Biology

ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

العضلات الهيكلية هي ضرورية للتنقل وتخزين البروتين الرئيسي هي الهيئات. ووصف القياسات الصحية العضلات داخل C. ايليجانس. ويتم تقييم التغيرات المحتملة في بنية العضلات وظيفة باستخدام GFP المحلية والأصباغ الموجبة.

Abstract

العضلات هي الأنسجة الحيوية التي تستجيب للتغيرات في التغذية، وممارسة، ودولة المرض. فقدان كتلة العضلات ووظيفتها مع المرض والعمر والصحة العامة أعباء كبيرة. ونحن نفهم حاليا سوى القليل عن التنظيم الجيني للصحة العضلات مع المرض أو التقدم في السن. الديدان الخيطية C. ايليجانس هو نموذج أنشئت لفهم التنظيم الجينومي من العمليات البيولوجية من الفائدة. عضلات جدار الجسم هذه الدودة تعرض على درجة كبيرة من التماثل مع عضلات الأنواع metazoan أعلى. منذ C. ايليجانس هو كائن شفاف، وتوطين GFP إلى الميتوكوندريا وsarcomeres يسمح التصور من هذه الهياكل في الجسم الحي. وبالمثل، تغذية الحيوانات الأصباغ الموجبة، والتي تتراكم على أساس وجود إمكانات غشاء الميتوكوندريا، يسمح للتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الجسم الحي. هذه الأساليب، فضلا عن تقييم بروتين العضلات homeostaجهاز الأمن والمخابرات، وجنبا إلى جنب مع تقييم وظيفة عضلة الحيوان كله، في شكل المقايسات حركة، للسماح للارتباط العيوب شبه الخلوية مع الإجراءات الوظيفية للأداء العضلات. وبالتالي، توفر جيم ايليجانس منصة قوية التي لتقييم تأثير الطفرات، ضربة قاضية الجينات، و / أو المركبات الكيميائية على بنية العضلات وظيفة. وأخيرا، كما GFP، والأصباغ الموجبة، والمقايسات حركة يتم تقييم غير جراحية، ويمكن إجراء الدراسات المستقبلية من بنية العضلات وظيفة عبر مسار الحياة وهذا كله في الوقت الحاضر لا يمكن تحقيق بسهولة في الجسم الحي في أي كائن آخر.

Introduction

العضلات هي الأنسجة المتعددة الوظائف، عن تقديره جيدا لدورها في الحركة ودعم وضع الجسم والتمثيل الغذائي. تطوير وصيانة العضلات صحية تتطلب تنسيق العمليات والمكونات الخلوية متعددة. إما من خلال الضرر أو المرض، يمكن أن تحدث التقلبات، مما أدى إلى تغير بنية العضلات و / أو وظيفة. الانخفاض المرتبط بالعمر في وظيفة العضلات يمثل عبئا كبيرا على ميزانيات الرعاية الصحية في العالم الغربي، لأن العضلات ^1،2 وخاصة القوة العضلية والتحمل ^3-5 ويرتبط سلبا مع فيات. قياس الجوانب المتعلقة تدهور وظيفة العضلات مثل وظيفة الميتوكوندريا تغييرها أو تعطيل قسيم عضلي، يمكن أن تسمح فهم أعمق للآليات التي تقوم عليها تنمية العضلات والصحة العامة.

ايليجانس C aenorhabditis (C. ايليجانس) هو بيز الخيطية المجهريةر معروف لأنه كان أول متعددة الخلايا أن يكون الجينوم بأكمله التسلسل ^6، الأولى لإسكات الجينات باستخدام رني ^7، وmetazoan الوحيد الذي لديه كامل النسب خلية ⁸ و ⁹ التشريح العصبي تحديدها. C. ايليجانس من كان أول من اقترح كما وقد اعترف نموذجا للدراسة وراثية تحكم السلوك في عام 1974 من قبل سيدني برينر ⁽¹⁰⁾ وأهمية هذا العمل واللاحقة مع أول ثلاثة جوائز نوبل التي منحت لC. ايليجانس الباحثين. حوالي 35٪ من جيم ايليجانس وقد حددت الجينات orthologues في البشر، مع C. ايليجانس كونها كائن الرئيسية المستخدمة لفهم السيطرة الوراثية للتنمية العضلات ^11. تقريبا كل الجينات في جينوم C. ايليجانس يمكن ترسيتها خلال رني ^7،12. وبالتالي، من خلال هدمت الجينات في عضلة تطويره بالكامل، العناصر الوراثية التي تسهم في إعادةgulation الصحة العضلات يمكن التحقيق مع البساطة النسبية ^13.

القدرة مجتمعة لاستخدام رني، المسوخ، والمركبات الكيميائية تجعل C. ايليجانس نظام رئيس الوزراء لاستكشاف التنظيم الجيني ^7،14،15 من بنية العضلات وظيفة مع التقدم في العمر ¹⁶ و ¹⁷ في نماذج المرض. ويمكن قياس تأثير ضربة قاضية الجينات، الطفرة، و / أو التعرض للمركبات الكيميائية على بنية العضلات و / أو وظيفة من خلال جوانب متعددة. نحن هنا وصف موجز تقنيات بسيطة لتقييم C. هيكل ايليجانس العضلات وظيفة، وكثير منها يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية للصحة العضلات.

وقد مكن تطوير بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ¹⁸ التصور كل محلة بروتينات محددة والهيكل العام للعضيات في C. ايليجانس. نحن هنا شرح كيفية أعرب GFP SPECIfically داخل الجسم الميتوكوندريا العضلات الجدار، نوى، أو sarcomeres يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان الضمور هذه الهياكل الفرعية الخلوية موجودا. كما هيكل ليس دائما بديل موثوق به لوظيفة، كيف نفسر أيضا استخدام الأصباغ الموجبة في الجسم الحي يسمح بتقييم ضعف إمكانات غشاء الميتوكوندريا داخل العضلات. عندما تستخدم الأصباغ في تركيبة مع GFP، فإنها تسمح دراسة الهندسة المعمارية وظيفة بطريقة الزمنية طوال العمر. وأخيرا، فإننا شرح أيضا كيف توازن البروتين داخل العضلات ويمكن تقييم وكيف أن كل هذه التدابير يمكن أن تستخدم لربط التغيرات في عضلة الصحة الحيوانية كلها عن طريق استخدام المقايسات الحركة. هذه التقنيات، جنبا إلى جنب مع ضربة قاضية الجينات، والطفرات، و / أو المركبات الكيميائية وتوفر ترسانة قوية لدراسة كيف يمكن للجينات أو مركبات معينة تؤثر على صحة العضلات في الجسم الحي. أوجه التشابه في الهيكل، والتمثيل الغذائي وظيفة جسيمة لعضلة بين C. ايليجانس والثدييات يعني C. ايليجانس هو كائن نموذجا بارزا لفهم تنظيم العضلة في الكائنات العليا، بما في ذلك البشر.

Protocol

1. السلالات، والثقافة، والمجهر

التعامل معها والحفاظ على سلالات C. ايليجانس كما هو موضح سابقا ^(19). تتوفر من مركز علم الوراثة انواع معينة (CGC) السلالات.
ملاحظة: السلالات المستخدمة في هذه التجارب كانت CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ، Pmyo-3 :: Mtgfp) الأول؛ له 8 (e1489 IV)) مع GFP البروتينات الانصهار محلية إلى الميتوكوندريا ونوى. PJ727 (jls01 (ميو-3 :: GFP، رول-6 (su1006))؛ UNC-54 :: lacZ V) مع البروتينات GFP الانصهار مترجمة إلى جهاز مقلص وPD55 (ccIs55 (سوب-7 (ST5)؛ unc- 54 :: lacZ) V) مع β غالاكتوزيداز البروتينات الانصهار مترجمة إلى العصارة الخلوية.
تجارب رني كاملة كما هو موضح سابقا في تجارب الأجيال رني ¹³ والحصول على البكتيريا رني من تسلسل التحقق منها مكتبة ORF-رني شيدت من قبل مارك فيدال وآخرون ^12.
بناء سلالات تحتوي على < م> غرف التجارة والصناعة 4251، jls01 أو CCIS 55 باستخدام التقنيات القياسية ^20. استخدام هذه الجينات المحورة لخلق سلالة لتقييم هيكل الشبكة الميتوكوندريا، منظمة الميوسين أو حالة استتباب بروتيني، على التوالي. عبور سلالات متحولة إلى حيث تبحث في واحدة من هذه المقصورات شبه الخلوية هو المطلوب في كل حيوان.
استخدام مثبطات PtdIns-3-كيناز، LY-294002 (LY) كما هو موضح سابقا ^21. لفترة وجيزة، إضافة LY-294002 في تركيز النهائي من 160 ميكرومتر على رأس-OP50 المصنف الجافة لوحات NGM.
التقاط كافة الصور باستخدام فلتر GFP لاجراء تجارب على أساس GFP والمجهر مع فلتر ثلاثي تمرير الذي يسمح التصوير من القنوات الأحمر والأخضر والأزرق في وقت واحد لتقييم المجراة غشاء المحتملة مع C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O، عادة تسويقه باعتباره MitoTracker الأحمر CMXRos. إجراء تحليل الصور وإعداد الرقم في برامج معالجة الصور.

S = "jove_title"> 2. تزامن L1 اليرقية الحيوانات عن طريق الجاذبية التعويم

ما لا يقل عن 1 يوم قبل الحاجة، وجعل M9 عازلة - 22.04 ملي KH ₂ PO _4، 42.27 ملي نا ₂ هبو _4، 85.56 ملي مول كلوريد الصوديوم (تركيزات النهائي)، وتعقيم بواسطة التعقيم. مرة واحدة يتم تبريده الى 45 درجة مئوية، إضافة عقيمة MgSO ₄ الى 1 ملي بعد التعقيم لمنع هطول الأمطار ^22. السماح للM9 لتبرد في 4 درجات مئوية، وقسامة إلى 50 مل أنابيب.
في يوم من التجربة، إضافة 3 مل M9 عازلة لواحدة 9 سم مع لوحة أرقام عالية من L1 اليرقات. غسل لوحة مرارا بواسطة الشفط السائل M9 وpipetting لضد سطح أجار مع لوحة عقدت في زاوية.
غسل وL1 من لوحة ومن ثم نقل M9 إلى 10 مل أنبوب اختبار باستخدام ماصة.
يترك لمدة 2.5 دقيقة للسماح لأكبر الكبار والحيوانات لاحقة مرحلة اليرقات ليسقط إلى أسفل أنبوب الاختبار وتبقى الحيوانات L1 أصغر قرب رالمرجع المخزن المؤقت M9.
إزالة أكبر 500 ميكرولتر من M9 في أنبوب الاختبار باستخدام ماصة. ثم ماصة M9 تحتوي على L1 اليرقات إلى لوحة NGM المصنفة جديدة مع 500 ميكرولتر OP50 تحت نطاق تشريح.
عادة، تهدف إلى نقل ~ 200-300 L1 اليرقات لكل لوحة. مراقبة لوحات يوميا من سن البلوغ، وإذا لزم الأمر، واختيار الحيوانات على لوحات OP50 NGM جديدة لمنع مصدر الغذاء OP50 يجري استهلاكها.
ملاحظة: هذا هو عادة 1-3 قطرات من M9 باستخدام ماصة P1000، على الرغم من أن هذا يختلف إلى حد كبير اعتمادا على عدد من L1 على لوحة أصلية.
وإذا رغبت الدراسات المستقبلية في الحيوانات الفردية، مرة واحدة تصل إلى مرحلة البلوغ الحيوانات، واختيار الحيوانات الفردية لفصل وحات NGM المصنفة. الحيوانات نقل كل 24-48 ساعة لفصل اليرقات من الحيوانات.

3. حركة فحوصات ¹⁹

ما لا يقل عن 2 ساعة قبل بدء التجريب، وإزالة قسامة 50 مل من M9 والسماح لتتوازن إلى درجة حرارة الغرفةerature.
اختيار حيوان بالغ واحد إلى 50 ميكرولتر M9 عازلة على شريحة المجهر.
عد عدد من الانحناءات الجسم اليسرى واليمين في 10 ثانية، حيث ينحني نحو اليسار واليمين واحد واحد يساوي بضربة واحدة.
كرر عدد من السكتات الدماغية لإعطاء الجسم ما مجموعه 5 على الأقل من القياسات التي في المتوسط يمكن اتخاذها. تتضاعف هذه الأرقام من خلال ستة لإعطاء معدل حركة لكل دقيقة.
باستخدام ماصة، ونقل الحيوانات إلى طبق بتري. هذه الطريقة يمكن قياس الزمني للحركة على مدار العمر كله في C. elegan S.

الشكل 1: فحوصات الحركة. مرة واحدة يتم انتقاؤها الديدان في المخزن، تتم إضافة نحو اليسار واحد (A) واحد اليمين (ب) منحنى معا لتعطي حركة واحدة كاملة(السكتة الدماغية).

4. التصوير من شبكات الميتوكوندريا وSarcomeres في جدار الجسم العضلات

ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول نفسه لتصوير كل من الميتوكوندريا وsarcomeres.
مزامنة الديدان كما هو موضح سابقا (القسم 1) وتنمو ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية عندما تصل إلى مرحلة البلوغ والشباب.
اختيار 20 الديدان (ممثل من لوحة) من لوحات في 20 ميكرولتر M9 على شريحة المجهر.
تطبيق زلة تغطية، والشروع في الصورة باستخدام مجهر فلوري تحت مرشح GFP (460-500 نانومتر والأزرق ضوء الإثارة) في 40X التكبير.

5. تقييم غشاء المحتملة باستخدام تراكم في فيفو الفحص مع MitoTracker الأحمر CMXRos (C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O)

مزامنة CB5600 (القسم 1)، وجميع المسمى مع GFP في الميتوكوندريا من عضلات، وتنمو إلى مرحلة البلوغ في وقت مبكر على NGM تحتوي على OP50 ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية.
إضافة 100 ميكرولتر DMSO إلى قسامة 50 ميكروغرام من C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O لجعل محلول المخزون من 940.692 ميكرومتر.
1 اتخاذ ميكرولتر من محلول المخزون 940.692 ميكرومتر و resuspend في 199 ميكرولتر M9 لخلق حل العاملة من 4.70 ميكرومتر (4.70346 ميكرومتر). إعداد هذه البنية في 1.5 مل أنابيب لC ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O هو حساس.
إعداد 20 مكل من 4.70 ميكرومتر الحل (20 الديدان البالغة في 20 ميكرولتر قسامة) العمل.
اختيار 20 حيوان بالغ إلى 20 ميكرولتر من 4.70 ميكرومتر C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O في البني 1.5 مل أنابيب. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
بعد حضانة 1 ساعة، إضافة 1 مل M9 إلى البني 1.5 مل أنابيب تحتوي على الديدان، وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 ثانية ثم قم بإزالة طاف. كرر هذه الخطوة يغسل قبل إعادة التعليق بيليه دودة ونقل 20 μ المتبقيةل (التي تحتوي على الديدان) إلى شريحة للتصوير.
التقاط صور من الميتوكوندريا مع 40X التكبير باستخدام فلتر ثلاثي النجاح الذي يسمح التصور من كل من القنوات الأحمر والأزرق والأخضر في وقت واحد. التصوير باستخدام الفلتر الثلاثي تمريرة يظهر المشارك توطين C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O مع GFP محلية إلى الميتوكوندريا الظهور كما البرتقال.
وقد أخذت صورة من الميتوكوندريا البرتقال والصور والتبييض الحيوان لمدة 10 ثانية باستخدام ضوء طول موجي 540/25 نانومتر على ضبط الحد الأقصى مع جميع المرشحات إزالتها. وهذا تبييض الأحمر داخل الميتوكوندريا وكشف GFP الميتوكوندريا وحدها لتأكيد colocalization في الميتوكوندريا العضلات.

6. تقييم من تدهور البروتين في العضلات C. ايليجانس

مزامنة PD55s (أو أي سلالة تحتوي على التحوير lacZ) على لوحات NGM المصنف مع OP50 (القسم 1). تنمو إلى مرحلة الشباب ل48-60 ساعة عند 20 درجة مئوية.
اختيار 20 الديدان البالغة في 20 ميكرولتر DDH ₂ O على شريحة المجهر. كن حذرا في محاولة لالتقاط الدودة فقط وليس أي بكتيريا مع الاختيار. تسمية شريحة المجهر في قلم رصاص.
ضع في المجفف لمدة 30 دقيقة حتى يجف والكراك بشرة من الحيوانات. ضمان ختم مشددة على استخدام مجفف الشحوم حول الختم.
تأكد من جفاف كانت فعالة تحت نطاق تشريح (الشكل 2).
غمر الشريحة المجهر في الأسيتون المثلج لمدة 3.5 دقيقة ثم تترك الشريحة المجهر على منشفة ورقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للالأسيتون على الشريحة لتتبخر. في هذه المرحلة ذوبان الجليد في X-غال والأكسدة العازلة والسماح توازنه لدرجة حرارة الغرفة.
إضافة 2 ميكرولتر X-غال إلى 100 ميكرولتر عازلة الأكسدة ودوامة بلطف لضمان هذا هو متجانس. هذا هو X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي العازلة.
إضافة 20 ميكرولتر من X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي عازلة لكل سمنطقة riginal من 20 الديدان. تفتيش تحت نطاق تشريح لضمان مزيج الرئيسي يغطي تماما جميع الحيوانات تماما. إمالة بلطف الشريحة المجهر لنقل مزيج الرئيسي على المناطق التي لا تغطيها الحيوانات.
ضع شريحة المجهر في غرفة الرطوبة ل1-2،5 ساعة عند 20 درجة مئوية. الحيوانات صورة عند اللون الأزرق الغامق موجود في عضلات جدار الجسم من الحيوانات السيطرة. تقييم حيوانات السيطرة تحت نطاق تشريح كل 15 دقيقة لتحديد متى يجب تصوير الحيوانات.

الرقم 2
الشكل 2: تقييم تدهور البروتين في العضلات باستخدام فحوصات β غالاكتوزيداز. يتم انتقاؤها (A) الحيوانات تحتوي على التحوير lacZ من أطباق بتري ل20 ميكرولتر DDH ₂ O على شريحة المجهر (B). الحيوانات المجفف وتصبح كسور (D). مرة واحدة يتبخر الأسيتون يضاف X-غال / الأكسدة مزيج الرئيسي عازلة (E). ويتم تقييم تطور اللون الأزرق في الحيوانات المراقبة في 15 دقيقة فترات (فلوريدا) من ر = 0 دقيقة (F) حتى يتم الحصول على اللون الأزرق الداكن عبر طول الحيوانات (L). تؤخذ الصور من الديدان في 2.5X التكبير في AE و8X في فلوريدا. الأزيز في C، D، F، G، و L هي 4X التكبير الأصلي.

Representative Results

حركة فحوصات لتحديد العيوب الحركة

تراجع حركة هو مؤشر جيد للوفيات في C. ايليجانس ^16، مع انخفاض معدلات مشيرا إلى مشاكل في الجهاز العصبي العضلي. تغييرات في الحركة، وفقا لتقييم المقايسات الحركة، يمكن أن تنجم عن رني ضد جين معين أو العلاج من تعاطي المخدرات (الأرقام 3-5) أو في الحيوانات الطافرة ^{13، 23.} انخفاض في حركة يمكن أن تنجم عن تطوير المتغيرة على سبيل المثال التالية تدق التنموي أسفل الجينات نقل الإلكترون ترميز أنا معقدة، الثالث، الرابع أو الخامس ^24. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار تدخلات محددة على الكبار فقط C. ايليجانس من أجل التحقيق في التأثير على فسيولوجيا ما بعد تنموي. على سبيل المثال، تعامل مع الحيوانات رني ضد UNC-112، والتي بترميز C. ايليجانس orthologue من Kindlin-1 والتي يتم ترجمتها إلى إنتغرين تحتوي علىالمجمعات التعلق العضلات (أرقام 3 و 4)، أو غاز-1، الذي يشفر أحد مكونات المجمع الأول من سلسلة نقل الإلكترون (الشكل 4)، وعرض تخفيض تدريجي في مقابل سيطرة حركة 48-72 ساعة بعد مرحلة البلوغ. قد يكون هذا مؤشرا على مشاكل مع فسيولوجيا العضلات. وبالمثل، وفقدان الحركة في الفترة من 24 - 72 ساعة لوحظ في الاستجابة للعلاج البالغين المتقدمة عادة مع العلاج مع مثبطات PI3K LY-294002 (الشكل 5). ومن الممكن أيضا لاختبار تأثير علاج ثانية رني، طفرة، أو دواء في استعادة الحركة في الحيوانات التي تظهر انخفاض الحركة ردا على هذا التدخل الأولي. على سبيل المثال، عرض unc- 112 المسوخ خفض كمي في الحركة مقارنة مع الحيوانات البرية النوع الذي الموهن في وجود طفرة ثانية في قاتمة-1 ^13. وبالتالي، يمكن تحديد كل من المقايسات حركة التدخلات التي تغير neuromuscuتطوير لار و / أو وظيفة، وكذلك تلك التي تعمل على تحسين و / أو استعادة وظيفة العصبية والعضلية.

تقييم قسيم عضلي التعطيل

وبعد تحديد وجود خلل الحركة، وغالبا ما يكون من المرغوب فيه لتحديد ما إذا كان سبب الخلل حركة يمكن تفسيرها من خلال مشاكل في الأعصاب والعضلات، أو كليهما. Sarcomeres هي مجمعات متعددة البروتين في العضلات التي تسمح للانكماش، وبالتالي إجبار جيل والحركة. من خلال الاستفادة من الحيوانات معربا عن الميوسين GFP البروتينات الانصهار مترجمة إلى جهاز مقلص، ومدى تعطل خيوط الميوسين وsarcomeres يمكن ملاحظة نسبيا غير جراحية ومستقبلي في الحيوانات الفردية من خلال تطوير و / أو مرحلة البلوغ. تعرض الحيوانات البرية من نوع sarcomeres المحتشدة التي تظهر خطوط خضراء متعددة كما مستقيمة متوازية في كل عضلات الجسم الجدار (الشكل 3). تعطيل لهذه المصفوفات العادية قد تكون طفيفة نسبيا معsarcomeres المحتشدة التي تظهر لدمج بدلا من البقاء في نفس الوقت. هذا النمط الظاهري، المرئي مع UNC-112 رني في ر = 24 ساعة أو 48 ساعة (الشكل 3)، يماثل خط Z-يتدفقون من مواقع الحجز الأكتين العضلات في الثدييات. وبالمثل، يمكن أن أجزاء صغيرة من صفائف تنهار أو أنها يمكن أن تختفي تماما مثل هذا العلاج مع UNC-112 رني في ر = 48 ساعة أو 72 ساعة = ر (الشكل 3). وجود عيوب قسيم عضلي في عضلات الحيوانات التي تعرض لخلل الحركة (الشكل 3) غير كافية لتفسير خلل الحركة ولكن لا يستبعد بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى في الاستجابة للتدخل .

تقييم الهيكل الميتوكوندريا الشبكة

في وجود خلل الحركة من المرغوب فيه في بعض الأحيان إلى فحص العضلات عن غيرها من العيوب التي قد تسبب أو تساهم في الحركة ديfect. الميتوكوندريا توفر الجزء الأكبر من الطاقة الخلوية وتنخفض في حركة قد يكون نتيجة لانخفاض توفير ATP، مما يقلل من الطاقة المتاحة لتقلص العضلات. وبالتالي هيكل الميتوكوندريا ويمكن الاطلاع للشذوذ. فمن المهم عدم تخدير الحيوانات مع أزيد الصوديوم لأنها تفضي إلى تفتت الميتوكوندريا السريع. وقد يجمد الحيوانات في هذه التجارب من خلال الضغوط التي مورست من قبل انزلاق الغطاء. ضمن البرية من نوع C. ايليجانس هيئة العضلات الجدار، وترد الميتوكوندريا داخل شبكات منظمة (الشكل 4) وجود وظيفة الميتوكوندريا بمثابة شبكية ^25. تعطل شبكة الميتوكوندريا كما يعرض تفتيت شبكة (الغاز-1 رني، الشكل 4B) ^26. قد تصبح قاسية بما فيه الكفاية التشرذم الذي لا يشبه شبكات منظمة يبقى مثل العلاج مع UNC-112 رني (الشكل 4B و C) ^13. كما واياضطرابات عشر في هيكل قسيم عضلي، وعيوب في بنية العضلات الميتوكوندريا في الحيوانات التي تعرض وجود خلل الحركة قد تكون كافية لتفسير خلل الحركة ولكن هذا لا ينفي بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، UNC-112 المسوخ ¹³ و العلاج مع UNC-112 رني (الشكلان 3 و 4) عرض كل من sarcomeres عطلت وتعطل البنية الميتوكوندريا.

تقييم وظيفة الميتوكوندريا في فيفو

تحدد إمكانات غشاء الميتوكوندريا قدرة الميتوكوندريا لخلق القوة الدافعة بروتون وتوليد ATP ^27، وبالتالي فإن القدرة على تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الجسم الحي يشير إلى قدرة هذا الحيوان لإنتاج ATP. كما قد تعطل الهيكلية الميتوكوندريا أو قد لا يغير من القدرات الوظيفية الميتوكوندريا، قد يكون ديسيالقابلة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الحيوانات التي تظهر بنية المتقدرة المتغيرة. C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O يتراكم في الميتوكوندريا، من جميع أنواع الخلايا، حيث إمكانات غشاء موجودة والبقع الميتوكوندريا ²⁸ (الشكل 4C). خصيصا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في العضلات، ويمكن للمرء استخدام C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O وGFP المسمى الميتوكوندريا العضلات لإظهار الآثار المترتبة على التدخل تحديدا على العضلات الميتوكوندريا (الشكل 4C). على سبيل المثال، فقدان غشاء الميتوكوندريا المحتملة بعد العلاج مع UNC-112 رني يمنع C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O من دخول المصفوفة. وبالتالي تظهر الميتوكوندريا القليل، إن وجدت تلطيخ الأحمر من الميتوكوندريا بالإضافة إلى وضع العلامات GFP من الميتوكوندريا (الشكل 4C). ويمكن أيضا الصورة تبيض استخدامها للتأكد من أن لاحظالميتوكوندريا هي بالتحديد تلك الموجودة في العضلات (الشكل 4C). تحديد سعة مخفضة لإنتاج ATP يكفي لتفسير عيب حركة احظ لكن لا يستبعد مشاكل أخرى داخل العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى. بغض النظر، كما يرتبط انخفاض قدرة إنتاج ATP مع الحالات المرضية في الإنسان ²⁹ و ³⁰ الشيخوخة، وتحديد هذا الخلل في استجابة لتدخل يوفر منصة للكشف عن المركبات و / أو العلاجات رني التي تعمل على تحسين القدرة الإنتاجية للاعبي التنس المحترفين وهذه قد ثم مزيد من الاستكشاف للإمكانيات العلاجية.

تقييم تدهور البروتين

في وجود خلل الحركة وsarcomeres العادية والميتوكوندريا من المستحسن أحيانا لفحص العضلات لغيرها من العيوب التي قد تسبب أو تساهم في خلل الحركة. القدرة على الحفاظ على التوازن البروتين هو توقيع ولاسوء الصحة، في حين أن الانخفاض في تخليق البروتين و / أو زيادة في تدهور البروتين هو نتيجة للتقدم في السن ³¹ والحالات المرضية المتعددة ^32،33. ولذلك قد يكون من المستحسن دراسة عضلات الحيوانات مع وجود خلل الحركة لتغير البروتين التوازن. هذا يمكن إنجازه من خلال تقييم مستويات بروتينات العضلات عصاري خلوي. استخدام البروتينات المشفرة transgenically يسمح بتقييم استتباب بروتيني معين العضلات. على سبيل المثال، استخدام الحيوانات التي تحتوي على β غالاكتوزيداز، تنصهر لجزء من محطة N-الميوسين، الذي يتم تصنيعه تحت سيطرة المروج الميوسين ومحسن يسمح بتقييم العضلات عصاري خلوي محتوى البروتين ^19. وجود بقع زرقاء في البرية من نوع البالغين يوضح وجود نشط β غالاكتوزيداز وغياب مرضية عصاري خلوي تدهور البروتين. خسارة من تلطيخ في الاستجابة للعلاج تشير تدهور البروتين مرضية يحدث (الشكل 5 13،14،19. على سبيل المثال، عرض الحيوانات غير المعالجة من النوع البري مكثفة وصمة عار الزرقاء 72 ساعة بعد مرحلة البلوغ، في حين تعرض LY-249002 معاملة الحيوانات عدم وجود وصمة عار (الشكل 5). كما هو الحال مع عيوب في هيكل قسيم عضلي وظيفة الميتوكوندريا، وجود مرضية تدهور البروتين في العضلات كافية لحساب لعيب حركة الملحوظ لكن لا يستبعد بالضرورة وجود مشاكل أخرى مع العضلات، الأعصاب، و / أو الأنسجة الأخرى.

الرقم 3: (A) UNC-112 رني يؤدي إلى خلل كبير في حركة ر = 72 ساعة (ب) تقييم المحتشدة هيكل فرقة داخل عضلة جدار الجسم. في ثر، وهناك فرق في العضلات تظهر خطوط مستقيمة كما في مرحلة الشباب (ر = 0 ساعة) وتبقى موحدة إلى حد كبير حتى إلى ما بعد 72 ساعة من سن البلوغ (انظر وزن التكبير). UNC-112 رني يسبب sarcomeres لتفقد العمارة في مناطق صغيرة من العضلة (ر = 24 ساعة)، وانهار sarcomeres المفقودين (ر = 48 ساعة)، وتجميع (ر = 72 ساعة لوحة أعلى والتكبير) وفقدان الخطي من sarcomeres (ر = 72 ساعة لوحة أسفل والتكبير). تمثل الحانات نطاق 25 ميكرومتر والأزيز هي 2.5X.

الرقم 4
الشكل 4: (A) UNC-112 أو الغاز-1 رني يؤدي إلى خلل الحركة (ب) تقييم الهيكل الميتوكوندريا داخل عضلة جدار الجسم. الميتوكوندريا في العضلات تظهر الخطوط المستقيمة الشبكية كما في مرحلة الشباب (بالوزن). معاملة الحيوانات مع UNC-112 رني النتائج في mitochondrتفتت الاتحاد العالمي للتعليم كما لوحظ سابقا بين 24 ساعة و 72 ساعة من سن البلوغ (الأزيز والسهم) ^13. وبالمثل، رني ضد الغاز -1 النتائج في تفتيت شبكات الميتوكوندريا كما لوحظ سابقا ^26. هذه هي الحاضرة كما فجوات صغيرة في شبكة الميتوكوندريا في ر = 24 ساعة وتقدم إلى الفوضى على نطاق واسع في 72 ساعة (انظر تقريب والسهم). (ج) تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا في الجسم الحي. في الحيوانات التي تحتوي أيضا GFP محلية إلى الميتوكوندريا، C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O يتراكم في جدار الجسم الميتوكوندريا العضلات ويظهر تحت اللون البرتقالي مرشح الثلاثي تمريرة من مرحلة الشباب (ر = 0 ساعة) حتى 72 ساعة بعد مرحلة البلوغ. العلاج مع UNC-112 رني يؤدي إلى الفقدان التدريجي للغشاء المحتملة كما هو مبين في 72 ساعة حيث تظهر الميتوكوندريا المتبقية تراكم أقل من C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O مقابل بالوزن. photobleaching من 10 SEج استخدام التبييض 540/25 نانومتر ضوء أحمر من MitoTracker ويكشف عن GFP محلية إلى الميتوكوندريا العضلات (التبييض + صور). الحانات النطاق تمثل 25 ميكرومتر والأزيز في على 2.5X.

الرقم 5: (أ) العلاج مع LY-294002 الحيوانات يؤدي الى خلل الحركة (ب) تقييم تدهور البروتين باستخدام مقايسة β غالاكتوزيداز. وتزرع سن متزامنة وزن L1 اليرقات لمرحلة الشباب عند 20 درجة مئوية (ر = 0 ساعة) قبل ان ينتقل الى NGM المصنف مع OP50 (التحكم بالوزن) أو NGM المصنف مع LY-294002 (PI3K العلاج المثبط) لمدة 24 ساعة عند 20 ° C . في A، ملطخة حوالي 20-30 حيوانات للنشاط β غالاكتوزيداز (الأزرق) في ر = 0 ساعة وبعد 24 ساعة، 48 ساعة و 72 ساعة.

Discussion

هذه الأساليب تتيح استكشاف العضلات من macrophysiology الحركة لتحديد العيوب التحت خلوية التي هي كافية للتسبب في خلل الحركة. عند الجمع بين هذه الأساليب تسمح بتحليل مفصل من العضلات. البصيرة المكتسبة تتيح إجراء مزيد من التجارب من الفرضيات الموجهة العضلات التي تتعلق الفيزيولوجيا العامة، الفيزيولوجيا المرضية والشيخوخة.

حركة فحوصات

هناك خلل الحركة يشير إلى اختلال وظيفة العصبية والعضلية العادية. قد يكون هذا محدد لالأعصاب أو العضلات أو أنها قد تكون مشتركة بين عدة الأنسجة. المراحل الأكثر صعوبة استكمال فحوصات الحركة هي التي تختار الديدان التي تكون ممثلة للسكان و / أو العلاج، وضمان أيضا أن المجرب لا تجرح الحيوان عقب نقله إلى M9. من المهم أن يكون حجم العينة كبير للحصول على تقييم تمثيلي ودقيق للحركة. عندما يعاير غاية القلمآثار etrant، على سبيل المثال ينظر إليها في كثير من الأحيان في المسوخ، وحجم عينة من عشرة حيوانات لتقييم كل حركة عشر مرات غير كافية لإيجاد فروق ذات دلالة إحصائية في مقابل من النوع البري. ومع ذلك، فإن البساطة من فحوصات الحركة وسهولة زراعة C. ايليجانس يعني أن مئات من الديدان يمكن بسرعة تقييمها من أجل ضمان تحقيق نتائج قوية من الناحية الكمية. عندما يعاير الآثار التي تظهر في الوقت الحاضر سوى جزء من السكان من المهم لتحديد ما هي نسبة السكان يظهر أن تتأثر، فضلا عن شدة خلل في الحيوانات الأكثر تضررا. في مثل هذه الحالات ينبغي تقييم أعداد أكبر من الحيوانات من أجل توفير البيانات الحد الأدنى لنسبة السكان المتضررين. في كثير من الأحيان على حد سواء المخدرات والعلاجات رني سينتج العيوب حركة حادة في نسبة صغيرة من السكان. في بعض الحالات زيادة جرعة العلاج وأو طريقة التسليم وزيادة نسبة قسم الشؤون الماليةقد تكون الحيوانات ECTED ومنحنيات الاستجابة للجرعة تشغيل مفيدا في تحديد تركيز الأمثل للدواء أو رني. والقيد الثاني من هذه الحركة الفحص هو أن الديدان يتم التلاعب في تقييم الحركة. وبالتالي، فإن الديدان وكلاهما حفز وتعرض لبعض الضغط الاسموزي درجة عندما تلقى في السائل. درجة الضغط الاسموزي يمكن أن يقتصر باستخدام M9 أو BU عازلة ¹⁹ بدلا من الماء. والتخفيف من بعض هذه القيود من خلال قياس حركة المعتادة على لوحات باستخدام نظم تتبع المتاحة تجاريا ³⁴ أو المكونات الإضافية المجانية ليماغيج ^35. ويمكن قياس معدل الحركة حيوان توفير المعلومات الهامة المتعلقة بالصحة العامة العضلات، بما في ذلك التغيرات في وظيفة التي يمكن قياسها في مختلف مراحل العمر وغير الغازية من هذه الطريقة هو المفتاح لدراسات مدى الحياة المتوقعة من وظيفة العضلات.

التصوير من جهاز مقلص

<كان ع الطبقة = "jove_content"> سلالة دودة تستخدم هنا لهيكل الجهاز صورة مقلص PJ727 ³⁶ الذي يعبر عن انصهار بروتين الميوسين GFP أن يكون موضعيا لsarcomeres داخل عضلات جدار الجسم. استخدام هذه السلالة يمكن تصور هيكل قسيم عضلي في الحيوانات الحية. على غرار فحص الحركة المذكورة أعلاه، والميزة الرئيسية لاستخدام GFP المسمى sarcomeres لتقييم هيكل قسيم عضلي هو أن الأسلوب هو نسبيا غير الغازية، وبالتالي يمكن استخدامها لمتابعة مستقبلي هيكل قسيم عضلي في الحيوانات الفردية في مختلف مراحل العمر. أكبر صعوبة مع هذا الأسلوب هو أن الديدان التي يجري تصويرها لا تزال على قيد الحياة، وبالتالي تتحرك، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ركز جيدا. يمكن استخدام العديد من الطرق للحد من الحركة وجعل التصوير أسهل. وتشمل هذه التخدير أو شل الديدان والشلل عن طريق الضغط والشفط، أو استخدام محلول اللزوجة العالية. كل من هذه الأساليب من immobilizأوجه ديه عيب أنه يمكن أن يغير نفسه وظيفة العصبية والعضلية. ولذا، فمن الضروري أن تشمل ضوابط غير المعالجة المناسبة في التحليل. كما قد يكون من الحكمة أن تستخدم اثنين على الأقل من وسائل مستقلة للتجميد لتأكيد النتائج ليست بسبب مشاكل مع أسلوب تجميد، وهذا يتوقف على كيفية استخدامها على نطاق واسع طريقة تجميد المختار هو المسألة قيد الدراسة. نحن هنا قد استخدمت ضغط بسيط من ساترة على دودة للحث على انخفاض الحركة. بعد وضع ساترة، فإن السائل تحت ساترة تتبخر وبالتالي سوف تبدأ ساترة لإنتاج المزيد من الضغوط على الديدان، وهذا يستغرق عادة 2-5 دقيقة إلى انخفاض إنتاج ما يكفي من الحركة لتمكين التصوير سهلا.

فمن الضروري لمراقبة عن كثب الديدان بعد أن تم عرضه ساترة مثل الضغط سيزيد في نهاية المطاف بما يكفي للتسبب الديدان أن تنفجر من الضغط المفرط، وعادة 10-15 دقيقة بعد التعاونبالإضافة verslip. ويمكن إدخال عازلة إضافية مع المعونة من طرف الماصة حول حواف ساترة لتجنب الاصابة لسحق الديدان. طلاء الأظافر يمكن أن تستخدم لختم حواف الغطاء زلة ومنع التبخر، على الرغم من أن هذا يمنع استرجاع الحيوانات من تحت الغطاء زلة، إذا رغبت في ذلك. وبالمثل، يمكن استخدام الخرز سيليكون في حل يساعد على التقليل من كمية الضغط الأماكن ساترة على الديدان.

كما هو الحال مع تقييم لعيب الحركة، فمن المهم النظر في انتفاذ من التأثير. ويمكن اعتبار انتفاذ عالية إذا عرض 80-100٪ من الحيوانات النمط الظاهري على لوحة NGM، جزئيا إذا 21-79٪ ومنخفضة إذا ≤20٪ من السكان على شاشة تؤثر. لآثار توغل للغاية، أحجام العينات الصغيرة يمكن استخدامها لإنتاج بيانات كمية كبيرة على عيوب قسيم عضلي. في الحالات التي يكون فيها أثر له انتفاذ المنخفض، واختيار الحيوانات التي تعرض وجود خلل واضح في الحركة ردا على المخدراتأو قد يكون مفيدا في علاج رني معايرة العيوب قسيم عضلي في الحيوانات الأكثر تضررا من العلاج. ومع ذلك، فإنه ليس بالضرورة أن مدى تأثير العلاج على الحركة والبنية التحت خلوية هو نفسه. وبالتالي، قد يكون من المرغوب فيه للنظر في مدى العيوب الموجودة في عدد كبير من السكان، على سبيل المثال 100 الحيوانات. وهذا يتيح فهم توزيع العيوب طوال السكان. قد يكون من المستحسن أيضا لدراسة مدى الخلل في الحيوانات الأكثر تضررا و / أو فحص العلاقة بين مدى الخلل قسيم عضلي ومدى خلل الحركة. الصعوبات المحتملة جانبا، وهذه الطريقة أسرع وأسهل من الطرق الأخرى لتقييم هيكل قسيم عضلي. هذه السرعة وسهولة، مع ذلك، تخضع لقيود الرئيسيين، sarcomeres تحتوي على البروتينات الانصهار GFP ليست طبيعية تماما وينبغي تأكيد ³⁷ وبالتالي تقييم sarcomeres تعطلت باستخدام أساليب كثيفة العمالة أكثر إضافية.وتشمل هذه الطرق استخدام الضوء المستقطب ^38، تلطيخ phalloidin ^39، والتألق المناعي غير المباشر ^40. من هذه الأساليب، الضوء المستقطب فقط هو نسبيا غير الغازية. طرق أخرى تتطلب تثبيت، وبالتالي لا يمكن استخدامها في الدراسات المستقبلية من الحيوانات الفردية، بل يمكن أن تستخدم إلا للتأكيد، عبر sectionally، والنتائج من هذه الدراسات.

التصوير شبكات الميتوكوندريا

كانت سلالة دودة تستخدم للتجارب التصوير الميتوكوندريا CB5600 ⁷ الذي يعبر عن البروتين GFP الانصهار مترجمة إلى الميتوكوندريا وGFP β غالاكتوزيداز البروتين الانصهار مترجمة إلى نوى، سواء في عضلات جدار الجسم. كما هو الحال مع استخدام PJ727 لsarcomeres التصوير، واستخدام هذه السلالة يمكن تصور بنية شبكة الميتوكوندريا في الحيوانات الحية. وبالتالي، هذه السلالة يمكن استخدامها لتقييم التغيرات الديناميكية التي تحدث، على سبيل المثال خفض mitochoالانصهار ndrial و / أو زيادة الانشطار الميتوكوندريا ^41. أيضا لsarcomeres التصوير، وأعظم صعوبة مع هذا الأسلوب هو أن الديدان التي يجري تصويرها لا تزال حية ومؤثرة، مما يجعل من الصعب الحصول على صور ركز جيدا. في حين أن العديد من الطرق، كما نوقش بمزيد من التفصيل أعلاه، يمكن استخدامها للحد من الحركة، والميتوكوندريا تظهر حساسية خاصة للتدخلات التي تحفز على انخفاض الحركة. على سبيل المثال، الأكثر استخداما مكونات التخدير الهدف من السلسلة التنفسية الميتوكوندريا، وبالتالي يجب أن تستخدم بحذر في دراسات هيكل الميتوكوندريا العادي وظيفة. وبالمثل، يجب استخدام معظم وكلاء مشلول بحذر في دراسات هيكل الميتوكوندريا العادي وظيفة، كما تسبب معظم وكلاء مشلول أقل إشارة بالمرور عبر تقاطع الاعصاب وإزالة التعصيب الوظيفي للعضلات وكافية لإحداث تجزئة الميتوكوندريا. التجارب في هذه الدراسة استخدمت الضغط لشل حركة الحيواناتS ولكن البعض الآخر قد استخدمت بنجاح الليفاميزول ^42، على الرغم من أنه من الضروري للحيوانات الصورة على الفور.

أخيرا، والملوثات البكتيرية المختلفة في الثقافات، على سبيل المثال B. الرقيقة، يمكن أن تحدث تجزئة الميتوكوندريا. ولذا فمن الضروري أن تشمل ضوابط غير المعالجة المناسبة في التحليل. لآثار توغل للغاية، أحجام العينات الصغيرة يمكن استخدامها لإنتاج بيانات كمية كبيرة على عيوب شبكة الميتوكوندريا. ولكن نظرا لانتشار العيوب الطفيفة في شبكة الميتوكوندريا، وهذا عدد قليل من الحيوانات من المرجح أن يكون ضعف العدد المطلوب لتقييم هيكل قسيم عضلي. في الحالات التي يكون فيها أثر له انتفاذ المنخفض، واختيار الحيوانات التي تظهر بوضوح وجود خلل الحركة ردا على المخدرات أو المعاملة رني قد تكون مفيدة في معايرة عيوب الميتوكوندريا في الحيوانات الأكثر تضررا من العلاج. لكن، وكما ذكر أعلاه، فإنه ليس بالضرورة أنمدى تأثير العلاج على الحركة والبنية التحت خلوية هو نفسه. وبالتالي، قد يكون من المرغوب فيه للنظر في مدى العيوب الموجودة في عدد كبير من السكان، على سبيل المثال 150-200 الحيوانات، فضلا عن مدى اضطراب في الأكثر تضررا الحيوانات ووجود أو عدم وجود قدر من التعطيل مع مدى خلل الحركة. سلالات أخرى مع fluorescently المسمى الميتوكوندريا يمكن استخدامها لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها في CB5600، ومع ذلك، فإن استخدام البروتينات الفلورية مختلفة يمكن أن تؤثر على الشبكات الأساسية من الميتوكوندريا. على سبيل المثال، يظهر استخدام TOMM 20 RFP البروتين الانصهار لتصور الميتوكوندريا لتسبب زيادة تجزئة الميتوكوندريا خط الأساس مقابل استخدام GFP محلية mitochondrially ^17. في حين أساليب أخرى مثل المناعي والمجهر الإلكتروني يمكن استخدامها لتقييم هيكل الميتوكوندريا، فإنها لا تسمح للتقييم في الجسم الحي من ديناميات الميتوكوندريا بسبب خطوة التثبيت هو مطلوبد. طرق أخرى مثل استخدام الأصباغ المحلية mitochondrially يمكن استخدامها دون تثبيت، وبالتالي يمكن أن تستخدم أيضا في مكان استخدام GFP محلية mitochondrially. كما نوقش في القسم التالي، واستخدام هذه الأصباغ كما يسمح بتقييم الخام في الجسم الحي وظيفة الميتوكوندريا.

تقييم غشاء الميتوكوندريا المحتملة في فيفو في C. ايليجانس

تتوفر لوضع العلامات الميتوكوندريا ²⁸ مجموعة متنوعة من الأصباغ. توفر هذه الأصباغ طريقة بديلة لتصور هيكل الشبكة الميتوكوندريا في C. ايليجانس الحية. العديد من هذه الأصباغ أيضا السماح تقييم الخام وظائف الميتوكوندريا في الجسم الحي لأنها تتراكم في الميتوكوندريا استنادا إلى إمكانات غشاء الميتوكوندريا. نحن هنا قد استخدمت C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O التي يتم تناولها من خلالالجهاز الهضمي، مع دخول بعض بالإضافة إلى الدودة عبر بشرة بسبب permeabilization التي يوفرها يجري حله في DMSO 0.5٪. بعد دخول الخلية C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O يتأكسد والمحتجزين من قبل الميتوكوندريا حيث يربط الكبريت التي تحتوي على الأحماض الأمينية (مثل الميثيونين والسيستين). تشكيل هذه المجمعات صبغ يعني الببتيد C ₃₂ H ₃₂ N ₂ الكلورين ₂ O يبقى في الميتوكوندريا مرة واحدة وصفت ^28. وهناك مشكلة رئيسية مع استخدام الأصباغ الميتوكوندريا هي أنهم سوف تسمية كل الميتوكوندريا في الحيوان. لذا قمنا بإجراء وضع العلامات في CB5600، نفس السلالة المذكورة أعلاه لتقييم عضلة هيكلية شبكة الميتوكوندريا. باستخدام صبغة حمراء الميتوكوندريا، وهو سلالة من الديدان معربا عن GFP في الميتوكوندريا العضلات، وتمرير مرشح الثلاثي، بل هو بسيط نسبيا لصورة الميتوكوندريا فقط في العضلات من خلال إيجاد الميتوكوندريا التي هي سمجموعة من قبل colocalization من صبغة حمراء والميتوكوندريا GFP المسمى. الخطوة الأكثر صعوبة في أداء هذا النهج colocalization هي التصوير بسبب الصبغة هو في غضون ثوان تحت كثافة عالية ضوء الفلورسنت-ابيض صور. هذا التأثير يمكن أن يقتصر طريق الحفاظ على مضان على طاقة منخفضة حتى المجرب جاهز لصورة ومن ثم تعديل كثافة مضان وفقا لذلك. بمجرد شهدت واحدة مع استخدام الأصباغ نهج آخر هو استخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع Z-مداخن لصورة الميتوكوندريا فقط في الأنسجة اليمنى. شبكات الميتوكوندريا في العضلات تختلف تماما بالمقارنة مع الأنسجة الأخرى. للأسف، عجز C ₃₂ H ₃₂ الكلورين ₂ N ₂ O لمغادرة الميتوكوندريا ²⁸ تعني أنه، على خلاف التقنيات قسيم عضلي والتصوير الميتوكوندريا التي نوقشت أعلاه، فإنه لا يمكن أن تستخدم لمتابعة مستقبلي فقدان وظيفة الميتوكوندريا مع مرور الوقت، إلا إذا C ₃₂ H ₃₂ CL ₂ N ₂ Oوأضاف في نقاط زمنية منفصلة لفصل السكان الحيوان. هذا القيد يمكن التغلب عليها باستخدام الأصباغ مثل JC-10 التي لا تترك الميتوكوندريا على انهيار محتمل غشاء ^43. الميتوكوندريا ويمكن أيضا أن تكون معزولة من C. ايليجانس ³⁰ للتحاليل الكيميائية الحيوية اللاحقة. هذا الاستخلاص الكمي يسمح للإمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس معدل امتصاص دهون الموجبة الصبغة باستخدام التدفق الخلوي أو قارئ لوحة فلوري ^44. بعد أن أنشأ ضعف إمكانات غشاء الميتوكوندريا، فمن الممكن أيضا تحديد ما إذا كان فقدان بروتون التدرج يترجم إلى فقدان إنتاج ATP باستخدام طريقة bioluminometric القائم luciferase المراسل حساس ^45.

تقييم تدهور البروتين في C. ايليجانس

كانت سلالة دودة تستخدم هنا لتقييم تدهور البروتين في العضلات PD55، والتي تحتوي على β محدد العضلات-galactosidase أن يتم تصنيعه بشكل مستمر طوال تنمية حتى يتم التوصل إلى مرحلة البلوغ والتي لا تزال مستقرة في العصارة الخلوية في 72-96 ساعة القادمة ^19. وبالتالي، وقياس مستويات β غالاكتوزيداز خلال تنمية تشير في الغالب تأثير التدخلات على التوليف من المروج ميوسين في حين أن فقدان β غالاكتوزيداز خلال مرحلة البلوغ يشير أثار هذا التدخل زاد تدهور البروتين عصاري خلوي ^19. الخطوة الرئيسية في تقييم النشاط β غالاكتوزيداز هي ضمان جفاف فعال. عدم تيبس فعال الحيوانات يؤدي إلى سوء توفير الركيزة X-غال وبالتالي ضعف اللون الأزرق في عضلات الجسم الجدار من الحيوانات. لضمان جفاف جيد يجب أن يتم التحقق الختم على المجفف ويجب فحص عينة في 5-10 دقيقة على مدار فترات جفاف لتقييم التقدم (أي عينة 20 ميكرولتر أن جفت في غضون 10 دقيقة و 20 دقيقة المتبقيةهو التأكد من جفاف شامل). فحص β غالاكتوزيداز هو بالتالي مقايسة النشاط عنصر تحكم المناسبة أمر ضروري. بالإضافة إلى ذلك، انخفضت تلطيخ البالغين في حالة العلاج قريب للسيطرة لا يثبت أن تدهور يحدث. بل يشير إلى انخفاض النشاط الأنزيمي في الاستجابة للعلاج. لتأكيد التدهور، يجب أن تكتمل مزيد من التحليل لطخة غربية كثيفة العمالة ضد β غالاكتوزيداز ¹³ وهذا يسمح تدهور البروتين الكمي في أعداد صغيرة من الديدان فرزها. غرب كثافة الفرقة لطخة يمكن قياسها كميا باستخدام يماغيج ^46. آخر الحد من هذه الطريقة هو أن استخدام البروتينات المعدلة وراثيا لا إعلام لأهداف الفسيولوجية للتدهور وأجوبة لمثل هذه الفرضية مدفوعة البقع الغربية البروتين و / أو المستهدفة يجب أن تستخدم ^13. أخيرا، وتخليق البروتين المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسات يغلق في مرحلة البلوغ في وقت مبكر ¹⁹ C. تطويره بالكامل ايليجانس العضلات. على سبيل المثال، وأساليب النظائر مستقرة أو مشعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red CMXRos (C₃₂H₃₂Cl₂N₂O)	Invitrogen	M-7512	Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO	Thermo Scientific	67-63-5
KH₂PO₄	Sigma	7778-77-0
Na₂HPO₄	BDH	301584L
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
MgSO₄	Sigma	M-7506
Microscopy Slides	Starfrost	K220
Microscopy Cover Slips	VW2 International	631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes	Fisher Scientific	FB74031
Dessicator	Nalgene	D2672
Nikon Microscope	Nikon	H600L	Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera	Nikon	DS-Fi1	Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera
Zeiss Microscope	Zeiss	Ax10	Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm	Starstedt	82-1473
Plates 6 cm	Gosselin	BP53-01
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	14459-95-1
MgCl₂	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Na₃PO₄	Sigma-Aldrich	7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside	Sigma-Aldrich	7240-90-6
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	68-12-2