Abstract
为了研究人的急性肺损伤和肺炎，它开发的动物模型来模拟这种疾病的各种病理特征是重要的。在这里，我们已经开发出通过气管内注射的细菌绿脓杆菌 （ 铜绿假单胞菌或PA）的小鼠肺损伤模型。利用该模型，我们能够显示肺部炎症损伤的早期阶段。此外，肺泡上皮屏障泄漏观察到通过分析支气管肺泡灌洗液（BAL）;并且观察到通过使用从受伤的肺组织制备TUNEL测定肺泡细胞死亡。在受伤后的稍后阶段，我们观察到所需的修复过程的细胞增殖。伤病得到了解决，从体育的开始7天后铜绿假单胞菌注射液。这个模型模拟的肺部炎症，损伤和修复的连续过程中的肺炎。这与临床相关的动物模型是适用于研究病理，修复机制中，following急性肺损伤，并且还可以用来测试潜在的治疗剂，这种疾病。
Introduction
肺部暴露于环境中的病原体，并很容易受到炎症和损伤1-3。在病理条件下，如肺炎或成人呼吸窘迫综合征（ARDS），病原体以及由白细胞释放炎性细胞因子诱导损伤的肺泡细胞1-3和死亡。它发展为急性肺损伤的动物模型，以促进损伤的病理修复的研究以及机制是很重要的。
目前，大多数人使用高氧和博来霉素诱导的小鼠肺损伤模型4。然而，氧的机制引起的损伤是不一样的肺炎或急性呼吸窘迫综合征5过程中出现的最常见的肺损伤。博莱霉素诱导的急性损伤是罕见的在临床方面4。在这里，我们报告使用气管内注射P的小鼠肺损伤模型铜绿假单胞菌 6,7。这个模型是临床上相关的，并且模仿在p这种情况发生以下肺炎8 rocesses。
由于免疫功能低下的人的机会，院内病原体，P.假单胞菌通常感染肺部，尿路，烧伤，创伤，并且还引起其他血液感染6。细菌释放出毒力因子外毒素A，乘，引发免疫反应6。 P的内部trachael管理假单胞菌反映到引起肺炎的细菌的情况，人体暴露和病理学可能是从最近报道流感病毒H1N1引起的肺损伤模型9不同。由于P.铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，它是相对安全的处理相比，一些更致命的病原体。在这里，我们使用气管内注射给药的细菌，因为我们观察到，该方法引入更多的细菌进入肺的较远端肺泡区一些其他方法，例如通过口用的导管。
与其他急性肺损伤模型相比，P。这里描述绿脓杆菌模型适用于研究肺损伤的细菌和过度炎症反应。与使用P。等的动物模型铜绿假单胞菌诱发败血症10,11，这里我们使用气管内注入这些细菌诱发局部急性肺损伤。
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Protocol
在动物实验中批准了伊利诺伊大学芝加哥分校的动物护理委员会和机构生物安全委员会。
注意：口罩，保护眼睛，礼服或连身衣，和双层手套：所有涉及假单胞菌程序应与生物安全2级（BSL2）的做法，其中包括但不限于执行。在认证的生物安全柜的工作。与细菌漂白粉或二氧化氯基消毒剂接触治疗手段。用密封箱运输样品。
1. P.铜绿假单胞菌培养与成长
- 商店P.绿脓杆菌 PA103作为细菌的库存在螺旋盖冷冻管在-80℃下。
- 放置在一个架子的小瓶中，用70％乙醇润湿的纸巾的盒子，并采取生物安全等级2（BSL2）实验室。
- 条纹的细菌到绵羊血琼脂平板上并生长在37℃〜15小时，在培养箱中。 在一个BSL2罩，从刮片细菌环和悬浮的细菌，5毫升的PBS。
- 存储库存在4℃下进行长达3个月。然而，确定的效价，每2个星期。
- 串行（1:10 4，通常1:10 7）稀释细菌在PBS和板出来羊血琼脂平板上已知的稀释。
- 孵育板为〜15小时。菌落计数并计算菌落形成单位（CFU），以确定细菌浓度。
- 重悬在合适的浓度（〜5×10 3 CFU /微升）在0.5ml PBS中于1.5ml无菌螺旋盖离心管。密封冷冻管，并放置在消毒上载货纸巾在瞬间盖盒一离心管架。
- 运输箱，以BSL2动物设施。一旦出现，打开了BSL2柜箱。
2. P.铜绿假单胞菌灌输
- 进行生存无菌手术（无菌手套，无菌器械和无菌技术）。使用无菌的悬垂性，为无菌（蒸压）手术器械提供了工作面。使用消毒每气管滴入程序之间的热珠灭菌仪器。
- 前麻醉小鼠的体重。麻醉小鼠用氯胺酮（100毫克/千克），甲苯噻嗪（5毫克/千克），在0.1 - 0.2毫升的PBS腹膜内（IP）的 。非响应性脚趾捏确定麻醉剂的效力。使用对眼睛的兽医药膏，以防止在麻醉下干燥。
- 抑制小鼠在BSL2柜外科板。
- 识别切割下来的区域。剃此区域，并准备利用交替醇和聚维酮碘拭子3倍的皮肤。
- 治疗与局部麻醉剂（利多卡因），为这个麻醉足以进行小手术如皮肤切口进入气管切口的区域。
- 作一个小切口（约5mm），在颈部的中线，并用钝˚Forceps轻轻移动肌肉访问气管。暴露气管通过手术剥离。
- 吸取菌液到1毫升一次性注射器用27G的针头。对于每个小鼠，给药20-30微升的细菌在适当的浓度（高达10 5 CFU每只小鼠）。
- 将针头插入气管。慢慢注入溶液到气管。
- 确保动物喘气，这通常表示该解决方案已经达到了进入肺部。
- 关闭无菌条件下无菌缝合线（6-0单丝）的伤口。
- 用0.1毫克/千克丁丙诺啡皮下注射作为术后镇痛控制手术后疼痛。
- 确保从初始麻醉诱导至切口闭合所需的时间小于15分钟。
- 注射后，在适当的生物危害的尖锐物容器处置注射器和针头。
- 治疗与二氧化氯基消毒药剂的外科手术器械nfectant 15分钟，冲洗，并返回到实验室进行灭菌，并根据需要重新使用。
- 房子小鼠单独在清洁笼子里的温暖的环境。
- 检查动物每隔30分钟，直到它恢复意识，并开始移动;后来，在12小时的时间间隔为第3天手术后。
- 保持在整个实验动物BSL2设施的小鼠。确保只有包含在密封的盒子组织离开动物BSL2设施。如果小鼠表达任何垂死的行为（定义为呼吸困难，嗜睡，故障响应温柔的刺 激走动），在该研究中的任何一点，从颈椎脱位瓶装源安乐死的小鼠通过CO 2吸入。
- 安乐死放血在麻醉状态下的实验对象。
- 从安乐死的小鼠收集肺组织。进行在一个BSL2引擎盖这些过程。如果需要，可以使用密封管放入外消旋转移样品钾对载货消毒纸巾在进一步处理易如反掌盖盒。
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Representative Results
72小时后P. -从24日开始假单胞菌注射，增加的细胞结构中观察到的肺切片（ 图1A-D）。肺开始从96小时后的损伤（ 图1E）中恢复。 7天后P.铜绿假单胞菌 ，正常肺泡形态基本恢复（ 图1F）。隧道染色用肺切片在24小时后的第制备假单胞菌表明细胞死亡中的肺泡细胞（ 图1G-1）。为了研究这种损伤模型中的修复过程中，尿嘧啶在后3天P.注入小鼠铜绿假单胞菌 。肺中分离，以5小时后的BrdU的喷射中，处理的BrdU抗体染色。 如图1J和K，显著在72小时后的第增大掺入BrdU的细胞数铜绿假单胞菌管理指示增生。
研究在每屏障的变化渗透性和炎症损伤后，支气管肺泡灌洗（BAL）液收集在不同的时间点发布P.铜绿假单胞菌注射液。 BAL中的蛋白质浓度在48小时后的第被显著增加假单胞菌注射（ 图2A），表明上皮屏障泄漏。 BAL中的细胞数量也处于48小时后P.显著增加假单胞菌注射（ 图2B），这表明炎性反应。在4 - 5天交P.假单胞菌注射液，二者的BAL蛋白水平和细胞数开始减少表明恢复（ 图2A，B）。此外，肺裂解物收集在不同的点发帖P.假单胞菌给药和巨噬细胞炎性蛋白2（MIP2）的水平，参与嗜中性粒细胞吸引12的细胞因子，通过ELISA测定。一贯以BAL分析结果，MIP2水平显著increa sed的48小时后P.铜绿假单胞菌注射液恢复到基础水平，在96小时后P.假单胞菌注射（ 图2C）。此外，从BAL细胞固定在载玻片上，并进行血液学染色。无P.铜绿假单胞菌，只有少数支气管肺泡灌洗液（ 图2D）单核细胞。与此相反，大量中性粒细胞存在于BAL孤立于48小时后P.铜绿假单胞菌注射液（ 图2E）。 96小时后P.铜绿假单胞菌注射液，BAL的细胞成分恢复到正常水平（ 图2F）。总之，结果在图2中表示的急性嗜中性粒细胞的炎症反应一起增加肺泡屏障渗透性和增加的细胞因子的浓度，这是急性肺损伤13的所有特点。在所有实验中，注射生理盐水作为对照。
ve_content“>中的数据，其中包括H和E染色，BrdU标记，TUNEL法，BAL分析和MIP2液位测量的一部分，此前公布的7人在这篇文章中，我们研究FOXM1，一个转录因子的作用，在修用在这里7所描述的铜绿假单胞菌肺部损伤模型肺泡损伤。
图1.组织学，细胞死亡和增殖在第铜绿假单胞菌介导的小鼠肺损伤模型。 （AF）肺隔离，切片和H / E染色用非执行P.铜绿假单胞菌注射 （非-PA）24小时（B），48小时（C），72小时（D），96小时（E），7天（F）后P.控制肺部（A），以及肺在铜绿假单胞菌jection（后PA）。（GI）的肺切片从控制肺（G）和24小时后的第制备铜绿假单胞菌注射肺（H，I），并继续进行TUNEL法检测细胞死亡。肺切片进行肺上皮细胞标志物SP-C（蓝），T1α（红色）来显示的形态，也染色TUNEL染色（绿色）。在（H）的箭头表示的TUNEL阳性细胞。（J，K）的BrdU在非P.注入假单胞菌注射的小鼠（J）和72小时后的第铜绿假单胞菌注射的小鼠（K）通过IP，肺准备在5小时后的BrdU注射并处理对尿嘧啶（绿染色）抗体染色。比例尺=60μm的用于自动对焦 ，50微米为G和H，20微米为I和100微米为J和 K。这个数字已经被修改柳
图2.肺泡屏障通透性和炎症P.以下绿脓杆菌引起的肺损伤。 （A，B）BAL从控制和收集P.铜绿假单胞菌治疗肺部。在BAL（A）蛋白质浓度的增加，在48小时后P.假单胞菌注射和下降，在96小时，后5天第 BAL中的铜绿假单胞菌注射液。（B）总细胞数量增加在48小时后P.假单胞菌注射（B）和重新调整的控制水平在96小时后的第假单胞菌注射。（C）的 MIP-2水平测定我们荷兰国际集团肺裂解液中分离，从控制老鼠和老鼠在48小时和96小时后的P.铜绿假单胞菌注射液。数据被表示为平均值±SE，正≥3（DF）从BAL细胞离心并固定在载玻片上，并进行HEMA3染色。在对照组小鼠的BAL（D）少数单核细胞人出席。大量中性粒细胞存在于BAL孤立于48小时后P.铜绿假单胞菌注射液（E）。 96小时后P.铜绿假单胞菌注射液，有少数在BAL（F），单核细胞。比例尺=10μm时，这些结果代表至少5次独立实验的。这个数字已经被修改Liu 等人 7。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
我们在这里描述的假小鼠肺损伤模型模拟炎症，肺损伤，修复和解决发生的急性肺损伤或肺炎的全过程。它具有与其他几个损伤模型中，这是临床相关的和相对安全的和易于处理的比较独特的优势。
在该过程的关键步骤是，在注射细菌溶液必须是很慢的。如果注射过快，老鼠有可能被噎到死。一个成功的注射后，老鼠通常会显示几个深呼吸和喘息，这将有助于微粒进入肺部的细菌。
我们所用的菌株是PA103 6。之一的该模型的关键点是，P的滴度假单胞菌需要进行严格控制。 P的批铜绿假单胞菌来自不同来源可能表现出不同程度的炎症和损伤，即使使用在相同的CFU。因此，建议在每一批新的细菌其致病作用（如炎症，细胞增殖等 ）进行测试，并相应地调整所使用的CFU数量。如果结果不一致时通过使用冷藏细菌的库存，可以使用通过培养细菌获得的新鲜库存从新鲜平板的每个实验。此外，细菌和选择的媒体的生长阶段也可具有对宿主反应的效果产生影响。因此，应小心以确保在细菌生长周期的同一相位发生细菌的接种。
有可能是在响应第一个差铜绿假单胞菌通过小鼠不同品系。我们所用的菌株是C57BL / 6和FVB / N的混合物。适当的P.假单胞菌滴度应为小鼠品系不同来确定。
一个因素来考虑这个模型这种细菌的损坏并不限于一种细胞类型。例如，上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞都可能被损坏。因此，该模型不适合用于研究细胞类型特异性肺损伤的影响。这种细菌会导致肺细胞死亡，刺激炎症反应，以及通过分泌毒素进入组织6。活的细菌通常是从在48小时后伤7,14肺清除。高浓度的死菌也可通过诱导炎症反应的15造成损害。
肺损伤和修复的机制可能是响应于不同类型的肺损伤的不同。因此，为了比较几种损伤模型是重要的。该P.这里描述绿脓杆菌模式是一个很好的补充了其他车型。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
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