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Developmental Biology

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से कार्डिएक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52047
Automatic Translation
1, 2, 1
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Introduction

दिल की बीमारी दुनिया में प्रमुख कारण आज रहता है और मृत्यु दर में पिछले दो दशकों (अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन) में लगभग अपरिवर्तित बनी हुई है। प्रभावी ढंग से रोकने के लिए या दिल की विफलता को उल्टा करने के उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। एक आशाजनक रणनीति स्टेम कोशिका जीव विज्ञान एक के तेजी से विकास के बाद सेल आधारित चिकित्सा है। इस संबंध में, multipotent सीपीसी के कारण पैदा करना है, लेकिन केवल हृदय वंश भेदभाव करने के लिए प्रतिबद्ध करने के लिए अपनी क्षमता को उपचार के लिए एक उत्कृष्ट सेल स्रोत हो सकता है। इसलिए, कुशल और मजबूत विधि पैदा करते हैं और दिल सेल थेरेपी के अध्ययन के लिए बहुत महत्व का है सीपीसी अलग करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल जल्दी embryogenesis और कैसे ESCs से उनकी पीढ़ी के दौरान पहचान भ्रूण सीपीसी पर केंद्रित है। विभिन्न सीपीसी भी हड्डी marrows 2 से, भ्रूण और वयस्क दिल से पृथक किया गया है। भ्रूण विकास के दौरान, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMPs), पंखहीन प्रकार MMTV एकीकरण साइट परिवार के सदस्यों (Wnts) और नोडल संकेतों Mesp1 + multipotent मेसोडर्म 3 की प्रतिबद्धता प्रेरित। Mesp1 + कोशिकाओं तो भ्रूण सीपीसी 4 में अंतर। ये सीपीसी आम तौर पर NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), आइएसएल लिम homeobox 1 (Isl1), टी बॉक्स 5 (Tbx5), और myocyte बढ़ाने कारक -2 सी (Mef2c), प्राथमिक और दूसरा दिल क्षेत्रों फार्म, HCN4 द्वारा चिह्नित है, और कर रहे हैं कार्डियोजेनेसिस 5-10 दौरान दिल के प्रमुख भागों में योगदान। Nkx2-5 + और ​​Isl1 / + Mef2c + दोनों सीपीसी cardiomyocytes में अंतर करने में सक्षम हैं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी), और endothelial कोशिकाओं 5-8। इस प्रकार इन सीपीसी हृदय वाहिका संरचना के साथ ही हृदय के ऊतकों को जन्म देने के लिए और सेल आधारित हृदय चिकित्सा के लिए एक आदर्श सेल स्रोत हैं जाएगा। नतीजतन, इन विट्रो में सीपीसी पैदा करने के हृदय अध्ययन में एक प्रमुख अनुसंधान ध्यान केंद्रित किया गया है। ESCs असीमित विस्तार क्षमता एक के बादएन डी ब्लास्टोसिस्ट चरण में आईसीएम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्राकृतिक embryogenesis निम्नलिखित भ्रूण सीपीसी में ESCs के भेदभाव सीपीसी प्राप्त करने के लिए एक तार्किक और प्रभावी तरीका माना जाता है।

ESCs से सीपीसी प्राप्त करने के लिए एक व्यापक रूप से व्यावहारिक दृष्टिकोण के ईबीएस 11 में ESCs को जोड़ता है। भेदभाव दक्षता में सुधार करने के लिए, हृदय के विकास के ज्ञान के आधार पर परिभाषित रासायनिक और वृद्धि कारकों 12-14 इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, व्यापक रूप से क्षेत्र में स्वीकार कर रहे हैं, जो कोई निश्चित सीपीसी मार्करों, विशेष रूप से कोई सेल सतह मार्करों, वहाँ रहे हैं। इस मुद्दे के समाधान के लिए, ESCs Isl1 + या Mef2c + सीपीसी और रचनात्मक / loxP प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ उनके डेरिवेटिव चिह्नित करने के लिए इंजीनियर हैं। Cre recombinase Isl1 / Mef2c प्रमोटर / बढ़ाने के नियंत्रण के अधीन में दस्तक दी है। एक विधान प्रमोटर द्वारा संचालित संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन आरएफपी या YFP जीन Cre recombinase साथ flox स्टॉप कोडोन के छांटना द्वारा सक्रिय किया जा सकता है(ISL1: रचनात्मक;-pCAG-flox बंद flox GFP या आरएफपी / Isl1-रचनात्मक; Rosa26YFP / Mef2c-रचनात्मक; Rosa26YFP) 5,6। ESCs दूसरा दिल क्षेत्र सीपीसी में भेदभाव कर रहे हैं एक बार, Isl1 / Mef2c प्रमोटर / बढ़ाने संचालित रचनात्मक फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को सक्रिय करेंगे और सीपीसी FACS-शुद्धि से समृद्ध किया जा सकता है। संक्षेप में, ईबी एकत्रीकरण विधि ईएससी भेदभाव आरंभ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। भेदभाव दक्षता बढ़ाने के लिए, विभेदित कोशिकाओं एस्कॉर्बिक एसिड (एए) और ऐसे BMP4, Activin एक और VEGF 13,15 के रूप में वृद्धि कारकों के साथ व्यवहार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल माउस और मानव ESCs दोनों का उपयोग कर मजबूत और कुशल सीपीसी भेदभाव की अनुमति देता है।

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Protocol

माउस ESCs से माउस भ्रूणीय सीपीसी की 1. व्युत्पत्ति

  1. माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts फीडर परत तैयार करें।
    1. गर्म MEF मध्यम 37 डिग्री सेल्सियस (DMEM में 10% FBS) के।
    2. जिलेटिन लेपित प्लेटें तैयार करें।
      1. एक 10 सेमी डिश में 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से या 5 मिलीलीटर में पानी में 0.1% जिलेटिन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. कम से कम 30 मिनट के लिए प्लेटों या व्यंजन 37 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान के लिए छोड़ दें। का उपयोग करने से पहले जिलेटिन की ख्वाहिश।
    3. पिघलना कोमल झटकों के साथ, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी MEFs किरणित।
    4. एक 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब धीरे कोशिकाओं स्थानांतरण। पूर्व गर्म MEF मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे कोशिकाओं भंवर और 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. MEF मध्यम में कोशिकाओं Resuspend और व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती। एक 10 सेमी पकवान से कोशिकाओं के लिए 2 मिलीलीटर 6 अच्छी तरह से थाली से अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के लिए और 10 मिलीलीटर: निम्न MEF मध्यम की मात्रा का प्रयोग करें।
    6. 6 अच्छी तरह प्लेटों में प्लेट कोशिकाओं या 1-2 पर 10 सेमी व्यंजनथाली / पकवान प्रति एक्स 10 6।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पर MEF प्लेटों / व्यंजन सेते हैं, 5% सीओ 2 के कम से कम 24 घंटा पहले का उपयोग करने के लिए।
      ध्यान दें: एक सप्ताह से अधिक पुराने MEF प्लेटों / व्यंजन त्यागें।
  2. माउस ESCs तैयार करें
    1. संस्कृति Isl1-रचनात्मक; Rosa26YFP / Mef2c-रचनात्मक; 90% मिला हुआ जब तक MEFs पर Rosa26YFP माउस ESCs। इस्तेमाल की ES सेल मध्यम 410 मिलीलीटर DMEM, 75 एमएल FBS के, 0.1 मिमी सदस्य NEAA, 2 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी पाइरूवेट, 100 यू पेन / Strep, और 0.1 मिमी β-mercaptoethanol के शामिल थे।
    2. 1.1.2 में वर्णित के रूप में जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें।
    3. प्लेटों से महाप्राण मध्यम और DPBS के साथ कोशिकाओं कुल्ला।
      1. महाप्राण DPBS के और 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएँ में 0.4 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया संघर्ष करने के लिए 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म ते मध्यम जोड़ें।
    4. हार्वेस्ट कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 200 XG और महाप्राण मध्यम पर। Resuspend 1 मिलीलीटर ES सेल मध्यम में कोशिकाओं और कोशिकाओं की गिनती। </ ली>
    5. 3 एक्स 10 4/2 सेमी के घनत्व में जिलेटिन लेपित प्लेटों पर प्लेट ESCs। ESCs के बारे में 90% मिला हुआ जब तक पहुँचने के बारे में दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 सेते हैं। मध्यम हर रोज बदलें।
    6. ESCs 90% मिला हुआ हैं, तो दोहराने पूरी तरह से MEF भक्षण को दूर करने के 1.2.2-1.2.5 कदम।
  3. ईबी गठन के द्वारा सीपीसी भेदभाव प्रेरित
    1. बाद के रूप में भेदभाव मध्यम तैयार: 36 मिलीलीटर IMDM, 12 एमएल हाम F12, 2 मिमी एल glutamine, 0.34 मिलीग्राम बीएसए (7.5%), 0.25 मिलीग्राम एन 2, 0.5 मिलीग्राम B27, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एए, और 0.45 मिमी 1-thioglycerol।
    2. महाप्राण कोशिकाओं से मध्यम और DPBS के साथ कुल्ला। महाप्राण DPBS के और 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएँ में 0.4 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एकल कक्षों में सेल समूहों को तितर-बितर करने के लिए नीचे प्रतिक्रिया और पिपेट अप संघर्ष करने के लिए और 1 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम जोड़ें।
    4. अपकेंद्रित्र ESCs 5 मिनट के लिए 200 XG पर और मध्यम त्यागें।
      1. Resuspend 1 एक्स 10 6 </ Sup> 1 मिलीलीटर भेदभाव माध्यम में ESCs। पहले ईबी एकत्रीकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर भेदभाव माध्यम में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में कम टुकड़ी पेट्री डिश में कोशिकाओं कोशिकाओं की गणना, और संस्कृति।
    5. दो दिन ईबी गठन के बाद, 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए व्यंजन से ईबीएस हस्तांतरण। एक मिनट के लिए 200 XG पर स्पिन। मध्यम निकालें और सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + बिना 10 मिलीलीटर DPBS के साथ ईबीएस कुल्ला।
    6. महाप्राण DPBS और 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 4.5 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम जोड़ें। Pipet और नीचे एकल कक्षों में ईबीएस अलग कर देना।
    7. 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। 1 मिलीलीटर भेदभाव माध्यम में महाप्राण मध्यम और resuspend कोशिकाओं।
    8. कोशिकाओं की गणना, और भेदभाव माध्यम में 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के लिए 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं पतला। 5 एनजी / एमएल, 0.8 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता में मध्यम करने के लिए वीईजीएफ़, BMP4 और Activin एक जोड़ है, और 5 एनजी / एमएल, क्रमशः। Cultu37 डिग्री सेल्सियस पर दूसरा ईबी गठन के लिए पेट्री डिश में कोशिकाओं को फिर से।
    9. दूसरा ईबी गठन के बाद 40 घंटा, 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए ईबीएस हस्तांतरण। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin साथ ईबीएस अलग कर देना, DPBS के साथ एक बार कुल्ला। Pipet और नीचे एकल कक्षों में ईबीएस अलग कर देना।
    10. 5 एनजी / एमएल वीईजीएफ़, 10 एनजी / एमएल bFGF और 12.5 एनजी / एमएल FGF10 साथ Stempro-34 मध्यम में कोशिकाओं Resuspend। जिलेटिन लेपित प्लेटों में 2 एक्स 10 5/2 सेमी में कोशिकाओं थाली। सीपीसी अलगाव से पहले के बारे में 32 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति।
  4. MCPCs पृथक
    1. महाप्राण मध्यम और DPBS के साथ कुल्ला। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों के लिए 0.5 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 4.5 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम जोड़ें। Pipet और नीचे एकल कक्षों में ईबीएस अलग कर देना। FACS-शुद्धि के लिए 2% FBS के / पीबीएस में सेंट्रीफ्यूज और resuspend कोशिकाओं से कोशिकाओं को इकट्ठा।
    2. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सॉर्टर पर समान ESCs चलाएँ। बदले वोल्टेज आगे गोबर को समायोजित करने के लिएआतंकवाद (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) वांछित जनसंख्या का चयन करने के लिए। मलबे और नक़ल को बाहर करने के पक्ष तितर बितर और चौड़ाई बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई बनाम तितर बितर आगे का प्रयोग करें। चयनित उप-जनसंख्या में, ईएससी नियंत्रण के वितरण के अनुसार, सेल autofluorescence खत्म करने के लिए हिस्टोग्राम पर सकारात्मक YFP के एक गेट आकर्षित। YFP + gating से YFP + सीपीसी लीजिए।
    3. भेदभाव मध्यम (1.3.1) के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें में शुद्ध सीपीसी (YFP + कोशिकाओं) प्लेट। Cardiomyocytes और एसएमसी में सीपीसी के भेदभाव के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति अतिरिक्त 3-5 दिनों के लिए।

मानव ESCs से मानव भ्रूण सीपीसी की 2. व्युत्पत्ति

  1. भक्षण तैयार करें
    1. 2 एक्स 10 4/2 सेमी के घनत्व पर ऊपर वर्णित के रूप में माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts फीडर परत तैयार करें।
  2. मानव ESCs बनाए रखें
    1. रचनात्मक; M पर नियमित pCAG-flox बंद flox-GFP या आरएफपी ESCs: मानव ISL1 बनाए रखेंनियमित hESC मध्यम (नॉकआउट DMEM / एफ-12 385 मिलीलीटर, नॉकआउट एसआर 100 मिलीलीटर, 2 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी NEAA, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 10 एनजी / एमएल बुनियादी FGF) का उपयोग एफई। हृदय भेदभाव करने से पहले, कम से कम दो मार्ग के लिए फीडर मुक्त हालत में मानव ESCs हस्तांतरण।
  3. फीडर मुक्त हालत में मानव ESCs तैयार करें
    1. मानव ESCs संस्कृति के लिए लेपित प्लेटें तैयार करें।
      1. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर Matrigel गला लें। बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब रखो और ट्यूब में 30 मिलीलीटर ठंड DMEM / F12 मध्यम जोड़ें।
      2. ठंड माध्यम में 1 मिलीलीटर Matrigel जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। एक 10 सेमी डिश में 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से या 5 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर ठंड Matrigel-DMEM / 12 मध्यम जोड़ें।
      3. 2 घंटे के लिए प्लेटें / 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर बर्तन या कमरे के तापमान के लिए छोड़ दें। महाप्राण माध्यम का उपयोग करने से पहले।
    2. MEF थाली से महाप्राण मीडिया और DPBS के साथ मानव ESCs कुल्ला: मानव प्लेटों पर ESCs विभाजित। तो 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर dispase (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस में कोशिकाओं को सेतेइनक्यूबेटर कालोनियों के किनारों को अलग करने के लिए शुरू जब तक।
    3. Dispase समाधान निकालें। तो 2.5 मिलीलीटर जोड़ने / अच्छी तरह से mTeSR मध्यम या MEF वातानुकूलित मध्यम प्रति थाली करने के लिए, दो बार DPBS के साथ कुल्ला।
    4. छोटे गुच्छों में मानव ईएससी कालोनियों को तोड़ने के लिए नीचे एक सेल खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं परिमार्जन और ध्यान से ऊपर pipet और।
    5. ईएससी गुच्छों के स्थानांतरण और एक पतला: 3 लेपित प्लेटों में।
    6. 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह mTeSR मध्यम या MEF वातानुकूलित मध्यम जोड़ें और दैनिक मध्यम बदल जाते हैं।
    7. MTeSR मध्यम या कम से कम दो मार्ग के लिए लेपित प्लेटों पर MEF वातानुकूलित माध्यम में संस्कृति मानव ESCs।
  4. मानव ESCs से सीपीसी भेदभाव प्रेरित
    1. कोशिकाओं ~ 90% मिला हुआ हैं, तो मध्यम महाप्राण और DPBS के साथ कुल्ला। फिर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीग्राम / एमएल Dispase में hESCs सेते हैं।
    2. एक सेल चोर के साथ प्लेटों से कोशिकाओं को हटाने, दो बार DPBS के साथ hESCs कुल्ला, तो DMEM / F12 18% FBS के, 0.1 मिमी NEAA, 2 मिमी युक्त (भेदभाव मध्यम में सेल clamps के resuspendएल glutamine, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol और 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Ascorbic एसिड)।
    3. ईबी गठन के लिए 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों में कोशिकाओं स्थानांतरण।
    4. अगले दिन भेदभाव मध्यम बदलें।
    5. हर 3 दिन मध्यम बदलें और निलंबन संस्कृति में ईबीएस बनाए रखें।
  5. HCPCS पृथक
    1. कोई बाद में मानव सीपीसी अलगाव के लिए भेदभाव के दिन 9 से ईबीएस लीजिए।
    2. महाप्राण मध्यम और दो बार DPBS के साथ ईबीएस कुल्ला। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.5 मिलीलीटर 0.25% trypsin जोड़ें।
    3. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए भेदभाव माध्यम के बराबर मात्रा में जोड़ें। Pipet और नीचे एकल कक्षों में ईबीएस अलग कर देना। 2% FBS के / DPBS में 5 मिनट और resuspend कोशिकाओं के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र से कोशिकाओं को इकट्ठा। 40 माइक्रोन सेल झरनी और FACS शुद्ध आरएफपी + सीपीसी कोशिकाओं के साथ फ़िल्टर कोशिकाओं के रूप में 1.4.3 में वर्णित है।
    4. प्लेट geltin में लिपटे प्लेटों पर HCPCS हल। 7 के लिए भेदभाव माध्यम में संस्कृति HCPCS-9 दिनों cardiomyocyte और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए। 7 दिनों के चढ़ाना के बाद, संस्कृति DMEM / F12 मध्यम में 5% नॉकआउट एसआर साथ कोशिकाओं विभेदित।

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Representative Results

प्रोटोकॉल कई ES सेल लाइनों से सीपीसी की व्युत्पत्ति को दर्शाता है। ESCs सीपीसी में अंतर करने के लिए ईबीएस के लिए फार्म एकत्रित कर रहे हैं। ESCs नियमित MEF भक्षण (चित्रा 1 ए, एफ) पर रखा जाता है और भक्षण भेदभाव से पहले हटा रहे हैं। भेदभाव माध्यम में ईबीएस (चित्रा 1 बी, जी) में ESCs के एकत्रीकरण पर, दूसरे का गठन ईबीएस माउस सेल लाइनों (चित्रा 1C) में मेसोडर्म भेदभाव को बढ़ाने के लिए BMP4 और Activin एक साथ व्यवहार कर रहे हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन YFP / आरएफपी (चित्रा -1) द्वारा की पहचान के रूप में ESCs हृदय वंश में भेदभाव कर रहे हैं। सीपीसी (चित्रा 1H) FACS के शुद्ध और cardiomyocytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए आगे सुसंस्कृत थे। cTnT और एस.एम.-एमएचसी की धुंधला cardiomyocytes और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (Figure1 ई, मैं, जम्मू) में सीपीसी के भेदभाव क्षमता दिखाया। आमतौर पर, 80-90% सीपीसी माउस ईएससी भेदभाव prot से प्राप्त कर रहे हैंocol और 0.5-5% सीपीसी मानव ईएससी भेदभाव प्रोटोकॉल से प्राप्त कर रहे हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1: multipotent सीपीसी में ESCs के भेदभाव। (एई) माउस ईएससी भेदभाव। फीडर कोशिकाओं में माउस ईएससी के (ए) आकृति विज्ञान। (बी) माउस ESCs के पहले ईबी गठन। (सी) वृद्धि कारकों के साथ भेदभाव माध्यम में दूसरा ईबी गठन। (डी) सीपीसी YFP व्यक्त कर रहे हैं। (ई) cardiomyocytes (cTnT +) FACS के शुद्ध सीपीसी से निकाली गई है। मानव ESCs के (FJ) भेदभाव। मानव ईएससी के (एफ) आकृति विज्ञान फीडर कोशिकाओं पर बनाए रखा। मानव ES कोशिकाओं (G) ईबी गठन। (एच) FACS के शुद्ध सीपीसी की। (आई जे) सीपीसी cardiomyocytes (cTnT +) और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में भेदभाव (एस-एमएचसी + इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

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Lei Bu

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से कार्डिएक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की व्युत्पत्ति
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Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z.… More

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

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