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Biology

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Il muscolo scheletrico è essenziale per la locomozione ed è il principale negozio di proteine ​​dei corpi. Muscle misure sanitarie all'interno C. elegans sono descritti. I potenziali modifiche alla struttura e la funzione muscolare, valutati in base GFP localizzate e coloranti cationici.

Abstract

Il muscolo è un tessuto dinamico che risponde ai cambiamenti di alimentazione, esercizio fisico, e lo stato di malattia. La perdita di massa muscolare e della funzione con la malattia e l'età sono significativi oneri di sanità pubblica. Al momento capiamo poco sulla regolazione genetica della salute dei muscoli con la malattia o l'età. Il nematode C. elegans è un modello stabilito per la comprensione della regolazione genomica dei processi biologici di interesse. Muscoli della parete del corpo di questo worm mostrano un elevato grado di omologia con i muscoli delle maggiori specie metazoi. Poiché C. elegans è un organismo trasparente, la localizzazione di GFP ai mitocondri e sarcomeri permette la visualizzazione di queste strutture in vivo. Allo stesso modo, l'alimentazione degli animali coloranti cationici, che si accumulano basato sull'esistenza di un potenziale di membrana mitocondriale, permette la valutazione della funzione mitocondriale in vivo. Questi metodi, e anche la valutazione di proteine ​​muscolari omeostasisis, sono combinati con la valutazione della intera funzione muscolare animale, sotto forma di saggi di movimento, per consentire la correlazione dei difetti sub-cellulari con misure funzionali del rendimento muscolare. Così, C. elegans offre una potente piattaforma con cui valutare l'impatto delle mutazioni, gene knockdown, e / o composti chimici sulla struttura e la funzione muscolare. Infine, come GFP, coloranti cationici, e saggi di circolazione sono valutati in modo non invasivo, studi prospettici della struttura e della funzione muscolare possono essere condotte attraverso l'intero corso della vita e questo al momento non possono essere facilmente studiati in vivo in qualsiasi altro organismo.

Introduction

Il muscolo è un tessuto multifunzionale, molto apprezzato per il suo ruolo nella locomozione, supporto posturale e il metabolismo. Lo sviluppo e la manutenzione del muscolo sano richiede il coordinamento di più processi e dei componenti cellulari. Sia attraverso il danno o la malattia, disregolazione può verificarsi, con conseguente struttura muscolare alterata e / o la funzione. Declino associato all'età nella funzione muscolare rappresenta un onere significativo per la spesa sanitaria nel mondo occidentale, dal momento che la massa 1,2 e in particolare la forza muscolare e la resistenza muscolare 3-5 sono negativamente correlati con la mortalità. La misurazione di aspetti legati alla funzione muscolare deterioramento come ad esempio la funzione mitocondriale alterata o interruzione sarcomero, in grado di consentire una migliore comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo muscolare generale e la salute.

Elegans C aenorhabditis (C. elegans) è un nematode microscopico best noto perché è stato il primo organismo multicellulare ad avere il suo intero genoma sequenziato 6, il primo ad avere i geni silenziati con RNAi 7, e l'unico ad avere i suoi metazoi intera linea cellulare e neuroanatomia 8 9 determinata. C. elegans è stato proposto prima come un modello per lo studio del controllo genetico del comportamento nel 1974 da Sydney Brenner 10 e l'importanza di questo lavoro e la successiva è stato riconosciuto con il primo dei tre premi Nobel assegnati a C. elegans ricercatori. Circa il 35% di C. elegans geni ortologhi hanno identificato negli esseri umani, con C. elegans essere un organismo chiave utilizzata per comprendere il controllo genetico dello sviluppo muscolare 11. Quasi ogni gene nel genoma di C. elegans può essere abbattuto attraverso RNAi 7,12. Così, abbattendo geni nel muscolo pienamente sviluppata, componenti genetiche contribuire alla ripresagolamento di salute dei muscoli può essere indagato con relativa semplicità 13.

La capacità combinata di utilizzare RNAi, mutanti, e composti chimici rende C. elegans un sistema di primo ministro per esplorare la regolazione genetica 7,14,15 della struttura e della funzione muscolare con 16 anni e in modelli di malattia 17. L'impatto di knockdown gene, mutazioni e / o esposizione a composti chimici su struttura e / o funzione muscolare può essere misurata attraverso molteplici aspetti. Qui descriviamo brevemente semplici tecniche di valutazione C. elegans struttura muscolare e la funzione, molti dei quali può essere utilizzato in studi prospettici di salute dei muscoli.

Lo sviluppo della proteina fluorescente verde (GFP) 18 ha permesso la visualizzazione sia della frazione di specifiche proteine ​​e la struttura generale degli organelli in C. elegans. Qui spieghiamo come GFP espressa specifically all'interno del corpo mitocondri muscolari parete, nuclei, o sarcomeri possono essere usati per determinare se la distrofia di queste strutture subcellulari è presente. Poiché la struttura non è sempre un surrogato affidabile per la funzione, abbiamo anche spiegato come l'uso di coloranti cationici in vivo permette la valutazione del potenziale di membrana mitocondriale alterata all'interno del muscolo. Quando i coloranti vengono utilizzati in combinazione con GFP, permettono lo studio di architettura e funzione in maniera temporale tutta la durata della vita. Infine, spieghiamo anche come omeostasi delle proteine ​​all'interno del muscolo può essere valutata e in che modo tutte queste misure può essere utilizzato per correlare i cambiamenti in tutto la salute dei muscoli degli animali mediante l'utilizzo di test di movimento. Queste tecniche, combinate con knockdown genico, mutazioni, e / o composti chimici forniscono un potente arsenale per studiare come geni o composti specifici influenzano la salute dei muscoli in vivo. I paralleli nella struttura, metabolismo e funzioni grosso del muscolo tra C. elegans emammiferi significano C. elegans è un organismo modello eccezionale per comprendere la regolazione del muscolo in organismi superiori, inclusi gli esseri umani.

Protocol

1. ceppi, Cultura e Microscopia

  1. Gestire e mantenere ceppi di C. elegans come precedentemente descritto 19. I ceppi sono disponibili presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    NOTA: I ceppi utilizzati in questi esperimenti erano CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; lo-8 (e1489 IV)), con proteine ​​di fusione GFP localizzate ai mitocondri e nuclei; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) con le proteine ​​di fusione GFP localizzate all'apparato contrattile e PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V), con proteine ​​di fusione β-galattosidasi localizzate nel citosol.
  2. Completa esperimenti di RNAi come precedentemente descritto per multigenerazionali esperimenti di RNAi 13 e ottenere batteri RNAi dalla sequenza verificati biblioteca ORF-RNAi costruita da Marc Vidal et al. 12.
  3. Costruire ceppi contenenti <em> CCIS 4251, jls01 o industrie culturali e creative 55 utilizzando tecniche standard 20. Utilizzare questi transgeni per creare un ceppo di valutare la struttura della rete mitocondriale, organizzazione miosina o lo stato di proteostasis rispettivamente. Attraversare le tensioni in un mutante dove guardare uno di questi compartimenti sub-cellulari in si desidera ogni animale.
  4. Utilizzare l'inibitore PtdIns-3-chinasi, LY-294002 (LY) come descritto in precedenza 21. Brevemente, aggiungere LY-294002 ad una concentrazione finale di 160 mM in cima piastre NGM OP50-seminato secco.
  5. Cattura tutte le immagini usando un filtro GFP per esperimenti basati GFP e un microscopio con un filtro passa-tripla che permette l'imaging di canali rosso, verde e blu simultaneamente per valutare in vivo potenziale di membrana per C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, comunemente commercializzato come MitoTracker Red CMXRos. Condurre analisi di immagine e la figura di preparazione nel software di elaborazione delle immagini.

  1. Un minimo di 1 giorno prima necessità, fare tampone M9 - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42.27 mM Na 2 HPO 4, 85.56 mM NaCl (concentrazioni finali), e sterilizzare in autoclave. Una volta raffreddata a 45 ° C, aggiungere sterili MgSO4 e 1 mm dopo la sterilizzazione in autoclave per evitare la precipitazione 22. Lasciare che la M9 raffreddare a 4 ° C e aliquote in provette da 50 ml.
  2. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 3 ml di tampone M9 ad una singola piastra 9 cm e un alto numero di larve L1. Lavare la piastra volte aspirando il liquido M9 e pipettaggio contro la superficie dell'agar con la piastra di tenuta ad un angolo.
  3. Lavare le L1 del dalla piastra e poi trasferire la M9 in una provetta da 10 ml con una pipetta.
  4. Lascia per 2,5 minuti per consentire l'adulto grande e successive animali stadi larvali a cadere sul fondo della provetta e gli animali L1 piccoli rimangono vicino al top del buffer M9.
  5. Rimuovere i primi 500 ml di M9 in provetta con una pipetta. Pipettare quindi la M9 contenente larve L1 ad una nuova piastra NGM seminato con 500 microlitri OP50 in un ambito dissezione.
  6. In genere, lo scopo di trasferire ~ 200-300 larve L1 per piastra. Monitor piatti tutti i giorni dalle età adulta e, se necessario, prendere gli animali a freschi piatti OP50 NGM per evitare OP50 fonte di cibo consumato.
    NOTA: Questo è di solito 1-3 gocce di M9 con una pipetta P1000, anche se questo varia ampiamente a seconda del numero di L1 di sulla piastra originale.
  7. Se si desiderano studi prospettici in singoli animali, una volta che gli animali raggiungono l'età adulta, scegliere singoli animali per separare le piastre NGM teste di serie. Animali di trasferimento ogni 24-48 ore per separare da animali larvali.

3. Movimento Saggi 19

  1. Un minimo di 2 ore prima di iniziare la sperimentazione, rimuovere una aliquota di 50 ml di M9 e lasciare equilibrare a temperatura ambienteeratura.
  2. Scegliere un solo animale adulto in 50 microlitri di buffer M9 su un vetrino da microscopio.
  3. Contare il numero di curve del corpo sinistro e destrorsi in 10 secondi, in cui uno a sinistra e uno curva verso destra è uguale a un colpo.
  4. Ripetere il numero di colpi del corpo per un totale di almeno 5 misurazioni da cui una media può essere preso. Moltiplicate queste cifre da sei a dare la velocità di movimento per min.
  5. Usando una pipetta, trasferire l'animale torna alla capsula di Petri. Questo metodo consente la misurazione temporale del movimento per tutta la durata della vita in C. elegan s.

Figura 1
Figura 1: test di movimento. Una volta che i vermi sono raccolti nel buffer, uno verso sinistra (A) e uno verso destra (B) piega vengono sommati per ottenere un movimento completo(Ictus).

4. Imaging di mitocondriali Reti e sarcomeri in parete del muscolo del corpo

  1. NOTA: Lo stesso protocollo vale per l'imaging sia mitocondri e sarcomeri.
  2. Sincronizzare vermi come descritto in precedenza (sezione 1) e crescere per 48-60 ore a 20 ° C quando raggiungeranno l'età adulta.
  3. Scegli 20 vermi (rappresentativi della piastra) dalle piastre in 20 microlitri M9 su un vetrino da microscopio.
  4. Applicare un vetrino e procedere ad immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza in un filtro GFP (460-500 nm, blu luce di eccitazione) a 40X di ingrandimento.

5. Valutare il potenziale di membrana utilizzando un test in vivo di accumulo con MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Sincronizzare CB5600 (sezione 1), tutti etichettati con GFP nei mitocondri dei muscoli, e crescere per la prima età adulta su NGM contenente OP50 per 48-60 ore a 20 ° C.
  2. Aggiungere 100 ml di DMSO alla aliquota 50 mg di C 32 H 32 Cl 2 N 2 O per ottenere una soluzione stock di 940,692 micron.
  3. Prendere 1 ml di soluzione madre 940,692 micron e risospendere in 199 ml M9 per creare una soluzione di lavoro di 4,70 micron (4,70346 um). Preparare questo in marrone provette da 1,5 ml per C 32 H 32 Cl 2 N 2 O è fotosensibile.
  4. Preparare aliquote 20 ml di 4,70 mM soluzione (20 vermi adulti per 20 microlitri aliquota) di lavoro.
  5. Scegli 20 animali adulti in 20 ml di 4,70 mM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O nei marroni provette da 1,5 ml. Incubare a 20 ° C per 1 ora.
  6. Dopo l'incubazione 1 ora, aggiungere 1 ml di M9 ai marroni provette da 1,5 ml contenenti i vermi, centrifugare a 2000 xg per 10 secondi e poi rimuovere il surnatante. Ripetere questa operazione di lavaggio prima di risospendere il pellet senza fine e il trasferimento dei restanti 20 μl (contenente i vermi) ad uno scivolo per l'imaging.
  7. Prendere immagini di mitocondri con 40X ingrandimento usando un filtro passa tripla che permette di visualizzare entrambi i canali rosso, blu e verde contemporaneamente. Imaging utilizzando il filtro passa-triplo mostra co-localizzazione di C 32 H 32 Cl 2 N 2 O con GFP localizzato ai mitocondri che appaiono come arancione.
  8. Dopo aver preso l'immagine di mitocondri arancia, foto-candeggiare l'animale per 10 secondi usando la luce di lunghezza d'onda 540/25 nm su impostazioni massimi con tutti i filtri rimossi. Questo candeggina il colore rosso all'interno dei mitocondri e rivelare solo la GFP mitocondriale per confermare co-localizzazione nei mitocondri muscolari.

6. Valutazione di Muscle Protein degradazione in C. elegans

  1. Sincronizzare PD55s (o qualsiasi ceppo contenente il transgene lacZ) su di piastre NGM seminato con OP50 (sezione 1). Crescere per giovani adulti di 48-60 ore a 20 ° C.
  2. Scegli 20 vermi adulti in 20 microlitri DDH 2 O su un vetrino da microscopio. Fare attenzione a cercare di scegliere solo il verme e non tutti i batteri con il plettro. Etichettare il vetrino da microscopio a matita.
  3. Mettere in un essiccatore per 30 minuti per asciugare e crack la cuticola degli animali. Assicurare una buona tenuta sul essiccatore con grasso intorno alla tenuta.
  4. Controllare l'essiccazione è stata efficace sotto una portata dissezione (Figura 2).
  5. Immergere il vetrino in acetone ghiacciata per 3,5 minuti poi lasciare il vetrino su carta assorbente a temperatura ambiente per 15 minuti per permettere l'acetone sul vetrino evaporare. A questo punto scongelare il buffer X-gal e l'ossidazione e permettere equilibrare a temperatura ambiente.
  6. Aggiungere 2 ml X-gal a 100 microlitri di buffer ossidazione e vortice delicatamente per evitare questo rischio è omogenea. Questo è l'X-gal / ossidazione mix buffer di master.
  7. Aggiungere 20 ml di X-gal / ossidazione mix buffer di master per ciascun ozona riginal di 20 vermi. Controllare in un ambito dissezione per garantire la master mix copre completamente tutti gli animali del tutto. Inclinare delicatamente il vetrino da microscopio per spostare il master mix su aree dove gli animali non sono coperti.
  8. Posizionare il vetrino in una camera umida per 1-2,5 ore a 20 ° C. Animali Immagine quando un colore blu scuro è presente nei muscoli della parete del corpo di animali di controllo. Valutare animali di controllo in un ambito di dissezione ogni 15 minuti per determinare quando gli animali dovrebbero essere ripreso.

Figura 2
Figura 2: Valutazione della degradazione delle proteine ​​muscolari utilizzando test β-galattosidasi. (A) gli animali che contengono un transgene lacZ vengono raccolte dalle piastre di Petri di 20 microlitri DDH 2 O su un vetrino da microscopio (B). Gli animali sono essiccato e diventano fratturato (D). Una volta che l'acetone evapora è aggiunto il X-gal / ossidazione della miscela tampone principale (E). Lo sviluppo di colore blu in animali di controllo è valutata a 15 min intervalli (FL) da t = 0 min (F) finché un colore blu scuro è ottenuta attraverso la lunghezza degli animali (L). Immagini di vermi sono prese a 2.5 x ingrandimento in AE e 8X in FL. Esegue lo zoom in C, D, F, G e L sono 4X l'ingrandimento originale.

Representative Results

Movimento Test per quantificare Difetti movimento

Declino Il movimento è un buon predittore di mortalità in C. elegans 16, alle diminuite percentuali che indicano problemi con il sistema neuromuscolare. Cambiamenti nella circolazione, come valutato mediante saggi di movimento, possono derivare da RNAi contro uno specifico gene o trattamento farmacologico (figure 3-5) o in animali mutanti 13, 23. Un calo in movimento può derivare dallo sviluppo alterato per esempio a seguito di colpi di sviluppo verso il basso di geni che codificano per il trasporto di elettroni del complesso I, III, IV o V 24. Inoltre, gli interventi specifici possono essere testati solo su adulti C. elegans, al fine di studiare l'effetto sulla fisiologia post-sviluppo. Ad esempio, gli animali trattati con RNAi contro unc-112, che codifica per la C. elegans ortologo di kindlina-1, che è localizzato a integrina contenentecomplessi di attacco muscolare (figure 3 e 4), o il gas-1, che codifica un componente del complesso I della catena di trasporto degli elettroni (figura 4), ​​mostrano una riduzione progressiva movimento contro controllo 48-72 ore post-adulta. Questo può essere indicativo di problemi con la fisiologia del muscolo. Analogamente, una perdita di movimento da 24 - 72 ore si osserva in risposta al trattamento di adulti normalmente sviluppati con il trattamento con l'inibitore di PI3K LY-294002 (Figura 5). E 'anche possibile testare l'effetto di un secondo trattamento RNAi, mutazione, o un farmaco per ripristinare il movimento in animali che presentano circolazione ridotta in risposta ad un primo intervento. Ad esempio, unc- 112 mutanti mostrano una riduzione quantificabile in movimento rispetto agli animali wild type che viene attenuata in presenza di una seconda mutazione in dim-1 13. Pertanto, le analisi di movimento in grado di identificare sia gli interventi che alterano neuromuscular sviluppo e / o la funzione, oltre a quelli che migliorano e / o ripristinare la funzione neuromuscolare.

Valutazione del sarcomero Turbativa

Dopo aver identificato un difetto movimento, è spesso desiderabile per determinare se la causa del difetto movimento può essere spiegato con problemi all'interno nervi, muscolo, o entrambi. Sarcomeri sono i complessi multi-proteici all'interno dei muscoli che permettono la contrazione e della forza e movimento in tal modo. Da animali che utilizzano esprimono proteine ​​di fusione miosina GFP localizzate dell'apparato contrattile, il grado di perturbazione filamenti di miosina e sarcomeri si può osservare relativamente non-invasivo e prospetticamente nei singoli animali attraverso lo sviluppo e / o l'età adulta. Wild-type animali mostrano sarcomeri disposti che appaiono come più linee verdi parallele rette all'interno di ogni muscolo del corpo a parete (Figura 3). Turbativa di questi array normali può essere relativamente minore consarcomeri disposti che appaiono per unire piuttosto che rimanere in parallelo. Questo fenotipo, visibile con unc-112 RNAi in t = 24 ore o 48 ore (Figura 3), è paragonabile a Z-line in streaming di actina siti attaccamento nei muscoli dei mammiferi. Analogamente, piccole porzioni di array possono collassare o possono sparire completamente come il trattamento con unc-112 RNAi at = 48 ore o t = 72 ore (Figura 3). La presenza di difetti sarcomero nel muscolo di animali che mostrano un difetto movimento (Figura 3) è sufficiente a spiegare il difetto movimento, ma non necessariamente esclude altri problemi muscolari, nervose, e / o altri tessuti in risposta ad un intervento .

Valutazione della struttura mitocondriale Network

In presenza di un difetto di movimento è talvolta auspicabile esaminare muscolare per gli altri difetti che possono causare o contribuire al movimento deperfetta. I mitocondri forniscono la maggior parte dell'energia cellulare e declina in movimento può essere il risultato di una ridotta prestazione ATP, riducendo l'energia disponibile per la contrazione muscolare. In tal modo la struttura dei mitocondri può essere esaminato per anomalie. È importante non anestetizzare animali con sodio azide come induce rapida frammentazione mitocondriale; animali in questi esperimenti sono stati immobilizzati dalla pressione applicata dal vetrino. All'interno di wild-type C. elegans muscolare parete del corpo, mitocondri sono contenute in reti organizzate (figura 4) ed esistono mitocondri e funzionare come un reticolo 25. Turbativa della rete dei mitocondri presenta come la frammentazione della rete (gas-1 RNAi, Figura 4B) 26. La frammentazione può diventare abbastanza grave che nessuna parvenza di reti organizzate rimane come ad esempio il trattamento con unc-112 RNAi (Figura 4B e C) 13. Come with interruzioni nella struttura del sarcomero, difetti nella struttura muscolare mitocondriale negli animali che presentano un difetto di circolazione possono essere sufficienti a spiegare il difetto movimento, ma questo non significa necessariamente escludere altri problemi con muscoli, nervi, e / o di altri tessuti. Ad esempio, UNC-112 mutanti 13 e trattamento con UNC-112 RNAi (figure 3 e 4) del display sia sarcomeri perturbato e perturbato struttura mitocondriale.

Valutazione della funzione mitocondriale In Vivo

Il potenziale di membrana mitocondriale determina la capacità dei mitocondri per creare protonica forza motrice e generare ATP 27, quindi la capacità di valutare il potenziale di membrana mitocondriale in vivo indica la capacità di tale animale per produrre ATP. Come interruzioni strutturali mitocondriali possono o non possono alterare la capacità funzionale mitocondriale, può essere desirable per valutare la funzione mitocondriale in animali che presentano alterata struttura mitocondriale. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O si accumula nei mitocondri, di tutti i tipi di cellule, in cui un potenziale di membrana è presente e macchie mitocondri 28 (Figura 4C). Per valutare in modo specifico la funzione mitocondriale nel muscolo, si può usare C 32 H 32 Cl 2 N 2 O e GFP etichettati mitocondri muscolari per dimostrare gli effetti di un intervento specifico su mitocondri muscolari (Figura 4C). Ad esempio, la perdita di potenziale di membrana mitocondriale trattamento successivo con unc-112 RNAi impedisce C 32 H 32 Cl 2 N 2 O di entrare matrice. I mitocondri mostrano quindi poca o nessuna colorazione rossa dei mitocondri oltre alla etichettatura GFP dei mitocondri (Figura 4C). Fotometabolismo può essere utilizzato anche per confermare che l'osservatomitocondri sono specificamente quelli nel muscolo (Figura 4C). Identificazione di una ridotta capacità di produrre ATP è sufficiente per tenere conto di un difetto movimento osservato, ma non esclude altri problemi all'interno del muscolo, nervo, e / o di altri tessuti. Indipendentemente da ciò, come ridotta capacità di produzione di ATP è associato a stati di malattia negli esseri umani 29 e 30 di invecchiamento, l'identificazione di tale difetto in risposta ad un intervento fornisce una piattaforma per lo screening per i composti e / o trattamenti RNAi che migliorare la capacità di produzione di ATP e questi possono poi essere ulteriormente esplorato per potenziale terapeutico.

Valutazione della degradazione delle proteine

In presenza di un difetto movimento e sarcomeri normali e mitocondri è talvolta auspicabile esaminare muscolare per gli altri difetti che possono causare o contribuire al difetto circolazione. La capacità di mantenere l'omeostasi proteica è una firma némal di salute, mentre una riduzione della sintesi proteica e / o un aumento della degradazione proteica è una conseguenza dell'invecchiamento 31 e più stati patologici 32,33. Pertanto, può essere desiderabile per esaminare muscoli degli animali con un difetto circolazione dei alterata omeostasi proteica. Ciò può essere realizzato mediante la valutazione dei livelli di proteine ​​muscolari citosoliche. L'uso di proteine ​​codificate transgenically permette la valutazione del muscolo proteostasis specifico. Ad esempio, l'uso di animali contenenti β-galattosidasi, fusa ad una porzione N-terminale di miosina, che è sintetizzato sotto il controllo di un promotore ed enhancer miosina permette la valutazione del muscolo citosolica contenuto proteico 19. La presenza di blu macchia wild-type adulti dimostra la presenza di attività β-galattosidasi e l'assenza di patologico degradazione proteica citosolica. Una perdita di colorazione in risposta al trattamento suggerisce patologico degradazione proteica avviene (figura 5 13,14,19. Ad esempio, non trattati gli animali wild-type mostrano un intenso blu macchia 72 ore dopo l'età adulta, mentre LY-249002 animali trattati mostrano una mancanza di macchia (Figura 5). Come con difetti nella struttura sarcomero e la funzione mitocondriale, la presenza di patologico degradazione delle proteine ​​muscolari è sufficiente considerazione per un difetto osservato movimento, ma non necessariamente esclude altri problemi con muscoli, nervi, e / o di altri tessuti.

Figura 3
Figura 3: (A) unc-112 RNAi causa un difetto di movimento significativo a t = 72 ore (B) Valutazione della schierati struttura A-band all'interno del muscolo parete del corpo.. In wt, A-band nei muscoli appaiono come linee rette in giovane età adulta (t = 0 ore) e rimangono in gran parte uniforme fino a oltre 72 ore di età adulta (vedi peso dello zoom). unc-112 RNAi fa sì che i sarcomeri a perdere architettura in piccole aree di il muscolo (t = 24 ore), è crollato e sarcomeri mancanti (t = 48 ore), l'aggregazione (pannello superiore t = 72 ore e zoom) e la perdita di linearità della sarcomeri (pannello inferiore t = 72 ore e zoom). Barre di scala rappresentano 25 micron e zoom sono 2,5 volte.

Figura 4
Figura 4: (A) unc-112 o gas-1 RNAi provoca un difetto circolazione (B) Valutazione della struttura mitocondriale all'interno del muscolo parete del corpo.. I mitocondri nei muscoli appaiono come linee rette collegate in rete in età adulta (in peso). Il trattamento degli animali con unc-112 RNAi si traduce in mitochondrframmentazione ial come precedentemente osservata tra 24 ore e 72 ore di età adulta (zoom e freccia) 13. Allo stesso modo, RNAi contro gas -1 determina la frammentazione delle reti mitocondriali come precedentemente osservato 26. Questi sono presenti in piccole lacune nella rete mitocondriale in t = 24 ore e di progresso per la disorganizzazione diffusa a 72 ore (vedi zoom e freccia). (C) Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale in vivo. Negli animali anche contenenti GFP localizzato ai mitocondri, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O si accumula nei mitocondri dei muscoli della parete del corpo e appare arancione sotto un filtro passa-tripla di età adulta (t = 0 ore) fino a 72 ore dopo l'età adulta. Il trattamento con unc-112 RNAi provoca una progressiva perdita di potenziale di membrana, come mostrato in 72 ore in cui i restanti mitocondri mostrano minor accumulo di C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs wt. Photobleaching per 10 sec utilizzando sbiancanti 540/25 nm luce rossa dal MitoTracker e rivela la GFP localizzato mitocondri muscolari (+ Foto candeggina). Barre di scala rappresentano 25 micron e ingrandisce sono 2.5X.

Figura 5
Figura 5: (A) Il trattamento con LY-294002 animali induce un difetto circolazione (B) Valutazione della degradazione delle proteine ​​usando un test β-galattosidasi.. Età sincronizzato peso L1 larve sono cresciuto alla giovane età adulta a 20 ° C (t = 0 ore) prima del trasferimento a NGM seminato con OP50 (controllo peso) o NGM seminato con LY-294002 (PI3K inibitore trattamento) per 24 ore a 20 ° C . In A, circa 20-30 animali sono macchiati per l'attività β-galattosidasi (blu) a t = 0 ore e dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore.

Discussion

Questi metodi consentono l'esplorazione del muscolo dal macrophysiology di movimento per individuare difetti subcellulari che sono sufficienti a provocare un difetto di movimento. Quando combinato questi metodi permettono un'analisi dettagliata del muscolo. La conoscenza acquisita permette ulteriori test di ipotesi orientata muscolari che riguardano in generale la fisiologia, fisiopatologia e l'invecchiamento.

Movimento saggi

Un difetto movimento indica una perturbazione della normale funzione neuromuscolare. Questo può essere specifico per i nervi o muscoli o può essere comune tra i diversi tessuti. Le tappe più difficili di portare a termine i test di movimento stanno selezionando i vermi che sono rappresentative della popolazione e / o il trattamento, e assicurando inoltre che lo sperimentatore non ferire l'animale al momento del trasferimento a M9. E 'importante avere una grande dimensione del campione per ottenere una valutazione accurata rappresentativo e di movimento. Quando saggiare altamente pennaeffetti etrant, per esempio come spesso visto nei mutanti, un campione di dieci animali ciascuno valutato per il movimento dieci volte è sufficiente trovare differenze statisticamente significative rispetto wild-type. Tuttavia, la semplicità del test di movimento e facilità di coltura C. elegans significa che centinaia di vermi possono rapidamente essere valutati al fine di garantire risultati quantitativamente robusti. Quando saggiare effetti che appaiono presente solo in una porzione di una popolazione è importante determinare quale percentuale della popolazione sembra essere influenzata e la gravità dei difetti negli animali più colpite. In tali situazioni un maggior numero di animali dovrebbero essere valutati al fine di fornire i dati minimi per la percentuale di popolazione colpita. Spesso sia droga e trattamenti RNAi produrranno gravi difetti di movimento in una piccola percentuale della popolazione. In alcuni casi, l'aumento della dose di trattamento e o il metodo di consegna aumenterà la percentuale di affanimali ette e curve dose-risposta in esecuzione può essere utile per determinare la concentrazione ottimale di un farmaco o RNAi. Una seconda limitazione di questo saggio movimento è che i vermi sono manipolati per valutare il movimento. Così, i vermi sono entrambi stimolati e sottoposti ad un certo grado di stress osmotico alla raccolta in liquido. Il grado di stress osmotico può essere limitata utilizzando M9 o BU tampone 19 rispetto all'acqua. Alcune di queste limitazioni sono alleviati misurando il movimento abituale su piatti utilizzando sistemi di localizzazione disponibili in commercio 34 o plug-in gratuiti per ImageJ 35. Misurare la velocità di movimento di un animale può fornire informazioni importanti per quanto riguarda la salute dei muscoli in generale, compresi i cambiamenti di funzione che può essere misurato in tutta la durata della vita e la non invasività di questo metodo è fondamentale per gli studi per tutta la vita i potenziali di funzione muscolare.

Imaging del dell'apparato contrattile

<p class = "jove_content"> Il ceppo verme utilizzato qui per la struttura dell'apparato contrattile immagine era PJ727 36 che esprime una proteina di fusione GFP miosina che è localizzato a sarcomeri nei muscoli della parete del corpo. L'utilizzo di questo ceppo permette la visualizzazione della struttura del sarcomero in animali vivi. Simile al dosaggio movimento sopra descritto, un vantaggio fondamentale dell'utilizzo GFP etichettati sarcomeri valutare struttura sarcomero è che il metodo è relativamente non invasivo e quindi può essere utilizzata per seguire prospetticamente struttura sarcomero nei singoli animali tutta la durata della vita. La difficoltà maggiore di questo metodo è che i vermi che viene esposta sono ancora vivi e quindi in movimento, il che rende difficile ottenere immagini ben focalizzate-. Diversi metodi possono essere impiegati per ridurre il movimento e rendere più semplice l'imaging; questi includono l'anestesia o paralizzare i vermi e l'immobilizzazione tramite pressione di aspirazione, o l'uso di una soluzione ad alta viscosità. Ciascuno di questi metodi di immobilizzione presenta l'inconveniente che può alterare stessa funzione neuromuscolare. Pertanto, è essenziale includere adeguati controlli non trattati nell'analisi. Può anche essere opportuno utilizzare almeno due metodi indipendenti di immobilizzazione per confermare i risultati non sono causa di problemi con il metodo di immobilizzazione, a seconda di come ampiamente utilizzato il metodo di immobilizzazione scelto sia per la questione in esame. Qui abbiamo usato una semplice pressione del coprioggetto sulla vite senza fine di indurre il movimento ridotta. Dopo aver posizionato il vetrino, il liquido sotto il vetrino evapora e il vetrino viene quindi cominciare a produrre più pressione sulle viti senza fine, in genere questo richiede 2-5 minuti per produrre abbastanza movimento ridotta per consentire un facile imaging.

È essenziale monitorare i vermi da vicino dopo il vetrino è stato introdotto come la pressione alla fine aumenterà sufficiente a causare i vermi a scoppiare da una pressione eccessiva, in genere 10-15 minuti dopo la coInoltre verslip. Buffer aggiuntivo può essere introdotto con l'ausilio di una pipetta attorno ai bordi del coprioggetto per evitare schiacciamento ai vermi. Lo smalto per unghie può essere usata per sigillare i bordi del vetrino e prevenire l'evaporazione, anche se questo impedisce il recupero di animali da sotto il vetrino, se desiderato. Analogamente, l'uso di perle di silicone nella soluzione può aiutare a ridurre la quantità di pressione luoghi coprioggetto sui vermi.

Proprio come valutare una deficienza movimento, è importante considerare la penetranza di effetto. Penetranza può essere considerato elevato se 80-100% animali mostrano un fenotipo sulla piastra NGM, parziale se 21-79% e basso se ≤20% del display popolazione di un effetto. Per gli effetti altamente penetranti, campioni di dimensioni più piccole possono essere utilizzati per produrre significativi dati quantitativi sui difetti sarcomero. Nei casi in cui l'effetto ha una penetranza bassa, la selezione degli animali da visualizzare per un difetto evidente movimento in risposta a farmacio il trattamento RNAi può essere utile nel saggiare difetti sarcomero in animali più colpite dal trattamento. Tuttavia, non è necessariamente il caso che l'entità dell'effetto del trattamento sul movimento e struttura subcellulare è la stessa. Pertanto, può essere desiderabile per esaminare il grado di difetti presenti in una grande popolazione, per esempio 100 animali. Ciò consente comprensione della distribuzione dei difetti tutta una popolazione. Può anche essere opportuno esaminare la misura del difetto negli animali più colpite e / o esaminare la correlazione tra entità del difetto sarcomero ed estensione del movimento difetto. Potenziali difficoltà a parte, questo metodo è più veloce e più facile che altre modalità di valutazione struttura sarcomero. Questa velocità e la facilità è, tuttavia, soggetta a una limitazione chiave, sarcomeri contenenti proteine ​​di fusione GFP non sono del tutto normali 37 e, pertanto, la valutazione di sarcomeri perturbato deve essere confermato utilizzando altri metodi più alta intensità di lavoro.Questi metodi includono l'uso di luce polarizzata 38, falloidina colorazione 39, e immunofluorescenza indiretta 40. Di questi metodi, solo la luce polarizzata è relativamente non invasiva; gli altri metodi richiedono fissaggio e quindi non possono essere utilizzate in studi prospettici di singoli animali, piuttosto possono essere utilizzati solo per confermare, attraversare sectionally, i risultati di tali studi.

Imaging di mitocondriali Networks

Il ceppo verme utilizzato per gli esperimenti di imaging mitocondriali era CB5600 7 che esprime una proteina di fusione GFP localizzata ai mitocondri e GFP β-galattosidasi proteina di fusione localizzata ai nuclei, sia nei muscoli della parete del corpo. Come con l'uso di PJ727 per sarcomeri di imaging, l'uso di questo ceppo permette la visualizzazione della struttura della rete mitocondriale negli animali viventi. Così, questo ceppo può essere utilizzato per valutare cambiamenti dinamici che si verificano, ad esempio ridotta mitochofusion ndrial e / o aumento della fissione mitocondriale 41. Anche per quanto riguarda sarcomeri di imaging, la più grande difficoltà di questo metodo è che i vermi viene esposta sono ancora vivi e in movimento, il che rende difficile ottenere immagini ben focalizzati. Mentre diversi metodi, come discusso in maggior dettaglio in precedenza, possono essere impiegati per ridurre il movimento, mitocondri sembrano particolarmente sensibili a interventi che inducono il movimento ridotta. Per esempio, più comunemente usato componenti anestetici bersaglio della catena respiratoria mitocondriale e pertanto deve essere utilizzato con cautela in studi sulla struttura mitocondriale normale e funzione. Allo stesso modo, la maggior parte degli agenti paralitico devono essere usati con cautela in studi sulla struttura e la funzione mitocondriale normale, come la maggior parte degli agenti di paralisi causano meno segnale di passare attraverso la giunzione neuromuscolare e denervazione funzionale del muscolo è sufficiente ad indurre la frammentazione mitocondriale. Gli esperimenti in questo studio impiegati pressione per immobilizzare animalis ma altri hanno utilizzato con successo levamisolo 42, anche se è essenziale animali immagine immediatamente.

Infine, vari contaminanti batterici nelle culture, per esempio B. subtilis, possono indurre la frammentazione mitocondriale; quindi è essenziale includere adeguati controlli non trattati nell'analisi. Per gli effetti altamente penetranti, campioni di dimensioni più piccole possono essere utilizzati per produrre significativi dati quantitativi sui difetti di rete mitocondriali. Tuttavia, a causa della prevalenza di difetti minori nella rete mitocondriale, questo piccolo numero di animali è probabile che sia il doppio del numero necessario per la valutazione della struttura sarcomero. Nei casi in cui l'effetto ha una bassa penetranza, selezione di animali che mostra chiaramente un difetto di movimento in risposta al farmaco o trattamento RNAi può essere utile nel saggiare difetti mitocondriali in animali più colpite dal trattamento. Tuttavia, come già detto, non è necessariamente il caso che ilentità dell'effetto del trattamento sul movimento e struttura subcellulare è la stessa. Pertanto, può essere desiderabile per esaminare il grado di difetti presenti in una grande popolazione, ad esempio 150-200 animali, nonché il grado di perturbazione negli animali più gravemente colpite e la presenza o assenza di portata di interruzione con portata di movimento difetto. Altri ceppi con contrassegnati in modo fluorescente mitocondri possono essere utilizzati per confermare i risultati ottenuti in CB5600, tuttavia, l'uso di proteine ​​fluorescenti differenti possono influenzare la rete basale dei mitocondri. Ad esempio, l'uso di una RFP proteine ​​TOMM-20 fusione di visualizzare mitocondri sembra causare un aumento basale frammentazione mitocondriale rispetto all'uso di GFP mitocondrialmente localizzato 17. Mentre altri metodi come immunofluorescenza e microscopia elettronica possono essere utilizzati per valutare la struttura mitocondriale, non permettono la valutazione in vivo delle dinamiche mitocondriali perché un passo fissazione è richieded. Altri metodi come l'uso di coloranti mitocondrialmente localizzate possono essere usate senza fissazione e quindi possono essere utilizzati anche in luogo di utilizzo della GFP mitocondrialmente localizzata. Come discusso nella sezione successiva, l'utilizzo di questi coloranti permette anche la valutazione in vivo grezza di funzione mitocondriale.

Valutare il potenziale di membrana mitocondriale in vivo in C. elegans

Una varietà di coloranti sono disponibili per l'etichettatura mitocondri 28. Questi coloranti forniscono un metodo alternativo di visualizzare la struttura di rete mitocondriale in C. elegans vivo. Molti di questi coloranti inoltre permettono la valutazione grezza di funzionalità mitocondriale in vivo perché si accumulano nei mitocondri basate sul potenziale di membrana mitocondriale. Qui abbiamo usato C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, che viene ingerito attraversoil tratto digerente, con qualche aggiunta entrare il verme tramite la cuticola causa della permeabilizzazione offerta dalla sua dissoluzione in 0,5% DMSO. A seguito dell'entrata in cella C 32 H 32 Cl 2 N 2 O viene ossidato e sequestrata dai mitocondri dove si lega aminoacidi contenenti zolfo (ad esempio, metionina e cisteina). La formazione di questi complessi peptide-colorante significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O rimane nei mitocondri volta etichettati 28. Una difficoltà chiave con l'uso di coloranti mitocondriali è che essi etichettare tutti mitocondri nell'animale. Per questo abbiamo svolto l'etichettatura in CB5600, lo stesso ceppo sopra descritto per la valutazione del muscolo struttura di rete mitocondriale. Utilizzando un colorante rosso mitocondriale, un ceppo di vermi esprimenti GFP nei mitocondri muscolari, ed un filtro passa tripla, è relativamente semplice immagine solo mitocondri nel muscolo trovando mitocondri che sono ogamma di colocalizzazione di colorante rosso e mitocondri GFP etichettati. Il passo più difficile nello svolgimento di questo approccio co-localizzazione è l'imaging in quanto il colorante è foto-sbiancato in pochi secondi sotto luce fluorescente ad alta intensità. Questo effetto può essere limitato mantenendo la fluorescenza a bassa potenza fino sperimentatore è pronta ad immagine e quindi regolando l'intensità di fluorescenza di conseguenza. Una volta che si è sperimentato con l'uso di coloranti altro approccio è quello di utilizzare la microscopia confocale con Z-stack a immagine solo mitocondri nel tessuto giusto; le reti mitocondriali nel muscolo sono ben distinti rispetto ad altri tessuti. Purtroppo, l'incapacità di C 32 H 32 Cl 2 N 2 O lasciare mitocondri 28 significa che, a differenza delle tecniche sarcomero e di imaging mitocondriale discusso sopra, non può essere utilizzata per seguire prospetticamente perdita di funzione mitocondriale con il tempo, a meno C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oè aggiunto in momenti discreti per separare popolazioni animali. Questa limitazione può essere superata utilizzando coloranti come JC-10 che fanno lasciare i mitocondri su crollo del potenziale di membrana 43. I mitocondri può anche essere isolato da C. elegans 30 per le successive analisi biochimiche. Tale estrazione permette la quantificazione del potenziale di membrana mitocondriale quantificando il tasso di assorbimento lipofilo colorante cationico usando la citometria a flusso o un lettore di piastre a fluorescenza 44. Dopo aver stabilito una alterata potenziale di membrana mitocondriale, è anche possibile determinare se la perdita di gradiente protonico traduce in una perdita di produzione di ATP utilizzando un metodo basato luciferasi-bioluminometric sensibili 45.

Valutare Proteina degradazione in C. elegans

Il ceppo verme qui utilizzato per valutare la degradazione delle proteine ​​muscolari era PD55, che contiene un β specifico muscologalattosidasi che viene continuamente sintetizzato durante tutto lo sviluppo fino a raggiungere l'età adulta e che rimane stabile nel citosol per il prossimo 72-96 ore 19. Pertanto, la misurazione dei livelli di β-galattosidasi durante lo sviluppo indica principalmente l'impatto degli interventi sulla sintesi dal promotore miosina, mentre la perdita di β-galattosidasi durante l'età adulta indica un intervento ha provocato un aumento della proteina citosolica degrado 19. Il passaggio chiave nella valutazione dell'attività β-galattosidasi è garantire essiccazione efficace. La mancata essiccare efficacemente gli animali si traduce in scarsa prestazione del substrato X-gal e quindi scadente di colore blu nei muscoli del corpo parete degli animali. Per assicurare una buona essiccazione il sigillo sulla essiccatore deve essere controllata e il campione deve essere controllato ad intervalli di 5-10 minuti in tutta essiccazione per valutare i progressi (ad esempio, il campione di 20 ml dovrebbe essere asciugato in 10 minuti e il restante 20 minè quello di garantire essiccazione completa). Il saggio β-galattosidasi è un saggio di attività quindi un controllo appropriato è essenziale. Inoltre, una diminuzione colorazione degli adulti in una condizione di trattamento rispetto al controllo non dimostra che sta avvenendo il degrado; piuttosto indica una diminuzione dell'attività enzimatica in risposta al trattamento. Per confermare il degrado, più analisi western blot alta intensità di lavoro deve essere completato contro β-galattosidasi 13 e questo permette la degradazione delle proteine ​​quantificazione in piccole popolazioni di vermi contati. Occidentali densità di banda Blot possono essere quantificati con ImageJ 46. Un altro limite di questo metodo è che l'uso di proteine ​​transgeniche non informare in relazione agli obiettivi fisiologici di degrado e per tali risposte ipotesi guidato Western blot proteomica e / o mirati devono essere impiegati 13. Infine, come la sintesi della proteina transgenica impiegato in questi studi si spegne nella prima età adulta 19 C. elegans muscolare; per esempio, i metodi isotopici stabili o radioattivi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 93 Fisiologia, Muscolare mitocondri sarcomeri l'invecchiamento
Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em
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Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

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