Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52047
Automatic Translation
1, 2, 1
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Introduction

Hjertesykdom er fortsatt den ledende årsak i verden i dag, og dødsrater har vært tilnærmet uendret de siste to tiårene (American Heart Association). Det er et kritisk behov for å utvikle nye terapeutiske strategier for effektivt å forebygge eller reversere hjertesvikt. En lovende strategi er cellebasert behandling etter den raske utviklingen av stamcelle biologi 1. I denne forbindelse, kan multipotente CPC-være en utmerket cellekilde for terapi på grunn av deres evne til å proliferere, men opptatt bare for hjerte avstamning differensiering. Derfor, effektiv og robust metode generere og isolere CPC-er av stor betydning for hjertecelle terapistudier.

Denne protokollen fokuserer på embryonale CPC identifisert under tidlig embryo og hvordan deres generasjon fra ESCs. Ulike CPC har blitt isolert fra embryonale og voksne hjerter, selv fra benmarger to. Under embryo utvikling, bein morphogemagnetiske proteiner (BMPs), vingeløse-type MMTV integrering nettstedet familiemedlemmer (Wnts) og nodal signaler indusere engasjementet til Mesp1 + multipotent mesoderm tre. Mesp1 + celler deretter differensieres til de embryonale CPC 4. Disse CPC er vanligvis preget av HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), og myocyte Enhancer faktor 2C (Mef2c), danner primære og andre hjerte felt, og bidra til de store deler av hjertet under cardiogenesis 5-10. Både Nkx2-5 + og Isl1 + / Mef2c + CPC er i stand til å differensiere i kardiomyocytter, glatte muskelceller (SMCS), og endotelceller 5-8. Dermed disse CPC vil gi opphav til hjerte blodkar samt hjerte vev, og er en ideell celle kilde for celle-baserte hjerteterapi. Derfor har generere CPC in vitro vært en stor forskningsfokus i hjerte-studier. Siden ESCs har ubegrenset kapasitetsutvidelse ennd representerer ICM celler på blastocyststadiet, er differensiering av ESCs til embryonale CPC følge den naturlige embryogenese betraktet som en logisk og effektiv tilnærming for å oppnå CPC.

En mye brukt metode for å skaffe CPC fra ESCs er å aggregere ESCs inn EBS 11. For å bedre differensiering effektivitet, har definert kjemiske og vekstfaktorer basert på kunnskap om hjerte utvikling blitt brukt 12-14. Det finnes imidlertid ingen definitive CPC markører, spesielt ikke noen celleoverflatemarkører som er vidt akseptert på området. For å løse dette problemet, er ESCs konstruert for å markere Isl1 + eller Mef2c + CPC og deres derivater med fluorescerende reportere bruker Cre / loxP system. Den ere rekombinase blir slått på under kontroll av Isl1 / Mef2c promoter / enhancer. Modifisert fluorescerende protein RFP eller YFP genet drevet av en konstitutiv promoter kan aktiveres ved fjerning av FLOX stoppkodon med ere rekombinase(ISL1: CRE; pCAG-FLOX-STOP-FLOX-GFP eller RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) 5,6. Når ESCs er differensiert i andre hjerte felt CPC, vil Isl1 / Mef2c promoter / enhancer drevet cre aktivere fluorescerende reportere og CPC kan bli beriket av FACS-rensing. I korthet er EB aggregering metode som brukes for å initiere ESC differensiering. For å forbedre effektiviteten differensiering, er de differensierte cellene behandlet med askorbinsyre (AA), og vekstfaktorer som Bmp4, aktivin A og VEGF 13,15. Denne protokollen tillater robust og effektiv CPC differensiering ved hjelp av både mus og menneske ESCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utledning av Mouse Embryonic CPC fra Mouse ESCs

  1. Forberede mus embryonale fibroblaster (MEFs) mater lag.
    1. Varm MEF-medium (10% FBS i DMEM) til 37 ° C.
    2. Forbered gelatin belagte plater.
      1. Tilsett 1 ml 0,1% gelatin i vann inn i en brønn på 6-brønners plate eller 5 ml i en 10 cm plate.
      2. La plater eller retter på 37 ° C eller romtemperatur i minst 30 min. Aspirere gelatinen før bruk.
    3. Tine bestrålt MEFs raskt i et 37 ° C vannbad med forsiktig risting.
    4. Overfør cellene forsiktig i et 15 ml eller 50 ml konisk rør. Tilsett 5 ml forvarmet MEF medium. Virvel cellene langsomt og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
    5. Resuspender cellene i MEF medium og telle levedyktige celler. Bruk følgende volumer av MEF medium: 2 ml for celler per brønn fra en seks-brønns plate og 10 ml for celler fra en 10 cm tallerken.
    6. Plate celler i seks-brønns plater eller 10 cm retter på 1-2x 10 6 per plate / fatet.
    7. Inkuber MEF plater / retter på 37 ° C, 5% CO 2 i minst 24 timer før bruk.
      MERK: Kast MEF plater / retter som er eldre enn en uke.
  2. Forberede mus ESCs
    1. Kultur Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP mus ESCs på MEFs till 90% sammenflytende. Bruk ES cellemedium bestående av 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM pyruvat, 100 U Pen / Strep, og 0,1 mM β-merkaptoetanol.
    2. Forbered gelatin belagt seks-brønns plater som beskrevet i 1.1.2.
    3. Aspirer medium fra plater og skyll celler med DPBS.
      1. Aspirer DPBS og tilsett 0,4 ml 0,25% trypsin i en brønn av seks-brønners plate. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 min. Tilsett 1 ml forvarmet ES mellom å slutte Trypsin reaksjon.
    4. Høste celler og sentrifuger cellene ved 200 xg og aspirer medium. Resuspender celler i en ml ES celle medium og telle cellene. </ Li>
    5. Tallerken ESCs på gelatin-belagte plater ved tetthet på 3 x 10 4 / cm2. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i ca. 2 dager ved ESCs nå omtrent 90% sammenflytende. Endre medium hverdagen.
    6. Når ESCs er 90% sammenflytende, gjenta punktene 1.2.2-1.2.5 å fjerne de MEF matere.
  3. Indusere CPC differensiering av EB formasjon
    1. Forbered differensieringsmedium som følger: 36 ml IMDM, 12 ml Hams F12, 2 mM L-glutamin, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 ug / ml AA, og 0,45 mM 1-tioglycerol.
    2. Aspirer medium fra celler og skyll med DPBS. Aspirer DPBS og tilsett 0,4 ml 0,25% trypsin i en brønn av seks-brønners plate. Inkuber ved 37 ° C i 5 min.
    3. Tilsett 1 ml differensieringsmedium for å stanse reaksjonen, og pipetten opp og ned for å dispergere celleklynger til enkeltceller.
    4. Sentrifuger ESCs 200 xg i 5 min og kaste mediet.
      1. Resuspender 1 x 10 6 </ Sup> ESCs i en ml differensiering medium. Tell cellene og kultur ble cellene i lav løsgjøring petriskål ved en konsentrasjon på 5 x 10 celler / ml i differensieringsmedium ved 37 ° C i første EB aggregering.
    5. To dager etter at EB formasjon, overføre EBS fra retter til 50 ml rør. Spinne ved 200 xg i 1 min. Fjern medium og skyll EBS med 10 ml DPBS uten Ca 2+ og Mg 2+.
    6. Aspirer DPBS og tilsett 1 ml 0,25% Trypsin. Inkuber ved 37 ° C i 5 min. Legg 4,5 ml differensieringsmedium for å stoppe reaksjonen. Pipet opp og ned for å distansere EBS i enkeltceller.
    7. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 5 min. Sug medium og resuspender celler i en ml differensiering medium.
    8. Tell cellene, og fortynn 2 x 10 celler 6 til 1 x 10 5 celler / ml i differensieringsmediet. Legg VEGF, Bmp4 og aktivin A til mediet ved sluttkonsentrasjon på 5 ng / ml, 0,8 ng / ml og 5 ng / ml, henholdsvis. Culture cellene i petriskål for andre EB dannelse ved 37 ° C.
    9. 40 timer etter at andre EB formasjon, overføre EBS til 50 ml rør. Skyll med DPBS gang, dissosiere EBS med 1 ml 0,25% trypsin ved 37 ° C i 5 min. Pipet opp og ned for å distansere EBS i enkeltceller.
    10. Resuspender cellene i Stempro-34 medium med 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF og 12,5 ng / ml FGF10. Plate cellene på 2 x 10 5 / cm 2 i gelatin-belagte plater. Kultur i 37 ° C inkubator for omtrent 32 timer før CPC isolasjon.
  4. Isolere mCPCs
    1. Aspirer medium og skyll med DPBS. Tilsett 0,5 ml 0,25% Trypsin til kulturplater ved 37 ° C i 5 min. Legg 4,5 ml differensieringsmedium for å stoppe reaksjonen. Pipet opp og ned for å distansere EBS i enkeltceller. Samle cellene sentrifuge og resuspender celler i 2% FBS / PBS for FACS-rensing.
    2. Kjør udifferensierte ESCs på sorter som negativ kontroll. Endre spenning for å justere frem scatter (FSC) og side scatter (SSC) for å velge ønsket befolkningen. Bruk frem spre versus side scatter og fremover scatter høyde versus bredde å utelukke rusk og dublett. I den valgte sub-populasjon, i henhold til fordeling av MGP-kontroller, tegne en gate av YFP positiv på histogrammet for å eliminere celle autofluorescence. Samle YFP + CPC fra YFP + gating.
    3. Plate de rensede CPC (YFP + celler) i seks-brønns plater med differensiering medium (1.3.1). Kultur ytterligere 3-5 dager ved 37 ° C for differensiering av CPC inn kardiomyocytter og SMC.

2. Utledning av humane embryonale CPC fra menneske ESCs

  1. Forberede Feeders
    1. Forbered mus embryoniske fibroblaster (MEFs) mater sjikt som beskrevet ovenfor, ved en tetthet på 2 x 10 4 / cm2.
  2. Opprettholde menneskelige ESCs
    1. Opprettholde menneskers ISL1: cre; pCAG-FLOX-STOP-FLOX-GFP eller RFP ESCs rutinemessig på MEF bruker vanlig hESC medium (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml basisk FGF). Før hjerte differensiering, overføre menneskelige ESCs i mater fri tilstand i minst to passeringer.
  3. Forberede menneskelige ESCs i mater fri tilstand
    1. Forberede belagte plater for menneske ESCs kultur.
      1. Tine matrigel ved 4 ° C over natten. Sett en 50 ml tube på is og tilsett 30 ml kaldt DMEM / F12 medium inn i røret.
      2. Tilsett 1 ml matrigel inn i det kalde mediet, og bland godt. Tilsett 1 ml kald matrigel-DMEM / 12 medium inn i en brønn på 6-brønners plate eller 5 ml i en 10 cm plate.
      3. La platene / tallerkner ved 4 ° C over natten eller ved romtemperatur i 2 timer. Aspirer medium før bruk.
    2. Splitte menneskelige ESCs på plater: Sug media fra MEF plate og skyll menneskelige ESCs med DPBS. Deretter tilsett 1 ml dispase (1 mg / ml) til en brønn på 6-brønners plate. Inkuber cellene i 37 ° Cinkubator inntil kantene av kolonier begynner å løsne.
    3. Fjern dispase løsning. Skyll med DPBS to ganger, deretter legge til 2,5 ml / per brønn mTeSR medium eller MEF kondisjonerte medium til plate.
    4. Skrape celler ved hjelp av en celle skrape og nøye pipettér opp og ned for å bryte menneske MGP koloniene i små klumper.
    5. Overføre MGP klumper og fortynne 1: 3 i de belagte plater.
    6. Tilsett 2 ml / godt mTeSR medium eller MEF kondisjonerte medium og endre medium daglig.
    7. Kultur menneskelige ESCs i mTeSR medium eller MEF kondisjonerte medium på belagte plater i minst to passeringer.
  4. Indusere CPC differensiering fra menneskelige ESCs
    1. Når cellene er ~ 90% konfluent, aspireres mediet og skyll med DPBS. Deretter inkuberes det hESCs i 0,5 mg / ml Dispase ved 37 ° C i 20 min.
    2. Skyll hESCs med DPBS to ganger, fjerne celler fra platene med en celle løfter, deretter resuspender celle klemmer i differensiering medium (DMEM / F12 inneholder 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2mML-glutamin, 0,1 mM β-merkaptoetanol og 50 ug / ml askorbinsyre).
    3. Overfør cellene i 6-brønners ultralave festeplater for EB formasjonen.
    4. Endre differensiering medium neste dag.
    5. Erstatte medium hver 3. dag og vedlikeholde EBS i suspensjon kultur.
  5. Isolere HCPCS
    1. Samle EBS senest dag 9 av differensiering for menneskelig CPC isolasjon.
    2. Aspirer medium og skyll EBS med DPBS to ganger. Tilsett 0,5 ml 0,25% Trypsin til hver brønn på 6-brønners kulturplater ved 37 ° C i 5 min.
    3. Legg likt volum av differensieringsmedium for å stoppe reaksjonen. Pipet opp og ned for å distansere EBS i enkeltceller. Samle cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter og resuspender cellene i 2% FBS / DPBS. Filtrer celler med 40 um cellefilter og FACS-rensede RFP + CPC-celler som beskrevet i 1.4.3.
    4. Plate sortert HCPCS bort på geltin-belagte plater. Kultur HCPCS i differensiering medium for 7-9 Dager for å differensiere til cardiomyocyte og glatte muskelceller. 7 dager etter plating, kultur differensierte celler med 5% Knockout SR i DMEM / F12 medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen viser avledning av CPC fra flere ES cellelinjer. ESCs aggregeres til å danne EBS å differensiere i CPC. ESCs blir rutinemessig opprettholdes på MEF matere (figur 1A, F) og matere er fjernet før differensiering. Ved aggregering av ESCs inn EBS i differensieringsmedium (figur 1 B, G), er andre som dannes EBS behandlet med Bmp4 og aktivin A for å forbedre mesoderm differensiering i musecellelinjer (figur 1C). ESCs er differensiert i hjerte avstamning som er identifisert av fluoriserende protein YFP / RFP (figur 1D). CPC-er var i FACS-rensede (figur 1 H) og videre dyrket til å differensiere til kardiomyocytter og glatte muskelceller. Fargingen av cTnT og SM-MHC viste differensieringen kapasitet på CPC-i kardiomyocytter og glatte muskelceller (Figur 1 E, I, J). Vanligvis er 80-90% CPC hentet fra mus ESC differensiering protocol og 0,5-5% CPC er hentet fra den menneskelige ESC differensiering protokollen.

Figur 1
Figur 1: Differensiering av ESCs til multipotente CPC. (AE) mus ESC differensiering. (A) Morfologi av mus ESC i mateceller. (B) First EB dannelsen av mus ESCs. (C) Second EB formasjonen i differensiering medium med vekstfaktorer. (D) CPC uttrykker YFP. (E) kardiomyocytter (cTnT +) avledet fra FACS-rensede CPC. (FJ) Differensiering av menneskelige ESCs. (F) Morfologi av menneskelig ESC opprettholdes på mateceller. (G) EB dannelsen av menneskelige ES-celler. (H) FACS-renset av CPC. (IJ) CPC differensiert i kardiomyocytter (cTnT +) og glatte muskelceller (SM-MHC + Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).

Tags

Developmental Biology embryonale stamceller embryoid kropper hjerte stamceller hjerte differensiering FACS-sortering fluorescerende reporter

Erratum

Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z.… More

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter