Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52047
Automatic Translation
1, 2, 1
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Introduction

Hjärtsjukdom är fortfarande den ledande orsaken i världen idag och dödstalen har förblivit i stort sett oförändrade under de senaste två decennierna (American Heart Association). Det finns ett kritiskt behov av att utveckla nya terapeutiska strategier för att effektivt förhindra eller vända hjärtsvikt. En lovande strategi är cellbaserad terapi efter den snabba utvecklingen av stamcellsbiologi 1. I detta hänseende skulle multipotenta CPC vara en utmärkt cellkälla för terapi på grund av deras förmåga att proliferera men beslutats endast till hjärt härstamning differentiering. Därför, för att effektivt och robust metod generera och isolera CPC är av stor betydelse för hjärtcellterapistudier.

Detta protokoll är inriktat på embryonala CPC identifierats under tidig embryogenes och hur deras generation från ekonomiska och sociala råd. Olika CPC har isolerats från embryonala och vuxna hjärtan, även från benmärg 2. Under embryoutveckling, ben morphogetiska proteiner (BMP), vinglös typ medlemmar MMTV integrations sajt familj (Wnts) och knutpunkter signaler inducerar åtagande Mesp1 + multi mesoderm 3. Mesp1 + celler differentierar sedan in i de embryonala CPC 4. Dessa CPC vanligtvis präglas av HCN4, NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), och myocyt förstärkare faktor 2C (Mef2c), bildar primära och andra hjärtfält, och bidra till stora delar av hjärtat under kardiogenes 5-10. Både Nkx2-5 + och Isl1 + / Mef2c + CPC har möjlighet att differentiera till kardiomyocyter, glatta muskelceller (SMC), och endotelceller 5-8. Således dessa CPC kommer att ge upphov till hjärtkärl samt hjärtvävnad och är en idealisk cellkälla för cellbaserad hjärtbehandling. Följaktligen genererar CPC in vitro har varit en viktig forskningsfokus i kardiovaskulära studier. Eftersom ekonomiska och sociala råd har obegränsad kapacitetsutbyggnad and representera ICM cellerna i blastocyststadiet, är differentiering av ekonomiska och sociala råd i embryonala CPC efter den naturliga embryogenes betraktas som en logisk och effektiv metod för att få CPC.

Ett allmänt tillämpad metod för att erhålla CPC från ekonomiska och sociala råd är att aggregera ESCs i EBS 11. För att förbättra differentieringseffektiviteten, har definierade kemiska och tillväxtfaktorer som bygger på kunskap om hjärt utveckling använts 12-14. Det finns dock inga definitiva CPC markörer, särskilt inga cellytan markörer, som allmänt accepterade inom området. För att lösa detta problem, är ekonomiska och sociala råden konstruerad för att markera Isl1 + eller Mef2c + CPC och deras derivat med fluorescerande reportrar använder Cre / loxP-systemet. Cre-rekombinas slås in under kontroll av Isl1 / Mef2c promotor / förstärkare. Modifierad fluorescerande protein RFP eller YFP-genen som drivs av en konstitutiv promotor kan aktiveras genom excision av flox stoppkodonet med cre-rekombinas(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP eller RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) 5,6. När ESC differentieras till andra hjärtfält CPC, kommer Isl1 / Mef2c promotor / enhancer driven cre aktivera fluorescerande reportrar och CPC kan berikas av FACS-rening. I korthet är EB aggregering metod som används för att initiera ESC differentiering. För att öka differentiering effektivitet, är de differentierade cellerna behandlades med askorbinsyra (AA) och tillväxtfaktorer såsom BMP4, Aktivin A och VEGF 13,15. Detta protokoll möjliggör robusta och effektiva CPC differentiering med både mus och mänskliga ekonomiska och sociala råd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Härledning av Mouse embryonala CPC från mus ESC

  1. Förbered musen embryonala fibroblaster (MEF) matarskikt.
    1. Varm MEF medium (10% FBS i DMEM) till 37 ° C.
    2. Bered gelatinbelagda plattor.
      1. Tillsätt 1 ml 0,1% gelatin i vatten i en brunn i 6-brunnars platta eller 5 ml i en 10 cm skål.
      2. Lämna fat eller tallrikar vid 37 ° C eller rumstemperatur i minst 30 minuter. Aspire gelatinet före användning.
    3. Thaw bestrålad MEFs snabbt i en 37 ° C vattenbad, med försiktig skakning.
    4. Överför cellerna försiktigt till en 15 ml eller 50 ml koniska rör. Tillsätt 5 ml förvärmda MEF medium. Snurra cellerna långsamt och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
    5. Resuspendera cellerna i MEF medium och räkna livskraftiga celler. Använd följande volymer av MEF-medium: 2 ml för celler per brunn från en 6-brunnar och 10 ml för celler från en 10 cm skål.
    6. Plate celler i 6-brunnsplattor eller 10 cm skålar vid 1-2X 10 6 per platta / skål.
    7. Inkubera MEF plattor / rätter vid 37 ° C, 5% CO2 minst 24 timmar före användning.
      OBS: Kasta MEF plattor / rätter äldre än en vecka.
  2. Förbered mus ESC
    1. Kultur för Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP mus ESCs på MEFs To 90% konfluenta. Använd ES-cell-medium bestående av 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM pyruvat, 100 U Pen / Strep, och 0,1 mM β-merkaptoetanol.
    2. Bered gelatinbelagda 6-brunnsplattor såsom beskrivits i 1.1.2.
    3. Sug medium från plattor och skölj celler med DPBS.
      1. Aspirera DPBS och tillsätt 0,4 ml 0,25% trypsin i en brunn på 6-brunnars platta. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 5 min. Tillsätt 1 ml förvärmda ES medel att upphöra trypsin reaktion.
    4. Skörda celler och Centrifugera cellerna vid 200 xg och aspirera mediet. Resuspendera cellerna i 1 ml ES cellmedium och räkna cellerna. </ Li>
    5. Plate ESCs på gelatinbelagda plattor vid densitet av 3 x 10 4 / cm 2. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 i ca 2 dagar när ESCs når omkring 90% konfluenta. Ändra mediet vardag.
    6. När ekonomiska och sociala råd är 90% sammanflytande, upprepa steg 1.2.2-1.2.5 att helt ta bort MEF matare.
  3. Framkalla CPC differentiering av EB bildning
    1. Förbered differentieringsmedium som följer: 36 ml IMDM, 12 ml Hams F12, 2 mM L-glutamin, 0,34 ml BSA (7,5%), 0,25 ml N2, 0,5 ml B27, 50 pg / ml AA, och 0,45 mM 1-tioglycerol.
    2. Sug medium från celler och skölj med DPBS. Aspirera DPBS och tillsätt 0,4 ml 0,25% trypsin i en brunn på 6-brunnars platta. Inkubera vid 37 ° C under 5 min.
    3. Tillsätt 1 ml differentieringsmedium för att avsluta reaktionen och pipett upp och ner för att dispergera cellkluster i enstaka celler.
    4. Centrifugera ekonomiska och sociala råd på 200 xg under 5 min och kassera mediet.
      1. Resuspendera 1 x 10 6 </ Sup> ekonomiska och sociala råd i 1 ml differentiering medium. Räkna celler och odla cellerna i låg lösgörpetriskål vid koncentration av 1 x 10 5 celler / ml i differentieringsmedium vid 37 ° C under första EB-aggregation.
    5. Två dagar efter EB formation, överföra EBS från disk till 50 ml rör. Spin vid 200 xg under 1 min. Ta medium och skölj EB med 10 ml DPBS utan Ca2 + och Mg2 +.
    6. Sug DPBS och tillsätt 1 ml 0,25% trypsin. Inkubera vid 37 ° C under 5 min. Lägg 4,5 ml differentiering medium för att stoppa reaktionen. Pipettera upp och ner för att dissociera EBS i enskilda celler.
    7. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 minuter. Aspirera medelstora och återsuspendera cellerna i 1 ml differentiering medium.
    8. Räkna celler och späd 2 x 10 6 celler till 1 x 10 5 celler / ml i differentieringsmedium. Lägg VEGF, BMP4 och Aktivin A till mediet vid slutlig koncentration av 5 ng / ml, 0,8 ng / ml, och 5 ng / ml, respektive. Culture cellerna i petriskål för andra EB bildning vid 37 ° C.
    9. 40 timmar efter andra EB formation, överföra EBS till 50 ml rör. Skölj med DPBS gång, dissociera EB med en ml 0,25% trypsin vid 37 ° C under 5 min. Pipettera upp och ner för att dissociera EBS i enskilda celler.
    10. Resuspendera cellerna i Stempro-34-medium med 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF och 12,5 ng / ml FGF10. Plate cellerna vid 2 x 10 5 / cm2 i gelatinbelagda plattor. Kultur i 37 ° C inkubator under ca 32 h före CPC isolering.
  4. Isolera mCPCs
    1. Aspirera medium och skölj med DPBS. Lägg 0,5 ml 0,25% trypsin till odlingsplattor vid 37 ° C under 5 min. Lägg 4,5 ml differentiering medium för att stoppa reaktionen. Pipettera upp och ner för att dissociera EBS i enskilda celler. Samla cellerna genom centrifuge och återsuspendera cellerna i 2% FBS / PBS för FACS-rening.
    2. Kör odifferentierade ESCs på sorterare som den negativa kontrollen. Ändra spänning för att justera framåt scatter (FSC) och sidospridning (SSC) för att välja önskad befolkningen. Använd framåt scatter kontra sidospridning och framåtspridning höjd kontra bredd att utesluta skräp och dubb. I den valda under befolkningen, enligt fördelningen av ESK kontroller, rita en grind YFP positivt på histogrammet för att eliminera cell autofluorescens. Samla YFP + CPC från YFP + gating.
    3. Plate de renade CPC (YFP + celler) i 6-brunnars plattor med differentieringsmedium (1.3.1). Kultur ytterligare 3-5 dagar vid 37 ° C för differentiering av CPC i hjärtmuskelceller och SMCs.

2. utvinning av mänskliga embryonala CPC från mänskliga ekonomiska och sociala råd

  1. Förbered Matare
    1. Förbered mus embryonala fibroblaster (MEF) matarskikt som beskrivits ovan vid en densitet av 2 x 10 4 / cm 2.
  2. Upprätthålla mänsklig ESC
    1. Upprätthålla mänsklig ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP eller RFP ekonomiska och sociala råd rutinmässigt på MEF använder vanlig hESC medium (Knockout DMEM / F-12 385 ml, Knockout SR 100 ml, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM NEAA, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml basisk FGF). Före hjärt differentiering, överföra mänskliga ekonomiska och sociala råd i matar fritt tillstånd i minst 2 passager.
  3. Förbered mänskliga ekonomiska och sociala råd i mataren fri skick
    1. Förbered belagda plattor för mänskliga ekonomiska och sociala råd kultur.
      1. Tina Matrigel vid 4 ° C över natten. Sätt en 50 ml rör på is och tillsätt 30 ml kallt DMEM / F12-medium i röret.
      2. Tillsätt 1 ml matrigel i det kalla mediet och blanda väl. Tillsätt 1 ml kall matrigel-DMEM / 12-medium i en brunn i 6-brunnar eller 5 ml i en 10 cm skål.
      3. Lämna tallrikar / rätter på 4 ° C över natten eller rumstemperatur i 2 timmar. Aspirera medium före användning.
    2. Split mänskliga ekonomiska och sociala råd på plattorna: Aspirera media från MEF plattan och skölj mänskliga ekonomiska och sociala råd med DPBS. Tillsätt sedan 1 ml dispas (1 mg / ml) till en brunn på 6-brunnar. Inkubera cellerna i 37 ° Cinkubator tills kanterna på kolonier börjar lossna.
    3. Avlägsna dispas lösning. Skölj med DPBS två gånger, tillsätt sedan 2,5 ml / per brunn mTeSR medium eller MEF-konditionerat medium till plattan.
    4. Skrapa celler med användning av en cellskrapa och försiktigt pipettera upp och ner för att bryta humana ESC kolonier i små klumpar.
    5. Överför ESK klumpar och späd 1: 3 i de belagda plattorna.
    6. Tillsätt 2 ml / väl mTeSR medium eller MEF-medium och ändra medel dagligen.
    7. Kultur mänskliga ekonomiska och sociala råd i mTeSR medium eller MEF-medium på belagda plattor i minst 2 passager.
  4. Framkalla CPC differentiering från mänskliga ekonomiska och sociala råd
    1. När cellerna är ~ 90% sammanflytande, aspirera på medellång och skölj med DPBS. Inkubera sedan hESCs i 0,5 mg / ml Dispase vid 37 ° C under 20 min.
    2. Skölj hESCs med DPBS två gånger, ta bort celler från plattor med en cell lyftare, resuspendera sedan klämmor cell i differentieringsmedium (DMEM / F12 innehållande 18% FBS, 0,1 mM NEAA, 2 mML-glutamin, 0,1 mM β-merkaptoetanol och 50 ^ g / ml askorbinsyra).
    3. Överför celler i 6-brunnars ultralåg fästplattor för EB formation.
    4. Ändra differentieringsmedium nästa dag.
    5. Byt medium var 3 dagar och underhålla EB i suspensionskultur.
  5. Isolera HCPCS
    1. Samla EB senast dag 9 av differentiering för human CPC isolering.
    2. Aspirera medium och skölj EB med DPBS två gånger. Lägg 0,5 ml 0,25% trypsin till varje brunn i 6-brunnars odlingsplattor vid 37 ° C under 5 min.
    3. Lägg lika volym differentieringsmedium för att stoppa reaktionen. Pipettera upp och ner för att dissociera EBS i enskilda celler. Samla cellerna genom centrifugera vid 200 xg under 5 min och återsuspendera cellerna i 2% FBS / DPBS. Filter celler med 40 ìm cell sil och FACS-renade RFP + CPC celler som beskrivs i 1.4.3.
    4. Plate sorterade HCPCS Onto geltin-belagda plattor. Kultur HCPCS i differentieringsmedium för 7-9 Dagar att differentiera till cardiomyocyte och glatta muskelceller. 7 dagar efter plätering, kultur differentierade celler med 5% Knockout SR i DMEM / F12-medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollet visar härledning av CPC från flera ES cellinjer. Ekonomiska och sociala råd aggregeras för att bilda EBS att differentieras till CPC. Ekonomiska och sociala råd rutinmässigt underhålls på MEF matare (Figur 1A, F) och matare avlägsnas innan differentiering. Vid aggregering av ekonomiska och sociala råd i EBS i differentiering medium (Figur 1B, G), är de andra bildade EBS behandlats med BMP4 och Aktivin A för att förbättra mesoderm differentiering i mus cellinjer (Figur 1C). Ekonomiska och sociala råd differentieras till hjärt härstamning som identifierats av fluorescerande protein YFP / RFP (Figur 1D). CPC var FACS-renat (figur 1 H) och odlades vidare differentieras till hjärtmuskelceller och glatta muskelceller. Färgningen av cTnT och SM-MHC visade differentieringskapacitet CPC i kardiomyocyter och glatta muskelceller (Figur1 E, I, J). Typiskt är 80-90% CPC erhållen från mus ESC differentierings protocol och 0,5-5% CPC erhålles från den humana ESC differentieringsprotokoll.

Figur 1
Figur 1: Differentiering av ekonomiska och sociala råd i multi CPC. (AE) mus ESC differentiering. (A) Morfologi av mus ESC i matarceller. (B) Första EB bildning mus ekonomiska och sociala råd. (C) Second EB bildning i differentiering medium med tillväxtfaktorer. (D) CPC uttrycker YFP. (E) Cardiomyocytes (cTnT +) härrör från FACS-renade CPC. (FJ) Differentiering av mänskliga ekonomiska och sociala råd. (F) Morfologi av humant ESC underhålls på matarceller. (G) EB bildandet av mänskliga ES-celler. (H) FACS-renade av CPC. (IJ) CPC differentieras till kardiomyocyter (cTnT +) och glatta muskelceller (SM-MHC + klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).

Tags

Developmental Biology embryonala stamceller embryoidkroppar hjärt progenitorceller hjärtdifferentiering FACS-sortering fluorescerande reporter

Erratum

Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z.… More

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter