Abstract
For å undersøke human akutt lungeskade og lungebetennelse, er det viktig å utvikle dyremodeller for å etterligne forskjellige patologiske trekk ved denne sykdommen. Her har vi utviklet en muselungeskade modellen ved intratrakeal injeksjon av bakterier Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa eller PA). Ved hjelp av denne modellen, var vi i stand til å vise lungebetennelse i den tidlige fasen av skade. I tillegg ble alveolar epithelial barriere leakiness observert ved å analysere bronchoalveolar lavage (BAL); og alveolar celledød ble observert av Tunel analyse ved hjelp av vev forberedt fra skadde lunger. Ved en senere fase etter skade, observerte vi celleproliferasjon som kreves for reparasjonsprosessen. Skaden ble løst 7 dager fra oppstart av P. aeruginosa injeksjon. Denne modellen etterligner den sekvensielle løpet av lungebetennelse, skader og reparasjon i løpet av lungebetennelse. Dette klinisk relevant dyremodell er egnet for å studere patologi, mekanismen for reparasjon, following akutt lungeskade, og også kan brukes for å teste potensielle terapeutiske midler for denne sykdom.
Introduction
Lungene er utsatt for miljø patogener og er utsatt for betennelser og skader 1-3. Under patologiske tilstander som lungebetennelse eller Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), patogener samt inflammatoriske faktorer utgitt av leukocytter indusere skader og død av alveolære celler 1-3. Det er viktig å utvikle dyremodeller av akutt lungeskade for å lette studiet av patologien for skade, samt mekanismen for reparasjon.
Foreløpig de fleste bruker hyperoksi og bleomycin indusert muselungeskade modeller 4. Imidlertid er mekanismene for hyperoksi forårsaket skade er ikke de samme som de fleste vanlige lungeskader som oppstår under lungebetennelse eller ARDS 5. Bleomycin indusert akutt skade er sjelden i en klinisk sammenheng fire. Her rapporterer vi en mus lungeskade modellen ved hjelp intratrakeal injeksjon av P. aeruginosa 6,7. Denne modellen er klinisk relevant, og etterligner processes som skjer etter lungebetennelse 8.
Som en opportunistisk, nosokomial patogen av immunsupprimerte individer, P. aeruginosa infiserer vanligvis lungeregionen, urinveier, brannskader, sår, og fører også til andre blodinfeksjoner 6. Bakteriene slipper virulensfaktor exotoxin A, formere seg og utløse immunresponser 6. Intra-trachael administrasjon av P. aeruginosa reflekterer situasjonen i menneskelig eksponering for de bakterier som forårsaker lungebetennelse og patologien er sannsynlig å være forskjellig fra den nylig rapportert influensavirus H1N1 indusert lungeskade-modellen 9. Siden P. aeruginosa er en opportunistisk patogen, det er relativt ufarlige å håndtere sammenlignet med noen av de mer virulente patogener. Her har vi brukt intratrakeal injeksjon for å administrere bakterier fordi vi har observert at denne fremgangsmåten innføres flere bakterier i det distale område alveolene i lungene sammenlignet mednoen andre prosedyrer som for eksempel ved hjelp av et kateter via munnen.
Sammenlignet med andre akutte lungeskademodeller, P. aeruginosa modellen beskrevet her er egnet for å studere lungeskade indusert av bakterier og av for sterk inflammasjon. I motsetning til andre dyremodeller som bruker P. aeruginosa å indusere sepsis 10,11, her bruker vi intratrakeal injeksjon av disse bakteriene å indusere lokaliserte akutt lungeskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyreforsøk ble godkjent av Animal Care komiteen og institusjonelle biosikkerhet komiteer ved University of Illinois i Chicago.
MERK: Alle prosedyrer som involverer pseudomonas skal utføres med biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) praksis, som inkluderer, men er ikke begrenset til: maske, vernebriller, kjole eller jumpsuit, og doble hansker. Arbeide i sertifisert biosikkerhet kabinettet. Unn instrumenter i kontakt med bakterier med blekemiddel eller klordioksid basert desinfeksjonsmiddel. Bruk en forseglet boks for transportprøver.
1. P. aeruginosa Kultur og Vekst
- Butikk P. aeruginosa PA103 som en bakteriell lager i en skrukork kryoampulle ved -80 ° C.
- Plasser hetteglasset i et stativ i en boks med 70% etanol fuktet tørkepapir og ta til biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) laboratorium.
- Serie bakteriene bort på saueblod agarplater og vokse ved 37 ° C i ~ 15 timer i en inkubator. I en BSL2 hette, skrape bakterier fra plate med bakterier sløyfe og resuspender i 5 ml PBS.
- Oppbevar lager ved 4 ° C i inntil 3 måneder. Imidlertid, bestemme titeren hver 2. uke.
- Serielt fortynnet i PBS bakterier (vanligvis fra 4 til 1:10 1:10 7) og plate ut den kjente fortynning på saueblod agarplater.
- Inkuber platene til ~ 15 timer. Telle koloniene og beregne kolonidannende enhet (CFU) for å bestemme bakteriekonsentrasjon.
- Resuspender de passende konsentrasjoner (~ 5 x 10 3 CFU / mL) i 0,5 ml PBS i 1,5 ml sterile skrukork cryovials. Forsegle cryovials og plassere dem i en kryoampulle rack på desinfiserende laden papirhåndklær på et blunk lokk boks.
- Transportere boksen til BSL2 dyret anlegget. Når du er der, åpne boksen i BSL2 kabinett.
2. P. aeruginosa Instillasjon
- Utfør overlevelse kirurgi aseptisk (sterile hansker, sterile instrumenterog aseptiske teknikker). Bruk av en steril drapere å tilveiebringe en arbeidsflate for sterile (autoklaverte) kirurgiske instrumenter. Sterilisere instrumentene ved hjelp av en varm perle sterilisator mellom hver tracheal instillasjon prosedyre.
- Vei mus før bedøvelsen. Bedøve mus med ketamin (100 mg / kg), xylazin (5 mg / kg), i 0,1 til 0,2 ml PBS intraperitonealt (ip). Fastlå effektiviteten av narkosen av ikke-respons til tå klype. Bruk en veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet under anestesi.
- Beherske mus på et operasjonsbord i BSL2 kabinett.
- Identifiser området for kuttet ned. Barbere dette området og forberede huden ved hjelp av vekslende alkohol og povidonjodid vattpinner 3 ganger.
- Behandl innsnitt område med lokalbedøvelse (lidokain), da dette er tilstrekkelig for anestesi en mindre operasjon, slik som en hud innsnitt for å få tilgang til luftrøret.
- Foreta et lite snitt (ca. 5 mm) på midtlinjen av halsen, og bruker f buttorceps forsiktig å bevege muskelen for tilgang til luftrøret. Expose luftrøret ved kirurgisk disseksjon.
- Tegn bakterieoppløsning i en 1 ml engangssprøyte med en 27 G nål. For hver mus, administrere 20-30 mL av bakterier på riktig konsentrasjon (inntil 10 5 CFU hver mus).
- Sett nålen inn i luftrøret. Sprøyt løsningen langsomt inn i trakea.
- Sørg for at dyret gisp, som vanligvis indikerer at løsningen har kommet inn i lungene.
- Lukke såret med sterile suturer (6-0 monofilament) under aseptiske forhold.
- Bruk 0,1 mg / kg buprenorfin ved subkutan injeksjon som post-op analgesi å kontrollere post-operativ smerte.
- Pass på at tiden det tar fra første anestesi induksjon til innsnitt nedleggelse er mindre enn 15 min.
- Etter injeksjonen, kast sprøyter og nåler i en egnet biohazard beholder for skarpe gjenstander.
- Unn de kirurgiske instrumenter med klordioksid basert desinfisenfectant i 15 minutter, skylles og gå tilbake til laboratoriet for sterilisering og gjenbruk hvis nødvendig.
- Hus musene enkeltvis i rene bur på varme omgivelser.
- Sjekk på dyret hvert 30 min før den gjenvinner bevisstheten og begynner å bevege seg; og senere ved 12 timers intervaller for første 3 dager etter operasjonen.
- Hold musene i dyret BSL2 anlegget gjennom hele eksperimentet. Sørg for at bare vev som finnes i forseglet boks forlater dyret BSL2 anlegget. Dersom musene uttrykke noen av de døende atferd (definert som pustevansker, slapphet, manglende ambulate svar på skånsom stimulering) på noe punkt i studien, avlive mus ved CO 2 inhalasjon fra en flaske kilde fulgt av halshugging.
- Avlive forsøkspersonen ved blodtapping under narkose.
- Samle lungevev fra avlives mus. Utføre disse prosedyrer i en BSL2 hette. Hvis nødvendig, overfører prøven ved hjelp av forseglede rør som er lagt inn i et rack på desinfiserende laden papirhåndklær på et blunk lokk boks for videre prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Starter 24-72 timer etter P. aeruginosa injeksjon, øket cellularitet ble observert i lungeseksjoner (figur 1A-D). Lungen begynte å gjenopprette fra 96 timer etter skade (figur 1E). 7 dager etter P. aeruginosa, normal alveolene morfologi ble i stor grad gjenopprettet (figur 1F). Tunnel flekker ved hjelp av lunge seksjoner forberedt ved 24 timer etter P. aeruginosa viste celledød i alveolene celler (figur 1G-I). For å studere reparasjonsprosessen i denne skademodellen, BrdU ble injisert i mus i 3 dager etter P. aeruginosa. Lungene ble isolert på fem timer etter BrdU injeksjon og behandlet for BrdU antistoffarging. Som vist i figur 1J og K, betydelig økt antall celler som inkorporerte BrdU i 72 timer etter P. aeruginosa administrasjon indikerer hyperproliferasjon.
For å undersøke endringen i barrieren permeability og betennelse etter skade, bronchoalveolar lavage (BAL) Væsken ble samlet inn ved ulike tidspunkt poste P. aeruginosa injeksjon. Proteinkonsentrasjonen i BAL var signifikant økt i 48 timer etter P. aeruginosa-injeksjon (figur 2A), som indikerer epitelial barriere leakiness. De celle tall i BAL økte også betydelig i 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon (figur 2B), hvilket antyder en inflammatorisk respons. På 4-5 dager legg P. aeruginosa injeksjon, både i BAL proteinnivå og cellenummeret begynte å avta noe som tyder på utvinning (figur 2A, B). Videre ble lunge lysat samlet på ulike punkter Post P. aeruginosa administrering og nivået av makrofag inflammatoriske proteiner 2 (MIP2), et cytokin som er involvert i nøytrofil tiltrekning 12, ble målt ved hjelp av ELISA. Konsistente med BAL analyseresultatene, MIP2 nivået betraktelig increa sed på 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon og returnerte til basalnivå på 96 timer etter P. aeruginosa injeksjon (figur 2C). Videre ble cellene fra BAL festet på glassplater og utsatt for hematologi farging. Uten P. aeruginosa, var det bare et lite antall monocytter i BAL væske (figur 2D). I kontrast, stor mengde av nøytrofile var tilstede i BAL isolert i 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon (2E). Ved 96 timer etter P. aeruginosa injeksjon, returnerte cellen sammensetningen av BAL til styrenivå (figur 2F). For å oppsummere, resulterer i figur 2 indikerte en akutt inflammatorisk nøytrofil respons sammen med økt permeabilitet og alveoli barriere økning i cytokin-konsentrasjoner, som alle er kjennetegnene til akutt lungeskade 13. I alle forsøk ble det benyttet injeksjon av saltløsning som kontroll.
ve_content "> en del av dataene, inkludert H og E-farging, BrdU-merking, TUNEL assay, BAL-analyse og MIP2 nivåmåling, ble tidligere utgitt 7. I denne artikkelen, studerte vi rollen som FoxM1, en transkripsjonsfaktor, i reparasjon på kjeveskader ved bruk av P. aeruginosa lungeskade modellen beskrevet her 7.
Figur 1. Histologi, celledød og spredning i P. aeruginosa mediert muselungeskade modell. (AF) Lung isolering, seksjonering og H / E farging ble utført ved hjelp av ikke-P. aeruginosa-injisert (non-PA) kontroll lungene (A), så vel som lungene ved 24 timer (B), 48 timer (C), 72 timer (D), 96 timer (E), 7 dager (F) etter P. aeruginosa ijection (post-PA). (GI) Lunge snitt ble fremstilt fra kontroll lungene (G) og 24-timers post-P. aeruginosa injisert i lungene (H, I) og fortsett for TUNEL assay for å detektere celledød. Lunge snitt ble farget for lunge epitel cellemarkør Sp-C (blå), T1α (rød) for å vise morfologi og også farget for TUNEL (grønn). Piler i (H) indikerer tunel positive celler. (J, K) BrdU ble injisert i ikke-P. aeruginosa injisert mus (J) og 72 timer etter P. aeruginosa injisert mus (K) av ip, ble lungene forberedt på fem timer etter BrdU injeksjon og behandlet for antistoffarging mot BrdU (grønn farging). Scale bar = 60 mikrometer for AF, 50 mikrometer for G og H, 20 mikrometer for jeg, og 100 mikrometer for J og K. Dette tallet har blitt forandret fra Liu
Figur 2. Alveolar barriere permeabilitet og inflammasjon etter i P. aeruginosa indusert lungeskade. (A, B) BAL ble oppsamlet fra kontroll og P. aeruginosa behandlet lungene. (A) Protein konsentrasjon i BAL økt på 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon og redusert på 96 timer, 5 dager etter P. aeruginosa injeksjon. (B) Totalt celle tall i BAL økt på 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon (B) og finjustert kontrollnivå på 96 timer etter P. aeruginosa injeksjon. (C) MIP-2-nivåer ble målt ossing lunge lysater isolert fra kontroll mus samt mus på 48 timer og 96 timer etter P. aeruginosa injeksjon. Data ble presentert på gjennomsnitt ± SE, n ≥ 3. (DF) Celler fra BAL ble sentrifugert og festet på glassplater og utsatt for HEMA3 farging. Et lite antall monocytter var tilstede i BAL av kontroll mus (D). Store mengder nøytrofile var tilstede i BAL isolert i 48 timer etter P. aeruginosa injeksjon (E). Ved 96 timer etter P. aeruginosa injeksjon, var det et lite antall monocytter i BAL (F). Skala bar = 10 um, disse resultatene er representative for minst fem uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt forandret fra Liu et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pseudomonas muselungeskade modell som vi beskriver her etterligner hele prosessen med betennelse, lungeskade, reparasjon og oppløsning som oppstår ved akutt lungeskade eller lungebetennelse. Den har unike fordeler sammenligner med flere andre skademodeller i at det er klinisk relevant og relativt trygt og enkelt å håndtere.
Det kritiske trinnet i fremgangsmåten er at injeksjon av bakterier løsningen må være meget langsom. Hvis injeksjon er for fort, musene er sannsynlig å dø av choke. Etter en vellykket injeksjon, musene viser vanligvis flere dype puster og gispe, som vil hjelpe bakteriene partikler kommer inn i lungene.
Belastningen vi brukte var PA103 6. Ett av de kritiske punkter i denne modellen er at titeren av P. aeruginosa trenger å bli kontrollert. Batch av P. aeruginosa fra annen kilde kunne vise ulike grader av betennelser og skader selv nårbrukes på samme CFU. Derfor er det anbefalt at hver ny batch av bakterier bli testet for deres forårsakende virkninger (for eksempel inflammasjon, celleproliferasjon, etc.), og følgelig justere antall CFU skal brukes. Hvis inkonsistens av resultatene utføres ved å bruke nedkjølte bakterier lager, kan man anvende friskt lager oppnådd ved voksende bakterier fra en frisk plate for hvert eksperiment. I tillegg kan vekstfasen av bakteriene og valg av media også ha en innvirkning på effekten på vertsrespons. Derfor bør man sørge for å sikre at bakterielle vaksiner forekommer i samme fase av bakteriell vekst syklus.
Det kan være en forskjell i respons til P. aeruginosa ved ulike stammer av mus. Stammen vi benyttet var en blanding av C57BL / 6 og FVB / N. Den aktuelle P. aeruginosa titer skal fastsettes for ulike musestammer.
En faktor å vurdere for denne modellen erat skaden av bakteriene ikke er begrenset til én celletype. For eksempel, epitel, endothelial, fibroblaster kunne alle ha blitt skadet. Derfor er denne modellen ikke egnet for å studere effektene av celletype spesifikk lungeskader. Bakteriene forårsake lunge celledød ved å stimulere inflammatoriske responser samt ved å skille giftstoffer i vevet 6. Levende bakterier er vanligvis fjernet fra lungene innen 48 timer etter skaden 7,14. En høy konsentrasjon av døde bakterier kan også forårsake skade ved å indusere inflammatoriske responser 15.
Mekanismene for lungeskade og reparasjon er sannsynlig å være forskjellig i respons til forskjellige typer av lungeskade. Derfor er det viktig å sammenligne flere skademodeller. P. aeruginosa modellen beskrevet her er et fint tillegg til de andre modellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
