedsænkes mikroskoppræparatglasset i iskold acetone i 3,5 minutter og derefter forlade objektglasset på køkkenrulle ved stuetemperatur i 15 minutter for at tillade acetonen på objektglasset til at fordampe. På dette tidspunkt tø X-gal og oxidation buffer og tillade ækvilibrering til stuetemperatur.
  6. Tilsæt 2 pi X-gal til 100 pi oxidation buffer og vortex forsigtigt for at sikre dette er homogen. Dette er X-gal / oxidation buffer mastermix.
  7. Tilsættes 20 ul af X-gal / oxidation buffer masterblandingen hver original område på 20 orme. Inspicere under et dissekere anvendelsesområde for at sikre master mix fuldstændig dækker alle dyr totalt. Forsigtigt vippe mikroskopobjektglasset at flytte master mix i områder, hvor dyrene ikke er dækket.
  8. Anbring objektglasset i et fugtighedskammer for 1-2,5 timer ved 20 ° C. Billede dyr, når en mørk blå farve er til stede i kroppen væg muskler kontroldyr. Vurdere kontroldyr under et dissekere anvendelsesområde hver 15 min at bestemme, hvornår dyrene skal afbildes.

Figur 2
Figur 2: Vurdering af muskelprotein nedbrydning ved hjælp af β-galactosidase-assays. (A) dyr, der indeholder en lacZ transgen plukkes fra petriskåle til 20 pi Hedeselskabet 2 O på en mikroskopi slide (B). Dyr er udtørret og blive splittet (D). Når acetone fordamper tilsættes X-gal / oxidation buffer mastermix (E). Udvikling af blå farve i kontroldyr vurderes ved 15 minutters intervaller (FL) fra t ​​= 0 min (F), indtil en mørkeblå farve er opnået over længden af dyrene (L). Billeder af orme er taget på 2,5X forstørrelse i AE og 8X i FL. Zoomer i C, D, F, G og L er 4X den oprindelige forstørrelse.

Representative Results

Movement Analyser at kvantificere Movement Mangler

Bevægelse tilbagegang er en god indikator for dødelighed i C. elegans 16, med nedsat satser angiver problemer med neuromuskulære system. Ændringer i bevægelse, som vurderet ved bevægelse assays kan skyldes RNAi mod et specifikt gen eller lægemiddelbehandling (figur 3-5) eller i muterede dyr 13, 23. Et fald i bevægelse kan skyldes ændret udvikling for eksempel efter udviklingsmæssige knock ned af elektron transport gener, der koder kompleks I, III, IV eller V 24. Derudover kan specifikke interventioner kun afprøves på voksne C. elegans for at undersøge virkningen på post-udviklingsmæssige fysiologi. For eksempel behandles dyrene med RNAi mod unc-112, der koder for C. elegans ortholog af Kindlin-1, som er lokaliseret til integrin indeholdendemuskel vedhæftede komplekser (figur 3 og 4) eller gas-1, som koder for en del af kompleks I i elektron transportkæden (figur 4), vise en gradvis reduktion i bevægelse versus kontrol 48-72 timer efter voksenalderen. Dette kan være tegn på problemer med muskel fysiologi. Tilsvarende er et tab af bevægelse fra 24 - der iagttages 72 timer i respons på behandling af normalt udviklede voksne med behandling med PI3K inhibitoren LY-294002 (figur 5). Det er også muligt at teste virkningen af ​​en anden RNAi behandling, mutation, eller et lægemiddel i genoprettelse af bevægeligheden i dyr, der udviser reduceret bevægelse som reaktion på en første intervention. For eksempel unc- 112 mutanter vise en kvantificerbar reduktion i bevægelse i forhold til vildtype dyr, der er svækket i tilstedeværelse af en anden mutation i dim-1 13. Derfor kan bevægelse assays identificere både indgreb, der ændrer neuromuscular udvikling og / eller funktion samt dem, forbedre og / eller genoprette neuromuskulære funktion.

Vurdering af sarkomer Disruption

Efter at have identificeret en bevægelse defekt, er det ofte ønskeligt at bestemme, om årsagen til bevægelse defekt kan forklares ved problemer i nerver, muskler, eller begge dele. Sarkomerer er multi-protein komplekser inden for muskel der giver mulighed for sammentrækning og dermed tvinge generation og bevægelse. Ved at udnytte dyr udtrykker myosin GFP fusionsproteiner lokaliseret til kontraktile apparat, kan omfanget af forstyrrelse myosin filamenter og sarkomerer observeres relativt ikke-invasivt og fremadrettet i de enkelte dyr gennem udvikling og / eller voksenalderen. Wild-type dyr vise grupperede sarkomerer, der vises som flere grønne parallelle rette linier inden for hvert vandområde-væg muskel (Figur 3). Forstyrrelse disse normale arrays kan være relativt mindre medarray sarkomerer optræder at fusionere stedet for at forblive parallelt. Denne fænotype, synlig med unc-112 RNAi ved t = 24 timer eller 48 timer (figur 3), er sammenlignelig med Z-line streaming af actin bindingssteder i pattedyr muskel. Tilsvarende kan små dele af arrays kollaps eller de kan forsvinde helt såsom behandling med unc-112 RNAi ved t = 48 timer eller t = 72 timer (figur 3). Tilstedeværelsen af sarkomer defekter i musklen af dyr, som udviser en bevægelse defekt (figur 3) er tilstrækkelig til at redegøre for bevægelse defekt, men ikke nødvendigvis udelukke andre problemer med muskel, nerve, og / eller andre væv som reaktion på en intervention .

Vurdering af mitokondrie Network Structure

I nærvær af en bevægelse defekt er det undertiden ønskeligt at undersøge muskel for andre fejl, der kan forårsage eller bidrage til bevægelsen defekt. Mitokondrier tilvejebringe størstedelen af ​​cellulær energi og falder i bevægelse kan være resultatet af reducerede ATP bestemmelse, hvilket reducerer energi til rådighed for muskelsammentrækning. Således kan undersøges strukturen af ​​mitokondrierne for abnormiteter. Det er vigtigt ikke at bedøve dyr med natriumazid som den inducerer hurtig mitokondrie fragmentering; dyr i disse eksperimenter blev immobiliseret ved det tryk, der påføres af dækglasset. Inden for vildtype-C. elegans krop væg muskel er mitokondrier indeholdt i organiserede netværk (figur 4), og findes mitokondrier og fungere som en reticulum 25. Afbrydelse af netværket af mitokondrier præsenterer som en fragmentering af netværket (gas-1 RNAi, figur 4B) 26. Fragmentering kan blive alvorlige nok, at ingen antydning af organiserede netværk forbliver såsom behandling med unc-112 RNAi (figur 4B og C) 13. Som with forstyrrelser i sarkomeret struktur, kan defekter i muskel mitokondriestruktur hos dyr, der viser en bevægelse defekt være tilstrækkelige til at forklare bevægelsen defekt, men det betyder ikke nødvendigvis udelukke andre problemer med muskler, nerver og / eller andre væv. For eksempel unc-112 mutanter 13 og behandling med unc-112 RNAi (figur 3 og 4) display både sprængte sarkomerer og forstyrret mitokondriestruktur.

Vurdering af mitokondrie funktion in vivo

Den mitokondriemembranpotentiale bestemmer kapaciteten af mitokondrier at skabe proton drivkraft og generere ATP 27 derfor evnen til at vurdere mitrokondriemembranen in vivo viser kapaciteten for den dyr at producere ATP. Som mitochondriske strukturelle forstyrrelser kan eller ikke kan ændre mitokondrie funktionsevne, kan det være desimenlignelig at vurdere mitokondriefunktion i dyr, der udviser ændret mitokondriestruktur. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O akkumuleres i mitokondrierne, af alle celletyper, hvor et membranpotentiale er til stede og pletter mitokondrier 28 (figur 4C). Til specifikt at vurdere mitokondriefunktion i muskler, kan man bruge C 32 H 32 Cl 2 N 2 O og GFP-mærket muskel mitokondrier at demonstrere effekten af en intervention specifikt på muskel mitokondrier (figur 4C). For eksempel tab af mitokondrielle membranpotentiale følgende behandling med unc-112 RNAi forhindrer C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ind i matrixen. Mitokondrierne viser derfor lidt, hvis nogen rød farvning af mitokondrier foruden GFP mærkning af mitokondrier (figur 4C). Foto-blegning, kan også anvendes til at bekræfte at den observeredemitokondrier er specifikt dem i musklen (figur 4C). Identifikation af en reduceret kapacitet til at producere ATP er tilstrækkelige til at forklare en observeret bevægelse defekt, men udelukker ikke andre problemer i muskler, nerver og / eller andre væv. Uanset, som nedsat ATP-produktion kapacitet er forbundet med sygdomstilstande i mennesker 29 og aldrende 30, identifikation af en sådan defekt i svar på et indlæg giver en platform til screening for forbindelser og / eller RNAi behandlinger, der forbedrer ATP produktionskapacitet, og disse kan så undersøges yderligere for terapeutisk potentiale.

Vurdering af proteinnedbrydning

I nærvær af en bevægelse defekt og normale sarkomerer og mitokondrier er det undertiden ønskeligt at undersøge muskel for andre fejl, der kan forårsage eller bidrage til bevægelsen defekt. Evnen til at opretholde protein homeostase er en underskrift ellermal sundhed, mens en reduktion af protein syntese og / eller en stigning i proteinnedbrydning er en konsekvens af aldring 31 og flere sygdomstilstande 32,33. Derfor kan det være ønskeligt at undersøge muskler af dyr med en bevægelse defekt for ændret protein homøostase. Dette kan opnås via vurdering af niveauet af cytosoliske muskelproteiner. Anvendelsen af ​​transgent kodede proteiner tillader vurdering af muskel specifik proteostasis. For eksempel er brugen af dyr, der indeholder β-galactosidase fusioneret til en N-terminal del af myosin, der syntetiseres under kontrol af en myosin promotor og enhancer tillader vurdering af cytosolisk muskel proteinindhold 19. Tilstedeværelsen af ​​blåsplint i vildtype-voksne viser tilstedeværelsen af ​​aktiv β-galactosidase og fraværet af patologisk cytosolprotein nedbrydning. Et tab af farvning i respons på behandlingen tyder patologisk proteinnedbrydning forekommer (figur 5 13,14,19. For eksempel viser ubehandlede vildtype-dyr en intens blå plet 72 timer efter voksenalderen, hvorimod LY-249.002 behandlede dyr viser en mangel på farvning (figur 5). Som med defekter i sarkomer struktur og mitokondriefunktion, tilstedeværelsen af ​​patologiske muskel proteinnedbrydning er tilstrækkelige til at forklare en observeret bevægelse defekt, men ikke nødvendigvis udelukke andre problemer med muskel, nerve, og / eller andre væv.

Figur 3
Figur 3: (A) unc-112 RNAi bevirker en betydelig bevægelse defekt ved t = 72 timer (B) Vurdering af array A-band struktur i kropsvæggen muskel.. I wt, A-bands i muskler vises som lige linjer på unge voksenliv (t = 0 timer) og stort set ensartet indtil over 72 timer af voksenalderen (se vægt zoom). unc-112 RNAi forårsager sarkomerer at miste arkitektur i små områder af musklen (t = 24 timer), kollapsede og manglende sarkomerer (t = 48 timer), sammenlægning (t = 72 timer top panel og zoom) og tab af linearitet sarkomerer (t = 72 timer bund panel og zoom). Skalapanelerne repræsenterer 25 pM og zoom er 2,5X.

Figur 4
Figur 4: (A) unc-112 eller gas-1 RNAi forårsager en bevægelse defekt (B) Vurdering af mitokondrie struktur i kropsvæggen muskel.. Mitokondrier i muskel vises som netværksbaserede lige linjer på unge voksenliv (vægt). Behandling af dyr med unc-112 RNAi resulterer i mitochondrsætteraktivitet fragmentering som tidligere observeret mellem 24 timer og 72 timer af voksenalderen (zoom og pil) 13. Ligeledes RNAi mod gas -1 resulterer i opsplitning af mitokondrie netværk som tidligere observerede 26. Disse er til stede som små huller i mitokondrie-net ved t = 24 timer og fremskridt udbredt desorganisering ved 72 timer (se zoom og pil). (C) Vurdering af mitokondriemembranpotentiale in vivo. Hos dyr, der også indeholder GFP lokaliseret til mitokondrierne, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ophobes i kroppen væg muskel mitokondrier og fremstår appelsin under en triple-pass filter fra ung voksenalder (t = 0 timer) indtil 72 timer efter voksenalderen. Behandling med unc-112 RNAi forårsager et progressivt tab af membranpotentiale som vist ved 72 timer, hvor de resterende mitokondrier viser mindre ophobning af C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs. vægt. Fotoblegning for 10 sec ved hjælp af 540/25 nm lys blegemidler den røde fra MitoTracker og afslører GFP lokaliseret til muskel mitokondrier (+ Photo blegemiddel). Skalapanelerne repræsenterer 25 um og zoomer ind er 2,5X.

Figur 5
Figur 5: (A) Behandling med LY-294002 dyr fremkalder en bevægelse defekt (B) Vurdering af proteinnedbrydning ved anvendelse af en β-galactosidase assay.. Alder synkroniseret wt L1 larver vokset til unge voksenliv ved 20 ° C (t = 0 timer) før overførsel til NGM podet med OP50 (vægt kontrol) eller NGM podet med LY-294002 (PI3K-inhibitor behandling) i 24 timer ved 20 ° C . I A, er ca. 20-30 dyr farvet for β-galactosidaseaktivitet (blå) ved t = 0 timer og efter 24 timer, 48 timer og 72 timer.

Discussion

Disse metoder tillader udforskning af muskel fra macrophysiology bevægelighed til at identificere subcellulære defekter, der er tilstrækkelig til at forårsage en bevægelse defekt. Når det kombineres disse metoder mulighed for en nærmere analyse af muskler. Indsigten tillader yderligere test af muskel-orienterede hypoteser, der vedrører almen fysiologi, patofysiologi og aldring.

Movement assays

En bevægelse defekt indikerer en afbrydelse af den normale neuromuskulære funktion. Dette kan være specifik for nerver eller muskler, eller det kan være fælles mellem flere væv. De mest vanskelige faser i gennemførelsen af ​​bevægelse assays vælger orme, der er repræsentative for befolkningen og / eller behandling, og også sikre, at forsøgslederen ikke skade dyret ved overførsel til M9. Det er vigtigt at have en stor stikprøve størrelse for at opnå en repræsentativ og præcis vurdering af bevægelse. Når analyse stærkt penetrant effekter, for eksempel som ofte ses i mutanter, en stikprøve på ti dyr hver vurderede bevægelighed for ti gange er tilstrækkelig til at finde statistisk signifikante forskelle i forhold til vildtype. Men enkelheden i bevægelse assays og nem dyrkning C. elegans betyder, at hundredvis af orme hurtigt kan vurderes med henblik på at sikre kvantitativt robuste resultater. Når analyse virkninger, der vises kun til stede i en del af en befolkning er det vigtigt at fastslå, hvilken del af befolkningen synes at være påvirket såvel som alvorligheden af ​​fejl i de angrebne dyr. I sådanne situationer bør vurderes med henblik på at tilvejebringe de minimale data for andelen af ​​befolkningen, der rammes større antal dyr. Ofte både narkotika og RNAi behandlinger vil producere alvorlige defekter bevægelse i en lille del af befolkningen. I visse tilfælde at øge dosis af behandling og eller metoden til levering vil øge andelen af ​​affected dyr og kører Dosisresponskurver kan være nyttig til at bestemme den optimale koncentration af et lægemiddel eller RNAi. En anden begrænsning af denne bevægelse assay er, at ormene er manipuleret til at vurdere bevægelse. Således er ormene både stimuleret og udsat for en vis grad af osmotisk stress, når plukket i væske. Graden af osmotisk stress kan begrænses ved hjælp af M9 eller BU buffer 19 i modsætning til vand. Nogle af disse begrænsninger afhjælpes ved at måle sædvanlige bevægelse på plader ved hjælp af kommercielt tilgængelige sporingssystemer 34 eller gratis plug ins for ImageJ 35. Måling af bevægelse på et dyr kan give vigtige oplysninger om den samlede muskel sundhed, herunder ændringer i funktion, der kan måles i hele levetiden og ikke-invasiv, ved denne metode er nøglen til potentielle livslange studier af muskel funktion.

Billeddannelse af kontraktile Apparat

<p class = "jove_content"> Ormen stamme bruges her til apparatur billede kontraktile struktur var PJ727 36, der udtrykker et myosin GFP-fusion protein, der er lokaliseret til sarkomerer i kroppen væg muskler. Anvendelse af denne stamme muliggør visualisering af sarkomer struktur i levende dyr. Svarende til bevægelse beskrevet ovenfor, en vigtig fordel ved anvendelse af GFP-mærkede sarkomerer at vurdere sarkomer struktur er, at fremgangsmåden er relativt ikke-invasiv og kan derfor anvendes til fremadrettet følge sarkomer struktur hos det enkelte dyr i hele levetiden. Den største vanskelighed ved denne metode er, at de orme, der er afbildet, er stadig i live og derfor bevæger sig, hvilket gør det vanskeligt at få godt fokuserede billeder. Adskillige fremgangsmåder kan anvendes til at reducere og foretager imaging enklere; disse omfatter bedøve eller lamme orme og immobilisering via tryk, suges eller brug af en høj viskositet løsning. Hver af disse metoder til immobilization har den ulempe, at det selv kan ændre neuromuskulære funktion. Derfor er det vigtigt at medtage passende ubehandlede kontroller i analysen. Det kan også være hensigtsmæssigt at anvende mindst to uafhængige fremgangsmåder til immobilisering for at bekræfte resultaterne ikke skyldes problemer med immobiliseringsmetode, afhængigt af hvor meget udbredt immobiliseringen metode er valgt for spørgsmålet under undersøgelsen. Her har vi brugt simpel pres fra dækglasset på ormen at medføre nedsat bevægelse. Efter placering af dækglasset, vil væsken under dækglasset fordampe og dækglasset vil derfor begynde at producere mere pres på orme, typisk det tager 2-5 min at producere nok reduceret bevægelse for at muliggøre let billeddannelse.

Det er vigtigt at overvåge orme nøje efter dækglasset er blevet indført som trykket i sidste ende vil forøge nok til at forårsage orme at sprænge fra overdrevent tryk, typisk 10-15 minutter efter coverslip tilføjelse. Yderligere puffer kan indføres ved hjælp af en pipettespids omkring kanterne af dækglasset for at undgå knusningsbeskadigelse til orme. Neglelak kan anvendes til at forsegle kanten af ​​dækglasset og forhindre fordampning, selv om dette forhindrer udtagning af dyr under dækglasset, hvis det ønskes. Tilsvarende kan anvendelsen af ​​silikone perler i opløsningen at reducere mængden af ​​tryk dækglasset steder på orme.

Ligesom med at vurdere for en bevægelse defekt, er det vigtigt at overveje penetransen virkning. Penetrans kan betragtes som høj, hvis 80-100% dyrene vise en fænotype på NGM plade, delvis, hvis 21-79%, og lav, hvis ≤20% af displayet befolkning en indvirkning. For stærkt penetrerende effekter, kan mindre stikprøvestørrelser bruges til at producere betydelige kvantitative data om sarkomeret defekter. I tilfælde, hvor effekten har en lav penetrans, udvælgelse af dyr, der viser en klar bevægelse defekt som reaktion på medicineller RNAi behandling kan være nyttige i at analysere sarkomeret defekter hos dyr er hårdest ramt af behandlingen. Det er imidlertid ikke nødvendigvis tilfældet, at omfanget af behandlingseffekt ved bevægelse og subcellulære struktur er den samme. Det kan således være ønskeligt at undersøge omfanget af defekter til stede i en stor population, for eksempel 100 dyr. Dette muliggør forståelse af fordelingen af ​​fejl i løbet af en population. Det kan også være ønskeligt at undersøge omfanget af defekten i de hårdest ramte dyr og / eller undersøge sammenhængen mellem omfanget af sarkomer defekt og omfanget af bevægelse defekt. Potentielle vanskeligheder til side, denne metode er hurtigere og nemmere end andre metoder til vurdering sarkomeret struktur. Denne hastighed og brugervenlighed er dog underlagt en vigtig begrænsning, sarkomerer indeholder GFP fusionsproteiner er ikke helt normal 37 og dermed vurdering af sprængte sarkomerer skal bekræftes ved brug af yderligere mere arbejdskraftintensive metoder.Disse fremgangsmåder indbefatter anvendelse af polariseret lys 38, phalloidin farvning 39 og indirekte immunfluorescens 40. Af disse metoder kun polariseret lys er relativt ikke-invasiv; de andre metoder kræver fiksering og derfor ikke kan anvendes i prospektive undersøgelser af de enkelte dyr, snarere at de kun kan anvendes til at bekræfte, i tværsnit, resultaterne fra disse undersøgelser.

Imaging mitokondrie Networks

Ormen stamme anvendes til mitokondrielle billeddannelse eksperimenter var CB5600 7, som udtrykker et GFP-fusionsproteinet lokaliseret til mitokondrierne, og et GFP β-galactosidase-fusionsprotein lokaliseret til kernerne, både i kropsvæggen muskler. Som med anvendelsen af ​​PJ727 for billeddannende sarkomerer, anvendelsen af ​​denne stamme muliggør visualisering af mitokondrie netværksstruktur i levende dyr. Således kan denne stamme anvendes til at vurdere dynamiske forandringer, der sker, for eksempel reduceret mitochondrial fusion og / eller øget mitokondrie fission 41. Også som for billeddiagnostiske sarkomerer, den største vanskelighed ved denne metode er, at ormene bliver afbildet stadig er i live og bevæger sig, hvilket gør det vanskeligt at få godt fokuserede billeder. Mens adskillige fremgangsmåder, som beskrevet mere detaljeret ovenfor, kan anvendes til at reducere bevægelse, mitokondrier synes særligt følsomme over for indgreb, som inducerer reduceret bevægelse. For eksempel, mest almindeligt anvendte bedøvelsesmidler målkomponenter i mitokondrie respiratoriske kæde og skal derfor anvendes med forsigtighed i undersøgelser af normal mitokondrie struktur og funktion. Ligeledes skal de fleste paralytisk midler anvendes med forsigtighed i undersøgelser af normal mitokondrie struktur og funktion, som de fleste paralytisk midler forårsager mindre signal at passere gennem den neuromuskulære junction og funktionel denervering af musklen er tilstrækkelig til at inducere mitokondrie fragmentering. Forsøgene i denne undersøgelse anvendte tryk for at immobilisere dyrs men andre har med held brugt levamisol 42, selv om det er vigtigt at billedet dyr straks.

Endelig forskellige bakterielle forureninger i kulturer, for eksempel B. subtilis, kan inducere mitokondrie fragmentering; derfor er det vigtigt at medtage passende ubehandlede kontroller i analysen. For stærkt penetrerende effekter, kan mindre stikprøvestørrelser bruges til at producere betydelige kvantitative data om mitokondrie netværk defekter. Men på grund af forekomsten af ​​mindre defekter i mitokondrie netværk, vil sandsynligvis være det dobbelte af antallet nødvendige for vurdering af sarkomer struktur dette lille antal dyr. I tilfælde, hvor effekten har en lav penetrans, kan udvælgelsen af ​​dyr klart udviser en bevægelse defekt som reaktion på medicin eller RNAi behandling være nyttige i at analysere mitokondrie defekter hos dyr er hårdest ramt af behandlingen. Som nævnt ovenfor, er det imidlertid ikke nødvendigvis tilfældet, atomfanget af behandling effekt på bevægelse og subcellulære struktur er den samme. Det kan således være ønskeligt at undersøge omfanget af defekter til stede i en stor population, for eksempel 150-200 dyr, såvel som omfanget af forstyrrelser i de hårdest ramte dyr og nærvær eller fravær af omfanget af forstyrrelser med omfanget af defekt bevægelse. Andre stammer med fluorescensmærkede mitokondrier kan bruges til at bekræfte resultaterne opnået i CB5600, dog kan anvendelsen af ​​forskellige fluorescerende proteiner påvirke baseline netværk af mitokondrier. For eksempel anvendelse af en Tomm-20 RFP fusion protein at visualisere mitokondrier synes at medføre øget baseline mitokondrie fragmentering i forhold til anvendelsen af mitokondrier lokaliseret GFP 17. Mens kan anvendes andre metoder, såsom immunofluorescens og elektronmikroskopi for at vurdere mitokondriestruktur, behøver de ikke give in vivo vurdering af mitokondrielle dynamik, fordi en fiksering trin er kræverd. Andre metoder såsom anvendelse af mitokondrier lokaliserede farvestoffer kan anvendes uden fiksering og kan derfor også anvendes i stedet for anvendelse af mitokondrier lokaliseret GFP. Som omtalt i næste afsnit, brug af sådanne farvestoffer tillader også rå vurdering af in vivo mitokondriefunktion.

Vurdere mitochondriemembran potentiale in vivo i C. elegans

En række farvestoffer er tilgængelige til mærkning af mitokondrier 28. Disse farvestoffer tilvejebringer en alternativ metode til at visualisere mitokondrie netværksstruktur i levende C. elegans. Mange af disse farvestoffer også tillade rå vurdering af mitochondrial funktion in vivo, fordi de ophobes i mitokondrier baseret på det mitokondrielle membranpotentiale. Her har vi brugt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, der indtages gennemfordøjelseskanalen, med nogle yderligere ind ormen via kutikula grund af permeabilisering gav ved at blive opløst i 0,5% DMSO. Efter indgang i cellen C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxideres og afsondres af mitokondrier, hvor det binder svovlholdige aminosyrer (f.eks methionin og cystein). Dannelsen af disse farvestof-peptid-komplekser betyder C 32 H 32 Cl 2 N 2 O forbliver i mitokondrierne, når mærket 28. Et centralt vanskelighed med anvendelse af mitokondrielle farvestoffer er, at de vil mærke alle mitokondrier i dyret. Derfor har vi udført mærkning i CB5600, den samme stamme, der er beskrevet ovenfor for vurdering af muskel mitokondrie netstruktur. Ved hjælp af en rød mitokondrie farvestof, en stamme af orme, der udtrykker GFP i muskel mitokondrier, og en tredobbelt pass filter, det er relativt ligetil at billedet kun mitokondrier i muskel ved at finde mitokondrier, der ovifte af co-lokalisering af rødt farvestof og GFP mærkede mitokondrier. Den sværeste trin i udførelsen af ​​denne colokalisering fremgangsmåde er imaging fordi farvestoffet er tilgængeligt bleget inden for sekunder under høj intensitet fluorescerende lys. Denne virkning kan begrænses ved at holde fluorescens på lav effekt indtil forsøgslederen er klar til billede og derefter justere fluorescensintensiteten i overensstemmelse hermed. Når man er erfaren med brugen af ​​farvestoffer anden tilgang er at udnytte konfokalmikroskopi med Z-stakke til billede kun mitokondrier i den rigtige væv; de mitokondrielle netværk i muskulatur er helt adskilt i forhold til andre væv. Desværre manglende evne til C 32 H 32 Cl 2 N 2 O forlade mitokondrier 28 betyder, at i modsætning til sarkomer og mitokondrie billeddannende teknikker diskuteret ovenfor, kan det ikke anvendes til fremadrettet følge tab af mitokondriefunktion med tiden, medmindre C 32 H 32 Cl 2 N 2 Otilsættes ved diskrete tidspunkter til at adskille dyrepopulationer. Denne begrænsning kan overvindes ved at anvende farvestoffer, såsom JC-10 at gøre forlade mitokondrierne ved sammenbrud af membranpotentiale 43. Mitokondrier kan også isoleres fra C. elegans 30 for efterfølgende biokemiske analyser. Sådan ekstraktion tillader kvantificering af mitokondriemembranpotentiale ved at kvantificere antallet af lipofile kationiske farvestof optagelse ved anvendelse af flowcytometri eller en fluorescerende pladelæser 44. Efter at have etableret en svækket mitokondriemembranpotentiale, er det også muligt at fastslå, om tabet af proton gradient udslag i et tab af ATP-produktion ved anvendelse af en følsom bioluminometric luciferase-baserede metode 45.

Vurdering af proteinnedbrydning i C. elegans

Ormen stamme anvendes her til at vurdere muskel proteinnedbrydning var PD55, som indeholder en muskel specifik βgalactosidase der konstant dannes gennem udvikling indtil voksenalderen er nået, og som forbliver stabil i cytosolen for de næste 72-96 timer 19. Således måling af β-galactosidase-niveauer under udviklingen overvejende angiver effekten af interventioner på syntese fra myosin promotoren hvorimod tab af β-galactosidase i voksenalderen indikerer et indgreb har udløst en øget cytosolprotein nedbrydning 19. Det afgørende skridt i vurderingen af ​​β-galactosidase aktivitet er at sikre en effektiv tørring. Lykkes det ikke at udtørre dyr resulterer i dårlig bestemmelse af X-gal-substrat og derfor ringe blå farve i kroppen væg muskler af dyr. For at sikre en god udtørring forseglingen på ekssikkatoren skal kontrolleres, og prøven bør kontrolleres med 5-10 minutters intervaller hele udtørring at vurdere fremskridt (dvs. 20 pi prøve skulle have tørret inden for 10 minutter, og de ​​resterende 20 miner at sikre en omfattende udtørring). Den β-galactosidase assay er en aktivitet assay derfor en passende kontrol er afgørende. Derudover faldt farvning af voksne i en behandling tilstand i forhold til at kontrollere beviser ikke, at nedbrydningen sker; snarere indikerer reduceret enzymatisk aktivitet i respons på behandlingen. For at bekræfte nedbrydning, skal mere arbejdskrævende western blot analyse blive afsluttet med en β-galactosidase 13 og dette giver mulighed for kvantificering proteinnedbrydning i små populationer af optalte orme. Western blot band tætheder kan kvantificeres ved hjælp ImageJ 46. En anden begrænsning ved denne metode er, at anvendelsen af transgene proteiner ikke oplyser, at fysiologiske mål for nedbrydning og for sådanne svar proteom og / eller målrettede hypotesebaseret western blots skal anvendes 13. Endelig da syntesen af de transgene proteiner anvendt i disse undersøgelser slukker i den tidlige voksenalder 19 C. elegans muskel; for eksempel, stabile og radioaktive isotop metoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Developmental Biology fysiologi, Muskel mitokondrier sarkomerer ældning
Metoder til at vurdere subcellulære afsnit af muskler i<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter