Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Skelettmuskulatur är avgörande för transport och är av organens huvudsakliga protein butik. Muskelhälsomätningar inom C. elegans beskrivs. Blivande förändringar muskel struktur och funktion bedöms med hjälp av lokal GFP och katjoniska färgämnen.

Abstract

Muscle är en dynamisk vävnad som reagerar på förändringar i kost, motion, och sjukdomstillstånd. Den förlust av muskelmassa och funktion med sjukdom och ålder är betydande hälsoproblem offentliga. Vi har för närvarande förstår lite om den genetiska regleringen av muskelhälsa med sjukdom eller ålder. Nematoden C. elegans är en etablerad modell för att förstå den genomiska regleringen av biologiska processer av intresse. Denna mask kropp väggen muskler visar en hög grad av homologi med musklerna i högre flercelliga arter. Sedan C. elegans är en transparent organism, lokalisering av GFP till mitokondrier och sarkomerer möjliggör visualisering av dessa strukturer in vivo. På liknande sätt, mata djuren katjoniska färgämnen, som ackumuleras baserat på förekomsten av en mitokondriell membranpotential, möjligt att bedöma om mitokondriell funktion in vivo. Dessa metoder, samt bedömning av muskelprotein homeostasis, kombineras med bedömning av hela djuret muskelfunktion, i form av varuanalyser, för att möjliggöra korrelation av sub-cellulära defekter med funktionella mått på muskelprestanda. Således ger C. elegans en kraftfull plattform som man kan bedöma effekterna av mutationer, gen knockdown, och / eller kemiska föreningar vid muskelstruktur och funktion. Slutligen, såsom GFP, katjoniska färgämnen, och transportanalyser bedöms icke-invasivt kan prospektiva studier av muskelstruktur och funktion att utföras över hela livsförlopp och detta för närvarande inte lätt kan undersökas in vivo i någon annan organism.

Introduction

Muscle är en multifunktionell vävnad, mycket uppskattat för sin roll i förflyttning, postural stöd och metabolism. Utveckling och underhåll av friska muskler kräver samordning av flera cellulära processer och komponenter. Antingen genom skada eller sjukdom, kan dysregulation uppstå, vilket leder till förändrad muskelstruktur och / eller funktion. Åldersrelaterad nedgång i muskelfunktion utgör en betydande börda för sjukvårdsbudgetar i västvärlden, eftersom muskelmassa 1,2 och speciellt muskelstyrka och uthållighet 3-5 är negativt korrelerad med dödlighet. Mätningen av aspekter försämrad muskelfunktion, såsom förändrad mitokondriefunktion eller sarcomere störningar, kan nå större kunskap om de mekanismer som ligger till grund övergripande muskelutveckling och hälsa.

C aenorhabditis elegans (C. elegans) är en mikroskopisk nematod best känt för att det var den första flercellig organism att ha hela sitt genom sekvens 6, den första som har gener tystas med hjälp av RNAi 7, och den enda metazoan att ha sina hela cellen härstamning 8 och neuroanatomi 9 bestämdes. C. elegans var först föreslagits som en modell för att studera genetisk kontroll av beteende 1974 av Sydney Brenner 10 och vikten av detta och efterföljande arbete belönades med det första av tre Nobelpris tilldelats C. elegans forskare. Cirka 35% av C. elegans gener har identifierat ortologer hos människor, med C. elegans är en nyckelorganism som används för att förstå den genetiska kontrollen av muskelutveckling 11. Nästan varje gen i C. elegans arvsmassa kan vara knackat genom RNAi 7,12. Således, genom att knacka ner gener i fullt utvecklad muskulatur, genetiska komponenter som bidrar till återgulation av muskel hälsa kan undersökas med relativ enkelhet 13.

Den kombinerade förmåga att använda RNAi, mutanter och kemiska föreningar gör C. elegans en ledande systemet för att utforska den genetiska regleringen 7,14,15 av muskel struktur och funktion med 16 års ålder och sjukdomsmodeller 17. Effekterna av genen knockdown, mutation, och / eller exponering för kemiska föreningar vid muskelstruktur och / eller funktion kan mätas genom flera aspekter. Här beskriver vi kortfattat enkla tekniker för bedömning C. elegans muskel struktur och funktion, av vilka många kan användas i prospektiva studier av muskelhälsa.

Utvecklingen av grönt fluorescerande protein (GFP) 18 har möjliggjort visualisering av både tätort av specifika proteiner och den allmänna strukturen hos organeller i C. elegans. Här förklarar vi hur GFP uttryckt specifically inom kroppen väggen muskler mitokondrier, kan kärnor eller sarkomerer användas för att avgöra om dystrofi av dessa undercellulära strukturer är närvarande. Eftersom strukturen är inte alltid en tillförlitlig surrogat för funktion, förklarar vi också hur användningen av katjoniska färgämnen in vivo möjliggör bedömning av nedsatt mitokondriell membranpotential i muskeln. När färgämnen används i kombination med GFP, medger de att studera arkitektur och funktion på ett tidsmässigt sätt i hela livslängd. Slutligen förklarar vi också hur protein homeostas i muskeln kan bedömas och hur alla dessa åtgärder kan användas för att korrelera förändringar av hela djuret muskelhälsa genom användning av rörelseanalyser. Dessa tekniker, i kombination med gen knockdown, mutationer och / eller kemiska föreningar ger en kraftfull arsenal för att studera hur specifika gener eller föreningar påverkar muskelhälsa in vivo. De paralleller i strukturen, metabolism och brutto funktion av muskler mellan C. elegans ochdäggdjur menar C. elegans är en enastående modellorganism för att förstå regleringen av muskeln i högre organismer, inklusive människor.

Protocol

1. Stammar, kultur och mikroskopi

  1. Handtag och underhålla stammar av C. elegans som tidigare beskrivits 19. Stammar är tillgängliga från Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    OBS: De stammar som användes i dessa experiment var CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; honom-8 (e1489 IV)) med GFP-fusionsproteiner lokaliserade till mitokondrier och kärnor; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)), UNC-54 :: lacZ V) med GFP-fusionsproteiner lokaliserade till den kontraktila apparaten och PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) med β-galaktosidas fusionsproteiner lokaliserade till cytosolen.
  2. Kompletta RNAi-experiment som tidigare beskrivits för flera generationer RNAi-experiment 13 och erhålla RNAi bakterier från sekvensen verifieras ORF-RNAi-bibliotek konstruerat av Marc Vidal et al., 12.
  3. Konstruera stammar innehållande <em> CCIS 4251, jls01 eller CCIS 55 användning av standardtekniker 20. Använd dessa transgener för att skapa en stam för att bedöma mitokondrie nätverksstruktur, myosin organisation eller staten Proteostas, respektive. Korsa stammarna till en mutant där tittar på ett av dessa under cellulära fack i varje djur önskas.
  4. Använd Ptdlns-3-kinas-hämmare, LY-294002 (LY) som tidigare beskrivits 21. I korthet till LY-294002 vid en slutlig koncentration av 160 | iM ovanpå torra OP50 sådd NGM plattor.
  5. Fånga alla bilder med en GFP filter för GFP-baserade experiment och ett mikroskop med en trippel-passfilter som möjliggör avbildning av röda, gröna och blå kanaler samtidigt för att bedöma in vivo membranpotential med C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, vanligen marknadsförs som MitoTracker Red CMXRos. Genomföra bildanalys och figur beredning i bildbehandlingsprogram.

  1. Minst 1 dygn före behövs, gör M9 buffert - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mM NaCl (slutkoncentrationer), och sterilisera i autoklav. När väl kyld till 45 ° C, tillsätt steril MgSO 4-1 mM efter autoklavering för att förhindra utfällning 22. Tillåt M9 svalna vid 4 ° C och alikvot i 50 ml rör.
  2. På dagen för experimentet, tillsätt 3 ml M9 buffert till en enda 9 cm platta med ett stort antal L1 larver. Tvätta plattan flera gånger genom att aspirera M9 vätska och pipettering mot ytan av agar med plattan hålls i en vinkel.
  3. Tvätta L1: s från plattan och sedan överföra M9 till ett 10 ml provrör med användning av en pipett.
  4. Låt stå i 2,5 min för att låta den större vuxen och senare larvstadiet djur att falla till botten av provröret och de mindre L1 djuren kvar i närheten av Top i M9-buffert.
  5. Ta bort de översta 500 ul av M9 i provröret med användning av en pipett. Överför sedan M9 innehåller L1 larver till ett nytt NGM tallrik ympats med 500 l OP50 under dissekera omfattning.
  6. Vanligtvis syftar till att överföra ~ 200-300 L1 larver per platta. Övervaka plattorna dagligen från vuxen ålder och, om nödvändigt, plocka djur till färska OP50 NGM plattor för att förhindra OP50 matkälla förbrukas.
    OBS: Detta är vanligtvis 1-3 droppar M9 med en P1000 pipett, även om detta varierar i hög grad beroende på antalet L1: s på originalplattan.
  7. Om prospektiva studier i enskilda djur önskas, när djuren når vuxen ålder, plocka enskilda djur för att separera seedade NGM plattor. Överför djur varje 24-48 timmar att separera från larv djur.

3. Rörelse Analyser 19

  1. Ett minimum av 2 h före start experimenterande, ta bort en 50 ml alikvot av M9 och låt ekvilibrera till rumstemperaturratur.
  2. Välj en enda vuxet djur i 50 ^ M9 buffert på ett objektglas.
  3. Räkna antalet vänster och åt höger kropps böjar i 10 sek, där en åt vänster och en åt höger böj är lika med en stroke.
  4. Upprepa räkningen av kroppsslag för att ge en totalt minst fem mätningar som ett genomsnitt kan vidtas. Multiplicera dessa siffror med sex för att ge rörelsehastighet per minut.
  5. Med hjälp av en pipett djuret tillbaka till petriskål. Denna metod möjliggör tidsmässiga mätning av rörelse under hela livslängden i C. elegan s.

Figur 1
Figur 1: Rörelse-analyser. När maskar plockas in i bufferten, är en åt vänster (A) och en åt höger (B) böj läggs samman för att ge en komplett rörelse(Stroke).

4. Imaging av mitokondrie Networks och sarkomerer i Body Wall Muscle

  1. OBS: Samma protokoll gäller för avbildning av både mitokondrier och sarkomerer.
  2. Synkronisera maskar som tidigare beskrivits (avsnitt 1) ​​och växa under 48-60 timmar vid 20 ° C när de når vuxen ålder.
  3. Pick 20 maskar (representativa av plattan) från plattorna in i 20 | il M9 på ett objektglas.
  4. Applicera ett täckglas och fortsätt till bilden med ett fluorescerande mikroskop under en GFP filter (460-500 nm, blått ljus excitation) vid 40X förstoring.

5. Bedöma membranpotential med hjälp av en in vivo Ansamling analys med MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synkronisera CB5600 (avsnitt 1), alla märkta med GFP i mitokondrierna av muskler och växa till tidig vuxen ålder på NGM innehåller OP50 för 48-60 timmar vid 20 ° C.
  2. Addera 100 pl DMSO till 50 | j, g alikvot av C 32 H 32 Cl 2 N 2 O för att göra en förrådslösning av 940,692 pM.
  3. Ta 1 pl av 940,692 iM stamlösning och slamma i 199 pl M9 för att skapa en fungerande lösning av 4.70 ^ M (4,70346 mikrometer). Förbered detta i bruna 1,5 ml rör, eftersom C 32 H 32 Cl 2 N 2 O är ljuskänslig.
  4. Förbered 20 l alikvoter av 4.70 ^ M arbetslösning (20 vuxna maskar per 20 pl alikvot).
  5. Pick 20 vuxna djur i 20 pl 4,70 iM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O i den bruna 1,5 ml rör. Inkubera vid 20 ° C under 1 h.
  6. Efter 1 h inkubation, tillsätt 1 ml M9 till de bruna 1,5 ml rör innehållande maskar, centrifugera vid 2000 xg under 10 sekunder och avlägsna supernatanten. Upprepa detta tvättsteg innan det blandas masken pelleten och överföra de återstående 20 μl (innehållande maskar) och en bild för avbildning.
  7. Ta bilder av mitokondrierna med 40X förstoring med hjälp av en trippelpassfilter som möjliggör visualisering av både de röda, blå och gröna kanaler samtidigt. Avbildning med trippel-pass filtret visar co-lokalisering av C 32 H 32 Cl 2 N 2 O med GFP lokaliserad till mitokondrier som visas som orange.
  8. Efter att ha tagit en bild av den orange mitokondrier, foto bleka djuret under 10 sekunder med hjälp av ljus med våglängden 540/25 nm på maxinställningar med alla filter borttagna. Detta kommer att bleka röda inuti mitokondrierna och avslöja den mitokondriella GFP ensam att bekräfta colocalization i muskel mitokondrier.

6. Bedömning av Muscle Protein Nedbrytning i C. elegans

  1. Synkronisera PD55s (eller någon stam innehållande lacZ transgen) på att NGM plattor ympats med OP50 (§ 1). Väx till unga vuxna i 48-60 timmar vid 20 ° C.
  2. Pick 20 vuxna maskar i 20 ^ DDH 2 O på ett objektglas. Var noga med att försöka plocka bara masken och inte några bakterier med hackan. Märk objektglas med blyerts.
  3. Placera i torkapparaten för 30 min för att torka och spricka ytterhud av djuren. Säkerställa en tät förslutning på torkapparaten med fett runt tätningen.
  4. Kontrollera uttorkning har varit effektiv under en dissekera omfattning (figur 2).
  5. Dränka objektglas i iskall aceton under 3,5 min, sedan lämnar objektglas på pappershandduk vid rumstemperatur under 15 min för att medge att aceton på objektglaset för att avdunsta. Vid denna punkt tina X-gal och oxidation buffert och låt jämvikta till rumstemperatur.
  6. Lägg 2 jil X-gal till 100 | il oxidation buffert och vortexa försiktigt för att säkerställa detta är homogen. Det här är X-gal / oxidation buffert Master Mix.
  7. Tillsätt 20 ìl av X-gal / oxidation buffert Master Mix till varje original område av 20 maskar. Kontrollera under ett dissekera omfattning för att säkerställa mastermixen helt täcker alla djur helt. Luta försiktigt på objektglas för att flytta Master Mix över områden där djuren inte omfattas.
  8. Placera objektglas i en fuktighetskammare under 1-2,5 h vid 20 ° C. Bild djur när en mörkblå färg är närvarande i kroppen väggen muskler kontrolldjur. Bedöma kontrolldjur under ett dissekera omfattning var 15 min för att bestämma när djur ska avbildas.

Figur 2
Figur 2: Bedömning av muskelproteinnedbrytning med användning av β-galaktosidas-analyser. (A) Djur som innehåller en lacZ transgen plockas från petriskålar till 20 l DDH 2 O på en mikroskopi slide (B). Djur är uttorkad och blir splittrade (D). När aceton avdunstar X-gal / oxidation bufferthuvudblandning tillsätts (E). Utveckling av blå färg i kontrolldjur bedöms vid 15 min intervall (FL) från t = 0 min (F) tills en mörkblå färg erhålls över längden av djuren (L). Bilder av maskar tas på 2,5X förstoring i AE och 8X i FL. Zoomar in C, D, F, G och L är 4X den ursprunglig förstoring.

Representative Results

Rörelse Analyser för att kvantifiera Rörelse Defekter

Rörelse nedgång är en bra prediktor för dödlighet i C. elegans 16, med minskade priser som indikerar problem med neuromuskulära systemet. Förändringar i rörelse, enligt bedömning av rörelseanalyser, kan vara resultatet av RNAi mot en specifik gen eller läkemedelsbehandling (fig 3-5) eller muterade djur 13, 23. En nedgång i rörelse kan bero på förändrad utveckling bland annat följande utvecklings knock ned av elektrontransport gener som kodar för komplex I, III, IV eller V 24. Dessutom kan specifika interventioner endast provas med vuxna C. elegans för att undersöka effekten på post-utvecklings fysiologi. Till exempel, behandlas djuren med RNAi mot UNC-112, som kodar för C. elegans ortologen av Kindlin-1, som är lokaliserad till integrin innehållandemuskel fästkomplex (fig 3 och 4) eller gas-1, som kodar för en del av komplex I elektrontransportkedjan (Figur 4), visar en gradvis minskning av rörelse mot kontroll 48-72 timmar efter vuxen ålder. Detta kan vara ett tecken på problem med muskelfysiologi. Likaså en förlust av rörelse från 24 - är 72 timmar observeras som svar på behandling av normalt utvecklade vuxna med behandling med PI3K hämmaren LY-294002 (Figur 5). Det är också möjligt att testa effekten av en andra RNAi behandling, mutation, eller ett läkemedel för att återställa rörelse i djur som uppvisar minskad rörelse som svar på en inledande ingripande. Exempelvis unc- 112 mutanter visar en kvantifierbar minskning av rörelse jämfört med vildtyp djur som dämpas i närvaro av en andra mutation i dim-1 13. Därför kan rörelseanalyser identifiera både insatser som förändrar neuromuscular utveckling och / eller funktion samt de som förbättrar och / eller återställa neuromuskulär funktion.

Bedömning av sarkomeren Störningar

Efter att ha identifierat en rörelse defekt, är det ofta önskvärt att bestämma om orsaken till den rörelse defekten kan förklaras av problem inom nerver, muskler, eller båda. Sarkomerer är de multiproteinkomplex i muskeln som möjliggör kontraktion och därmed tvinga generering och rörelse. Genom användning av djur som uttrycker myosin GFP fusionsproteiner lokaliserade till den kontraktila apparaten, kan observeras omfattningen av störningar i myosin filament och sarkomerer relativt icke-invasivt och prospektivt i enskilda djur genom utveckling och / eller i vuxen ålder. Vildtyp djur visar klädd sarkomerer som visas som flera gröna parallella raka linjer inom varje kroppsvägg muskeln (Figur 3). Störningar till dessa normala matriser kan vara relativt liten medklädd sarkomerer som visas för att slå ihop istället för att vara parallellt. Denna fenotyp, synlig med UNC-112 RNAi vid t = 24 h eller 48 h (Figur 3), är jämförbar med Z-line streaming av aktin bindningsställen i däggdjurs muskler. På liknande sätt kan små delar av uppsättningarna kollapsa eller de kan försvinna helt såsom behandling med UNC-112 RNAi vid t = 48 tim eller t = 72 h (fig 3). Förekomsten av sarcomere defekter i muskeln av djur som uppvisar en rörelsedefekt (Figur 3) är tillräcklig för att förklara rörelsen felet men inte nödvändigtvis utesluta andra problem med muskler, nerver, och / eller andra vävnader som svar på en intervention .

Bedömning av mitokondrie Nätverksstruktur

I närvaro av en rörelse fel är det ibland önskvärt att undersöka muskeln Övriga fel som kan orsaka eller bidra till rörelsen defect. Mitokondrier tillför merparten av cellulära energi och nedgångar i rörelse kan vara en följd av minskad ATP bestämmelse, vilket minskar den energi som finns tillgänglig för muskelkontraktion. Kan undersökas Således struktur mitokondrierna vara för avvikelser. Det är viktigt att inte söva djuren med natriumazid som den leder till en snabb mitokondrie fragmentering; djur i dessa experiment immobiliserades genom det tryck som appliceras genom täckglaset. Inom vildtyp C. elegans kroppen väggen muskler, finns mitokondrier som finns i organiserade nätverk (Figur 4) och mitokondrier finns och fungerar som en nätmagen 25. Störningar av nätverket av mitokondrier presenterar som fragmentering av nätet (gas-1 RNAi, figur 4B) 26. Fragmentering kan bli allvarlig nog att ingen tillstymmelse till organiserade nätverk förblir såsom behandling med UNC-112 RNAi (figur 4B och C) 13. Som with störningar i sarcomere strukturen, kan defekter i muskel mitokondriell struktur hos djur som visar en rörelse defekt vara tillräcklig för att redogöra för rörelsedefekt, men det behöver inte utesluta andra problem med muskler, nerver och / eller andra vävnader. Till exempel, UNC-112 mutanter 13 och behandling med unc-112 RNAi (figur 3 och 4) display både avbrutna sarkomerer och störde mitokondriell struktur.

Bedömning av mitokondriell funktion in vivo

Den mitokondriella membranpotentialen avgör kapacitet mitokondrier att skapa proton drivkraft och genererar ATP 27, alltså förmågan att bedöma mitokondriell membranpotential in vivo indikerar kapaciteten av detta djur för att producera ATP. Som mitokondriella strukturella störningar kan eller inte kan förändra mitokondriella funktionsförmåga, kan det vara desibart att bedöma mitokondriefunktion i djur som uppvisar förändrad mitokondriestruktur. C 32 H 32 Cl 2 N2O ackumuleras i mitokondrier, i alla celltyper, där en membranpotential är närvarande och fläckar mitokondrier 28 (Figur 4C). För att särskilt bedöma mitokondriell funktion i muskeln, kan man använda C 32 H 32 Cl 2 N 2 O och GFP märkt muskel mitokondrier för att visa effekterna av en intervention speciellt vid muskel mitokondrier (Figur 4C). Till exempel, förlusten av mitokondriell membranpotential efter behandling med UNC-112 RNAi förhindrar C 32 H 32 Cl 2 N 2 O från att komma in i matrisen. Mitokondrierna visar därför lite, om någon röd färgning av mitokondrier förutom GFP-märkning av mitokondrierna (Figur 4C). Fotoblekning kan också användas för att bekräfta att den observerademitokondrierna är särskilt de i muskeln (Figur 4C). Identifiering av en minskad förmåga att producera ATP är tillräcklig för att svara för ett observerat rörelse fel, men utesluter inte andra problem inom muskel, nerv, och / eller andra vävnader. Oavsett, eftersom minskad ATP produktionskapacitet är associerad med sjukdomstillstånd hos människor 29 och åldrande 30, ger identifiering av ett sådant fel som svar på en intervention en plattform för screening för föreningar och / eller RNAi behandlingar som förbättrar ATP produktionskapacitet och dessa kan sedan undersökas ytterligare för terapeutisk potential.

Bedömning av proteinnedbrytning

I närvaro av en rörelse fel och normala sarkomerer och mitokondrier är det ibland önskvärt att undersöka muskeln Övriga fel som kan orsaka eller bidra till rörelsen defekten. Förmågan att upprätthålla protein homeostas är en underskrift av normal hälsa, medan en minskning av proteinsyntes och / eller en ökning av proteinnedbrytning är en konsekvens av åldrande 31 och multipla sjukdomstillstånd 32,33. Därför kan det vara önskvärt att undersöka musklerna av djur med en rörelsedefekt för förändrad protein homeostas. Detta kan åstadkommas via utvärdering av nivåer av cytosoliska muskelproteiner. Användningen av transgent kodade proteiner möjliggör utvärdering av muskelspecifika Proteostas. Till exempel användning av djur som innehåller β-galaktosidas, fuserad till en N-terminala delen av myosin, är som syntetiseras under kontroll av en myosin promotor och förstärkare tillåter bedömning av cytosoliskt muskelproteinhalt 19. Närvaron av blånad i vildtyp vuxna visar närvaron av aktiva β-galaktosidas och frånvaron av patologisk cytosoliskt proteinnedbrytning. En förlust av färgning som svar på behandling tyder patologisk proteinnedbrytning sker (Figur 5 13,14,19. Exempelvis obehandlade vildtyp djur visar en intensiv blå fläck 72 h efter vuxen ålder, medan LY-249.002 behandlade djur uppvisar en brist på fläck (Figur 5). Som med defekter i sarcomere struktur och mitokondriefunktion, är närvaron av patologiska muskelproteinnedbrytning är tillräcklig för att redogöra för en observerad rörelse defekten men inte nödvändigtvis utesluta andra problem med muskel, nerv, och / eller andra vävnader.

Figur 3
Figur 3: (A) unc-112 RNAi orsakar en betydande rörelse defekt vid t = 72 h (B) Bedömning av grupperade A-bandstruktur inom kroppen väggen muskeln.. I wt, A-band i muskeln visas som raka linjer vid vuxenlivet (t = 0 timmar) och är i stort sett jämn förrän efter 72 timmar i vuxen ålder (se vikt zoom). UNC-112 RNAi orsakar sarkomerer förlora arkitektur i små områden av muskeln (t = 24 h), kollapsade och saknade sarkomerer (t = 48 h), aggregering (t = 72 timmar toppanelen och zoom) och förlust av linearitet sarkomerer (t = 72 timmar nedre panelen och zoom). Skala barer representerar 25 pm och zoomningar är 2,5X.

Figur 4
Figur 4: (A) unc-112 eller gas-1 RNAi orsakar en rörelse defekt (b) Bedömning av mitokondriell struktur inom kroppen väggen muskeln.. Mitokondrier i muskel visas som nätverks raka linjer vid ung vuxen ålder (vikt). Behandling av djur med UNC-112 RNAi leder mitochondrIAL fragmentering som tidigare observerats mellan 24 timmar och 72 timmar i vuxenlivet (zoomar och pil) 13. Likaså RNAi mot gas -1 medför fragmentering av mitokondriella nätverk som tidigare observerats 26. Dessa finns som små luckor i det mitokondriella nätverket vid t = 24 h och framsteg till omfattande oordning på 72 timmar (se zoom och pil). (C) Bedömning av mitokondriell membranpotential in vivo. Hos djur också innehåller GFP lokaliserade till mitokondrier, C 32 H 32 Cl 2 N2O ackumuleras i kroppen väggen muskler mitokondrier och visas orange i en trippel-passfilter från vuxenlivet (t = 0 timmar) tills 72 timmar efter vuxen ålder. Behandling med UNC-112 RNAi orsakar en progressiv förlust av membranpotential som visas vid 72 timmar, där de återstående mitokondrier visar mindre ansamling av C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs vikt. Fotoblekning för 10 SEc använder 540/25 nm ljus bleker det röda från MitoTracker och avslöjar GFP lokaliserad till muskel mitokondrier (+ Foto blekmedel). Skala barer representerar 25 pm och zoomar in är 2,5X.

Figur 5
Figur 5: (A) Behandling med LY-294002 djur inducerar en rörelse defekt (B) Bedömning av proteinnedbrytning med användning av en β-galaktosidas-analysen.. Ålder synkroniserad wt L1 larver odlas till unga vuxna vid 20 ° C (t = 0 timmar) innan de överförs till NGM ympats med OP50 (vikt kontroll) eller NGM ympats med LY-294002 (behandlings PI3K-hämmare) under 24 timmar vid 20 ° C . I A, är cirka 20-30 djur färgas för β-galaktosidasaktivitet (blå) vid t = 0 timmar och efter 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar.

Discussion

Dessa metoder gör det möjligt att utforska muskler från den macrophysiology rörligheten till att identifiera subcellulära defekter som är tillräckligt för att orsaka en rörelse defekt. När de kombineras dessa metoder tillåter detaljerad analys av muskler. Insikten fick möjliggör ytterligare tester av muskelinriktade hypoteser som rör allmän fysiologi, patofysiologi och åldrande.

Riktning Analyser

En rörelse fel indikerar en störning av normal neuromuskulär funktion. Detta kan vara specifika för nerver eller muskler eller det kan vara gemensamma mellan flera vävnader. De svåraste faserna i skapandet rörelseanalyser väljer maskar som är representativa för befolkningen och / eller behandling, och även se till att försöksledaren inte skadar djuret vid överföring till M9. Det är viktigt att ha en stor provstorlek för att erhålla en representativ och korrekt bedömning av rörelse. Vid analys av mycket pennaetrant effekter, till exempel som ofta ses i mutanter, en provstorlek av tio djur vardera utvärderas för rörelse tio gånger är tillräcklig för att finna statistiskt signifikanta skillnader jämfört med vildtypen. Men enkelheten rörelseanalyser och enkel odling C. elegans gör att hundratals maskar snabbt kan bedömas för att säkerställa kvantitativt robusta resultat. När analys av effekterna som visas föreligger i endast en del av en population är det viktigt att avgöra hur stor del av befolkningen förefaller att påverkas liksom svårighetsgraden av fel i de drabbade djuren. I sådana situationer ska bedömas för att ge de grundläggande uppgifter för andel av befolkningen som drabbats större antal djur. Ofta både läkemedel och RNAi-behandlingar kommer att producera svåra rörelsedefekter i en liten del av befolkningen. I vissa fall att öka dosen av behandling och eller den metod för leverans kommer att öka andelen av affsad djur och kör dos-responskurvor kan vara användbara för att bestämma den optimala koncentrationen av ett läkemedel eller RNAi. En andra begränsning av denna rörelse analys är att maskarna är manipulerade för att utvärdera rörelsen. Sålunda maskarna är båda stimuleras och utsattes för en viss grad av osmotisk påfrestning när de plockas in i vätskan. Graden av osmotisk stress kan begränsas med hjälp av M9 eller BU-buffert 19 i stället för vatten. En del av dessa begränsningar lindras genom att mäta vanliga rörelser på plattor med hjälp av kommersiellt tillgängliga spårningssystem 34 eller gratis plug ins för ImageJ 35. Mätning av rörelsehastigheten hos ett djur kan ge viktig information om den totala muskelhälsa, inklusive förändringar i funktion som kan mätas under hela livet och den icke-invasivt med denna metod är nyckeln för blivande livslånga studier av muskelfunktion.

Imaging av kontraktila Apparatus

<p class = "jove_content"> Snäckstam som används här för att bild kontraktila apparat struktur var PJ727 36 som uttrycker en myosin GFP-fusionsprotein som är lokaliserad till sarkomerer i kroppen väggen muskler. Användning av denna stam möjliggör visualisering av sarcomere struktur i levande djur. I likhet med rörelseanalys som beskrivits ovan, är en viktig fördel med att använda GFP märkta sarkomerer att bedöma sarcomere struktur att metoden är relativt icke-invasiv och kan därför användas för att prospektivt följa sarcomere struktur i enskilda djur under hela livet. Den största svårigheten med denna metod är att de maskar som är avbildade är fortfarande vid liv och därför flytta, vilket gör det svårt att få väl fokuserade bilder. Flera metoder kan användas för att reducera rörelse och gör avbildning enklare; dessa inkluderar anesthetizing eller förlamande maskar och immobilisering via tryck, sug, eller användning av en lösning med hög viskositet. Var och en av dessa metoder för immobiliztion har den nackdelen att den själv kan förändra neuromuskulär funktion. Därför är det viktigt att inkludera lämpliga obehandlade kontroller i analysen. Det kan också vara klokt att använda minst två oberoende metoder för immobilisering för att bekräfta resultaten inte beror på problem med immobilisering metoden, beroende på hur flitigt immobilisering valda metoden för den fråga som studeras. Här har vi använt enkla tryck från täckglas på masken att medföra försämrad rörlighet. Efter att ha placerat täck kommer vätskan under täck avdunsta och täckglas kommer följaktligen att börja producera mer press på de maskar, vanligtvis det tar 2-5 minuter att producera tillräckligt nedsatt rörlighet för att möjliggöra enkel avbildning.

Det är nödvändigt att övervaka maskarna noggrant efter att täck har införts som trycket kommer så småningom att öka tillräckligt för att orsaka maskarna att spricka från överdrivet tryck, vanligen 10-15 min efter samtidigverslip tillsats. Ytterligare buffert kan införas med hjälp av en pipettspets runt kanterna på täckglaset för att undvika krosskada till maskar. Nagellack kan användas för att täta kanterna på täckglas och förhindra avdunstning, även om detta förhindrar hämtning av djur från under täckglas, om så önskas. På liknande sätt kan användningen av silikonpärlor i lösning bidrar till att minska den mängd tryck täck platser på maskar.

Precis som med att bedöma om en rörelse fel, är det viktigt att beakta penetrans av effekten. Penetrans kan betraktas som hög, om 80 till 100% djur uppvisar en fenotyp på NGM tallrik, delvis om 21-79%, och låg om ≤20% av befolkningen displayen en inverka. För mycket penetrerings effekter, kan mindre provstorlekar användas för att ge betydande kvantitativa uppgifter om sarcomere defekter. I de fall där effekten har låg penetrans, urval av djur som visar en tydlig rörelse defekt i svar på läkemedelseller RNAi behandling kan vara användbara vid analys sarcomere defekter hos djur som drabbats hårdast av behandlingen. Emellertid är det inte nödvändigtvis så att omfattningen av behandlingseffekten på rörelse och subcellulära strukturen är densamma. Sålunda kan det vara önskvärt att undersöka omfattningen av defekter som föreligger i en stor population, t ex 100 djur. Detta möjliggör förståelsen av fördelningen av defekter genom en population. Det kan också vara önskvärt att undersöka omfattningen av fel i de värst drabbade djur och / eller undersöka sambandet mellan graden av sarcomere fel och omfattning rörelsedefekt. Potentiella problem åt sidan, är denna metod snabbare och enklare än andra metoder för beräkning sarcomere struktur. Denna snabbhet och enkelhet är dock föremål för en nyckel begränsning, sarkomerer innehåller GFP fusionsproteiner är inte helt normal 37 och därmed bedömningen av störda sarkomerer bör bekräftas med hjälp av ytterligare mer arbetsintensiva metoder.Dessa metoder inkluderar användning av polariserat ljus 38, phalloidin färgning 39, och indirekt immunofluorescens 40. Av dessa metoder är endast polariserat ljus relativt icke-invasiv; de andra metoderna kräver fixering och kan därför inte användas i prospektiva studier av enskilda djur, utan de kan bara användas för att bekräfta, korsa sektion och resultat från sådana studier.

Imaging av mitokondrie-nätverk

Masken stam som används för de mitokondriella imaging experiment var CB5600 7 som uttrycker en GFP-fusionsprotein lokaliseras till mitokondrierna och en GFP-β-galaktosidas fusionsprotein lokaliserat till kärnorna, både i kroppsväggen muskler. Som med användning av PJ727 för avbildning sarkomerer, användning av denna stam möjliggör visualisering av mitokondriell nätverksstruktur i levande djur. Sålunda kan denna stam användas för att bedöma dynamiska förändringar som sker, till exempel reducerad mitochondrial fusion och / eller ökad mitokondrie fission 41. Också som för avbildnings sarkomerer, är den största svårigheten med denna metod att maskarna som avbildas fortfarande lever och rör sig, vilket gör det svårt att få väl fokuserade bilder. Medan flera metoder, såsom diskuteras mer i detalj ovan, kan utnyttjas för att reducera rörelse, mitokondrier verkar särskilt känsliga för interventioner som inducerar nedsatt rörlighet. Till exempel, de flesta vanligen använda bedövningsmedel målkomponenter av den mitokondriella andningskedjan och är därför måste användas med försiktighet i studier av normal mitokondriell struktur och funktion. På samma sätt måste de flesta paralytisk medel användas med försiktighet till studier av normal mitokondrie struktur och funktion, eftersom de flesta paralytisk medel orsakar mindre signal att passera genom den neuromuskulära förbindelsen och funktionell denervation av muskeln är tillräcklig för att framkalla mitokondriella fragmentering. Experimenten i denna studie användes tryck för att immobilisera djurets men andra har framgångsrikt använt levamisol 42, även om det är viktigt att bilddjur omedelbart.

Slutligen olika bakteriella föroreningar i kulturer, till exempel B. subtilis, kan inducera mitokondriella fragmentering; Därför är det viktigt att inkludera lämpliga obehandlade kontroller i analysen. För mycket penetrerings effekter, kan mindre provstorlekar användas för att ge betydande kvantitativa uppgifter om mitokondriella nätverksdefekter. Men på grund av förekomsten av mindre fel i den mitokondriella nätet, kommer sannolikt att vara dubbelt så många som behövs för bedömning av sarcomere struktur detta lilla antal djur. I de fall där effekten har låg penetrans, kan valet av djur uppenbarligen uppvisar en rörelsedefekt som svar på läkemedel eller RNAi behandling vara användbar vid analys mitokondriella defekter hos djur som drabbats hårdast av behandlingen. Emellertid, såsom nämnts ovan, är det inte nödvändigtvis så att denomfattningen av behandlingseffekt på rörelse och subcellulär strukturen är densamma. Således kan det vara önskvärt att undersöka omfattningen av defekter som förekommer i en stor population, till exempel 150-200 djur, liksom omfattningen av störningar i de svårast drabbade djur och närvaron eller frånvaron av omfattningen av störningar med omfattningen av rörelse defekt. Andra stammar med fluorescerande mitokondrier kan användas för att bekräfta resultat som erhållits i CB5600 kan dock användningen av olika fluorescerande proteiner påverkar baslinjen nätverk av mitokondrier. Till exempel visas användningen av en TOMM-20 RFP fusionsprotein för att visualisera mitokondrierna att orsaka ökad baslinjen mitokondrie fragmentering kontra användningen av mitokondriellt lokaliserad GFP 17. Även andra metoder såsom immunofluorescens och elektronmikroskopi kan användas för att bedöma mitokondrie struktur, de inte tillåter en bedömning av mitokondriella dynamik in vivo eftersom en fixerings steg är att krävad. Andra metoder, såsom användning av mitokondriellt lokaliserade färgämnen kan användas utan fixering och därför kan också användas i stället för användning av mitokondriellt lokaliserad GFP. Som diskuteras i nästa avsnitt, användningen av sådana färgämnen gör också rå bedömning av in vivo mitokondriefunktion.

Bedöma mitokondriell membranpotential in vivo i C. elegans

En mängd olika färger finns tillgängliga för märkning av mitokondrier 28. Dessa färgämnen ger en alternativ metod för att visualisera mitokondriell nätverksstruktur i levande C. elegans. Många av dessa färgämnen tillåter också rå bedömning av mitokondriell funktion in vivo eftersom de ansamlas i mitokondrier baserade på den mitokondriella membranpotential. Här har vi använt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, som intas genommag-tarmkanalen, med några ytterligare in i masken via nagelbanden på grund av permeabilization ges genom att upplösas i 0,5% DMSO. Efter inträdet i cellen C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxideras och lagras i mitokondrierna, där den binder svavelinnehållande aminosyror (t.ex. metionin och cystein). Bildningen av dessa färgämnespeptidkomplex betyder C 32 H 32 Cl 2 N 2 O kvarstår i mitokondrierna gång märkta 28. En viktig svårighet med användningen av mitokondriella färgämnen är att de kommer att märka alla mitokondrier i djuret. Därför har vi utfört märkningen i CB5600, samma stam som beskrivits ovan för att bedöma muskel mitokondriell nätverksstruktur. Genom att använda en röd mitokondriell färgämne, en stam av maskar som uttrycker GFP i muskel mitokondrier, och en trippel passfilter, är det relativt enkelt att bilden bara mitokondrier i musklerna genom att hitta mitokondrier som är ointervall genom colocalization av rött färgämne och GFP märkta mitokondrier. Det svåraste steget i att utföra detta colocalization tillvägagångssätt är avbildning, eftersom färgämnet är fotoblekt inom några sekunder under hög intensitet fluorescerande ljus. Denna effekt kan begränsas genom att hålla den fluorescens på låg effekt tills försöksledaren är redo att bilden och sedan justering av fluorescensintensiteten i enlighet därmed. När man är erfaren med användning av färgämnen annan metod är att använda konfokalmikroskopi med Z-stackar till bild bara mitokondrier i rätt vävnad; de mitokondriella nätverk i muskeln är helt olika jämfört med andra vävnader. Tyvärr, oförmåga C 32 H 32 Cl 2 N 2 O för att lämna mitokondrierna 28 innebär att till skillnad från sarcomere och mitokondriell avbildningstekniker som diskuterats ovan, kan den inte användas för att prospektivt följa förlust av mitokondriefunktionen med tiden, om inte C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oläggs vid diskreta tidpunkter för att separera djurpopulationer. Denna begränsning kan övervinnas genom att använda färgämnen såsom JC-10 som gör lämnar mitokondrier vid kollaps av membranpotential 43. Mitokondrier kan också isoleras från C. elegans 30 för efterföljande biokemiska analyser. Sådan extraktion medger kvantifiering av mitokondriell membranpotential genom att kvantifiera graden av lipofila katjoniska färgupptagning med hjälp av flödescytometri eller en fluorescerande plattläsare 44. Efter att ha fastställt en nedsatt mitokondriell membranpotential, är det också möjligt att fastställa om förlusten av protongradient leder till en förlust av ATP-produktion med hjälp av en känslig bioluminometric luciferas baserad metod 45.

Bedöma proteinnedbrytning i C. elegans

Masken stam som används här för att bedöma muskelproteinnedbrytning var PD55, som innehåller en muskel specifikt βgalaktosidas som kontinuerligt syntetiseras under utveckling till vuxen ålder har uppnåtts, och som förblir stabila i cytosolen för nästa 72-96 tim 19. Således, mätning av β-galaktosidas nivåer under utveckling tyder främst effekterna av interventioner på syntes från myosin promotorn, medan förlusten av β-galaktosidas under vuxenlivet visar en intervention har utlöst ökat cytosoliskt proteinnedbrytning 19. Nyckelsteget vid bedömningen β-galaktosidas aktivitet är att säkerställa en effektiv uttorkning. Misslyckande med att effektivt uttorka djuren resulterar i dålig avsättning av X-gal-substratet och därför dålig blå färg i kroppsväggs musklerna i djuren. För att säkerställa god uttorkning bör kontrolleras förseglingen på torkapparaten och provet bör kontrolleras med 5-10 minuters intervall under hela uttorkning att utvärdera framstegen (dvs. provet 20 ^ borde ha torkat inom 10 min och resterande 20 minär att säkerställa omfattande uttorkning). Den β-galaktosidas-analysen är en aktivitetsanalys därför en lämplig kontroll är nödvändig. Dessutom minskade färgning av vuxna i en behandlingstillstånd i förhållande till kontroll bevisar inte att markförstöring pågår; snarare indikerar minskad enzymaktivitet som svar på behandling. För att bekräfta nedbrytning, måste mer arbetsintensiv western blot-analys vara klar mot β-galaktosidas 13 och detta tillåter kvantifiering proteinnedbrytning i små populationer av räknade maskar. Western blot bandtäthet kan kvantifieras med ImageJ 46. En annan begränsning med denna metod är att användningen av transgena proteiner inte informerar om fysiologiska mål nedbrytning och för sådana svar proteomik och / eller riktade hypotesdriven western blottar måste användas 13. Slutligen, eftersom syntesen av transgena proteiner som används i dessa studier stängs av i tidig vuxen ålder 19 C. elegans muskler; till exempel stabila och radioaktiva isotopmetoder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Utvecklingsbiologi fysiologi, Muskel mitokondrier sarkomerer åldrande
Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter