Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52049

Abstract

Reparasjon og regenerering av skjelettmuskulatur krever handling av satellitten celler, som er bosatt muskel stamceller. Disse kan bli isolert fra humant muskelbiopsiprøver ved enzymatisk fordøyelse og deres myogeniske egenskaper studert i kultur. Kvantitativt de to hoved adherente celletyper erholdt fra enzymatisk fordøyelse er: (i) de satellittceller (kalt myogeniske celler eller muskel forløper-celler), som er identifisert i utgangspunktet som CD56 + og senere som CD56 + / desmin + celler, og (ii) muskel- avledet fibroblaster, identifisert som CD56 - og TE-7 +. Fibroblaster sprer svært effektivt i kultur og i blandede cellepopulasjoner disse cellene kan overkjørt myogeniske celler til å dominere kulturen. Isolering og rensing av forskjellige celletyper fra human muskel er således en viktig faktor når metodiske forsøk på å undersøke den medfødte oppførsel av hver celletype i kultur. Her vi descrIbe et system for sortering basert på milde enzymatiske fordøyelse av celler ved hjelp av kollagenase og dispase etterfulgt av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som gir både en høy renhet (> 95% myogeniske celler) og med godt utbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 celler / g vev etter 7 dager in vitro) for eksperimenter i kultur. Denne fremgangsmåten er basert på å inkubere det blandede muskel-avledet cellepopulasjon med magnetiske mikrokuler konjugert til et antistoff mot CD56, og deretter passerer cellene selv om et magnetisk felt. CD56 + celler bundet til microbeads beholdes av feltet mens CD56 - celler passere uhindret gjennom kolonnen. Cellesuspensjoner fra hvilket som helst trinn av sorteringsprosessen kan bli belagt og kultivert. Etter et gitt inngrep, cellemorfologi, og ekspresjon og lokalisering av proteiner, inkludert nukleære transkripsjonsfaktorer kan kvantifiseres ved hjelp av immunfluorescens-merking med spesifikke antistoffer og et bilde processing og analysepakke.

Introduction

Reparasjon og regenerering av skjelettmuskulatur krever handling av satellitten celler 1, de myogeniske stamceller 2,3. In vivo disse cellene finnes i et reversibelt hviletilstand ligger mellom sarcolemma og basal lamina av hver myofiber, men bli aktivert for å spre seg, sikring og differensiere muskelvev er skadet, repareres og regenereres tre. Satellittceller kan isoleres fra unge og eldre menneskers muskelbiopsiprøver ved hjelp av enzymatisk fordøyelse fire og deres myogeniske egenskaper kan senere bli studert i primærkultur 5. Effektiviteten av denne isoleringsprosessen i forhold til både utbytte og renhet av cellepopulasjon er avhengig av de metoder som brukes, og kan variere fra prøve til prøve. De to viktigste tilhenger celletyper hentet fra enzymatisk fordøyelse er satellittceller (nå betegnet myogeniske celler eller muskel forløper celler), identifiserte først som CD56 + / desmin celler, og muscle-avledede fibroblaster, identifisert som CD56 - og TE7 + -celler 5. Fibroblaster har en rask proliferativ hastighet og ikke gjennomgår irreversibel vekst arrest og terminal differensiering på celle-celle kontakt som myogeniske celler; dermed i blandede bestander, kan fibroblaster kjørt myogeniske celler til å dominere kulturen.

Fibroblaster har ofte blitt sett på som en irritasjon for muskel biologer, men det er nå en økende interesse i fibroblaster som celler verdig studie i seg selv, særlig når de har vist seg å ha en samarbeidsvillig rolle med myogeniske celler under muskel reparasjon 6 . Isolering og rensing av forskjellige celletyper fra human muskel er således en viktig faktor når metodiske forsøk på å undersøke den medfødte oppførsel av begge celletyper i kultur. Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) er en metode ved hvilken celler kan sorteres for videre studier og / eller telles oganalysert. FACS har vist seg å pålitelig berike human myogeniske celler, men utbyttet av celler for etterfølgende kultur har hittil ikke vært høy 7. Gitt den begrensede replikasjonspotensialet av somatiske celler, slik som satellitt-celle-avledet myogeniske cellene og svært dårlig proliferasjon og differensiering forbundet med begynnende alderdom 4, er mer skånsomme metoder påkrevd. Enkeltmuskelfiber kulturer tilby en annen, mindre aggressiv, betyr å skaffe murine satellittceller fortsatt bosatt i deres sublaminal nisje og etter deres aktivering i kultur 8,9. Dette er imidlertid ofte ikke mulig fra human muskelbiopsimateriale (fordi fibrene kan sjelden oppnås fra senen til senen) betyr at denne teknikken ikke kan være tilgjengelig for mange forskningslaboratorier som er interessert i å studere humane muskel-avledede celler. Dessuten gir den eneste fiberteknikken bare svært begrenset antall celler.

Her beskriver vi et system for sortering basert på gentle enzymatisk fordøyelse av celler ved hjelp av kollagenase og dispase fulgt av to suksessive runder av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) som gir både en høy renhet (> 95% myogeniske celler) og utbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g vev) for eksperimenter i kultur. CD56 er regnet som gullstandarden overflatemarkør for identifikasjon av menneskelige satellittceller in situ 10 og in vitro 11 og gir den ideelle overflaten markør kandidat for perle vedlegg. I denne tilnærmingen CD56-antistoffer konjugert til jernoksyd og polysakkarid-inneholdende superparamagnetiske kuler er bundet til celler og føres gjennom en høy gradient magnetisk celleseparasjonskolonne plassert i et sterkt magnetfelt 12,13. Separasjonskolonnene er fylt med en matrise av ferromagnetiske stålull eller jernkuler som tjener til å fokusere magnetiske feltlinjer langs deres overflate å generere sterke magnetiske feltgradienter (~ 4tesla) 14. I disse kolonnene enda litt magnetiske celler er tiltrukket og absorbert til overflaten deres 14. Ubundet (CD56 - celler) passerer gjennom kolonnen, mens CD56 + celler merket med magnetiske mikroperler beholdes inntil fjerning av det magnetiske feltet 12,15.

Cellesuspensjoner fra hvilket som helst trinn av sorteringsprosessen kan bli belagt på den ønskede densitet for videre eksperimentering. Etter en gitt intervensjon de cellulære bestanddeler kan identifiseres ved hjelp av immunocytokjemi, avbildes med wide-feltet eller konfokal fluorescens mikroskopi og analysert kvantitativt ved hjelp av en bildeanalyse tilnærming som tillater rask objektiv måling av alle merkede celler i et gitt bilde. I vårt laboratorium har vi benyttet denne doble immunomagnetisk sortering tilnærming etterfulgt av bildeanalyse 16 for å demonstrere at CD56 - humane fibroblaster lett transdifferentiate inn adipocytter, mens myogenic celles av satellitt opprinnelse er svært motstandsdyktig mot denne adipogenic konvertering 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: For studier utført i vår lab alle fag ga sitt skriftlige, informerte samtykke til å delta og alle eksperimenter ble utført med UK National Health Service etiske komité godkjenning (London forskningsetiske komiteen; referanse: 10 / H0718 / 10), og i samsvar med Human Tissue Act og Helsinkideklarasjonen.

1. Innledende Fremstilling Før muskelbiopsien (15 min)

  1. Gjør menneskelig skjelettmuskelvekst medium. Til en gradert sterilt 50 ml konisk rør legger 2,5 ml supplement blanding, 10 ml føtalt kalveserum, antibiotika (penicillin / streptomycin) og glutamin til de korrekte sluttkonsentrasjoner (tabell 1) og deretter fylles røret til 50 ml med skjelettmuskel basal medium.
  2. Satt 15 ml av den skjelettmuskel basalmedium i et sterilt 20 ml konisk rør og veie den. Når veide sted dette røret på is. Bruk av dette for å motta den menneskelige muskelprøven.
  3. I en annen 20 ml tube forberede 10 ml av en Kollagenase D og Dispase II enzymoppløsning til en endelig konsentrasjon på 2 mg / ml hver ved oppløsning arkiv aliquoter av disse enzymene i skjelettmuskel basalmedium. Filter-steriliseres oppløsningen ved å føre den gjennom et 0,22 um filter. Plasser denne sterilt enzymblandingen i kuvøse eller et vannbad ved 37 ° C i 15 min for å varme opp.
    MERK: Denne blandingen av enzymer er litt mildere enn trypsin og bedre vedlikeholder celleviabilitet 17.
  4. Sett til side en petriskål og et par sterile skalpeller.

2. musicelbiopsiprosedyren (45 min-1 time)

  1. Før rekruttere deltakere, oppnå full etisk klarering og prosedyre godkjenning (herunder relevante vaksiner for forskere) fra alle relevante styrende organer, komiteer og helsepersonell (for eksempel etiske, institusjonelle, statlige etc.).
  2. Lag et sterilt felt på rundt benet (f.eks, med sterile kirurgiske ark) end rengjør området rundt biopsi området med en antiseptisk antibakterielt middel (klorheksidin).
  3. Bedøver slått biopsistedet på frivillige ben ved lokal injeksjon av 2% lidokain i det subkutane området overliggende fascia av vastus lateralis muskel.
  4. Lag en ~ 5 mm bredt innsnitt ved hjelp av en steril kirurgisk kniv gjennom huden og fascia og utfører Bergström nål biopsi prosedyre 18 med ekstra sug.
  5. Ved hjelp av steril tang fjerne muskel fra nålen lumen og lev i basal medium på is. Transportere vevet til laboratoriet for videre behandling så snart som mulig, men levedyktige celler myogeniske kan oppnås etter 24 timers perioder eller mer.
  6. Debrief faget, rens og forsegle snittet området med flere sterile klebe hud-nedleggelse strimler og aseptisk kjole med en ytre vanntett dekker.

3. Isolere Muskel-avledet Precursor CeLLS (1 t, 30 min)

  1. Ta av røret som inneholder muskelprøven og veie det (pass på at røret er tørr ved å tørke med vev). Beregn vekten av muskelprøven ved å subtrahere vekten av røret inneholdende medium og prøve fra røret inneholdende medium alene.
  2. Virvle oppløsningen flere ganger for å vaske muskel blodprøve. La muskel sediment ved romtemperatur i 30 til 60 sek.
    1. Fjerne nesten hele volumet av mediet fra røret, først ved hjelp av en elektronisk pipetteringshjelpemiddel eller aspirator, men la ca 2-3 ml i røret.
    2. Snu røret på en steril petriskål slik at den gjenværende væske til å bære muskelprøven på fatet; bruke steril skalpell til å trekke ut eventuelle gjenværende muskel fragments.Rotate parabolen å mobilisere den gjenværende væske og fjerne det med en pipette.Remove synlige biter av fett eller bindevev.
  3. For biopsier som veier 100-400 mg, tilsett 3 ml varmenzymoppløsningen og ved hjelp av sterile skalp kutte muskelprøven inn i meget små stykker (<1-2 mm3).
  4. Ved hjelp av en bred utboring 25 ml pipette trekke opp muskelfragmenter og enzymoppløsning, og overføring til et sterilt 10 ml konisk rør. Vask petriskål med en ytterligere 3-5 ml av collagenase og dispase enzym løsning og bruke en mindre 10 ml pipette samle eventuelle gjenværende muskel fragmenter og sted i røret. Det nøyaktige volum er ikke kritisk.
  5. Plasser flasken i en 37 ° C inkubator (eller vann-bad) i 60 minutter med finmaling (10 ml pipette) hvert 15 min.
  6. Etter 1 time eller forhindre enzymatisk dissosiasjon ved tilsetning av et ekvivalent volum av frisk forvarmet vekstmedium, og cellesuspensjonen passerer gjennom et 100 um filter for å fjerne eventuelle store myofiber rusk. Sentrifuger filtrerte celleoppløsning ved 657 x g i 6 minutter ved romtemperatur (20-25 C).
  7. Cellepelleten suspenderes i 5-7 ml vekstmedium og plate i en ubelagt T-25vevskulturkolbe. Overføre denne platen til inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO2 i 7 dager. Endre medium hver 48 time. På dette stadiet myogeniske cellene er meget små og avrundet og vanskelige å skjelne fra ikke-myogeniske celler.
    1. På den første medium forandring, sentrifuger supernatanten for å pelletere alle ikke-adherente celler. Re-suspendere disse i frisk medium og re-plate.
  8. Etter 7 dager i kultur, sørge for at de fleste av de myogeniske (og fibroblast-celler) har festet, men cellene ennå ikke har nådd konfluens. Rense myogeniske forløpere og utføre MACS henhold til en protokoll opprinnelig utviklet av i laboratorier av Gherardi og Chazaud 19,20 og ytterligere modifisert av oss fem.

4. immunomagnetiske Bead Sortering av celler basert på CD56 Expression (1,5 t)

  1. Etter 7 dager Skyll cellemonolag (som typisk vil inneholde 50-60% myogeniske celler 5) med tre børserfra romtemperatur fosfatbufferoppløsning (PBS) for å fjerne eventuelle gjenværende ikke-adherente celler og rester fra isolasjon.
    1. Trypinize cellene (0,04% trypsin i Ca2 + -fri PBS med 0,73 mM EDTA) i 3 minutter. Når cellene har frittliggende, tilsett 5-10 ml skjelettmuskelvekst medium for å hindre over-fordøyelsen. Pelletere cellene ved sentrifugering ved 657 x g i 6 minutter ved romtemperatur (20-25 C) og resuspendert i et egnet volum av komplett medium for telling.
    2. Telle en liten prøve av cellesuspensjonen med ønsket metode (for eksempel ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert telling enhet) og beregne starter celle nummer og levedyktighet.
  2. Plate noen brønner i en 96-brønners plate (eller større fartøy om nødvendig) for immunocytokjemisk eller strømningscytometri basert karakterisering av populasjonen før sortering (fibroblaster og myogeniske celler vil være de mest tallrike celletyper tilstede).
  3. Til cellesuspensjonen add 15 ml steril PBS for å fortynne cellene og medium. Sentrifuger cellene igjen og resuspendere dem i 170 ul romtemperatur sortering buffer (1% BSA i en MACS skylling løsning, sterilisert via passering gjennom et 0,22 um filter).
    1. Legg 35 ul av godt blandede magnetiske mikrokuler konjugert til en CD56 primært antistoff (klon AF12-7H3, 130-050-401) i celleløsning, å blande pipette og la det inkuberes i 15 min ved 4 ° C med forsiktig omrøring i halvveis.
  4. Etter inkubasjon fortynnes cellen og vulsten oppløsning med 10 ml MACS-buffer sortering og sentrifuger ved 657 xg i 6 min. Resuspender cellene i 1 ml av buffer sortering.
  5. Legg til MACs separator (magnet) til MACS holder stand. Vær forsiktig når du legger magnet til stand på grunn av den sterke magnetfelt. Sliss i søylen og at den passer til pre-separasjonsfilter. Pipetter 1 ml buffer sortering gjennom pre-separasjonsfilter og kolonnen for smøring.
  6. ImmediatEly etter dette, forsiktig blande cellesuspensjonen og drypper hele 1 ml gjennom pre-separasjonsfilter og inn i kolonnen.
  7. Vask kolonnen tre ganger med 1 ml (eller 500 pl) av sorterings buffer. Samle de ikke-tilbakeholdt celler som passerer gjennom kolonnen i første slag i et sterilt 50 ml konisk rør inneholdende en liten mengde vekstmedium. Disse cellene er den første typen CD56 - brøk og vil bli høyanriket for bindevevs fibroblaster. Ikke la kolonnen tørke ut mellom hver vask.
  8. Etter vasker den fjerne pre-separasjonsfilter og tilsett 2,5 ml MACS buffer til kolonnen. Deretter umiddelbart fjerne kolonnen fra magneten og samle den første sorterings CD56 + fraksjonen i en separat 50 ml konisk rør ved å presse stempelet inn i toppen av kolonnen.
    MERK: Stempelet passer veldig godt inn i toppen av kolonnen, og kan være ganske vanskelig å betjene; Imidlertid må dette gjøres mens kolonnen er fortsatt full buffer, slik at hastigheten er nødvendig. Unngå å trykke inn stempelet for hardt og fort.
  9. Før plating vurdere levedyktigheten til cellene ved hjelp av, for eksempel, den trypanblått-assay. Bestemme prosenten av levedyktige celler fra 8 x 1 mm 2 tellefelt (begge kamrene i hemocytometer).
    MERK: Cellene kan være enten enkel eller dobbel sortert avhengig av renhet som kreves. Hvis det gjøres omhyggelig disse cellene tolerere dobbeltsorteringsprosedyren meget godt og er meget høy levedyktighet> 95%. For dobbel sortering, sette opp en annen kolonne, smøre med en ml sortering av buffer og fortsett fra trinn 4.6.
    1. Hvis bildebehandling skal utføres, plateceller direkte på dekkglass ligger i 24 brønners retter 21 og belagt med ditt valg av ECM molekyl for cellebinding (f.eks kollagen eller laminin). Her bruker 0,1-0,5 mg / ml kollagen-I (tabell 3).

5. Sortering av Humen Muscle-avledet Fibroblaster umiddelbart etter isolasjon.

  1. Å rense fibroblast stamceller umiddelbart etter isolasjon, ansetter protokollen som ovenfor med følgende modifikasjoner:
    1. Umiddelbart etter isolasjon resuspender celler i komplett medium og filter en gang om en 100 mikrometer celle sil og deretter igjen om en 40 mikrometer sil. Tilsett 5 ml PBS og sentrifugering ved 657 x g i 6 minutter.
    2. Resuspender cellene i MACS-buffer sortering og inkuber i Anti-human-fibroblast Microbeads i 15-30 minutter ved romtemperatur.
    3. Bruk LS kolonne og Midi-MACS separator (tabell 3) og installere 40 mikrometer pre-separasjon filter.
    4. Utføre en eller to typer, avhengig av renhet som kreves, overføre cellene så snart som mulig i serumholdig medium, å utføre en telling, og plate ut på den ønskede densitet

6. immunocytokjemisk Farging (en dag og over natten).

  1. Ordneceller i brønner ved tilsetning av et likt volum av 8% paraformaldehyd i iskald PBS i 10 min med forsiktig omrøring. Etter 10 min aspirer fiksativ og vask to ganger med PBS.
  2. For å immunfarging av celleoverflateantigener, blokkere celler i minst 1 time i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og deretter sonde med de aktuelle primære antistoffer (tabell 4).
    1. For intracellulære antigener, permeabilisere cellene etter fiksering ved tilsetning av 0,2% Triton-X-100 i PBS med 1% BSA og NaN3 (0,01%) i 10 minutter, og deretter blokkere og inkuberes med primære antistoffer. Utføre alle primære antistoff-inkubasjoner over natten ved romtemperatur (eller ved 4 ° C) med forsiktig omrøring på en gyngende plattform.
  3. Fjern ubundet primære antistoff og vask cellene tre ganger med kald PBS. Inkuber i 1 time inkubering med artsspesifikke fluoresceinmerkede sekundære antistoffer (tabell 4) ved romtemperatur.
  4. Etter fjerning avubundne sekundære antistoffer, skyll celler med tre utvekslinger av PBS og deretter counterstain med fluorescerende DNA-fargestoff Hoechst 33342 (1 pg / ml) løsning i 10 minutter på en risteplattform.
  5. For samtidig visualisering av begge celleoverflateantigener og intracellulære antigener, for å probe cellene først med primære antistoffer celleoverflateantigener, etterfulgt av deres egnede sekundære antistoffer. Deretter gjen fikse cellene i kaldt PFA, permeabilize, blokk og inkuberes med primære antistoffer mot cytoplasmatiske eller kjernefysiske antigener fulgt av sine respektive sekundære antistoffer.
  6. Etter farging, fjerne dekkglass fra sine brønner ved hjelp av buede tang og skyll baksiden av dekkglass med destillert vann. Legge dekkglass cellen skli ned på en dråpe anti-fade monteringsmedium 22 sett på et glass objektglass.

7. Oil Red O Farging i kombinasjon med Immunofluorescent Farging av celler (2 timer)

  1. Avslørelipidinnholdet av celler sådd ut i 24 brønners skåler ved farging med Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol) 5,23. Først fremstille en stamløsning på 0,5% (w / v) Oil Red O ved å oppløse 500 mg av Oil Red O i 60 ml 99% trietyl-fosfat og 40 ml destillert vann. Oppretthold denne løsningen ved romtemperatur i mørke inntil bruk.
  2. På dagen for bruk, blir en 36% (w / v) trietyl-fosfat arbeidsoppløsning inneholdende 12 ml Oil Red O stamløsning og 8 ml destillert vann. Filtrere denne løsningen gjennom filterpapir nummer 42 for å fjerne all krystallisert Oil Red O (som svekker bildekvalitet).
  3. Forsiktig oppvarming av dette arbeidsløsning i et vannbad i 1 time, hvoretter oppløsningen blir sentrifugert ved 1200 x g i 6 minutter. Fjern supernatanten og filtrer igjen gjennom filterpapir (nummer 42) og overføring til en frisk 20 ml tube.
  4. Etter cellene har blitt fikset, permeabilised og immunostained, fjerne PBS og tilsett 500 mL av Oil Red O / Triethyl-Phossulfatoppløsning til brønnene i 60 minutter. Triton-X ved den konsentrasjon som brukes her for cellemembranen permeabilisation ikke påvirker cellulær lipidinnhold 23.
    MERK: Olje Red O blir opphisset av bølgelengder mellom 540 og 580 nm og dermed Texas-Red filter kan brukes til å påvise olje Red O utslipp i fluorescens mikros 23. Merk at fluorescens utslipp fra Oil Red O tidvis kan lekke inn i langt røde kanalen hvis cellene er veldig sterkt farget (dvs. svært høyt fettinnhold).
  5. Etter inkubasjon fjerne overflødig olje Red O og skyll cellene fem ganger med 500 mL PBS. Montere Dekk som for farging som beskrevet i kapittel 6. Detect Oil Red O fargestoff av både lysfelt / fasekontrastmikroskopi eller ved epifluorescence mikros hjelp av Texas Red filter (skifte gratis, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Innhenting Mikrografer fra Fluorescensmikroskopi for Følgende Analysis

MERK: Kontroller at glir å bli sammenlignet kvantitativt er farget med de samme løsningene, fotografert ved identiske forhold (for eksempel eksponering, kamera og oppkjøps innstillinger etc.) og fanget i den samme mikros økt. Alt etter oppkjøpet formatering bør også være identiske og være i henhold til foreslåtte retningslinjer for digitale bilder 24.

  1. For bildet oppkjøpet (Widefield mikroskopi), slå på mikroskopet og fluorescens lyskilde og la stå i den anbefalte mengden av tid til å tillate fluorescens lyskilde for å varme opp og stabilisere.
  2. Still mørkestrøm for kameraet ved å blokkere lysbanen til kameraet; tilegne seg et bilde ved maksimal oppløsning og bruke dette til å korrigere senere ervervet bilder.
  3. Belyse immunofluorescent prober ved epifluorescence levert av flytende lys guider (fleksible rør av fluor fylt med fenvlmetvl silikon olje) ennd signaler visualisert gjennom rød (filter satt 45 HQ Texas rød skift fri, grønn (filter satt 44 FITC spesiell skift gratis) og blå (filter satt 49 DAPI skift gratis) bånd pass filter på en omvendt epi-fluorescens mikroskop (10X, 20X, 40X, planlegger apokromatiske mål med 0,25, 0,75, 0,95 numeriske åpninger henholdsvis).
  4. For å unngå pixel metning finne optimal eksponering innenfor den lineære området av detektoren for hver fluoriserende fargestoff ved hjelp av "Overeksponering-funksjonen på bildet oppkjøpet programvare. Noter standardisert eksponering for hver fluorescerende etikett.
  5. Fange opp individuelle kanaler og lagre gråtoner eller pseudocolored tiff (Tagged Image File Format) bildefiler i høyeste bitdybde (helst 16 bit - 65.536 grå verdier) levert av opptaksenheten (f.eks avkjølt CCD (belastet coupled device) montert på mikroskop) . Angi bildeoppløsningen til 1388 x 1040 eller høyere. Sørg for å inkludere en skala bar eller et objekt av kjent didimensjoner i bildet.
  6. Der det er mulig å lagre filer i 16 bit Tagged Image File Format (TIFF) og ikke i JPEG-format for å hindre tap av informasjon 25.
  7. Hvis det er noen bekymringer over jevnhet av belysning (programvare sammen med mikroskop kan ha automatisk korrigering for dette) ta en "flat-feltet 'bilde av dekkglass uten celler, men farget og montert på samme måte som eksperimentelle lysbilder; dette kan brukes til å korrigere for belysning defekter etter oppkjøpet i bildeanalyse programvare.
  8. For bildet oppkjøpet (konfokalmikroskopi), optimalisere detektor gevinst og laser makt for hver bilde eksperiment (unngå metning). Generelt er fluorescensen måles proporsjonal med lasereffektnivå. Sett pinhole størrelse til 'en luftig "for å oppnå best mulig signal-til-støy-forhold (forbedret oppløsning kan oppnås ved 0,5 luftig for særlig sterke signaler). Ta optiske seksjoner på forskjellige nivåer langs z-aksen gjennom mauriBody-merkede celler og spare en 16 bit maksimal projeksjon for hver kanal for bildeanalyse.

9. utøvende Målinger av fluoresceinmerket Nuclear transkripsjonsfaktorer Bruke Bildebehandling og analyse programvare (5 min per synsfelt).

  1. Tilgang individuell tiff bildefiler og overlay tilsvarende kanaler ved å klikke og dra et bilde til et annet. Hver kanal vil da fremstå som et eget lag i Lag-panelet.
  2. Velg lette fra filtermenyen for å tillate lag under som skal visualiseres samtidig. Alternativt justere tettheten av de beste lagene til 50%.
    MERK: Tiff bilder kan lagres med "lossless" Lempel-Ziv-Welch (LZW) datakomprimering for å redusere filstørrelser uten tap av informasjon.
  3. I analysevinduet (Analyse> Velg Data Points> Custom), velger Analyse og velge målingene som kreves (f.eks Integrert tetthet, mener Polyetyleny, sirkularitet, histogram etc.). Kast alle unødvendige målinger ved å fjerne merket i boksen ved siden av dem. Hvis målingene området er nødvendig i mikrometer klikk på Analyse> Set Measurement Scale. Herskeren verktøyet vil automatisk dukke opp - spore lengden av skalaen bar og inn sin kjent lengde i mikrometer. Programvaren vil da konvertere målinger området i kvadratiske mikron.
    MERK: Hvis histogrammet analyse er valgt, når målinger registreres en ekstra mappe vises (plasseringen av disse kan velges) med 8 bit histogrammer for hver enkelt merket område i mikrografi samt summering av alle individuelle valg (dette vises alltid som Histogram-en hvis flere valg er gjort). Denne analysen kan ikke utføres av programvaren i 16 bit formatet, men er svært anvendelig for å undersøke fordelingen av bildeelementintensitetene gjennom et objekt av interesse.
  4. For analyse av kjernefysisk fluorescens intensitet først konstruere en repretant 'Color Range Selection Mask' (CRSM) for Hoechst eller DAPI beiset DNA for å definere kjernefysiske området. Når de ønskede kanal bildene kledde, bør bare Hoechst kanal lag stå i visningen ved å sikre den "øye-ikonet 'grenser til det i kategorien lag er valgt, og deretter laget er uthevet (blir blått), mens alle andre lag bør være opphevet. Kontroller at blending dropdown er satt tilbake til "Normal" i kategorien lag.
  5. Åpne Color Range dialogboksen (Velg> Color Range) og angi valget alternativet dropdown til 'Samplet farger ". Med valget forhåndsvisning satt til "rask maske '(rød bakgrunn) velge alle de blå fargetoner innenfor kjernen ved å holde shift-tasten (' + '-tegnet vises) og klikke innenfor kjerner hjelp øyedråpeteller verktøy som vises.
    1. Hvis det er valgt uønskede toner, fjerne dem ved å trykke på Alt-tasten ('─'sign vises) og klikkepå dem. Opprettholde den uklarhet skala på null, slik at bare manuelt utvalgte fargetoner er inkludert i målingen og 'Lokaliserte fargeklynger' bør overlates ukontrollert.
  6. Lagre denne CRSM til datamaskinens harddisk som en-program-spesifikke ekstrakt fil (.AXT fil). Med en annen tilfeldig felt av kjerner, last, oppdatere og lagre CRSM (Select Color Range, Load). Gjør dette i minst fem tilfeldige felt for å sikre at atom valg er representative.
    1. Bruke en farget versjon av et gråtonebilde for opprettelsen av en maske for å isolere funksjoner fordi det menneskelige øyet er bedre i stand til å diskriminere mellom ulike fargenyanser enn mellom forskjellige nyanser av grått 26.
  7. Bruke atom CRSM å segmentere atom regioner for farging. Når atomkjerner har blitt valgt klikk på Bilde> Justering> Threshold og flytt glidebryteren helt til høyre, slik at kjernene bli svart. Alternativthøyreklikk og velg "Fyll" og deretter velge "Fyll til: svart '. Klikk deretter på Select> Inverse og nå trykker slett for å fjerne all bakgrunnen (hvis alternativet vises velger "fill til: White '). Dette binarizes hovedsak bildet basert på ditt valg. Deretter laste vannskille plugin fra kategorien filtre for å skille overlappende kjerner (Filter> Binary bilde> Watershed funksjonen separasjon).
    1. Hvis mange kjerner er tungt overlappende, fjerne kjerner fra analyse ved å fjerne merkingen dem (Hold Alt-tasten og løst tegne rundt dem med lasso verktøyet).
  8. På den nå binære kjernefysisk lag, gå til Velg> Color Range og> Shadows, for å velge enkeltkjerner. Alternativ hold shift og klikk i ett svart kjerne. Alle kjerner vil umiddelbart bli valgt. Deretter overføre dette valget til laget som inneholder atomtranskripsjonsfaktor flekker (f.eks myogenin) ved å velge at lag og fjerne merkingen alleandre lag. Marsjerte linjer vil nå vise posisjonen til kjerner i myogenin kanal.
  9. Hvis du arbeider med pseudocolored bare bilder klikk på Kanalpaletten (til høyre for kategori lag) og velge bare den grønne kanalen (bildet vises nå grå). Deretter klikker du på Bilde> Modus> Gråtone. En advarsel vises 'Flat synlige lag og kast skjulte lag "klikk OK, så en annen advarsel vil si' forkaste andre kanaler" klikk OK igjen. Bare et enkelt lag av gråtone- valgte kjerner vil nå være til stede i lagene palett.
    1. Klikk Rekord Målinger i måleloggen å innhente data for de valgte kjerner. Hvis laget som skal analyseres (f.eks myogenin flekker) er allerede en rå 16 bit gråtonebilde så bare trykk Record Målinger.
    2. Eksportere utvalgte målinger som TXT fil til plasseringen av ditt valg. Disse kan deretter bli videre bearbeidet og analysert på annen datahåndtering programvare packages
      MERK: Edit> skritt bakover kommando (trykk alle Alt, Ctrl og Z tastene samtidig) gjenoppretter alle tidligere lag hvis nødvendig.
    3. Riktig for ikke-spesifikk bakgrunnsfluorescens 27 for resultatene å være kvantitativ og sammenlignbare som målinger av fluorescens-intensitet er alltid en blanding av signal og bakgrunn.
      1. Velg firkantet utvalg verktøy og sjekk 'fast størrelse' velge 20 av 20 piksler (eller større om ønskelig og avhengig av confluency av celler i bildet). Mens du holder shift velge ti eller flere bakgrunnsområder spredt over hele synsfeltet. Trykk 'Rekord Målinger "i måleloggen.
      2. Beregne gjennomsnittlig integrert tetthet (summen av alle piksel grå verdier) per piksel av alle 10 utvalgte bakgrunns regioner (gitt som "bety grå verdi 'i loggen Measurement). Multiplisere den gjennomsnittlige bakgrunnstetthet per piksel med antall piksler i målobjektet (
      3. Trekk bakgrunnsfluorescens fra gjenstandene opprinnelige integrert densitet for å gi den endelige bakgrunn korrigert verdi. Denne fremgangsmåten utgjør potensielle felt til felt variasjon i ikke-spesifikk bakgrunn fluorescens.
        MERK: Det er av største viktighet å velge bare bona fide bakgrunns regioner som denne korreksjonen har en betydelig innvirkning på de endelige verdiene. Zoome inn med forstørrelsesglass anbefales ved å gjøre valg.
      4. Det kan også være hensiktsmessig å dele den generelle bakgrunn korrigert verdi av det området av kjernen i piksler (samme som å ta midlere gråtone / intensitet per kjerne) for å minimalisere eventuelle påvirkning av kjerne lokalisert bakgrunnssignal som ville bidra mer til den integrerte densitet verdi med økende atomstørrelse (Figur 3C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Purified myogeniske celler og fibroblaster kan dyrkes i adipogenic differensiering medium for tre dager etterfulgt av adipogenic ernæring medium fra hvor som helst mellom 7-30 dager for å vurdere deres potensial for adipogenese. Ved hjelp av de rensede cellepopulasjoner, Oil Red O farging i kombinasjon med immunfarging for adipogenic og myogeniske avstamning markører viste at bare fibroblast fraksjon var i stand til å adipogenic differensiering (figur 2). Den massive akkumulering av fett ved fibroblastene er synlig for det blotte øye (panel A), og deres fullstendige transdifferensiering er vist ved den meget sterke ekspresjon av kjerne PPAR γ (figur 2 panelene B og C, og figur 3). Med 15 dagers behandling, har disse cellene sluppet eventuelle gjenværende TE-7 (en bindevevs antigen) på sitt substrat (panel D). I motsetning myogeniske celler opprettholde sin normale fenotype inkludert ekspresjon av desmin og myosin tungkjeden (figur 2 paneler E & F) og ikke oppregulere atom PPARγ (Figur 3C).

Et eksempel på en kvantitativ analyse av et felt av myogeniske celler (desmin +) er vist på figur 3. Panel B viser felt analysert, og felt A viser den kvantifiserte fluorescensintensitet (etter bakgrunnskorrigering). Denne metode viser klart at variasjon av myogenin ekspresjon i enkelte kjerner ved denne spesifikke seeding tetthet og tidspunkt. Figur 3C viser anvendeligheten av fremgangsmåten for direkte å sammenligne transkripsjonsfaktornivåer i forskjellige celletyper på en celle-for-celle-nivået. Her viser vi at CD56 - muskel fibroblaster uttrykke et høyt nivå av adipogenic transkripsjonsfaktor PPARγ mens sortert CD56 + celler myogeniske opprett bare svært lave nivåer etter eksponering for adipocytt-induserende medium.


Fig. 1: Rensede populasjoner av myogeniske celler og fibroblaster oppnådd ved immunomagnetisk vulst sortering (AB) Etter en uke i kultur sortert myogeniske celler uttrykker celleoverflate celleadhesjonsmolekyl CD56 (N-CAM) og muskel spesifikke mellomliggende filament desmin. Nuclear ki-67 uttrykk gir bevis for at disse cellene formerer. Farging av membranen, cytoplasmiske og kjernefysiske bestanddeler er beskrevet i protokollen trinn 6.5. (CD) myogeniske celler uttrykker ikke fibroblast markør TE-7. (E) fibroblaster avledet fra human muskel uttrykke TE-7 og (F) transmembranplater avledede vekstfaktor-reseptor α (PDGFRα). Skala barer er: (A) = 20 um, (B, C og E) = 200 nm, (D og F) 50 &# 181; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Human muskel-avledet CD56 - / TE-7 + fibroblaster og CD56 + / desmin + myogeniske celler dyrket i adipocytt Inducing Medium (AIM). (A) Fibroblaster ble isolert ved MACS differensierer til adipocytter når de dyrkes i adipocytt-induserende medium (AIM), og dette kan lett sees med det blotte øye etter Oil Red O-farging. Myogeniske celler viser ingen tegn til adipogenic differensiering etter samme periode i AIM og viser svært begrenset Oil Red O farging. (B & C) HUman muskel-avledet fibroblaster sterkt uttrykte PPARγ og CEBPα (ikke vist) etter dyrkning i AIM. (C) Som fibroblaster differensierer til adipocytter de slipper gjenværende intracellulær ECM-proteiner som danner et tett nettverk rundt dem. (E) myogenisk celle opprettholde sin myogenisk morfologi og ekspresjon av avstamning markører som for eksempel desmin, og (F) myosin tung kjede (MHC), en markør for terminal differensiering myogenisk, og mislykkes i å akkumulere lipid. Skala barer er: (B, D) = 200 mikrometer (E, F) = 100 mikrometer, (C) = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Eksempel på data innhentet fr om immunolabelled kulturer ved hjelp av bildeanalyse metoden beskrevet (Adobe Photoshop Extended tilnærming). (A) en celle-for-celle-fluorescensintensitet plott for muskel spesifikke nukleære transkripsjonsfaktor myogenin etter 24 timer i serum-fritt differensieringsmedium. (B) Representative mikrografer av desmin + / myogenin + humane myogeniske forløpere. Skala barer er: (B) = 50 mikrometer (C) PPARγ fluorescens intensitet i enkelte kjerner fra sortert CD56 + / desmin + myogeniske populasjoner (CD56 +) og CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Kollagen VI + celler (CD56. -) etter kultur i adipocytt Inducing Medium i 15 dager. Fluorescens-verdier ble normalisert til kjerneområdet for å ta hensyn til variasjoner i atomstørrelse mellom de to celletyper. Horisontale svarte striper i (A) og (B) viser gjennomsnittet.52049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Medium komponenter Konsentrasjon Katalog no. Kommersiell kilde
Menneskelig skjelettmuskelvekst medium: C-23060 (Comes "klar til bruk" som inneholder alle faktorer som er oppført)
Skjelettmuskulatur basal medium - PromoCell
Føtalt kalveserum 15% PromoCell (5%) og FCS Gold, PAA Laboratories (10%) - Cat no. A15-151
Fetuin (storfe) 50 pg / ml PromoCell
Epidermal vekstfaktor 10 ng / ml PromoCell
Basisk fibroblast vekstfaktor (rekombinant human) 1 ng / ml PromoCell
Deksametason 0,4 ug / ml PromoCell
Insulin (rekombinant human) 10 ug / ml PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml Sigma
L-Glutamin 292 pg / ml Sigma
Myogenic differensiering medium C-23260
Skjelettmuskulatur basal medium - PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml </ Td> Sigma
Merk: PromoCell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK

Tabell 1: cellekulturmedier komponenter og konsentrasjoner.

Medium sammensetning Konsentrasjon Katalog no. Selskap
Preadipocyte Vekst medium C-27410 (klar til bruk)
Føtalt kalveserum 0,05 ml / ml PromoCell
Endotelcelle-vekstsupplement 0,004 ml / ml PromoCell
Epidermal vekstfaktor (rekombinant human) 10 ng / ml PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml Sigma
Glutamin 292 pg / ml Sigma
D-Biotin 8,0 ug / ml PromoCell
Insulin (rekombinant human) 0,5 ug / ml PromoCell
Deksametason 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 pg / ml PromoCell
L-tyroksin 9 ng / ml PromoCell
Ciglitazon 3 ug / ml PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml Sigma
Glutamin 292 pg / ml Sigma
Preadipocyte differensiering medium C-27436 (klar til bruk)
D-Biotin 8,0 ug / ml PromoCell
Insulin (rekombinant human) 0,5 ug / ml PromoCell
Deksametason 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 pg / ml PromoCell
L-tyroksin 9 ng / ml PromoCell
Ciglitazon 3 ug / ml PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml Sigma
Glutamin 292 pg / ml Sigma
Fettceller ernæring medium C-27438 (klar til bruk)
D-Biotin 8,0 ug / ml PromoCell
Insulin (rekombinant human) 0,5 ug / ml PromoCell
Deksametason 400 ng / ml PromoCell
Penicillin 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 pg / ml Sigma
Glutamin 292 pg / ml Sigma
Merk: PromoCell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK

Tabell 2: Sammensetning av adipogenic cellekulturmedier.

Navn på utstyr / reagens Selskap Katalog no. Kommentarer / beskrivelse
Cellekultur Kollagenase D Roche 11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Må filter steriliseres før bruk
Trypsin / EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 mikrometer celle sil BD Biosciences 352360
Kollagen-løsning (3 mg / ml i 0,1% eddiksyre) Sigma, Dorset, UK C8919
Minisart SRP15 sprøytefilter (0,2 mikrometer) Sartorius 17573ACK Polytetrafluoretylen (PTFE) membran
CD56 menneskelige Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Magnetisk-aktivert Cell Sorting (MACS)
Vær oppmerksom på begrenset holdbarhet av mikroperler
Anti fibroblast Microbeads, menneskelig Miltenyi Biotech 130-050-601
40 um Pre-separasjonsfiltre Miltenyi Biotech 130-041-407
Store Cell collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 Disse kolonnene kommer med en flyt motstand. Bruk av strømningsmotstanden er ikke nødvendig for å oppnå de høye myogeniske renheter som er beskrevet her.
LS kolonner Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMACS Prioriterte Miltenyi Biotech 130-042-102 Denne separator passer storcellet kolonnen, men ikke LS kolonne.
MidiMACS Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Må filter steriliseres før bruk
Olje Red O Sigma O0625 Lipid farging
Triethylfosfat Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, askefrie. For å fremstille filteret brette den sirkulære filterpapir for å lage en halvsirkel, og deretter brette den halvsirkel i en halv gang til for å danne en konisk form. Monter kjegle i en trakt for filtrering.
Montering
Forlenge Gold Antifade Reagens Molekylære prober, Invitrogen P36930 Dette kan kjøpes med eller uten DAPI og ikke slukke innledende fluorescens.
AxioVision Carl Zeiss Kontakt Zeiss Image oppkjøpet programvare
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (kjøpt fra Pugh Computers) ADPH16982 * Bildeanalyse programvare

Tabell 3: Utstyr og reagenser.

Navn / antigen Antistoff arter og isotypen Klone navn Fortynning for bruk Katalog no.
Myogeniske markører:
CD56 (N-CAM) Mus mc IgG 1 MY-31 (1: 100) 347740 BD
Desmin Kanin mc IgG 1 D93F5 (XP) (1: 250) 5332S NEB
Myogenin Mus mc IgG 1 F5D (01:50) F5D DSHB
Myosin tung kjede Mus mc IgG2b, kappa-lettkjede MF20 (1: 200) MF20 DSHB
Fibroblast / binde
tissue markører:
Anti-human fibroblast Mus mc IgG 1 TE-7 (1: 100) CBL271 Millipore
PDGFRα Kanin mc IgG D13C6 (1: 500) 5241 NEB
Proliferative markører:
Ki67 Kanin mc IgG SP6 (1: 200) MP-325-CRM1 MD
Adipogenic
transkripsjonsfaktorer:
PPARγ Mus mc IgG 1 E8 (01:20) Sc-7273 Santa Cruz Bioteknologi
Nøkkel: mc: monoklonalt,pc: polyklonale, DSHB: Utviklingsstudier Hybridoma Bank, Iowa USA;
Neb: New England BioLabs, UK; MD: A. Menarini Diagnostics, UK; BD: BD Bioscience, UK.

Tabell 4: primære antistoffer.

</ Tr>
Antigen Antistoff arter og isotypen Fortynning Katalog no. Selskap
Alexafluor488 Geit-anti-mus IgG (H + L) 1: 1000 A-11001 MP
Alexafluor 594 Geit-anti-mus IgG (H + L) 1: 1000 A-11005 MP
Alexafluor 594 Geit-anti-kanin IgG (H + L) 1: 1000 A-11012 MP
Nøkkel: H + L = tunge og lette kjeder; MP: molekylære prober, Invitrogen Life Technologies, Paisley UK

Tabell 5: Sekundære antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet en immunomagentic sortering fremgangsmåte for selektiv anrikning av humane muskel-forløpere avledet fra små prøver av muskelbiopsimateriale. Denne teknikken har vært uvurderlig i vårt laboratorium for å overvinne tapet av humane muskel-avledet kulturer til fibroblaster, men også for å forstå den unike virkemåten av distinkte populasjoner av muskel-avledede stamceller. Når rensede myogeniske celler kan bli etterforsket for endringer i protein og / eller genekspresjon, eller brukes til nedstrøms eksperimenter.

I tillegg til celle rensing vi også detalj en hurtig og enkel metode for å analysere spesifikke regioner av interesse i mikrografer fra fluorescens mikroskopi. Digitale bilder fra fluorescens mikroskopi inneholder et vell av informasjon for cellebiologer til å trekke ut; faktisk piksler holde data som ikke nødvendigvis er synlige for det menneskelige øye. Med denne teknikken kvantitative data kan oppnås på et stort antall av individuelle celler i en populasjon. En unik egenskap ved bildeanalyse sammenlignet med flowcytometri er evnen til å korrelere endringer i proteinekspresjon med endringer i celleform orcell-celle-interaksjoner. Videre, til kapasiteten lage og lagre optimalisert og representativt utvalg masker tillater raske, nøyaktige og reproduserbare målinger skal gjøres på mange synsfelt og dermed redusere muligheten for brukeren skjevhet.

MACS-baserte celle rensing

En fordel med denne metoden er at celler som med hell kan renses enten umiddelbart etter isolering eller etter noen få dager i kultur (når utbyttet blir høyere).

Avgjørende, bør myogeniske celler ikke tillates å bli konfluent før sortering, fordi dette hindrer deres passasje gjennom kolonnen, og vil redusere andelen av proliferative celler oppnådd for ytterligere ekspansjon og eksperimentering.

t "> Avhengig av den innledende vevsprøve oppnådd, kan det være et stort antall av ikke-adherente erytrocytter i kulturen på dette tidspunktet. Metoder foreligger for selektivt å lyse erytrocytter, men for å unngå unødvendig kjemisk stress til muskel-avledede celler av denne trinnet er unngått. Vi har ikke observert nevneverdig negativ innvirkning av erytrocytter på tidlig kultur av menneskelige muskel-avledet celler, og disse erytrocytter er fjernet av medie endringer gang myogeniske celler feste.

Andre metoder for celle løsgjøring like før sortering (f.eks, andre milde proteaser eller EDTA-baserte metoder) kan brukes for celler hvori ekspresjonen av celleoverflate-antigenet er lav eller spesielt følsomme for tryptisk fordøyelse. Uttrykket av CD56 på menneskelige myogeniske celler er sterk og motstandsdyktig mot en kort trypsinsation (når analysert med antistoffer som er beskrevet her).

Det er viktig at sorterings bufferen inneholder EDTA for å inhibere calcium-avhengig celle-celle-adhesjon; Dette er avgjørende for å oppnå (og opprettholde) et enkeltcellesuspensjon for sortering. Avhengig av cellenummer, form og størrelse som skal sorteres, er det et valg som skal gjøres med hensyn til separasjonskolonnen (se tabell 3).

Fjerning av kolonnen fra det magnetiske felt for å frigi tilbakeholdt cellene kan være vanskelig, slik at oppsamlingsrøret (selv om skjørtede) er plassert i en holder plassert svært nær stammen for å unngå tap av celler i transitt.

Selv om vi har beskrevet denne teknikk for bruk med humane primære celler fra skjelettmuskel, kan denne protokollen kan lett tilpasses for andre celletyper for hvilke en spesiell / unik celleoverflatemarkør er kjent. Andre fordeler omfatter det faktum at hele prosedyren kan utføres i det sterile arbeidsmiljøet for en laminær strømningsskap. Dessuten er den MACS prosedyre mildere på cellene i forhold til FACS sortering på grunn av lavskjærkrefter og kan være en spesiell fordel for større celler. De magnetiske perler som anvendes er lite, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar i kultur. Faktisk har MACS blitt brukt for rensing og undersøkelse av en rekke andre celletyper.

En begrensning ved denne teknikk er at MACS ikke lett kan utføres for flere markører samtidig. Dessuten kan mengden av markør og størrelse på cellene ikke kan påvises i løpet av sorteringsprosessen, bare etterpå.

Betraktninger for å optimalisere bildeopptak og analyse

Bildeanalysemetode vist her gir et kraftig verktøy for å belyse endringer i ekspresjonsnivået av proteiner på en celle-for-celle-basis i store populasjoner av celler. Ved å utnytte lagene anlegget og utvalgsmasker i et bredt tilgjengelige programvarepakke, kan eksperimentator objektivt velge ulike fluorescerende signaler på tvers av flere bilder, for å tillateKvantifiseringen av de enkelte funksjoner, og hvilket som helst antall komponenter innenfor dem. Vi har med hell brukt denne metoden for å kvantifisere og direkte sammenligne utvalget av transkripsjonsfaktor uttrykk i ulike cellepopulasjoner utsatt for en adipogenic utfordring.

Hver fluorescens kanal (som representerer en spesifikk markør) kan holdes atskilt fra de andre og slått på eller av etter behov, noe som er nyttig for multi-farge immunomerking eksperimenter.

En rekke faktorer må tas i betraktning når man forsøker å trekke kvantitative og semi-kvantitative data fra fluorescens mikros 28. Oppmerksomhet på disse vil tillate basis semi-kvantitative målinger skal gjøres. Ofte forskere ønsker å bruke en rekke fluorokromer å merke ulike proteiner av interesse; av stor betydning er evnen til å kunne skille mellom de enkelte emisjonsspektra. I de fleste tilfeller oppnås dette ved selektiv excitation av bare en fluorokrom gangen. Men hvis utslipps og / eller eksitasjon spektra lapper betydelig eller er mangelfullt filtreres deretter blø-through eller cross-talk kan kompromittere nøyaktigheten av bildedata innhentet. Blø gjennom er passasjen av fluorescensemisjon på en upassende deteksjon kanal og er forårsaket av en overlapping av emisjonsspektra 29,30.

Noen punkter du bør vurdere er: velger fluorokromer som har godt atskilt eksitasjon og emisjonsspekter, bruker svært selektive eksitasjonsbølgelengdene (som oppnås ved lasere i konfokalmikroskopi), påse at utslipp filter sett er strenge nok til å utelukke uønskede bølgelengder, og utfører flerfarget bildebehandling på den lengste (dvs. 'reddest') bølgelengde topp emisjons fargestoff først å ta hensyn til det faktum at absorpsjon spektra er generelt en vridning mot kortere bølgelengder (blått lys), mens emisjonsspekter er forskjøvet mot lengre Wavelalle bølgelengder (rødt lys). Spektrene av fluorescerende merker som er tilgjengelige på 'fluorescens Spectraviewer' levert av Invitrogen.

Bruken av høye målsettinger kvalitet er avgjørende for bilder bestemt for analyse. En høy numerisk apertur (> 1,3) er best, og forstørrelse bør tilpasses til kameraet i Widefield mikroskopi. I begge Widefield og konfokal mikroskopi, er NA kritisk, da z-oppløsning øker som en funksjon av den numeriske apertur kvadrert 29. Der det er mulig benytter seg av pensjons-apokromatisk objektiver som er korrigert for både sfærisk og kromatisk avvik 29. Bruk av flytende lys guider anbefales sterkt som de reduserer ujevn belysning ved scrambling kilden belysning for å redusere romlig og tidsmessig sammenheng før sin inntreden i mikroskop objektiv 29.

Det er viktig å unngå metning av bilder, som mettede piksler kan ikke være korrekt quantified på grunn av klipping av informasjon på det mest intense gråtoneverdier 26.

Ulike 'plugins' kan være tilgjengelig slik at flat-felt rettelse prosedyrer for å utføres med relativ letthet; for eksempel Dr. John C. Russ har gjort mange av disse gratis tilgjengelig på nettet (http://www.drjohnruss.com/download.html). Ved hjelp av denne plugg forholdet mellom lysstyrken på hvert piksel i den eksperimentelle mikrobilde til den tilsvarende i referansebildet blir beregnet og erstatter den opprinnelige. Resultatene blir så skalert for å fylle lysstyrken spekter av bildet. Alternativt, er bildet kalkulator av ImageJ en annen måte å korrigere for ujevn belysning.

For noen bildeanalyse, kan konfokal mikros være metoden for valg som det hindrer ut-av-fokus fluorescens fra å nå detektoren 29. Imidlertid kan denne tilnærmingen ta vesentlig lengre enn Widefield fluorescens mikroskopi, begrense nummeneh av individuelle synsfelt som kan oppnås i en enkelt økt.

Nylig andre metoder har blitt rapportert for anriking av myogeniske celler fra menneskelig muskelvev. Bareja 31 brukte en kombinasjon av MACS mangel (for: CD11b, CD31, CD34 og CD45) etterfulgt av FACS for positiv utvelgelse av CXCR4 + / CD56 + myogeniske celler. Imidlertid, selv om denne fremgangsmåten var i stand til å generere et sterkt anriket myogenisk befolkning, er det betydelig lengre enn metoden beskrevet her, inneholder mange flere påfølgende trinn og resulterer i et lavere utbytte av rensede myogeniske celler lavere per gram vev.

I en annen fersk undersøkelse, Castiglioni 32 isolerte myofiber-tilknyttede celler fra menneskelige foster muskel ved FACS bruker flere markører og viste at CD34 - / CD56 + / Pax7 + celler (arketypiske satellittceller) kan fremvise osteogen samt myogenic avstamning potential, men generelt avtale med vårt arbeid viser ikke adipogenic potensial. Disse forfatterne viste at CD34 + / PAX7 - celler var ikke-myogenisk, men var i stand til å adipogenic og osteogent differensiering. Berikelse av CD90 uttrykk (en markør for muskel fibroblaster 33) i CD34 + non-myogenic brøkdel tyder på at en stor andel av disse cellene kan ha vært fibroblaster, som har vist seg å være den viktigste kilden til adipocytter i voksent menneske skjelettmuskulatur kulturer (referanse 5 og figur 2). Om muskel-avledet fibroblaster har også osteogene differensiering potensielle garanterer videre etterforskning.

I motsetning til fremgangsmåten ifølge Castiglioni 32, vår fremgangsmåte krever bare ett antistoff (i motsetning til 7) for å reproduserbart oppnå høye utbytter av rene myogenisk cellekulturer og kan utføres raskt i løpet av de aseptiske betingelser i en laminær strømningshette. En ytterligere methodological forskjellen er at disse forfatterne isolerte celler direkte fra dissosiert muskel og deretter fulgt disse i kultur, mens vi oftest kultur celler for en uke før sortering og dyrking. I våre hender denne tilnærmingen er bedre tolerert av cellene. Viktigere er total tid i kultur i hovedsak tilsvarende mellom de to tilnærmingene. Videre, gitt at fosterets skjelettmuskulatur er under hyperplasic og hypertrofisk muskelvekst 34 det er ikke overraskende at utbyttet av myogeniske forløpere er større fra foster muskelvev i forhold til voksen muskel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
  2. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
  3. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
  4. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
  5. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
  7. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
  8. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
  9. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  10. Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
  11. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
  12. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
  13. Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
  16. Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
  17. Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
  18. Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
  19. Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
  20. Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
  21. Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
  22. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
  23. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
  24. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
  27. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  28. Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
  29. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  30. Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
  31. Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
  32. Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
  33. Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
  34. Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).

Tags

Developmental Biology Stamcelle Biology Tissue Engineering Stem Cells Satellitt-Cells Skeletal Muscle adipocytter myogenic Cells myoblaster fibroblaster Magnetic Aktivert Cell Sorting bildeanalyse
Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Agley, C. C., Rowlerson, A. M.,More

Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter