Abstract
Insan akut akciğer hasarı ve pnömoni incelemek üzere, bu hastalığın çeşitli patolojik özelliklerini taklit etmek için hayvan modelleri geliştirilmesi önemlidir. Burada bakteriler Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa veya PA) intra-trakeal enjeksiyon yoluyla fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu modeli kullanarak, yaralanma erken dönemde akciğer iltihabı gösteren başardık. Buna ek olarak, alveol epitel bariyer leakiness bronkoalveoler lavaj (BAL) analiz ederek gözlenmiştir; ve alveolar hücre ölümü yaralı akciğerlerinden hazırlandı doku kullanılarak TÜNEL tahlili ile gözlemlenmiştir. Yaralanmasının ardından daha sonraki bir aşamada, biz tamir işlemi için gerekli hücre çoğalmasını gözlendi. Yaralanma 7 gün P. başlatılmasından çözüldü aeruginosa enjeksiyon. Bu model pnömoni sırasında akciğer iltihabı, yaralanma ve onarım sıralı ders taklit eder. Bu klinik açıdan anlamlı hayvan modeli f, onarım mekanizmasını patolojiyi incelemek için uygundurakut akciğer hasarı ollowing ve bu hastalık için potansiyel bir terapötik maddelerin test edilmesi için kullanılabilir.
Introduction
Akciğerler çevresel patojenlere maruz ve inflamasyon ve yaralanma 1-3 yatkındır vardır. Pnömoni veya yetişkinlerde solunum zorluğu sendromu (ARDS) gibi patolojik durumları sırasında, lökositler tarafından salgılanan patojen hem de enflamatuvar etkenlerin alveol hücreleri 1-3 yaralanma ve ölümünü indükler. Bu onarım yaralanma patoloji çalışma yanı sıra mekanizmasını kolaylaştırmak için akut akciğer hasarı hayvan modellerinin geliştirilmesi önemlidir.
Şu anda, çoğu insan hiperoksia ve Bleomisine bağlı fare akciğer hasarı modellerini 4 kullanın. Ancak, hiperoksinin mekanizmaları yaralanma pnömoni veya ARDS 5 sırasında ortaya en sık akciğer yaralanmaları gibi aynı değildir neden oldu. Bleomisin ile oluşturulan akut hasarı klinik bağlamda 4 nadirdir. Burada P. içi trakeal enjeksiyon kullanılarak fare akciğer hasarı modeli rapor aeruginosa 6,7. Bu model klinik olarak önemlidir, ve taklit ppnömoni 8 Aşağıdaki olur rocesses.
Bağışıklığı baskılanmış kişilerde bir fırsatçı, hastane patojen, P. gibi aeruginosa genellikle pulmoner sistem, üriner sistem, yanıklar, yaralar bozar, hem de diğer kan enfeksiyonlarına 6 neden olur. Bakteriler, virulans faktör ekzotoksin A serbest çarpma ve immün yanıtları 6 tetikler. P. içi trachael yönetim aeruginosa pnömoniye neden bakteri insan maruz kalma durumunu yansıtan ve patoloji son bildirilen grip virüsü H1N1 kaynaklı akciğer hasarı modelinde 9 farklı olması muhtemeldir. P. yana aeruginosa o daha öldürücü patojenlerin bazı karşılaştırıldığında işlemek için nispeten güvenli bir fırsatçı patojendir. Gözlemlediğimiz, çünkü burada bu yöntemin kıyasla akciğerin en uzak alveol bölgesine daha fazla bakterilerin ortaya koyduğu bakterileri yönetmek için içi trakeal enjeksiyon kullanılanBöyle ağız yoluyla bir kateter kullanarak gibi diğer bazı prosedürler.
Diğer akut akciğer hasarı modelleri ile karşılaştırıldığında, S. Burada açıklanan model, aeruginosa, bakterilerin ve aşırı iltihaplanma ile kaynaklı akciğer hasarı çalışmak için uygundur. P. kullanan diğer hayvan modellerinde farklı aeruginosa burada lokalize akut akciğer hasarı oluşturmak için bu bakterilerin içi trakeal enjeksiyon kullanımı, sepsis 10,11 ikna etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri tarafından onaylandı.
NOT: maskesi, göz koruması, önlük veya tulum, ve çift eldiven: pseudomonas kapsayan tüm işlemler bunlarla sınırlı değildir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) uygulamaları ile yapılmalıdır. Sertifikalı Biyogüvenlik Kurulu çalışın. Çamaşır suyu veya klor dioksit bazlı dezenfektan ile bakteri ile temas aletleri davranın. Taşıma örnekleri için bir kapalı kutu kullanın.
1. P. aeruginosa Kültür ve Büyüme
- Mağaza P. -80 ° C de dondurarak saklamaya uygun vialler bir vidalı başlık bakteriyel bir stok olarak aeruginosa, PA103.
- % 70 etanol ıslatılmış kağıt havlu ile bir kutu içinde bir rafa yerleştirin flakon ve Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL2) laboratuvara götürmek.
- Şerit koyun kanı agar plakalarına bakteri ve bir kuluçka makinesi içinde 15 saat ~ 37 ° C'de büyütülmüştür. Bir BSL2 kaputu, 5 ml PBS içinde bakteri döngü ve tekrar süspansiyon ile plaka bakterileri çizebilir.
- 3 aya kadar 4 ° C 'de stok saklayın. Bununla birlikte, titre her 2 haftada bir belirler.
- Seri olarak (01:10 ila 7 01:10 4 genellikle) PBS içinde bakteri sulandırarak koyun kanı agar plakaları üzerinde bilinen seyreltme plaka.
- ~ 15 saat süreyle inkübe edin. Kolonileri sayın ve bakteri konsantrasyonunu belirlemek için Koloni Oluşturma Birimi (CFU) hesaplayabilirsiniz.
- Uygun konsantrasyonlarda yeniden süspanse edin (~ 5 x 10 3 CFU / ml), 1.5 ml steril vida kapaklı bir küçük cryovials içinde 0.5 ml PBS içinde. Kriyotüplerin Seal ve bir çırpıda kapaklı kutu dezenfektan yüklü kağıt havlu üzerinde kriyotüpe rafa koyun.
- BSL2 hayvan tesisine kutusuna taşıyın. Bir kez orada, BSL2 kabinede kutusunu açmak.
2. P. aeruginosa damlatma
- Sağkalım cerrahi aseptik (steril eldiven, steril aletler gerçekleştirinVe aseptik teknikler). Steril (otoklav) cerrahi aletler için bir çalışma yüzeyi sağlamak için steril örtüyü kullanın. Her trakea İnstilasyon prosedür arasında sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak aletleri sterilize.
- Anesthetization önce fareler tartılır. Ketamin (100 mg / kg), ksilazin (5 mg / kg) ile fareler anestezi 0.1 - 0.2 ml PBS intraperitoneal (ip). Ayak tutam cevapsızlıktan tarafından anestezik etkinliğini belirlemek. Anestezi altında kuruluğunu önlemek için gözleri bir veteriner merhem kullanın.
- BSL2 kabinede bir cerrahi gemide fareler dizginlemek.
- Kesim aşağı için bölgeyi belirlemek. Bu alanı tıraş ve 3 kez alkol ve povidon iyot bezlerden alternatif kullanılarak cildi hazırlar.
- Bu anestezi gibi trakea erişmek için bir cilt kesisi olarak küçük bir ameliyat için yeterli olduğu gibi lokal anestezi (lidokain) ile kesi alanı davranın.
- Boyun orta hatta küçük bir kesi (yaklaşık 5 mm) yapmak, ve künt f kullanınorceps hafifçe trakea erişim için kas taşımak için. Cerrahi diseksiyon ile trakea Açığa.
- 27 G iğne ile 1 ml tek kullanımlık enjektöre bakteri çözüm çizin. Her bir fare için, uygun konsantrasyonda (10 5 CFU her bir fare kadar) bakteri 20-30 ul uygulayın.
- Trakea içine iğne takın. Trakea içine yavaş yavaş bir çözüm enjekte edilir.
- Genellikle bu çözümü gösterir hayvan soluk soluğa, akciğere ulaştığını emin olun.
- Aseptik koşullarda steril sütür (6-0 lifli) ile yarayı kapatın.
- 0.1 mg / ameliyat sonrası ağrıyı kontrol etmek için post-op analjezi gibi deri altı enjeksiyon yoluyla kg buprenorfin kullanın.
- Kapatma insizyon ilk anestezi indüksiyon gerekli süre en az 15 dk olduğundan emin olun.
- Enjeksiyonundan sonra, uygun bir biyolojik tehlikeli kabın içinde şırınga ve iğneler atmayın.
- Klor dioksit bazlı bir dezenfeksiyon cerrahi aletler davranınnfectant 15 dakika için durulayın ve sterilizasyon için laboratuar dönmek ve gerektiğinde yeniden.
- Tek başına sıcak bir ortamda temiz kafeslerde ev fareler.
- Bu bilinç kavuşur ve hareket edene kadar hayvanın her 30 dakikada kontrol edin; ve daha sonra da ilk 3 gün sonra, cerrahi için 12 saatlik aralıklarla.
- Deney boyunca, hayvan BSL2 tesiste fareler tutun. Mühürlü kutuda bulunan tek doku hayvan BSL2 tesisi bırakır emin olun. Fareler can çekişen davranışların bir ifade halinde çalışmada herhangi bir noktada (solunum güçlüğü, uyuşukluk, yumuşak bir uyarıya yanıt olarak ambulasyon durum olarak tanımlanmaktadır), servikal dislokasyon bir şişe bir kaynaktan CO2 soluma ile farelerin euthanize.
- Anestezi altında kanı akıtılarak deneysel konuyu euthanize.
- Öldürülen farelerin akciğer dokusunu toplayın. Bir BSL2 kaputu bu işlemleri yürütmek. Gerekirse, rac içinde yerleştirilmekte, tüpler kullanılarak örnek aktarmakdaha fazla işlem için bir çırpıda kapaklı kutu dezenfektan yüklü kağıt havlu üzerinde k.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
72 saat sonrası P. - 24 başlayarak aeruginosa enjeksiyonu artan hücreli (Şekil 1A-D), akciğer bölümleri gözlenmiştir. Akciğer 96 saat sonrası yaralanma (Şekil 1E) kurtarmak için başladı. 7 gün sonra, P. yayınlamak aeruginosa normal alveol morfoloji büyük ölçüde (Şekil 1F) restore edildi. Tünel boyama kullanılarak akciğer kesitleri 24 saat sonrası P. hazırlanmış aeruginosa, alveol hücreleri (Şekil 1 G-I) 'de, hücre ölümünü göstermektedir. Bu hasar modelinde, onarım işlemi incelemek için BrdU P. sonrası 3 gün sonra, farelere enjekte edildi aeruginosa. Akciğerler 5 saat sonrası BrDU enjeksiyon izole ve BrdU antikor boyama için işlendi. Şekil 1J ve K 'de gösterildiği üzere, önemli ölçüde 72 saat sonra, P. BrdU dahil hücre sayısı arttı hiperproliferasyonunu belirten aeruginosa yönetim.
Her bariyer değişimi incelemek içinmeability ve inflamasyon sonrası yaralanma, bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında P sonrası farklı zaman noktalarında toplandı aeruginosa enjeksiyon. BAL içindeki protein konsantrasyonu önemli ölçüde 48 saat sonra, P. de artmıştır epitelyal bariyer sızıntının gösteren aeruginosa, enjeksiyon (Şekil 2A). BAL'da hücre sayıları da 48 saat sonrası P. de önemli ölçüde artmıştır bir enflamatuvar yanıtı öneren aeruginosa, enjeksiyon (Şekil 2B). P. sonrası 5 gün - 4 At aeruginosa enjeksiyon, BAL protein seviyesi ve hücre sayısı hem de düşündüren kurtarma (Şekil 2A, B) azalmaya başlamıştır. Ayrıca, akciğer lizat farklı noktalarda S., post toplandı aeruginosa yönetim ve makrofaj enflamatuar protein, 2 (MIP2) düzeyi, nötrofıl çekimine 12 katılan bir sitokin, ELISA ile ölçülmüştür. BAL analiz sonuçları ile tutarlı, MIP2 seviyesi önemli ölçüde yükselebilir 48 saat sonrası P. de sed aeruginosa enjeksiyon ve 96 saat sonrası P. bazal seviyeye döndü aeruginosa, enjeksiyon (Şekil 2C). Ayrıca, BAL ile ilgili hücreler cam slaytlar üzerinde sabit ve hematoloji boyama tabi tutuldu. P. olmadan aeruginosa, BAL sıvısında (Şekil 2D) monosit sadece az sayıda vardı. Bunun aksine, nötrofillerin büyük miktarda BAL mevcuttu 48 saat sonra S. izole aeruginosa enjeksiyon (Şekil 2E). 96 saat yazılan P. tarafından aeruginosa enjeksiyon, BAL hücre kompozisyonu kontrol seviyesinde (Şekil 2F) döndü. Özetlemek gerekirse, Şekil 2 içindeki sonuçlar, artan alveol bariyeri geçirgenliğinin ve akut akciğer hasarı 13 simgeleridir sitokin konsantrasyonundaki artışla birlikte akut nötrofilik enflamatuar tepkiyi belirtti. Tüm deneylerde, tuzlu su, enjeksiyon kontrol olarak kullanılmıştır.
ve_content "> H ve E boyama, BrdU etiketleme, TUNEL yöntemi, BAL analiz ve MIP2 seviye ölçümü de dahil olmak üzere veri, bir kısmı daha önce. 7 yayınlanan bu makalede, biz tamir, FoxM1, bir transkripsiyon faktörünün rolünü okudu Burada 7 açıklanan P. aeruginosa akciğer hasarı modeli kullanılarak alveol yaralanma.
Şekil 1. Histoloji, P. hücre ölümü ve çoğalması aeruginosa aracılı fare akciğer hasarı modeli. (AF) Akciğer izolasyonu, kesit ve H / E boyama olmayan P. kullanılarak yapıldı aeruginosa, enjekte edilen (non-PA), 24 saat (B), 48 saat (C), 72 saat (D), 96 saatten (E), 7 gün (F) sonrası P. de kontrol akciğerleri (A) yanı sıra akciğer aeruginosajection (post-PA.) (Gl) Akciğer kesitleri kumanda akciğerde (G) ve 24 saat sonrası P. hazırlandı aeruginosa, akciğerler (İH, I) enjekte edilmiş ve hücre ölümünü tespit etmek için TÜNEL deneyi için devam edin. Akciğer kesitleri morfoloji gösteren akciğer epitelyal hücre belirteci SP-C (mavi), T1α (kırmızı) için boyandı ve TÜNEL (yeşil) için boyandı. (H) 'de oklar TÜNEL pozitif hücrelerini göstermektedir. (J, K) BrdU olmayan P. enjekte edilmiştir aeruginosa fareler (J) ve 72 saat sonrası P. enjekte aeruginosa ip tarafından fareler (K), akciğerler 5 saat sonrası BrDU enjeksiyon hazırlanan ve BrdU (yeşil boyama) karşı antikor boyama işlendi enjekte. Ölçü bar AF = 60 um, G ve H, 50 um, I için 20 um, ve J ve K 100 um. Bu rakam Liu modifiye edilmiş
Şekil 2. Alveoler bariyeri geçirgenliği ve iltihap P. aşağıdaki aeruginosa akciğer hasarı bağlı. (A, B) ile lekelenerek BAL kontrol ve P ile toplandı aeruginosa, akciğerler işlemden geçirildi. BAL'daki (A), protein konsantrasyonu 48 saat sonra S. artmıştır aeruginosa enjeksiyon ve 96 saat boyunca azalarak, 5 gün P. sonrası BAL'da aeruginosa enjeksiyonu yapılmıştır. (b) toplam hücre sayıları, 48 saat sonra S. artmıştır 96 saat sonrası P. de aeruginosa enjeksiyon (B) ve retuned kontrol seviyesi aeruginosa enjeksiyon. MIP-2 düzeyleri bize ölçüldü (C)48 saat ve 96 saat sonrası P. de kontrol fareler yanı sıra farelerden izole ing akciğer lisatlar aeruginosa enjeksiyon. Veriler ortalama ± SE olarak verilmiş olup, n, Bal ≥ 3 (DF) Hücreler santrifüj edilir ve cam lameller üzerine sabit ve HEMA3 boyama tabi tutuldu. Monosit az sayıda kontrol farelerinin BAL (D) 'de mevcuttu. Nötrofillerin Büyük miktarda BAL'da mevcut olan 48 saat sonrası P. izole aeruginosa enjeksiyon (E). 96 saat yazılan P. tarafından aeruginosa enjeksiyonu, BAL (F) monosit az sayıda olmuştur. Ölçü bar = 10 um, bu sonuçlar, en azından 5 bağımsız deneyi temsil etmektedir. Bu rakam Liu ve ark. 7 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada açıklamak Pseudomonas fare akciğer hasarı modeli akut akciğer hasarı veya zatürre sonrası oluştuğu inflamasyon, akciğer hasarı, onarım, ve çözünürlük tüm süreci taklit eder. Bu, klinik olarak ilgili ve içerisinde nispeten güvenli ve kullanımı kolay olduğu birçok başka yaralanması modelleri ile karşılaştırıldığında eşsiz avantajlara sahiptir.
Prosedürdeki kritik aşama bakteri çözeltisi, enjeksiyon çok yavaş olması gerekiyor. Enjeksiyon çok hızlı ise, fareler bobini tarafından ölme olasılığı vardır. Başarılı bir enjeksiyonundan sonra, fareler, genellikle parçacıklar akciğerin içine almak bakteri yardımcı olacak çeşitli derin nefes ve nefesi göstermektedir.
Biz kullanılan suş PA103 6 oldu. Bu modelin kritik noktalardan biri olduğu P. titeri aeruginosa sıkı kontrol edilmesi gerekir. P. Toplu Farklı bir kaynaktan aeruginosa farklı inflamasyon derecelerde hasara hatta gösterebilirimAynı CFU kullanılır. Bu nedenle, her bakteri yeni bir parti (örneğin enflamasyon, hücre çoğalması, vs gibi) bunların etken etkileri için test edilebilir ve buna bağlı olarak CFU sayısı kullanılmak üzere ayarlanması tavsiye edilir. Sonuçların tutarsızlık buzdolabında bakteri stok kullanarak oluşursa, birer deney için yeni bir plaka büyüyen bakteriler tarafından elde edilen taze stok kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, bakteri ve ortamın seçimi, büyüme safhası olarak, aynı zamanda bir ev sahibi tepkisi üzerinde etkisi üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, bakım bakteriyel aşılar bakteri büyüme döngüsünün aynı aşamasında ortaya sağlamak için alınmalıdır.
P. yanıt olarak bir fark olabilir Değişik fare sıraları ile aeruginosa. Kullandığımız soyu C57BL / 6 ve FVB / N karışımıdır. Uygun P. aeruginosa titeri, farklı fare suşları için belirlenmelidir.
Bu model için bir faktör dikkatebakterilerin zarar bir hücre tipi ile sınırlı olmadığını gösterir. Örneğin epitel, endotelyal, fibroblastlar tüm hasarlı olabilirdi. Bu nedenle, bu model, hücre tipi özel akciğer yaralanmalarının etkilerini incelemek için uygun değildir. Bakteriler enflamatuar tepkileri teşvik ederek hem de doku 6 toksin salgılayan akciğer hücre ölümüne neden olur. Canlı bakteriler genellikle 48 saat sonrası yaralanma 7,14 içinde akciğer silinir. Ölü bakteriler daha yüksek bir konsantrasyonu, aynı zamanda enflamatuar tepkileri 15 harekete geçirmek suretiyle hasara neden olabilir.
Akciğer harabiyeti ve onarım mekanizmaları akciğer hasarı farklı yanıt olarak farklı olması muhtemeldir. Bu nedenle, pek çok hasar modellerinde karşılaştırmak için önemlidir. S. Burada anlatılan aeruginosa modeli diğer modellere güzel bir ektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
