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Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa प्रेरित फेफड़ों की चोट मॉडल

doi: 10.3791/52044 Published: October 29, 2014

Abstract

मानव गंभीर फेफड़ों की चोट और निमोनिया का अध्ययन करने के क्रम में, यह इस रोग के विभिन्न रोग विशेषताओं की नकल करने के लिए पशु मॉडल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम बैक्टीरिया Pseudomonas aeruginosa (पी aeruginosa या पीए) की अंतर-सांस की नली इंजेक्शन द्वारा एक माउस फेफड़ों की चोट मॉडल विकसित किया है. इस मॉडल का उपयोग करना, हम चोट के प्रारंभिक चरण में फेफड़ों की सूजन दिखाने में सक्षम थे. इसके अलावा, वायुकोशीय उपकला बाधा leakiness ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) का विश्लेषण करके मनाया गया; और वायुकोशीय कोशिका मृत्यु घायल फेफड़ों से तैयार ऊतक का उपयोग TUNEL परख से मनाया गया. चोट के बाद एक बाद के चरण में, हम सुधार प्रक्रिया के लिए आवश्यक सेल प्रसार मनाया. चोट 7 दिनों पी की दीक्षा से हल किया गया था aeruginosa इंजेक्शन. इस मॉडल को निमोनिया के दौरान फेफड़ों में सूजन, चोट और मरम्मत की अनुक्रमिक पाठ्यक्रम mimics. इस नैदानिक ​​प्रासंगिक पशु मॉडल च, मरम्मत के तंत्र विकृति के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैभी गंभीर फेफड़ों की चोट ollowing, और इस रोग के लिए संभावित चिकित्सीय एजेंटों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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फेफड़े पर्यावरण रोगज़नक़ों से अवगत कराया और सूजन और चोट 1-3 करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. ऐसे निमोनिया या वयस्क श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) के रूप में रोग की स्थिति के दौरान, ल्यूकोसाइट्स द्वारा जारी रोगजनकों के साथ ही भड़काऊ कारकों वायुकोशीय कोशिकाओं 1-3 की चोट और मौत प्रेरित. इसे मरम्मत की चोट की विकृति विज्ञान के अध्ययन के साथ ही तंत्र की सुविधा के लिए गंभीर फेफड़ों की चोट के पशु मॉडल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

वर्तमान में, ज्यादातर लोगों hyperoxia और bleomycin प्रेरित माउस फेफड़ों की चोट मॉडल 4 का उपयोग करें. हालांकि, hyperoxia के तंत्र चोट निमोनिया या ARDS 5 दौरान होती है कि सबसे आम फेफड़ों चोटों के रूप में ही नहीं कर रहे हैं के कारण होता है. Bleomycin प्रेरित गंभीर चोट एक नैदानिक ​​संदर्भ 4 में दुर्लभ है. यहाँ हम पी के इंट्रा-सांस की नली इंजेक्शन का उपयोग कर एक माउस फेफड़ों की चोट मॉडल की रिपोर्ट aeruginosa 6,7. इस मॉडल नैदानिक ​​प्रासंगिक है, और mimics पीनिमोनिया 8 निम्नलिखित हुआ कि rocesses.

प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों के एक अवसरवादी, nosocomial रोगाणु, पी के रूप में aeruginosa आम तौर पर फेफड़े पथ, मूत्र मार्ग, जल, घावों को संक्रमित करता है, और भी अन्य रक्त संक्रमण 6 का कारण बनता है. बैक्टीरिया, डाह कारक exotoxin एक रिलीज गुणा और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6 ट्रिगर. पी के आंतर trachael प्रशासन aeruginosa निमोनिया के कारण जो बैक्टीरिया के लिए मानव जोखिम में स्थिति को दर्शाता है और विकृति हाल ही में सूचना दी इन्फ्लूएंजा वायरस H1N1 के प्रेरित फेफड़ों की चोट मॉडल 9 से अलग होने की संभावना है. पी के बाद aeruginosa यह अधिक उग्र रोगज़नक़ों से कुछ की तुलना में संभाल करने के लिए अपेक्षाकृत सुरक्षित है, एक अवसरवादी रोगज़नक़ है. हम मनाया क्योंकि यहाँ हम इस विधि के साथ तुलना में फेफड़ों के बाहर का वायुकोष्ठिका क्षेत्र में अधिक बैक्टीरिया शुरू की कि बैक्टीरिया प्रशासन के लिए अंतर-सांस की नली इंजेक्शन का इस्तेमाल कियाऐसे मुंह के जरिए एक कैथेटर का उपयोग कर के रूप में कुछ अन्य प्रक्रियाओं.

अन्य गंभीर फेफड़ों की चोट के मॉडल के साथ तुलना में, पी यहाँ वर्णित aeruginosa मॉडल बैक्टीरिया से और अत्यधिक सूजन से प्रेरित फेफड़ों की चोट के अध्ययन के लिए उपयुक्त है. पी का उपयोग करने वाले अन्य पशु मॉडल के विपरीत aeruginosa यहाँ हम स्थानीय तीव्र फेफड़ों की चोट प्रेरित करने के लिए इन जीवाणुओं का इंट्रा-सांस की नली इंजेक्शन का उपयोग, पूति 10,11 प्रेरित करने के लिए.

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Protocol

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पशु प्रयोगों शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति और संस्थागत जैव सुरक्षा समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया.

नोट: मुखौटा, आंख की सुरक्षा, गाउन या jumpsuit, और डबल दस्ताने: स्यूडोमोनास शामिल सभी प्रक्रियाओं में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, जो जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) प्रथाओं, के साथ किया जाना चाहिए. प्रमाणित जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं. ब्लीच या क्लोरीन डाइऑक्साइड आधारित कीटाणुनाशक साथ बैक्टीरिया के संपर्क में उपकरणों समझो. परिवहन के नमूने के लिए एक मोहरबंद बॉक्स का उपयोग करें.

1. पी aeruginosa संस्कृति और विकास

  1. स्टोर पी -80 डिग्री सेल्सियस पर cryovial एक पेंच टोपी में एक जीवाणु स्टॉक के रूप में aeruginosa PA103.
  2. 70% इथेनॉल गीला कागज तौलिये के साथ एक बॉक्स में एक रैक में शीशी प्लेस और जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) प्रयोगशाला के लिए ले.
  3. स्ट्रीक भेड़ रक्त अगर प्लेटों पर बैक्टीरिया और एक मशीन में 15 घंटा ~ के लिए 37 डिग्री सेल्सियस हो जाना. एक BSL2 हुड में, 5 मिलीलीटर पीबीएस में बैक्टीरिया पाश और resuspend के साथ थाली से बैक्टीरिया खरोंच.
  4. अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान. हालांकि, अनुमापांक हर 2 सप्ताह का निर्धारण.
  5. क्रमानुसार (1:10 से 7 01:10 4 से आमतौर पर) पीबीएस में बैक्टीरिया पतला और भेड़ रक्त अगर प्लेटों पर जाना जाता कमजोर पड़ने बाहर थाली.
  6. ~ 15 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं. कालोनियों गणना और बैक्टीरिया एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए कॉलोनी बनाने यूनिट (CFU) की गणना.
  7. उपयुक्त सांद्रता Resuspend (~ 5 एक्स 10 3 CFU / μl) 1.5 मिलीलीटर बाँझ पेंच टोपी cryovials में 0.5 मिलीलीटर पीबीएस में. Cryovials सील और एक तस्वीर ढक्कन बॉक्स में कीटाणुनाशक लादेन कागज तौलिए पर एक cryovial रैक में उन्हें जगह है.
  8. BSL2 जानवरों की सुविधा के लिए बॉक्स परिवहन. एक बार वहाँ, BSL2 कैबिनेट में बॉक्स खुला.

2. पी aeruginosa टपकाना

  1. अस्तित्व सर्जरी aseptically (बाँझ दस्ताने, बाँझ उपकरणों प्रदर्शन, और सड़न रोकनेवाला तकनीक). बाँझ (autoclaved) शल्य चिकित्सा उपकरणों के लिए एक काम की सतह प्रदान करने के लिए एक बाँझ कपड़ा का प्रयोग करें. प्रत्येक सांस की नली टपकाना प्रक्रिया के बीच एक गर्म मनका अजीवाणु का उपयोग उपकरणों जीवाणुरहित.
  2. Anesthetization से पहले चूहों वजन. , Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों anesthetize 0.1 में - 0.2 मिलीलीटर पीबीएस intraperitoneally (आईपी). पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए गैर-जवाबदेही से संवेदनाहारी के प्रभाव को निर्धारित करते हैं. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर एक पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें.
  3. BSL2 कैबिनेट में एक शल्य चिकित्सा बोर्ड पर चूहों को नियंत्रित.
  4. कटौती नीचे के लिए क्षेत्र की पहचान करें. इस क्षेत्र दाढ़ी और 3 बार शराब और povidone आयोडीन swabs बारी का उपयोग त्वचा तैयार करते हैं.
  5. इस संज्ञाहरण ऐसे श्वासनली तक पहुँचने के लिए एक त्वचा चीरा के रूप में एक मामूली सर्जरी के लिए पर्याप्त है के रूप में स्थानीय संवेदनाहारी (lidocaine) के साथ चीरा क्षेत्र समझो.
  6. गर्दन के midline में एक छोटा सा चीरा (लगभग 5 मिमी) बनाओ, और कुंद च उपयोगorceps धीरे ट्रेकिआ के लिए उपयोग के लिए मांसपेशियों को स्थानांतरित करने के लिए. शल्य विच्छेदन से ट्रेकिआ बेनकाब.
  7. 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज में बैक्टीरिया समाधान ड्रा. प्रत्येक माउस के लिए, उचित एकाग्रता में (10 5 CFU प्रत्येक माउस तक) बैक्टीरिया का 20-30 μl प्रशासन.
  8. श्वासनली में सुई डालें. सांस की नली में धीरे-धीरे समाधान इंजेक्षन.
  9. आमतौर पर कि समाधान इंगित करता है जो पशु हाँफना, फेफड़ों में पहुँच गया है कि यह सुनिश्चित करें.
  10. सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत बाँझ टांके (6-0 monofilament) के साथ घाव को बंद करें.
  11. 0.1 मिलीग्राम / शल्य चिकित्सा के बाद दर्द को नियंत्रित करने के बाद सेशन analgesia के रूप में चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा किलो buprenorphine का प्रयोग करें.
  12. बंद होने चीरा के लिए प्रारंभिक संवेदनाहारी प्रेरण से आवश्यक समय कम से कम 15 मिनट है कि सुनिश्चित करें.
  13. इंजेक्शन के बाद, एक उपयुक्त Biohazard sharps कंटेनर में सीरिंज और सुई के निपटान के.
  14. क्लोरीन डाइऑक्साइड आधारित Disi साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों का इलाजnfectant 15 मिनट के लिए, कुल्ला और नसबंदी के लिए प्रयोगशाला में लौटने और आवश्यक के रूप में पुन: उपयोग.
  15. अकेले गर्म वातावरण में स्वच्छ पिंजरों में सदन चूहों.
  16. यह चेतना आ और स्थानांतरित करने के लिए शुरू होता है जब तक पशु पर हर 30 मिनट की जाँच करें; और बाद में पहले 3 दिनों के बाद सर्जरी के लिए 12 घंटे के अंतराल पर.
  17. प्रयोग के दौरान पशु BSL2 सुविधा में चूहों रखें. मोहरबंद बॉक्स में निहित केवल ऊतक पशु BSL2 सुविधा पत्ते सुनिश्चित करें. चूहों मरणासन्न व्यवहार के किसी भी व्यक्त यदि अध्ययन में किसी भी बिंदु पर (श्वसन संकट, सुस्ती, कोमल उत्तेजना के जवाब में ambulate करने के लिए विफलता के रूप में परिभाषित), गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद एक बोतल स्रोत से सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों euthanize.
  18. संज्ञाहरण के तहत exsanguination द्वारा प्रयोगात्मक विषय euthanize.
    1. Euthanized चूहों से फेफड़े के ऊतकों लीजिए. एक BSL2 हुड में इन प्रक्रियाओं को पूरा. यदि आवश्यक हो, एक आरएसी में रखा सील ट्यूब का उपयोग नमूना हस्तांतरणआगे की प्रक्रिया के लिए एक तस्वीर ढक्कन बॉक्स में कीटाणुनाशक लादेन कागज तौलिए पर कश्मीर.

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Representative Results

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72 घंटे बाद पी - 24 से शुरू aeruginosa इंजेक्शन, बढ़ cellularity (चित्रा 1 ए-डी) फेफड़ों वर्गों में मनाया गया. फेफड़ों के 96 घंटे बाद चोट (चित्रा 1E) से उबरने के लिए शुरू कर दिया. 7 दिनों में पी पोस्ट aeruginosa, सामान्य वायुकोष्ठिका आकृति विज्ञान मोटे तौर पर (चित्रा 1F) बहाल किया गया. सुरंग धुंधला का उपयोग फेफड़ों वर्गों के 24 घंटे बाद पी में तैयार aeruginosa वायुकोष्ठिका कोशिकाओं (चित्रा 1G-आई) में कोशिका मृत्यु दिखाया. इस चोट के मॉडल में सुधार प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, BrdU पी पद 3 दिनों में चूहों में इंजेक्शन दिया गया था aeruginosa. फेफड़े 5 घंटा पद BrdU के इंजेक्शन पर पृथक और BrdU एंटीबॉडी धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया. चित्रा 1J और कश्मीर में दिखाया गया है, काफी 72 घंटे बाद पी में BrdU शामिल कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई hyperproliferation संकेत aeruginosa प्रशासन.

प्रति बाधा में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिएmeability और सूजन पद चोट, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) तरल पदार्थ पी पोस्ट अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था aeruginosa इंजेक्शन. बाल में प्रोटीन एकाग्रता काफी 48 घंटे बाद पी में वृद्धि की गई थी उपकला बाधा leakiness संकेत aeruginosa इंजेक्शन (2A चित्रा),. बाल में सेल नंबर भी 48 घंटा पद पी में काफी वृद्धि हुई है एक भड़काऊ प्रतिक्रिया सुझाव aeruginosa इंजेक्शन (चित्रा 2B),. पी पद 5 दिनों - 4 पर aeruginosa इंजेक्शन, बाल प्रोटीन के स्तर पर और सेल नंबर दोनों का सुझाव वसूली (चित्रा 2A, बी) में कमी करना शुरू कर दिया. इसके अलावा, फेफड़ों lysate विभिन्न बिंदुओं पर पी पोस्ट एकत्र किया गया था aeruginosa प्रशासन और मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन 2 (MIP2) के स्तर, न्यूट्रोफिल आकर्षण 12 में शामिल एक साइटोकाइन, एलिसा द्वारा मापा गया था. बाल विश्लेषण के परिणामों के अनुरूप, MIP2 स्तर काफी increa 48 घंटे बाद पी पर sed aeruginosa इंजेक्शन और 96 घंटे बाद पी में बेसल स्तर को लौट aeruginosa इंजेक्शन (चित्रा -2). इसके अलावा, बाल से कोशिकाओं गिलास स्लाइड पर तय की और रुधिर विज्ञान धुंधला के अधीन थे. पी के बिना aeruginosa, बाल तरल पदार्थ (चित्रा 2 डी) में monocytes के केवल एक छोटा सा संख्या में थे. इसके विपरीत, neutrophils की बड़ी राशि बाल में उपस्थित थे 48 घंटे बाद पी में अलग-थलग aeruginosa इंजेक्शन (चित्रा 2 ई). 96 घंटे बाद पी द्वारा aeruginosa इंजेक्शन, बाल की कोशिका संरचना नियंत्रण स्तर (चित्रा 2 एफ) को लौट गया. संक्षेप में, चित्रा 2 में परिणाम वृद्धि वायुकोष्ठिका बाधा पारगम्यता और गंभीर फेफड़ों की चोट 13 के सभी पहचान हैं जो साइटोकाइन सांद्रता में वृद्धि के साथ साथ एक तीव्र neutrophilic भड़काऊ प्रतिक्रिया संकेत दिया. सभी प्रयोगों में, खारा की यह इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

ve_content "> एच और ई धुंधला, BrdU लेबलिंग, TUNEL के परख, बाल विश्लेषण और MIP2 स्तर माप सहित डेटा, का हिस्सा है, पहले से. 7 प्रकाशित किए गए इस लेख में, हम मरम्मत में, FoxM1, एक प्रतिलेखन कारक की भूमिका का अध्ययन यहाँ 7 वर्णित पी aeruginosa फेफड़ों की चोट मॉडल का उपयोग वायुकोशीय चोट की.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल, पी में कोशिका मृत्यु और प्रसार aeruginosa मध्यस्थता माउस फेफड़ों की चोट मॉडल. (वायुसेना) फेफड़े अलगाव, सेक्शनिंग और एच / ई धुंधला गैर पी का उपयोग किया गया aeruginosa इंजेक्शन (गैर-पीए) 24 घंटा (बी), 48 घंटा (सी), 72 घंटा (डी), 96 घंटा (ई), 7 दिन (एफ) के बाद पी पर नियंत्रण फेफड़ों (ए) के साथ-साथ फेफड़े में aeruginosajection (पोस्ट-पीए). (सैनिक) फेफड़े वर्गों नियंत्रण फेफड़ों (जी) और 24 घंटे के बाद पी से तैयार किए गए aeruginosa फेफड़ों (एच, आई) इंजेक्शन और कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए TUNEL के परख के लिए आगे बढ़ें. फेफड़े वर्गों आकृति विज्ञान दिखाने के लिए फेफड़ों के उपकला सेल मार्कर SP-सी (नीला), T1α (लाल) के लिए दाग और भी TUNEL के (हरा) के लिए दाग रहे थे. (एच) में तीर TUNEL के सकारात्मक कोशिकाओं से संकेत मिलता है. (जम्मू, कश्मीर) BrdU गैर पी में इंजेक्ट किया गया था aeruginosa चूहों (जे) और 72 घंटे बाद पी इंजेक्शन aeruginosa आईपी द्वारा चूहों (कश्मीर), फेफड़ों 5 घंटा पद BrdU के इंजेक्शन पर तैयार और BrdU (हरे रंग धुंधला हो जाना) के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया इंजेक्शन. स्केल बार वायुसेना के लिए = 60 माइक्रोन, जी और एच के लिए 50 माइक्रोन, मैं के लिए 20 माइक्रोन, और जम्मू और कश्मीर के लिए 100 माइक्रोन. यह आंकड़ा लियू से संशोधित किया गया है 7. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. वायुकोशीय बाधा पारगम्यता और सूजन पी में निम्नलिखित aeruginosa फेफड़ों की चोट प्रेरित किया. (ए, बी) बाल नियंत्रण और पी से एकत्र किया गया था aeruginosa फेफड़ों का इलाज किया. बाल में (ए) प्रोटीन एकाग्रता 48 घंटे बाद पी में वृद्धि हुई aeruginosa इंजेक्शन और 96 घंटा में कमी आई, 5 दिन पी पोस्ट बाल में aeruginosa इंजेक्शन. (बी) के कुल सेल नंबर 48 घंटा पद पी में वृद्धि हुई 96 घंटे बाद पी में aeruginosa इंजेक्शन (बी) और लौटा नियंत्रण स्तर aeruginosa इंजेक्शन. एमआईपी 2 स्तरों हमें मापा गया (सी)48 घंटे और 96 घंटे बाद पी पर नियंत्रण चूहों के साथ ही चूहों से अलग आईएनजी फेफड़ों lysates aeruginosa इंजेक्शन. डाटा एसई ± मतलब में प्रस्तुत किए गए, एन बाल से ≥ 3. (लोमो) कोशिकाओं centrifuged और गिलास स्लाइड पर तय की और HEMA3 धुंधला के अधीन थे. Monocytes की एक छोटी संख्या नियंत्रण चूहों के बाल (डी) में मौजूद थे. Neutrophils की बड़ी राशि बाल में उपस्थित थे 48 घंटे बाद पी में अलग-थलग aeruginosa इंजेक्शन (ई). 96 घंटे बाद पी द्वारा aeruginosa इंजेक्शन, बल (एफ) में monocytes के एक छोटे संख्या में थे. स्केल बार = 10 माइक्रोन, इन परिणामों को कम से कम 5 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. यह आंकड़ा लियू एट अल. 7 से संशोधित किया गया है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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हम यहाँ वर्णन है कि स्यूडोमोनास माउस फेफड़ों की चोट मॉडल गंभीर फेफड़ों की चोट या निमोनिया निम्न होती है कि सूजन, फेफड़ों की चोट, मरम्मत, और संकल्प की पूरी प्रक्रिया mimics. यह नैदानिक ​​प्रासंगिक और अपेक्षाकृत सुरक्षित और आसानी से संभाल रहा है कि कई अन्य चोट मॉडल के साथ तुलना की अद्वितीय फायदे हैं.

प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम बैक्टीरिया समाधान के इंजेक्शन बहुत धीमी गति से होने की जरूरत है. इंजेक्शन भी तेजी से होता है, तो चूहों चोक से मरने की संभावना है. एक सफल इंजेक्शन के बाद, चूहों आमतौर पर कण फेफड़ों में मिलता बैक्टीरिया में मदद मिलेगी जो कई गहरी साँस और हांफी, दिखा.

हम इस्तेमाल तनाव PA103 6 था. इस मॉडल के महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक है कि पी के अनुमापांक aeruginosa कसकर नियंत्रित करने की जरूरत है. पी के बैच अलग स्रोत से aeruginosa अलग सूजन की डिग्री और नुकसान भी जब दिखा सकता हैएक ही CFU पर इस्तेमाल किया. इसलिए, यह बैक्टीरिया के हर नए बैच (जैसे सूजन, सेल प्रसार, आदि) के रूप में उनकी प्रेरणा का प्रभाव के लिए परीक्षण किया है, और तदनुसार CFU की संख्या में इस्तेमाल किया जा करने के लिए समायोजित किया जा सिफारिश की है. परिणामों की विसंगति प्रशीतित बैक्टीरिया स्टॉक का उपयोग करके होती है, तो एक-एक प्रयोग के लिए एक ताजा थाली से बढ़ रही बैक्टीरिया से प्राप्त ताजा स्टॉक का उपयोग कर सकते हैं. इसके अलावा, बैक्टीरिया और मीडिया के विकल्प के विकास के चरण भी मेजबान प्रतिक्रिया पर प्रभाव पर एक प्रभाव हो सकता है. इसलिए, देखभाल बैक्टीरियल inoculations बैक्टीरिया विकास चक्र का एक ही चरण के दौरान होती है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.

पी के जवाब में अंतर हो सकता है चूहों के विभिन्न प्रकारों से aeruginosa. हम इस्तेमाल तनाव C57BL 6 / और FVB / एन का मिश्रण था. उचित पी aeruginosa अनुमापांक अलग चूहों स्ट्रेन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.

इस मॉडल है के लिए एक पहलू पर विचार करने के लिएबैक्टीरिया की क्षति एक सेल प्रकार तक सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, उपकला, endothelial के लिए, fibroblasts के सभी क्षतिग्रस्त किया जा सकता था. इसलिए, इस मॉडल सेल प्रकार विशिष्ट फेफड़ों चोटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूल नहीं है. बैक्टीरिया भड़काऊ प्रतिक्रियाओं उत्तेजक द्वारा के रूप में अच्छी तरह से ऊतक 6 में विषाक्त पदार्थों स्रावित द्वारा फेफड़ों कोशिका मृत्यु का कारण. जीवित बैक्टीरिया आमतौर पर 48 घंटे बाद चोट 7,14 भीतर फेफड़ों से मंजूरी दे दी है. मृत बैक्टीरिया के एक उच्च एकाग्रता भी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 15 उत्प्रेरण से नुकसान हो सकता है.

फेफड़ों की चोट और मरम्मत के तंत्र फेफड़ों की चोट के विभिन्न प्रकार के जवाब में अलग होने की संभावना है. इसलिए, यह कई चोट मॉडल की तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है. पी यहाँ वर्णित aeruginosa मॉडल अन्य मॉडलों के लिए एक अच्छा इसके अतिरिक्त है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine pharmaceutical grade
27 G needle Fisher 1482648
syringe Fisher 14823434 1 ml
scissors Fine Science tools
forceps Fine Science tools
suture  Fisher 19-037-526
Eye gauge, glove, gown
Biosafety Cabinet
chlorine dioxide based disinfectant Clidox
sheep blood agar plates  Medex supply HL-1160

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References

  1. Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
  2. Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
  3. Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31, (8), 524-531 (2003).
  4. Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
  5. Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
  6. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
  7. Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
  8. Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
  9. Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
  10. Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
  11. Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391, (3), 1555-1560 (2010).
  12. Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
  13. Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
  14. Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
  15. Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
<em>Pseudomonas aeruginosa</em> प्रेरित फेफड़ों की चोट मॉडल
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Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).More

Suresh Kumar, V., Sadikot, R. T., Purcell, J. E., Malik, A. B., Liu, Y. Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model. J. Vis. Exp. (92), e52044, doi:10.3791/52044 (2014).

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