Abstract
수리 및 골격 근육의 재생은 상주 근육 줄기 세포 인 위성 세포의 작용을 필요로한다. 이러한 문화에서 공부 인간의 근육 생검 소화 효소를 사용하여 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 할 수 있습니다. 정량적으로, 소화 효소에 의한 두 가지 점착성 세포 유형이있다 : (ⅰ) 위성 CD56 +로서 처음 확인 된 세포 (이라, 근원 세포 또는 근육 전구체 세포), 및 나중에 CD56 + / 최근 desmin + 세포와 같은 (II) muscle- 과 TE-7 + - CD56으로 식별 파생 섬유 아세포. 섬유 아세포 문화에 매우 효율적으로 증식 및 혼합 세포 집단에서 이러한 세포는 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다. 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 따라서 배양 중 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 여기에서 우리는 DESCR모두 고순도 (> 95 %, 근원 세포)과 좋은 수율 (~을주는 콜라겐을 사용하여 세포의 부드러운 소화 효소에 따라 정렬 및 자기 활성화 된 셀 정렬 (MACS) 다음 디스 파제의 시스템을 IBE 2.8 × 10 6 ± 8.87 문화 실험에 대한 시험 관내 7 일) 후 × 10 5 세포 / g 조직. 이 방법은 CD56에 대한 항체에 접합 된 마이크로 비드, 자기 비드와 혼합 된 근육 유래 세포 집단을 배양하고 자기장 비록 세포 전달에 기초한다. 마이크로 비드에 결합 된 CD56 + 세포는 CD56 반면 필드에 의해 유지됩니다 - 세포는 칼럼을 통해 방해받지 않고 전달합니다. 선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액을 도금하여 배양 할 수있다. 주어진 개입, 세포 형태 및 식 핵 전사 인자를 포함한 단백질의 위치 파악을 수행하면 특정 항체 및 화상 (p)과 면역 형광 표지를 사용하여 정량화 할 수있다세 싱 및 분석 패키지.
Introduction
골격근의 수선과 재생은 위성 셀 1, 근육 조직 줄기 세포 2,3-.의 작업이 필요한 생체 이들 세포는 모든 myofibre의 sarcolemma 및 기저판 사이에 가역적으로 정지 상태로 존재하지만, 증식 활성화 될, 퓨즈 및 근육 조직으로 분화가 손상 수리 (3)를 다시 생성됩니다. 위성 세포는 소화 효소 (4)를 사용하는 젊은 노인 인간의 근육 생검 샘플과 근육 조직 특성에서 분리 될 수는 이후 차 문화 (5)에서 공부하실 수 있습니다. 세포 집단 모두 수율 및 순도에 따른 본 분리 공정의 효율은 사용 된 방법에 따라 샘플들과 다를 수있다. 소화 효소에 의한 두 가지 종류의 세포 부착은 CD56 + / 최근 desmin 세포, 및 MU 당초 식별 위성 세포 (이제 지칭 근원 성 근육 세포 또는 전구 세포), 아르scle 유래 CD56으로 식별 섬유 아세포, - 그리고 TE7 + 셀 (5). 섬유 아 세포는 빠른 증식 속도를 가지고 있으며, 근원 세포와 같은 세포 - 세포 접촉시 돌이킬 수없는 성장 정지 및 터미널 차별화를받지 않는다 따라서 혼합 된 인구에, 섬유 아세포 문화를 지배하는 근육 조직 세포를 오버런 수 있습니다.
섬유 아세포는 종종 있지만, 자신의 권리 연구의 가치 세포와 같은 섬유 아세포에 대한 관심은 그들이 근육 수리 (6) 동안 근육 조직 세포와 협력 역할을하는 것으로 나타났다 특히로서, 지금이, 근육 생물학에 대한 자극으로 간주되어왔다 . 인간 근육 상이한 세포 유형의 분리 및 정제 배양 따라서 두 세포 유형의 타고난 거동을 조사하려고 방법론 중요한 고려 사항이다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 세포를 추후 연구 정렬 할 수있는 방법 및 / 또는 계산 및분석 하였다. FACS 확실 인간 근원 성 세포를 풍부하게 도시되었지만, 후속 배양을위한 세포의 수율이 높은 7 지금까지 없었다. 이러한 노화 4와 관련된 위성 세포 유래 근육 조직 세포와 매우 가난한 증식과 분화와 같은 체세포의 제한된 복제 가능성을 감안할 때, 더 부드러운 접근이 필요하다. 단일 근육 섬유의 문화는 또 다른, 덜 공격적, 자신의 sublaminal 틈새와 문화 8,9에서의 활성화 후 여전히 상주 쥐의 위성 세포를 얻는 수단 제공합니다. 그러나,이 기술은 인간의 근육 유래 세포 연구에 관심이 많은 연구소에 액세스 할 수 없습니다 것을 의미한다 (섬유가 거의 건에 건에서 얻을 수 없으므로) 인간의 근육 생검 재료에서 가능하지 않은 경우가 종종있다. 또한, 단일 섬유 기술은 매우 제한된 세포 수를 제공합니다.
여기에서 우리는 세대에 따라 정렬 시스템을 설명TLE 효소 콜라게나 제를 사용하여 세포의 소화는 자기 활성화 된 셀의 두 개의 연속 라운드 분류 고순도 (> 95 %, 근원 세포) 및 수율 (~를 모두 제공 (MACS) 다음 디스 파제 2.8 × 10 6 ± 8.87 × 10 5 세포 / 문화 실험 g 조직). CD56은 동일계 10 및 11에서 인간 체외 위성 세포의 식별을위한 표준 금 표면 마커 간주 비드 부착 이상적인 표면 마커 후보를 제공한다. 이 방법에서는 CD56 항체는 산화철 및 폴리 사카 라이드 - 함유 상자성 비드 강한 자계 (12, 13)에 배치 된 고 구배 자기 세포 분리 컬럼을 통해 세포에 결합 및 통과에 접합된다. 분리 컬럼은 강한 자계 구배 (~ 4tesla)을 생성하는 그 표면을 향해 자력선을 집중시키는 역할을 강자성 스틸 울 또는 철 분야의 행렬로 채워진다 14. 이 컬럼에서 조금이라도 자기 세포는 매력과 표면 (14)에 흡착. 언 바운드 (CD56 -) 자기 마이크로 비드으로 표시 CD56 + 세포가 자기장 12,15에서 제거 될 때까지 유지되는 반면 세포는 칼럼을 통해 전달합니다.
선별 과정의 어느 단계에서 세포 현탁액은 상기 실험을 위해서, 원하는 밀도로 도금 될 수있다. 세포 성분은 면역 세포 화학을 사용하여 식별 될 수 주어진 개입 이어 넓은 필드 또는 공 초점 형광 현미경을 이용하여 묘화하고 주어진 이미지의 모든 표지화 된 세포의 신속한 대물 측정이 가능 화상 해석 방법을 이용하여 정량적으로 분석 하였다. 근육 조직 세포 반면, 인간의 섬유 아세포가 쉽게 지방 세포에 transdifferentiate - 우리의 실험실에서 우리는 CD56을 설명하기 위해 영상 분석 (16) 다음이 이중 면역 자기 정렬 방식을 사용했다위성 기원의이 지방 세포 변환 5 뛰어납니다.
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Protocol
참고 : 우리의 실험실에서 수행 된 연구에 대한 모든 주제는 참여하는 자신의 서면 동의서를주고 모든 실험은 영국 국민 건강 보험 (National Health Service) 윤리위원회의 승인을 수행 하였다 (런던 연구 윤리위원회; 참조 : 10 / H0718 / 10)과에 따라 인체 조직 법 헬싱키 선언.
1. 초기 준비 근육 생검 이전 (15 분)
- 인간의 골격 근육 성장 매체를합니다. 졸업 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 다음 골격근 기초와 50ml로 튜브를 채우기 보충 믹스의 2.5 ㎖를 10 ㎖의 올바른 최종 농도에 태아 혈청, 항생제 (페니실린 / 스트렙토 마이신)과 글루타민 (표 1)를 추가 매체.
- 멸균 20 ML 원뿔 튜브에 골격근 기초 배지 15ml를 넣어 무게를 측정. 일단 장소를 얼음이 튜브의 무게. 인간의 근육 샘플을 수신하는 데 사용합니다.
- 또 다른 20 ML 튜브에서 10m를 준비2 mg의 최종 농도로 콜라게나 제 II D 및 디 스파 아제 (Dispase) 효소 용액 l / ml의 골격근 기초 배지에서 이들 효소의 스톡 씩 용해하여 각. 0.22 μm의 필터를 통과하여 솔루션을 필터 소독. 15 분 예열 37 ° C에서 인큐베이터 또는 물 목욕이 살균 효소 믹스를 놓습니다.
참고 : 효소의이 혼합물은 약간 트립신보다 완만하고 더 나은 세포 생존 (17)를 유지한다. - 페트리 접시 및 멸균 메스의 쌍을 따로 설정합니다.
2. 근육 조직 검사 절차 (45 분 - 1 시간)
- 참가자를 모집하기 전에, (예를 들어, 윤리적, 기관, 정부 등) 모든 관련 관할 기관,위원회와 의료 공급자의 전체 윤리적 통관과 (실험자에 대한 관련 예방 접종 포함) 절차의 승인을 얻을 수 있습니다.
- (무균 수술 장으로, 예를 들어) 다리 주위에 무균 필드 만들기살균 항균제 (클로르헥시딘)로 완전히 생검 사이트 부분을 청소 거라고.
- 측광 근의 근막을 덮는 피하 지역에서 2 % 리도카인 국소 주입하여 자원 봉사의 다리에 제안 된 생검 사이트를 마취시키다 근육을 lateralis.
- 피부와 근막을 통해 멸균 수술 블레이드를 사용하여 ~ 5mm 폭 절개를 추가 흡입 버그 스트롬 바늘 생검 절차 (18)를 수행합니다.
- 무균 핀셋을 사용하여 바늘의 루멘에서 근육을 제거하고 얼음에 기초 배지 담근다. 가능한 근원 성 세포주기 이상 24 시간 후에 얻어 질 수 있지만, 가능한 한 빨리 처리를 위해 실험실로 조직 전송.
- 피사체를 브리핑 정화 및 외부 방수 커버와 여러 멸균 접착제 피부 폐쇄 스트립 및 무균 드레스 절개 사이트를 밀봉.
3. 근육 유래 전구 세륨 격리를LLS (1 시간, 30 분)
- 근육 샘플을 포함하는 튜브를 제거하고 (확인 튜브 티슈로 닦아 건조하게) 무게. 단독 배지를 함유하는 배지에서 튜브를 함유하는 샘플 튜브의 무게를 빼서 근육 시료의 중량을 계산한다.
- 혈액의 근육 샘플을 씻어 솔루션을 여러 번 소용돌이. 30-60 초 동안 실온에서 근육 퇴적물하자.
- 먼저 전자 피펫 보조 또는 흡입기를 사용하여 튜브에서 매체의 거의 전체 볼륨을 제거하지만, 튜브에 약 2 ~ 3 ㎖를 둡니다.
- 접시에에 근육 샘플을 수행하기 위해 남아있는 유체를 허용하는 멸균 페트리 접시에에 튜브를 반전; 남아있는 근육이 지방이나 결합 조직의 눈에 보이는 부분을 나머지 액체를 동원 pipette.Remove로 제거 할 수있는 요리를 fragments.Rotate 추출하기 위해 멸균 메스를 사용합니다.
- 100 ~ 400 mg의 무게 생검를 들어, 따뜻한 3 ㎖를 추가효소 용액 및 멸균하여 메스 매우 작은 조각 (<1-2mm 3)로 근육 시료를 잘라.
- 멸균 10 ML 원뿔 튜브에 근육 조각과 효소 솔루션과 전송을 그려 넓은 구멍 25 ml의 피펫을 사용. 콜라게나 제와 디스 파제 효소액과 작은 10ml를 피펫은 튜브에 남아있는 근육 조각과 장소를 수집 사용의 또 다른 3-5 ㎖로 배양 접시를 씻으십시오. 정확한 볼륨은 중요하지 않다.
- 분쇄와 60 분 (10 ㎖ 피펫) 매 15 분 동안 37 ° C 배양기 (또는 수조)의 병을 놓습니다.
- 1 시간 후 신선한 예열 된 증식 배지의 용적 당량의 첨가에 의해 효소 분해를 종료하고 어떤 큰 myofibre 부스러기를 제거하기 위해 100 ㎛ 필터를 통해 세포 현탁액을 통과한다. 실온 (20-25 ℃)에서 6 분 동안 657 XG에 셀 여과 액을 원심 분리기.
- 코팅되지 않은 성장 배지에 접시 5-7 ㎖ 중의 세포 펠렛을 재현 탁 T-25조직 배양 플라스크. 7 일간 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터이 판을 전송합니다. 매체마다 48 시간을 변경합니다. 이 단계에서 근육 조직 세포가 아닌 근육 조직 세포에서 분별하기가 매우 작고 둥근 및 어렵습니다.
- 최초의 매체 변화에 비 부착 펠릿 세포 상층 액을 원심 분리. 새로운 배지 및 재 판에이를 다시 일시 중지합니다.
- 문화 7 일 후, 근육 조직 (섬유 모세포) 세포의 대부분은 첨부하지만 세포가 아직 합류에 도달하지 않았 음을 확인합니다. 근육 조직 전구체를 정화하고 원래 GHERARDI과 Chazaud (19, 20)의 실험실에서 개발하여 더 우리 (5)에 의해 수정 된 프로토콜에 따라 MACS를 수행합니다.
CD56 발현을 바탕으로 세포의 4. 면역 자기 비드 정렬 (1.5 시간)
- 세 교류와 (일반적으로 50-60%, 근원 세포 (5)를 포함합니다) 세포 단층 린스 후 7 일실온으로 인산 완충액 (PBS)의 나머지로부터 격리 미부착 세포 잔사를 제거했다.
- 세포를 Trypinize (0.04 % 트립신 칼슘 0.73 mM의 EDTA와 2 + - 무료 PBS)을 3 분. 세포가 분리되면 위에 소화 방지 골격근 성장 배지 5-10를 가하여. 카운팅 완전 배지의 적당한 부피로 실온 (20-25 ℃)에 재현 탁하고 6 분 동안 657 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.
- 원하는 방법을 이용하여 세포 현탁액의 소량의 샘플 카운트 (예를 들어, 또는 자동 혈구 계수 장치를 이용) 및 세포 수 및 생존율을 계산 시작.
- 면역 세포 화학에 대한 96 웰 플레이트 (필요한 경우 또는 더 큰 용기)에 몇 우물 플레이트 또는 이전의 정렬에 인구의 세포 계측법 기반 특성 흐름 (섬유 아세포와 근육 조직 세포가 존재하는 가장 풍부한 세포 유형 것입니다).
- 세포 현탁액 광고에멸균 PBS의 D 15 ml의 세포와 매체를 희석합니다. 세포는 원심 다시 정렬 버퍼 실온의 170 μL에 재현 탁 그들을 (MACS 세정 용액 1 % BSA를, 0.22 ㎛의 필터를 통과 통해 멸균).
- 셀 솔루션으로 CD56 차 항체 (클론 AF12-7H3, 130-050-401)에 결합 잘 혼합 된 자기 마이크로 비즈의 35 μl를 추가, 피펫은 혼합에서 교반과 함께 4 ℃에서 15 분 동안 배양 떠나 의 중간 지점.
- 배양 후, MACS 10ml를 6 분 동안 657 XG에 버퍼 원심 정렬을 갖는 셀 및 비드 용액을 희석. 정렬 버퍼에 1 ml의 세포를 재현 탁.
- 스탠드를 들고 맥 MAC가 분리 (자석)를 추가합니다. 때문에 강한 자기장에 스탠드에 자석을 추가 할 때주의하십시오. 열 슬롯 및 사전 분리 필터를 장착한다. 피펫 윤활 사전 분리 필터 및 칼럼을 통해 완충액을 1 ml의 선별.
- Immediat엘리이 후, 부드럽게 세포 현탁액을 혼합하고 사전 분리 필터를 통해 열로 전체 1 ml의 물방울.
- 버퍼를 정렬 1 ㎖ (500 μL)에 열을 세 번 씻으십시오. 성장 배지의 소량을 함유하는 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 먼저 정렬에 컬럼을 통과 비 - 보유 세포를 수집한다. 분획 및 높은 결합 조직 섬유 아세포 농축된다 - 이들 세포는 CD56 제 정렬이다. 열이 세척 사이에 건조시키지 마십시오.
- 세척 후에는 사전 분리 필터를 제거하고 컬럼 MACS 완충액 2.5 mL에 추가한다. 그런 다음 즉시 자석에서 열을 제거하고 열 상단에 플런저를 눌러서 별도의 50 ML 원뿔 튜브에 첫 번째 정렬 CD56 + 분수를 수집합니다.
참고 : 플런저 컬럼의 상단에 아주 단단하게 설치하고 운영하는 것은 매우 까다로운 일이 될 수있다; 열이 여전히 F 동안 그러나이 이루어져야버퍼의 ULL은, 그래서 속도가 필요합니다. 플런저 너무 열심히하고 빠른 우울하지 마십시오. - 예를 들어, 사용하는 세포의 생존 능력을 평가 도금하기 전에, 트리 판 블루 분석법. 8 × 1mm 2 카운트 필드에서 가능한 세포의 비율 (혈구의 양원)를 결정합니다.
참고 : 세포는 필요한 순도에 따라 정렬 된 단일 또는 이중 될 수 있습니다. 신중하게하는 경우에 이들 세포가 잘 이중 정렬 절차를 허용하고 생존율은 95 %> 매우 높다. 이중 분류를 들어, 버퍼의 정렬을 1 ml의 윤활 단계 4.6에서 진행, 다른 열을 설정합니다.- 영상 24도 요리 (21)에 위치하고 있으며 세포 부착 (예를 들면 콜라겐 또는 라미닌)에 대한 ECM 분자의 선택으로 코팅 된 커버 글라스에 직접에, 플레이트 세포를 수행 할 경우. 여기에, 0.1 ~ 0.5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I (표 3)를 사용합니다.
흠 5. 정렬즉시 차단 후 근육 유래 섬유 아세포.
- 즉시 차단 후 섬유 아세포의 전구 세포를 정화 다음과 같이 수정하여 위와 같은 프로토콜을 사용하려면 :
- 즉시 한 번 100 μm의 셀 스트레이너하지만 한 후 다시 40 μm의 여과기하지만 완전한 매체와 필터에 격리에 resuspend 세포 후. 6 분 동안 657 XG에서 PBS와 스핀의 5 ML을 추가합니다.
- MACS 정렬 버퍼에 재현 탁하고 세포를 실온에서 15 내지 30 분 동안 항 - 인간 섬유 아세포 마이크로 비드 부화.
- LS 열 및 미디-MACS 분리기 (표 3)를 사용하고, 40 μm의 사전 분리 필터를 설치합니다.
- 필요한 순도에 따라 하나 또는 두 종류를 수행 혈청 함유 배지에 가능한 빨리 셀을 전송 카운트를 수행하고, 원하는 농도에서 운동 판
6. 면역 세포 화학 염색 (1 일 하룻밤).
- 수정교반과 함께 10 분 동안 얼음 - 냉각 PBS 8 % 파라 포름 알데히드의 동일 부피의 첨가에 의해 그들의 웰 세포. 10 분 대기음 정착 후 PBS로 두 번 세척한다.
- PBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 적어도 1 시간 동안 세포 표면 항원, 블록 세포 발현 사이 후 해당 일차 항체 (표 4)와 프로브.
- 세포 항원, 다음 블록 일차 항체와 인큐베이션, 1 % BSA, 10 분 동안이 NaN 3 (0.01 %)와 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가하여 세포를 고정 후 Permeabilize 하시려면. 락 플랫폼에서 교반과 모든 차 항체 배양을 실온에서 하룻밤 (4 ° C에서) 수행합니다.
- 언 바운드 차 항체를 제거하고 차가운 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 실온에서 종 특이 형광 표지 된 이차 항체와 함께 1 시간 배양 (표 4) 동안 배양.
- 제거한 후언 바운드 차 항체는 PBS의 세 교류로 세포를 씻어하고 형광 DNA 염료의 Hoechst 33342 (1 ㎍ / ㎖)을 흔들 플랫폼에서 10 분 동안 솔루션 Counterstain과.
- 세포 표면 항원 및 세포 내 항원의 양을 동시에 가시화하여 제 일차 항체 프로브 셀은 해당 이차 항체이어서 표면 항원을 셀. 다음, 차가운 PFA, Permeabilize 하시려면, 블록의 세포를 재 - 수정과 적절한 보조 항체 다음 세포질이나 핵 항원에 대한 일차 항체와 부화.
- 염색 후, 곡선 집게를 사용하여 웰에서 커버 슬립을 제거하고, 증류수를 이용하여 커버 슬립의 뒷면을 헹군다. 커버 슬립 셀이 유리 현미경 슬라이드에 매체 22 세트를 설치 안티 - 페이드의 드롭 다운 밀어 놓습니다.
세포의 면역 형광 염색법과 조합 7. 오일 레드 O 염색법 (2 시간)
- 계시5,23 - 세포의 지질 함량은 오일 레드 O (([4- (Xylylazo) 자일 릴] 아조) -2- 나프톨 1)로 염색하여 24 웰 접시에 도금. 첫 번째 (V / w) 오일 레드 O 60 99 % 트리 에틸 포스페이트 ㎖의 증류수 40 ㎖에 오일 레드 O 500mg을 용해시켜 0.5 %의 스톡 용액을 제조 하였다. 사용할 때까지 실온에서 어두운 곳에서 상기 용액을 유지한다.
- 사용 일째에 36 % (12)을 오일 레드 O 스톡 ㎖의 용액 8 ml의 증류수를 포함하는 트리 에틸 포스페이트 작업 용액 (/ V w). 모든 결정화 오일 레드 O를 (어떤 이미지 품질을 손상)을 제거하기 위해 필터 종이 번호 (42)를 통해이 솔루션을 필터링합니다.
- 부드럽게 용액 6 분 동안 1,200 XG에서 회전되어, 그 후에 1 시간 동안 물 중탕에서이 작업 용액을 가온. 상층 액을 제거하고 신선한 20 ML 튜브에 종이 필터 (번호 42) 및 전송을 통해 다시 필터링합니다.
- 세포를 고정 permeabilised 및 면역 염색 한 후, PBS를 제거하고 오일 레드 O / 트리 에틸 - 진료 기관 연합의 500 μl를 추가60 분 동안 우물에 인산염 솔루션입니다. 세포막 permeabilisation 여기에 사용되는 농도 트리톤-X 세포 지질 함량 (23)에 영향을주지 않습니다.
주 : 오일 레드 O (540) 및 580 nm의 때문에 텍사스 레드 필터 사이의 파장에 의해 여기되어 형광 현미경 (23)에 오일 레드 O 방출을 검출하는데 사용될 수있다. 세포가 매우 강하게 (즉, 매우 높은 지방 함량을) 묻 으면 오일 레드 O에서 형광 방출 가끔 멀리 빨간 채널로 누출 할 수 있습니다. - 배양 후, 과량의 오일 레드 O를 제거하고 PBS 500 ㎕의 세포로 다섯 번 씻어. 섹션 모두 시야 / 위상차 현미경으로 또는 텍사스 레드 필터를 사용하여 표면 형광 현미경으로 오일 레드 O 염색을 감지 6에 설명 된 바와 같이 면역 염색에 대한 것과 된 커버를 장착 (EX BP 40분의 560, BS FT 585, EM BP (630)를 무료로 이동 / (75), 칼 자이스).
8. 이후에 대한 형광 현미경의 현미경 사진을 구하기alysis
참고 : 확인을 정량적으로 비교하는 슬라이드 동일한 조건 (예를 들면, 노출, 카메라와 인수 설정 등)에서 촬영과 같은 현미경 세션에서 캡처, 같은 솔루션으로 염색된다. 모든 취득 후 포맷은 동일하고 디지털 이미지 (24)에 대한 제안 지침을 엄격히 준수해야한다.
- 영상 획득 (위드 현미경)의 경우, 현미경과 형광 광원을 켜고 형광 광원 따뜻하게하고 안정 될 수 있도록 시간의 권장 금액을 둡니다.
- 카메라에 빛의 경로를 차단하여 카메라의 어두운 전류를 설정하고, 최대 해상도에서 이미지를 획득하고 이후 획득 한 이미지를 보정 할 때 사용합니다.
- 액체 라이트 가이드 (페닐 메틸 실리콘 오일 가득 불소 수지의 유연한 튜브)에 의해 전달 표면 형광에 의해 면역 형광 프로브를 조명차 신호 (필터 45 HQ 텍사스 적색 편이 무료, 녹색 (필터 44 FITC 특별한 변화 무료), 청색 (필터가 거꾸로 에피 형광 현미경에 49 DAPI 이동 무료) 대역 통과 필터를 설정 (10X, 20X 세트 빨간색을 통해 시각화 40X는, 0.25, 0.75, 0.95 개구 각각)와 아포 크로매틱 목표를 계획한다.
- 포화 화소 화상 획득 소프트웨어 "과다 노출 '기능을 이용하여 각각의 형광 마커 검출기의 직선 범위 내의 최적의 노출을 피하기 위해 발견. 각각의 형광 표지에 대한 표준화 된 노출을 적어 둡니다.
- 개별 채널을 캡처 그레이 스케일 또는 모조 TIFF (태그 이미지 파일 형식) 가장 높은 비트 심도의 이미지 파일을 저장 (바람직하게는 16 비트 - 65,536 회색 값) 기록 장치에 의해 제공 (예 : CCD (충전 결합 소자) 현미경에 장착 냉각 된) . 1388 X 1040 이상으로 이미지 해상도를 설정합니다. 알려진 디의 규모 표시 줄이나 개체를 포함해야합니다이미지의 mensions.
- 가능한 것은 정보 (25)의 손실을 방지하기 위해 .JPEG 형식으로 16 비트 태그 이미지 파일 포맷 (TIFF 형식)으로 파일을 저장하지.
- (이 자동 보정을 가질 수있다 현미경으로 번들 소프트웨어) 조명의 균일 이상의 우려가있는 경우 세포없이 커버 슬립의 '플랫 필드'이미지를 촬영하지만 염색하는 방법과 동일하게 실험 슬라이드에 장착; 이것은 이미지 분석 소프트웨어에 조명 결함 취득 후 보정하기 위해 사용될 수있다.
- 화상 획득 (초점 현미경)의 경우, 각 촬상 실험 (포화를 피하기) 미국 검출기 이득 및 레이저 파워의 최적화. 일반적으로, 측정 된 형광 레이저 전력 레벨에 비례한다. 최상의 신호 대 잡음비를 달성하기 위해 '1 통풍로 설정 핀홀 크기 (해상도 개선이 특히 강한 신호 통풍 0.5에서 달성 될 수있다). 개미를 통해 z 축에 서로 다른 수준의 광학 부분을 가지고세포를 ibody 표지 및 이미지 분석을위한 각 채널에 대해 16 비트 최대 투사를 저장합니다.
찬란 9. 수행 측정은 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (시야 당 5 분)를 사용하여 핵 전사 인자를 표기 됨.
- 액세스 개별 TIFF 이미지 파일을 클릭하고 다른에 하나의 이미지를 드래그하여 오버레이 해당 채널. 각 채널은 레이어 패널에서 별도의 레이어로 나타납니다.
- 아래 동시에 시각화 할 레이어를 허용하도록 필터 메뉴에서 밝게를 선택합니다. 대안 적으로, 50 % 상부층의 불투명도를 조정한다.
참고 : 티파니 이미지는 정보의 손실없이 파일 크기를 낮추는 '손실'한 -Ziv-Welch (LZW) 데이터 압축 저장할 수 있습니다. - 분석 창 (분석> 데이터 선택 포인트> 사용자 정의)에서, densit을 의미, 분석을 선택하고 측정을 요구 (예를 들어, 통합 밀도를 선택Y, 원형, 히스토그램 등). 그 옆에있는 상자를 취소하여 불필요한 측정을 폐기하십시오. 지역 측정 분석> 설정 측정 스케일에 μm의 클릭에 필요한 경우. 눈금자 도구가 자동으로 나타납니다 - 스케일 바의 길이를 추적하고 마이크로 미터에서의 알려진 길이를 입력합니다. 소프트웨어는 평방 미크론으로 측정 영역으로 변환한다.
주 : 히스토그램 분석이 선택되면, 측정이 기록 될 때 추가 폴더 (이를 현미경의 개별 선택 영역뿐만 아니라 모든 개별 선택의 합산 8 비트 히스토그램 (선택 될 수있는 위치) 나타난다 여러 항목을 선택하는 경우 항상) 히스토그램-1로 나타납니다. 이 분석은 16 비트 형식으로 소프트웨어에 의해 수행되지만 관심 대상 화소에 걸쳐 농도의 분포를 검사하는 데 매우 유용 할 수 없다. - 핵 형광 강도 분석을위한 제를 구성하는 파트 :훽스트 (Hoechst) 또는 DAPI 스테인드 DNA에 대한 sentative '색상 범위 선택 마스크'(CRSM은) 핵 영역을 정의합니다. 다른 모든 층이 있어야 할 동안 원하는 채널의 이미지가 중첩되면, 만 훽스트 (Hoechst)의 채널 층이 선택된 레이어 탭에서 옆에있는 '눈 아이콘'을 확인하여보기에 남아 있어야 다음 층 강조, (파란색으로 변합니다) 선택 해제. 혼합 드롭 다운이 레이어 탭에서 '정상'으로 다시 설정되어 있는지 확인합니다.
- 색상 범위 대화 상자를 엽니 다 (> 색상 범위를 선택합니다)와 '샘플링 된 색상'을 선택 옵션 드롭 다운을 설정합니다. '빠른 마스크'(빨간색 배경)으로 설정 선택 미리보기 ( '+'기호가 표시) Shift 키를 누른 나타나는 스포이드 도구를 사용하여 핵 내에서 클릭하여 핵 내의 모든 블루 색상 톤을 선택합니다.
- 원치 않는 톤을 선택하는 경우, Alt 키 ( '─'sign가 나타납니다) 눌러 클릭하여 제거그들에. 수동으로 만 선택한 색상 톤이 측정에 포함되며, '현지화 된 컬러 클러스터가'체크를 해제하도록 제로 퍼지 스케일을 유지한다.
- - 프로그램 별 추출 파일 (.AXT 파일)와 컴퓨터의 하드 디스크에이 CRSM을 저장합니다. 또 다른 임의의 핵, 부하, 업데이트의 필드 및 CRSM (선택, 색상 범위,로드) 저장과 함께. 핵 선택 대표 있는지 확인하기 위해 적어도 다섯 임의의 필드에 대해이 작업을 수행합니다.
- 인간의 눈이 회색 (26)의 다양 한 음영 사이의보다 색상의 다른 그늘 구별 더 잘 수 있기 때문에 기능을 분리하기 위해 마스크의 창조를 위해 그레이 스케일 이미지의 컬러 버전을 사용합니다.
- 염색에 대한 세그먼트 핵 지역에 핵 CRSM을 사용합니다. 핵 이미지> 조정> 임계 값에 클릭을 선택하고 슬라이더를 오른쪽으로 이동 한 후, 핵 검은 색 같은 설정하는 것이. 또한,마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 '채우기'를 선택하신 후 '를 입력 : 검은'를 선택합니다. 모든 배경을 제거하려면 삭제를 지금 키를 눌러 선택> 역을 클릭하고 (옵션 선택 나타나면 '채우기 : 화이트'). 이것은 본질적으로 사용자의 선택에 기초하여 이미지를 이진화. 그런 다음 중복 핵 (필터> 바이너리 이미지> 유역 기능 분리)를 분리하는 필터 탭에서 유역 플러그인을로드합니다.
- 많은 핵이 많이 겹치는 경우이를 취소하여 분석에서 핵을 제거 (Alt 키를 누른 상태에서 느슨하게 올가미 도구로 둘레에).
- 지금 진 핵 층에서 개별 핵을 선택, 색상 범위와> 그림자>을 선택로 이동합니다. 어떤 하나의 검은 핵 내에서 대체 Shift 키를 누른 채로 클릭합니다. 모든 핵은 바로 선택됩니다. 그 층을 선택하고, 모든 선택 해제하여 (예를 들어 오게 닌) 핵 전사 인자 얼룩을 함유하는 층에 이러한 선택을 전송다른 층. 행진 라인은 이제 오게 닌 채널에서 핵의 위치를 표시합니다.
- 모조 이미지 작업하는 경우에만 (레이어 탭의 오른쪽) 채널 팔레트를 클릭 만 녹색 채널을 (이미지가 지금은 회색으로 표시됩니다)을 선택합니다. 그런 다음 이미지> 모드> 그레이 스케일을 클릭합니다. 표시 '눈에 보이는 레이어를 평평하게하고 숨겨진 레이어 폐기'확인을 클릭합니다 경고 후 또 다른 경고는 말할 것입니다 확인을 다시 클릭 '다른 채널 폐기'를. 그레이 스케일 선택 핵의 단일 층은 이제 레이어 팔레트에 존재합니다.
- 선택된 핵에 대한 데이터를 얻기 위해 측정 로그에 기록 측정을 클릭합니다. 층 분석 할 경우 (예를 들어 오게 닌 염색) 이미 단순히 기록 측정을 눌러 원시 16 비트 그레이 스케일 이미지입니다.
- TXT로 내보내기 선택한 측정이 선택한 위치에 파일. 이것들은 추가 처리 등의 데이터 처리 소프트웨어 (P)에서 분석 될 수있다ackages
참고 : 필요한 경우 편집> 단계 뒤로 명령 (보도 동시에 Alt 키, Ctrl 키와 Z 키를 모두) 이전의 모든 층을 복원합니다. - 비 특정 배경 형광 결과는 양적 형광 강도의 측정과 같은 필적하는 27에 대한 올바른 항상 신호와 배경의 혼합물이다.
- 사각형 선택 도구를 선택하고 (원하는 이미지에서 세포의 컨 플루에 따라 경우 또는 그 이상) (20) (20) 픽셀을 선택 '고정 된 크기'를 선택합니다. 변화가 시야에 걸쳐 확산 10 개 이상의 배경 영역을 선택 채. 측정 로그인을 눌러 '기록 측정'.
- (측정 로그에 '의미 회색 값'으로 주어진) 모든 10 선택된 배경 영역의 픽셀 당 평균 통합 밀도 (모든 픽셀의 회색의 값의 합)을 계산합니다. (대상체의 화소 수로 픽셀 당 평균 배경 농도를 곱
- 마지막 배경 보정 값을 산출 할 수있는 개체를 원래 통합 밀도에서 빼기 배경 형광. 이 방식은 비 - 특이 배경 형광 필드 변화에 잠재적 필드를 차지한다.
참고 :이 보정이 최종 값에 상당한 영향을 미치는으로 만 선의의 배경 영역을 선택하는 가장 중요합니다. 선택을 할 때 돋보기를 사용하여 확대하는 것이 좋습니다.- 또한 일반적인 배경 보정 (핵 당 평균 그레이 레벨 / 강도를 가지고 동일) 픽셀 핵의 면적 값 집적 밀도 자세히 기여 핵 국부 배경 신호의 잠재적 인 영향을 최소화하기를 분할하는 것이 유용 할 수있다 핵의 크기 (그림 3C)를 증가 값입니다.
- 마지막 배경 보정 값을 산출 할 수있는 개체를 원래 통합 밀도에서 빼기 배경 형광. 이 방식은 비 - 특이 배경 형광 필드 변화에 잠재적 필드를 차지한다.
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Representative Results
정제 된 근육 조직 세포와 섬유 아세포는 지방 조직에 대한 자신의 잠재력을 평가하기 위해 어디 7-30 사이의 일에서 지방 세포 영양 매체 다음 사흘 동안 지방 세포 분화 배지에서 배양 할 수있다. 정제 된 세포 집단을 사용하여, 지방 세포와 근육 조직 계보 마커에 대한 면역 염색과 함께 오일 레드 O 염색은 섬유 아세포 비율이 지방 세포 분화 (그림 2) 할 수있는 것으로 나타났다. 섬유 아세포에 의한 지방의 대규모 축적은 육안 (패널 A)에 표시하고, 자신의 완전한 분화는 핵의 PPAR γ (그림 2 패널 B & C와 그림 3)의 매우 강한 표현으로 표시됩니다. 십오일 처리에 의해, 이들 세포는 그들의 기판 상으로 TE -7- (결합 조직 항원) 나머지 (패널 D)를 발표했다. 대조적으로, 근육 조직 세포는 최근 desmin과 무거운 미오신의 표현을 포함하여 정상 표현형을 유지체인 (그림 2 패널 E & F) 및 핵 PPARγ (그림 3C)를 상향 조절하지 않습니다.
근원 성 세포 (최근 desmin의 +)의 필드의 정량 분석의 일례가도 3에 도시되어있다. 패널 B는 필드 분석 나타내고, 패널은 (백그라운드 보정 후의) 정량 형광 강도를 나타낸다. 이 방법은 명확하게 특정 파종 밀도와 시간 시점에서 각각의 핵에서 미 오게 닌의 발현의 변화를 나타낸다.도 3c는 직접 셀 별 레벨에 상이한 세포 유형에서 전사 인자 수준을 비교하는 방법의 유용성을 보여준다. 분류 CD56 +, 근원 세포가 지방 세포 유도 매체에 노출 된 후 매우 낮은 수준을 유지하는 반면 근육 섬유 아 세포 지방 세포 전사 인자 PPARγ의 높은 수준을 표현 - 여기에서 우리는 CD56가 있음을 보여준다.
그림 1 :. 면역 자기 비드 정렬하여 얻은 근육 조직 세포와 섬유 아세포의 정제 인구 (AB) 문화의 일주 후에는 근육 조직 세포가 세포 표면 세포 접착 분자 CD56 (N-CAM) 및 근육 특정 중간 필라멘트 최근 desmin을 표현 분류. 핵 KI-67 발현이 세포가 증식되어 있다는 증거를 제공합니다. 세포막, 세포질 및 핵 성분의 염색 프로토콜 단계 6.5에 기재되어있다. (CD), 근원 세포가 섬유 아세포의 마커 TE-7을 발현하지 않는다. 인간 근육 유래의 (E) 섬유 아세포 TE-7 (F) 트랜스 혈소판 표현할 - 유래 성장 인자 수용체 α (PDGFRα). 스케일 바는 다음과 같습니다 (A)는 20 μm의 = (B, C 및 E) = 200 μm의 (D & F) 50# 181;. m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 인간의 근육에서 유래 CD56 - / TE-7 + 섬유 아 세포와 CD56 + / 최근 desmin + 지방 세포 유도 중간 (AIM)에서 배양, 근원 세포. 지방 세포 유도 중간 (AIM)이 배양이 오일 레드 O 염색 다음 육안으로 쉽게 볼 수 있습니다 때 MACS에 의해 분리 (A) 섬유 아 세포가 지방 세포로 분화. 근육 조직 세포가 AIM에 같은 기간 후 지방 세포 분화의 증거를 보여주지 매우 제한된 오일 레드 O 염색을 보여줍니다. (B & C) HAIM에서 잃어버린 근육 유래 섬유 아세포 고 명시 PPARγ와 문화 후 CEBPα (도시하지 않음). (C) 섬유 아세포가 그들 주위에 조밀 한 네트워크를 형성 세포 내 ECM 단백질을 나머지 눌렀다 지방 세포로 분화으로. (E), 근원 세포가 근육 조직을 유지 형태 및 최근 desmin 및 (F) 마이 오신 중쇄 (MHC), 터미널 근육 조직 분화의 지표로 혈통 마커의 발현 및 지질을 축적하지 못한다. 스케일 바는 다음과 같습니다 (B, D) = 200 μm의 (E, F) = 100 ㎛ (C) = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 샘플 데이터 FR 획득 OM 설명 화상 해석법 (어도비 포토샵 확장 방식)을 사용하여 배양을 immunolabelled. (A) 무 혈청 배지에서 분화 후 24 시간 근육 특정 핵 전사 인자 오게 닌에 대한 셀 별 형광 강도 플롯. (B) 최근 desmin + / + 오게 닌 인간 근원 성 전구체의 대표 현미경 사진. 스케일 바는 다음과 같습니다 (B)는 50 μm의 = 분류 CD56 + / 최근 desmin +, 근원 인구 (CD56 +) 및 CD56에서 개별 핵에 (C) PPARγ의 형광 강도 - / TE-7 + / PDGFRα + / 콜라겐 VI + 세포 (CD56. -) 15 일 동안 지방 세포 유도 배지에서 배양 한 후. 형광 값은 두 종류의 세포 간 핵의 크기 변동을 고려하기 위해 핵 영역으로 정규화 하였다. (A) 및 (B)에서 가로 검은 색 막대는 평균값을 나타낸다.52049 / 52049fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 중간 구성 요소 | 집중 | 카탈로그 없음. | 상업 소스 |
| 인간 골격근 성장 배지 : | C-23060은 (나열된 모든 요소를 포함하는 '사용 준비'온다) | ||
| 골격근 기초 배지 | - | PromoCell | |
| 태아 송아지 혈청 | 15 % | PromoCell (5 %) FCS 골드, PAA 연구소 (10 %) - 고양이 없음. A15-151 | |
| Fetuin (소) | 50 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 표피 성장 인자 | 10ng의 / ㎖ | PromoCell | |
| 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (재조합 인간) | 1 NG / ㎖ | PromoCell | |
| 덱사메타손 | 0.4 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 인슐린 (재조합 인간) | 10 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| 스트렙토 마이신 | 100 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| L 글루타민 | 292 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 근육 조직 분화 매체 | C-23260 | ||
| 골격근 기초 배지 | - | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| 스트렙토 마이신 | 100 ㎍ / ㎖의 </ TD> | 시그마 | |
| 참고 : PromoCell, 하이델베르크, 독일; 시그마 - 알드리치 회사는 회사, Dorset, 영국 | |||
표 1 : 세포 배양 배지의 성분과 농도.
| 중간 조성 | 집중 | 카탈로그 없음. | 회사 |
| 지방 전구 세포 성장 배지 | C-27410 (준비가 사용하는) | ||
| 태아 송아지 혈청 | 0.05 ml의 / ㎖ | PromoCell | |
| 내피 세포 성장 보충 | 0.004 ml의 / ㎖ | PromoCell | |
| 표피 성장 인자 (재조합 인간) | 10ng의 / ㎖ | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| 스트렙토 마이신 | 100 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 글루타민 | 292 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| D-비오틴 | 8.0 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 인슐린 (재조합 인간) | 0.5 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 덱사메타손 | ng를 400 / ㎖ | PromoCell | |
| IBMX | 44 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| L-티록신 | 9 NG / ㎖ | PromoCell | |
| 와 ciglitazone | 3 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| Strepto마이신 | 100 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 글루타민 | 292 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 지방 전구 세포의 분화 매체 | C-27436 (준비가 사용하는) | ||
| D-비오틴 | 8.0 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 인슐린 (재조합 인간) | 0.5 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 덱사메타손 | ng를 400 / ㎖ | PromoCell | |
| IBMX | 44 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| L-티록신 | 9 NG / ㎖ | PromoCell | |
| 와 ciglitazone | 3 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| 에스treptomycin | 100 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 글루타민 | 292 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 지방 세포 영양 매체 | C-27438 (준비가 사용하는) | ||
| D-비오틴 | 8.0 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 인슐린 (재조합 인간) | 0.5 ㎍ / ㎖의 | PromoCell | |
| 덱사메타손 | ng를 400 / ㎖ | PromoCell | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 시그마 | |
| 스트렙토 마이신 | 100 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 글루타민 | 292 ㎍ / ㎖의 | 시그마 | |
| 참고 : PromoCell, 하이델베르크, 독일; 시그마 - 알드리치 회사는 회사, Dorset, 영국 | |||
표 2 : 지방 세포 세포 배양 배지의 조성입니다.
| 장비 / 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 없음. | 댓글 / 설명 |
| 세포 배양 | 콜라게나 D | 로슈 | 11088866001 |
| 디스 파제 II | 시그마 | D4693-1G | 필터는 사용하기 전에 소독해야합니다 |
| 트립신 / EDTA | (기브) 인비 트 로젠 | 15400-054 | |
| 100 μm의 셀 스트레이너 | BD 바이오 사이언스 | 352360 | |
| 콜라겐 용액 (0.1 % 아세트산 3 ㎎ / ㎖) | 시그마, 도싯, 영국 | C8919 | |
| Minisart SRP15 주사기 필터 (0.2 μm의) | 사토 리우스 | 17573ACK | 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 막 |
| CD56 인간의 마이크로 비드 | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-050-401 | 마그네틱 활성화 셀 정렬 (MACS) 마이크로 비드의 제한된 수명의주의 |
| 안티 섬유 아세포 마이크로 비즈, 인간의 | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-050-601 | |
| 40 μm의 사전 분리 필터 | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-041-407 | |
| 대 세포 Collumns는 | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-042-202 | 이러한 열 흐름 저항이 제공됩니다. 유동 저항의 사용은 여기에 설명 된 높은 순도 근육 조직을 얻을 필요가 없다. |
| LS 열 | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-042-401 | |
| MiniMacs의 separator | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-042-102 | 이 구분은 큰 셀 열하지만 LS 열을 맞는다. |
| MidiMACS | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-042-302 | |
| MACS의 multistand | 있는 Miltenyi 생명 공학 | 130-042-303 | |
| BSA | 시그마 | 필터는 사용하기 전에 소독해야합니다 | |
| 오일 레드 O | 시그마 | O0625 | 지질 염색 |
| 트리 에틸 포스페이트 | 시그마 | 538728 | |
| 와트 만지 종이 | 시그마 | Z241121-1PAK | 42 번, 무회. 필터 세미 원을 만들기 위해 원형 필터 종이 접기 준비하고,를 원뿔 모양의 형태로 다시 반 반원 폴드. 필터링 깔때기에 콘을 맞 춥니 다. |
| 설치 | |||
| 골드 Antifade 시약을 연장 | 분자 프로브, 인비 트 로젠 | P36930 | 이것은 또는 DAPI없이 구입하실 수 있습니다 및 초기 형광을 해소하지 않습니다. |
| 를 AxioVision | 칼 자이스 | 연락 자이스 | 이미지 aquisition 소프트웨어 |
| 어도비 포토샵 CS5 익 스텐 디드 | 어도비 (Pugh의 컴퓨터에서 구입) | ADPH16982 * | 이미지 분석 소프트웨어 |
표 3 : 장비 및 시약.
| 이름 / 항원 | 항체 종 및 이소 타입 | 클론 이름 | 사용하기에 희석 | 카탈로그 없음. | |
| 근육 조직 마커 : | |||||
| CD56 (N-CAM) | 마우스 MC의 IgG 1 | MY-31 | (100 1) | 347740 | BD |
| 최근 desmin | 토끼 엠씨의 IgG 1 | D93F5 (XP) | (250 1) | 5332S | NEB |
| 오게 닌 | 마우스 MC의 IgG 1 | F5D | (1시 50분) | F5D | DSHB |
| 마이 오신 무거운 체인 | 마우스 MC의 IgG2b, 카파 경쇄 | MF20 | (200 1) | MF20 | DSHB |
| 섬유 아세포 / 결합 | |||||
| TIssue 마커 : | |||||
| 안티 인간 섬유 아세포 | 마우스 MC의 IgG 1 | TE-7 | (100 1) | CBL271 | 밀리 포아 |
| PDGFRα | 토끼 MC의 IgG | D13C6 | (500 1) | 5241 | NEB |
| 증식 마커 : | |||||
| Ki67 | 토끼 MC의 IgG | SP6 | (200 1) | MP-325-CRM1 | MD |
| 지방 세포 | |||||
| 전사 인자 : | |||||
| PPARγ | 마우스 MC의 IgG 1 | E8 | (1:20)을 수행 | SC-7273 | 산타 크루즈 생명 공학 |
| 키 : MC : 단일 클론,PC : 클론, DSHB : 발달 연구 하이 브리 도마 은행, 아이오와 미국; | |||||
| NEB : 뉴 잉글랜드 바이오 랩사, 영국; MD : A. MENARINI 진단, 영국; BD : BD 바이오 사이언스, 영국. | |||||
표 4 : 1 차 항체.
| 항원 | 항체 종 및 이소 타입 | 희석 | 카탈로그 없음. | 회사 |
| Alexafluor488 | 염소 항 - 마우스 IgG (H + L의) | 1000 : 1 | A-11001 | MP |
| Alexafluor 594 | 염소 항 - 마우스 IgG (H + L의) | 1000 : 1 | A-11005 | MP |
| Alexafluor 594 | 염소 항 - 토끼의 IgG (H + 1) | 1000 : 1 | A-11012 | MP | </ TR>
| 키 : H + 1은 = 중쇄 및 경쇄; MP : 분자 프로브, 인비 트 로젠 라이프 테크놀로지, 페이즐리 영국 | ||||
표 5 : 이차 항체.
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Discussion
우리는 근육 생검 재료의 작은 샘플에서 인간의 근육 유래 전구 물질의 선택적 농축에 대한 immunomagentic 정렬 절차를 설명했다. 이 기술은 섬유 아세포에 인간의 근육에서 파생 된 문화의 손실을 극복하기 위해 우리 실험실에서 매우 귀중뿐만 아니라 근육 유래 전구 세포의 고유 한 인구의 독특한 행동을 이해했다. 일단 정제 된 근육 조직 세포는 단백질 및 / 또는 유전자 발현의 변화를 조사 또는 하류 실험에 사용될 수있다.
형광 현미경에서 현미경에 대한 관심의 특정 지역을 분석하는 신속하고 간단한 방법 우리 또한 세부 세포 정화뿐만 아니라. 형광 현미경에서 디지털 이미지는 세포 생물 학자들이 추출하기위한 풍부한 정보를 포함하고; 실제로 픽셀은 반드시 인간의 눈에 철로되지 않은 데이터를 보유. 이 기술은 정량적 데이터에 대해 다수 얻을 수있다 인구 각 셀의. 유동 세포 계측법에 비해 화상 해석의 독특한 특징은 셀 형상 orcell - 세포 상호 작용의 변화에 단백질 발현 변화를 상관시킬 수있는 점이다. 또한, 용량함으로써 사용자 편향의 가능성을 줄여보기의 많은 분야에 걸쳐 만들 수, 신속 정확하고 재현성있는 측정을 최적화 대표 선택 마스크를 허용 생성하고 저장합니다.
맥 기반의 세포 정화
이 방법의 장점 중 하나는 세포가 성공적으로 즉시 차단 후 또는 문화에 몇 일 (때 수율이 높을 것이다) 이후에 정제 할 수 있다는 것입니다.
결정적으로, 근원 세포 전에이 칼럼을 통해 통과를 방해하기 때문에 정렬에 합류하게 허용하지 말아야하고, 또한 팽창 및 실험에 얻어진 증식 세포의 비율을 감소시킬 것이다.
t는 "> 얻어진 초기 조직 샘플에 따라. 방법은 선택적로 용해 적혈구는 그러나이 근육 유래 세포에 불필요한 화학 스트레스를 방지하기 위해 존재하는이 단계에서 문화에 비 부착 적혈구의 높은가있을 수 있습니다 단계는 피했다. 우리는 인간의 근육 유래 세포의 초기 문화에 적혈구의 주목할만한 부정적인 영향을 관찰하지 않고, 근육 조직 세포가 연결되면이 적혈구 미디어의 변화에 의해 제거된다.직전에 (예를 들어, 다른 프로테아제 또는 부드러운 EDTA 기반 방법)을 정렬하는 세포 분리하는 다른 방법은 세포 표면 항원의 발현이 부족하거나 트립신 소화에 특히 민감되는 셀들에 대해 사용될 수있다. 인체 근육 조직 세포에 대한 CD56의 발현은 강하고 (여기에 기재된 항체와 분석) 짧은 trypsinsation에 강하다.
그것은 정렬 버퍼가 CALC를 억제하는 EDTA를 포함하는 것이 중요합니다IUM - 의존성 세포 - 세포 부착을; 이것은 정렬 단일 세포 현탁액을 얻었다 (유지하고) 매우 중요하다. 세포 수에 따라 모양과 크기가 정렬하도록, 분리 컬럼 (표 3 참조)에 대하여 이루어질 수있는 선택의 여지가있다.
유지 세포를 분리 자기장에서 열을 제거하기 때문에 포집 관이 (심지어 스커트 경우) 운송 세포의 손실을 방지하기 위해 열 매우 가까운 위치 홀더에 배치되어 있는지 확인 까다로울 수있다.
우리는 인간 골격근 일차 전지와 함께 사용이 기술을 설명 하였지만,이 프로토콜은 쉽게 특정 / 독특한 세포 표면 마커가 알려져있는 다른 세포 유형에 대해 적응 될 수있다. 다른 장점은 전체 절차가 층류 캐비닛의 무균 작업 환경에서 수행 될 수 있다는 사실을 포함한다. 또한, MACS 절차는 낮기 때문에, 정렬 FACS에 비해 세포 완만전단력은 큰 셀 특별한 장점이 될 수있다. 사용되는 자석 구슬은 작은 비 독성와 문화 생분해. 실제로, MACS 성공적으로 다른 세포 유형의 수의 정제 및 연구를 위해 적용되어왔다.
이 기술의 한 가지 제한은 MACS 쉽게 동시에 여러 마커에 대해 수행 될 수 없다는 것이다. 또한, 셀의 크기 및 표지 량은 이후, 정렬 프로세스 동안 확인 될 수 없다.
이미지 수집 및 분석을 최적화하기위한 고려 사항
여기서 입증 화상 분석 방법은 세포의 큰 개체군 셀별로 단백질의 발현 수준의 변화를 명료하게하기위한 강력한 도구를 제공한다. 널리 사용 가능한 소프트웨어 패키지의 층 시설 및 선택 마스크를 이용하여, 실험자는 객관적으로 할 수 있도록, 여러 이미지를 통해 서로 다른 형광 신호를 선택할 수 있습니다개별 기능의 정량화하고, 그 안에 구성 요소의 수입니다. 우리는 성공적으로 정량화 직접 지방 세포 도전에 노출 서로 다른 세포 집단에서 전사 인자의 발현 범위를 비교하기 위해이 방법을 사용했다.
(특정 마커를 나타내는) 각 형광 채널은 다른 사람들로부터 분리 된 상태를 유지하고 멀티 컬러 immunolabelling 실험에 대한 유용하다, 또는 필요에 따라 해제 할 수 있습니다.
형광 현미경 (28)로부터 정량 및 반 정량적 데이터를 추출 할 때 다수의 인자가 고려되어야한다. 기본 반 정량적 측정을 허용하는 이들에 대한주의를 만들 수 있습니다. 연구자들은 종종 서로 다른 관심 대상의 단백질에 라벨의 형광체들을 사용하고자; 가장 중요 개개의 발광 스펙트럼을 구별 할 수있는 능력이다. 대부분의 경우, 이것은 선택적 excitat함으로써 달성된다한 번에 하나의 형광 색소 이온. 그러나, 발광 및 / 또는 여기 스펙트럼이 상당히 중첩 또는 불충분 블리드 통해 혼선 수득 화상 데이터의 정확성을 손상시킬 수 여과하는 경우. 형광 방출 통로가 부적절한 검출 채널에 있고, 발광 스펙트럼 (29, 30)의 중첩으로 인해 발생 흘러.
아르 고려해야 할 몇 가지 사항에 대한 정보 :이 방출 필터 세트를 보장 (공 초점 현미경 레이저에 의해 달성 될 때) 매우 선택적 여기 파장을 사용하여, 잘 분리 된 여기 및 발광 스펙트럼을 형광 색소를 선택 원치 않는 파장을 배제 할 정도로 엄격하고, 여러 가지 빛깔의 이미징을 수행 긴에 (즉, '이 가장 붉은') 흡수 스펙트럼은 일반적으로 발광 스펙트럼 반면, 짧은 파장 (청색)을 향해 휘어 있다는 사실을 고려하여 제 1 피크 발광 색소 wavel 긴 파장쪽으로 휘어engths (붉은 빛). 형광 라벨의 스펙트럼은 인비 트 로젠에서 제공하는 '형광 Spectraviewer'에서 사용할 수 있습니다.
높은 품질 목표의 사용은 분석 향하는 이미지에 결정적이다. 높은 개구 수 (> 1.3) 최고 및 배율은 위드 현미경 카메라에 적응해야한다. 개구 수의 함수로서 29 제곱 Z 해상도가 향상됨에 따라 모두 위드 및 공 초점 현미경에있어서, NA가 중요하다. 어디 구면 수차와 색수차 (29) 모두에 대해 보정 계획 - 아포 크로매틱 렌즈 가능하게 사용. 그들은 이전 29 목적 현미경으로 해당 항목에 공간 및 시간 일관성을 줄이기 위해 소스 조명 스크램블링 고르지 않은 조명을 줄이기로 액체 빛 가이드를 사용하는 것이 좋습니다.
그것은 제대로 quantifi 포화 픽셀이 될 수 없기 때문에, 이미지의 포화를 방지하는 것이 중요하다가장 강렬한 그레이 레벨에서 정보의 클리핑으로 인해 에드 (26) 값.
다양한 '플러그인'은 상대적으로 쉽게 수행에 플랫 필드 보정 절차를 활성화하는 데 사용할 수 있습니다; 예를 들어 닥터 존 C. 러스는이 온라인에서 무료로 사용 가능 (http://www.drjohnruss.com/download.html)의 많은했다. 이 참조 화상에 대응하는 하나에 실험 현미경의 각 화소의 휘도의 비율을 사용하여 계산 된 플러그인 및 일본어로 대체된다. 결과는 다음 화상의 밝기 범위를 채우기 위해 스케일링된다. 대안 적으로, ImageJ에의 화상 계산기 조명용 얼룩 보정의 또 다른 수단이다.
이 검출기 (29)에 도달하는 포커스 아웃 형광 방지 일부 이미지 분석을 위해, 공 초점 현미경의 선택 방법 일 수있다. 그러나이 방법은 감각을 제한 위드 형광 현미경보다 실질적으로 더 오래 걸릴 수있다단일 세션에서 얻을 수있다 뷰의 개별 필드의 ER.
다른 방법은 최근 인간 근육 조직으로부터 근원 성 세포의 농축을 위해보고되었다. CXCR4 + / CD56 +, 근원 세포의 긍정적 인 선택을 FACS 다음 : Bareja 31 (CD11b를, CD31, CD34 및 CD45에 대한) MACS 고갈의 조합을 사용했다. 이 절차는 매우 풍부한, 근원 인구를 생성 할 수 있었지만 그러나, 여기에 설명 된 방법보다 훨씬 더 긴이며, 더 많은 연속적인 단계 및 조직의 그램 당 낮은 정제, 근원 세포의 낮은 수율 결과가 포함되어 있습니다.
/ CD56 + / Pax7 + 세포 (원형 위성 세포) 근육 조직 계보 potenti뿐만 아니라 골 형성을 나타낼 수 - 최근의 다른 연구에서, 여러 개의 마커를 사용하여 FACS에 의해 인간 태아의 근육에서 CASTIGLIONI 32 격리 myofibre 관련 세포는 CD34는 것을 보여 주었다알은 있지만, 일반적으로 계약에 우리의 일에 지방 세포의 잠재력을 표시하지 않습니다. 세포가 아닌 근육 조직했지만, 지방 세포와 골 세포 분화 할 수 있었다 -이 저자들은 CD34 + / PAX7는 것을 보여 주었다. CD90 발현 CD34 + 비 근육 조직 분율 (근육 섬유 아세포 (33)의 마커)의 농축은 이들 세포의 큰 비율이 성인 인간 골격근, 지방 세포의 주요 원인이 될 것으로 나타났다 된 섬유 아세포를 가질 수 있음을 시사 문화 (참고 5 및 그림 2). 근육 유래 섬유 아세포는 골 형성 분화 잠재력을 보증 추가 조사가 있는지.
재현성 순수 근육 조직 배양 세포의 높은 수율을 얻기 위해 (7 대조적으로) 및 층류 후드의 무균 조건에서 빠르게 수행 될 수 CASTIGLIONI (32)의 방법과는 달리, 우리의 방법은 오직 하나의 항체를 필요로한다. 또 methodologicaL의 차이는 이러한 저자는 해리 근육에서 직접 세포를 분리하고 1 주간 우리 대부분 세포를 배양 반면, 정렬 및 재배하기 전에, 문화이를 따라한다는 것입니다. 우리의 손에이 방법은 세포에 의한 내약성은 더 뛰어나다. 중요한 것은, 문화의 총 시간은 두 방법의 본질적으로 동일하다. 또한, 태아 골격근 그것이 근육 조직 전구체의 수율 성인 근육에 비해 태아 근조직에서 큰 것은 놀라운 일이 아니다 과형성 및 비후성 근육 성장 34를 겪고 주어진
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
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