Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52049

Abstract

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen, die de bewoner spierstamcellen zijn. Deze kunnen worden geïsoleerd uit menselijke spier biopten middels enzymatische digestie en hun myogene eigenschappen bestudeerd in kweek. Kwantitatief de twee hechtende celtypen verkregen enzymatische digestie zijn: (i) de satelliet cellen (genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), oorspronkelijk geïdentificeerd als CD56 + en later als CD56 + / desmine + cellen en (ii) spier- afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 - en TE-7 +. Fibroblasten vermenigvuldigen zeer efficiënt in de cultuur en in gemengde celpopulaties deze cellen myogene cellen aan de cultuur domineren kan overlopen. De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide typen cellen in kweek te onderzoeken. Hier descr weIbe een sorteersysteem gebaseerd op de zachte enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door magnetische celsortering (MACS) dat een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en goede opbrengst (~ geeft beide 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel na 7 dagen in vitro) voor experimenten in de cultuur. Deze benadering is gebaseerd op het incuberen van het gemengde spier afgeleide celpopulatie met magnetische microbolletjes beads geconjugeerd met een antilichaam tegen CD56 en vervolgens passeren cellen hoewel een magnetisch veld. CD56 + cellen gebonden aan microbolletjes worden bewaard door het veld, terwijl CD56 - cellen passeren ongehinderd door de kolom. Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kunnen worden uitgeplaat en gekweekt. Na een bepaalde ingreep, celmorfologie en de expressie en lokalisatie van eiwitten inclusief nucleaire transcriptiefactoren kan worden gekwantificeerd middels immunofluorescentie labeling met specifieke antilichamen en een afbeelding pEHANDELING en analyse pakket.

Introduction

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen 1, de myogene stamcellen 2,3. In vivo deze cellen bestaan ​​in een reversibel rusttoestand gelegen tussen de sarcolemma en basale lamina van elke myofibre, maar geactiveerd worden om te woekeren, zekering en differentiëren spierweefsel beschadigd, gerepareerd en geregenereerd 3. Satelliet-cellen kunnen worden geïsoleerd uit jonge en oudere humane spierbiopsie monsters middels enzymatische digestie 4 en de myogene eigenschappen kunnen vervolgens worden onderzocht in primaire kweek 5. De efficiëntie van dit isolatieproces met betrekking tot zowel opbrengst en zuiverheid van de celpopulatie afhankelijk van de gebruikte methoden en kunnen verschillen van monster tot monster. De twee belangrijkste aanhanger celtypen verkregen van enzymatische afbraak zijn de satelliet cellen (nu genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), aanvankelijk geïdentificeerd als CD56 + / desmine cellen, en mu-SCLE afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 - en TE7 + cellen 5. Fibroblasten hebben een snelle proliferatieve tarief en geen onomkeerbare groeistop en terminale differentiatie op cel-cel contact achtige myogene cellen niet ondergaan; dus in gemengde populatie, kan fibroblasten myogene cellen overspoeld met de cultuur domineren.

Fibroblasten vaak gezien als een irritatie voor spier biologen, maar er is nu een groeiende interesse in fibroblasten als cellen waard studie op zich, vooral omdat zij aangetoond dat een coöperatieve rol myogene cellen tijdens spier herstel 6 . De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide celtypen in kweek te onderzoeken. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode waarbij cellen kan worden gesorteerd voor verdere studie en / of geteld engeanalyseerd. FACS is aangetoond betrouwbaar verrijken menselijke myogene cellen, maar de opbrengst aan cellen voor verdere kweek is vooralsnog niet hoog 7 geweest. Gezien de beperkte replicatie potentieel van somatische cellen, zoals satelliet-cel-afgeleide myogene cellen en de zeer slechte proliferatie en differentiatie in verband met veroudering 4, zijn meer zachte aanpak vereist. Single spiervezels culturen bieden een andere, minder agressief, betekent het verkrijgen van muizen satelliet-cellen nog in hun sublaminal niche en na hun activering in cultuur 8,9 inwoner. Dit is echter vaak niet mogelijk uit menselijke spierbiopsie materiaal (omdat vezels nauwelijks zijn te verkrijgen pees pees) waardoor deze techniek niet toegankelijk voor veel onderzoekslaboratoria geïnteresseerd om menselijke spier afgeleide cellen zijn. Bovendien is de enkele vezel techniek maar korte tijd celaantallen.

Hier een sorteersysteem gebaseerd op het gen beschrijven weTLE enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door twee opeenvolgende ronden van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dat zowel een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en opbrengst (~ geeft 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel) voor experimenten in de cultuur. CD56 wordt beschouwd als de gouden standaard oppervlak marker voor de identificatie van menselijke satelliet cellen in situ 10 en in vitro 11 en de ideale oppervlaktemerker kandidaat voor kralen bevestiging. In deze benadering CD56 antilichamen geconjugeerd aan ijzeroxide en polysaccharide bevattende superparamagnetische gebonden aan cellen en door een hooggradiënte magnetische celscheidingskolom geplaatst in een sterk magnetisch veld 12,13. De scheiding kolommen zijn gevuld met een matrix van ferromagnetische staalwol of ijzeren bolletjes die dienen om magnetische veldlijnen zich aan hun oppervlak die sterke magnetische veld gradiënten (~ 4tesla) 14. In deze kolommen zelfs licht magnetische cellen worden aangetrokken en geadsorbeerd aan het oppervlak 14. Ongebonden (CD56 -) cellen passeren de kolom terwijl CD56 + cellen gelabeld met magnetische microbolletjes worden behouden tot verwijdering uit het magnetische veld 12,15.

Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kan worden geplateerd op de gewenste dichtheid voor verdere experimenten. Naar aanleiding van een bepaalde interventie van de cellulaire bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunocytochemie, afgebeeld met behulp van wide-field of confocale fluorescentie microscopie en kwantitatief geanalyseerd met behulp van een beeldanalyse aanpak die een snelle objectieve meting van alle gelabelde cellen in een bepaalde afbeelding maakt. In ons laboratorium hebben we deze dubbele immunomagnetische sortering benadering gevolgd door beeldanalyse 16 gebruikt om dat CD56 te tonen - de menselijke fibroblasten gemakkelijk transdifferentiëren tot adipocyten, terwijl myogenic cels satelliet oorsprong zijn zeer resistent tegen deze adipogene omzetting 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Voor de studies in ons lab alle vakken gaven hun schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen en alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring Britse National Health Service ethische commissie (Londen Research Ethics Committee; referentie: 10 / H0718 / 10) en in overeenstemming met de Human Tissue Act en de Verklaring van Helsinki.

1. Eerste Voorbereiding Voorafgaand aan spierbiopsie (15 min)

  1. Maak menselijk skelet spiergroei medium. Om een afgestudeerd steriele 50 ml conische buis toe 2,5 ml van het supplement mix, 10 ml foetaal kalf serum, antibiotica (penicilline / streptomycine) en glutamine om de juiste uiteindelijke concentraties (tabel 1), vul dan de buis tot 50 ml met skeletspieren basale medium.
  2. Breng 15 ml van de skeletspier basaal medium in een steriele 20 ml conische buis en wegen. Zodra woog plaats deze buis op ijs. Gebruik dit om het menselijke spier monster ontvangen.
  3. In een andere 20 ml buisje bereiden 10 ml een collagenase D Dispase II enzymoplossing tot een eindconcentratie van 2 mg / ml elk door oplossen stock monsters van deze enzymen in de skeletspier basaal medium. Filter-steriliseren deze oplossing door het door een 0,22 urn filter. Plaats deze steriele enzymmengsel in de incubator of waterbad bij 37 ° C gedurende 15 minuten opwarmen.
    LET OP: Dit mengsel van enzymen is iets zachter dan trypsine en beter onderhoudt cel levensvatbaarheid 17.
  4. Vernietiging van een petrischaal en een paar steriele scalpels.

2. spierbiopsie Procedure (45 min-1 uur)

  1. Voorafgaand aan het werven van deelnemers, het verkrijgen van volledige ethische verklaring en procedurele goedkeuring (inclusief relevante vaccinaties voor onderzoekers) uit alle relevante bestuursorganen, commissies en zorgverleners (bijvoorbeeld, ethische, institutionele, bestuurlijke etc.).
  2. Maak een steriel veld rondom het been (bijvoorbeeld met een steriele chirurgische lakens) eend grondig reinigen het gebied rond de biopsie met een antiseptisch antibacterieel middel (chloorhexidine).
  3. Verdoven de voorgestelde biopsie site op het been van de vrijwilliger door lokale injectie van 2% lidocaïne in de onderhuidse regio boven de fascia van de vastus lateralis.
  4. Wordt ~ 5 mm brede insnijding met een steriel chirurgisch mes door de huid en fascia en voer de Bergström naald biopsie procedure 18 met extra afzuiging.
  5. Met behulp van een steriel pincet verwijder de spier van de naald lumen en onder te dompelen in basaal medium op ijs. Vervoer het weefsel naar het laboratorium voor verdere verwerking zo snel mogelijk maar levensvatbare myogene cellen kunnen worden verkregen na perioden van 24 uur of meer.
  6. Debrief het onderwerp, reinigen en verzegelen de incisie site met meerdere steriele zelfklevende huid-sluiting strips en aseptisch jurk met een buitenste waterdichte bekleding.

3. Isoleren-Muscle afgeleid Precursor CeLLS (1 uur, 30 min)

  1. Verwijder de buis met de spier monster en wegen (zorg ervoor dat de buis droog schoon met weefsel). Bereken het gewicht van de spier monster door het aftrekken van het gewicht van de buis met medium en monster uit de buis alleen bevattend medium.
  2. Zwenk de oplossing een paar keer om de spier bloedmonster te wassen. Laat de spier sediment bij kamertemperatuur gedurende 30-60 sec.
    1. Verwijder nagenoeg het gehele volume van medium uit de buis, eerst via een elektronisch pipetteerhulp of aspirator maar laat ongeveer 2-3 ml in de buis.
    2. Inverteer de buis op een steriele petrischaal zodat de resterende vloeistof naar de spier proefexemplaar in de schotel dragen; gebruik maken van de steriele scalpel te extraheren eventuele resterende spier fragments.Rotate de schotel naar de resterende vloeistof te mobiliseren en te verwijderen met een pipette.Remove zichtbare stukken vet of bindweefsel.
  3. Voor biopsies wegen 100-400 mg, voeg 3 ml warmenzym-oplossing en met steriele scalpels snijd de spier monster in heel kleine stukjes (<1-2 mm 3).
  4. Met behulp van een wijde boring 25 ml pipet opstellen van de spier fragmenten en enzymoplossing en transfer naar een steriele 10 ml conische buis. Was de petrischaal met een verdere 3-5 ml collagenase en dispase enzymoplossing en met een kleinere 10 ml pipet verzamelen resterende spier fragmenten en plaats in de buis. Het exacte volume is niet kritisch.
  5. Plaats het flesje in een 37 ° C incubator (of waterbad) gedurende 60 min bij trituratie (10 ml pipet) elke 15 min.
  6. Na 1 uur beëindigen enzymatische dissociatie door toevoeging van een overeenkomstige hoeveelheid vers voorverwarmd groeimedium en laat de celsuspensie door een 100 urn filter om eventuele grote myofibre vuil te verwijderen. Centrifugeer de gefilterde cel oplossing bij 657 xg gedurende 6 min bij kamertemperatuur (20-25 ° C).
  7. Resuspendeer de cel pellet in 5-7 ml groeimedium en plaat in een onbeklede T-25weefselkweekfles. Breng de plaat aan de incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 7 dagen. Verander het medium elke 48 uur. In dit stadium myogene cellen zijn zeer klein en rond en moeilijk te onderscheiden van niet-myogene cellen.
    1. Op de eerste mediumverversing, centrifugeer het supernatant alle niet hechtende cellen te pelletiseren. Re-schorten deze in vers medium en re-plaat.
  8. Na 7 dagen kweken zorgen dat de meeste myogene (en fibroblast) cellen gehecht maar de cellen nog niet samenvloeiing bereikt. Zuiveren de myogene precursoren en MACS voeren volgens een protocol oorspronkelijk ontwikkeld door in de laboratoria van Gherardi en Chazaud 19,20 en verder bewerkt door ons 5.

4. Immunomagnetische Bead sorteren van cellen op basis van CD56 expressie (1,5 uur)

  1. Na 7 dagen Spoel de cel monolaag (die doorgaans zal 50-60% myogene cellen 5 bevatten) met drie beurzenkamertemperatuur fosfaatbufferoplossing (PBS) om eventuele resterende niet-hechtende cellen en afval van isolatie te verwijderen.
    1. Trypinize de cellen (0,04% trypsine in Ca2 + -vrij PBS met 0,73 mM EDTA) gedurende 3 minuten. Zodra cellen hebben losgemaakt, voeg 5-10 ml van de groei van skeletspieren medium om te voorkomen dat over-vergisting. Pellet de cellen door centrifugatie bij 657 xg gedurende 6 min bij kamertemperatuur (20-25 ° C) en resuspendeer in een geschikt volume van volledig medium voor tellen.
    2. Graaf een klein monster van de celsuspensie met de gewenste werkwijze (bijvoorbeeld met behulp van een hemocytometer of een automatische telinrichting) en bereken starten aantal cellen en levensvatbaarheid.
  2. Plate enkele putjes in een plaat met 96 putjes (of groter vaartuig indien nodig) voor immunocytochemische of flowcytometrie gebaseerd karakterisering van de bevolking voor sorteren (fibroblasten en myogene cellen zijn de meest voorkomende celtypen aanwezig).
  3. Aan de celsuspensie advertentied 15 ml steriele PBS cellen en medium verdund. Centrifugeer ze de cellen weer en resuspendeer in 170 ul van kamertemperatuur sortering buffer (1% BSA in een MACS spoeloplossing, gesteriliseerd via die door een 0,22 urn filter).
    1. Voeg 35 ul van goed gemengd magnetische microbolletjes geconjugeerd aan een CD56 primair antilichaam (kloon AF12-7H3, 130-050-401) in de cel oplossing pipet te mengen en laat incuberen gedurende 15 min bij 4 ° C onder zacht roeren bij het halverwege.
  4. Na incubatie verdunnen de cel en bead oplossing met 10 ml MACS sortering buffer en centrifugeer bij 657 xg gedurende 6 min. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer sorteren.
  5. Voeg het MAC-afscheider (magneet) aan de MACS houden stand. Wees voorzichtig bij het toevoegen van magneet om de stand te wijten aan de sterke magnetische veld. Sleuf in de kolom en passen de pre-scheidingsfilter. Pipetteer 1 ml sorteren buffer via de pre-scheidingsfilter en kolom voor smering.
  6. Immediately Hierna meng de celsuspensie en druppelen de gehele 1 ml tot pre-scheidingsfilter en in de kolom.
  7. Was de kolom driemaal met 1 ml (of 500 pl) van het sorteren buffer. Verzamel de niet vastgehouden cellen die in een steriele 50 ml conische buis met een kleine hoeveelheid groeimedium passeren de kolom sorteren. Deze cellen zijn de eerste soort CD56 - fractie en zal zeer worden verrijkt voor bindweefsel fibroblasten. Laat de kolom uitdrogen tussen wasbeurten.
  8. Na wast het verwijderen van de pre-scheiding filter en voeg 2,5 ml MACS buffer om de kolom. Daarna onmiddellijk de kolom uit de magneet en het verzamelen van de eerste soort CD56 + fractie in een afzonderlijke 50 ml conische buis door het indrukken van de plunjer in de top van de kolom.
    OPMERKING: De zuiger zit stevig vast in de top van de kolom en kan heel lastig te bedienen; echter, moet dit worden gedaan, terwijl de kolom is nog steeds full buffer, zodat snelheid gewenst. Vermijd het indrukken van de zuiger te hard en snel.
  9. Voordat plating de levensvatbaarheid van de cellen met behulp bepalen bijvoorbeeld de trypan blauw assay. Bepaal het percentage van levensvatbare cellen van 8 x 1 mm 2 tellen velden (beide kamers van de hemocytometer).
    OPMERKING: De cellen kunnen enkele of dubbele gesorteerd naargelang de vereiste zuiverheid. Indien zorgvuldig gedaan deze cellen tolereren dubbele sorteren procedure zeer goed en de levensvatbaarheid is zeer hoog> 95%. Voor dubbele sorteren, het opzetten van een andere kolom, smeren met 1 ml het sorteren van de buffer en ga verder met stap 4.6.
    1. Als beeldvorming moet worden uitgevoerd, plaat cellen direct op dekglaasjes gelegen in 24 goed schotels 21 en bekleed met uw keuze van de ECM-molecule voor celaanhechting (bv collageen of laminine). Hier gebruikt 0.1-0.5 mg / ml collageen I (Tabel 3).

5. Het sorteren van Humeen-Muscle afgeleid Fibroblasts Onmiddellijk na isolatie.

  1. Om fibroblast voorouders zuiveren onmiddellijk na isolatie, in dienst van het protocol zoals hierboven met de volgende wijzigingen:
    1. Onmiddellijk na isolatie resuspendeer cellen in compleet medium en filter eenmaal hoewel een 100 micrometer cel zeef en dan weer al een 40 pm zeef. Voeg 5 ml PBS en draaien op 657 xg gedurende 6 min.
    2. Resuspendeer de cellen in MACS buffer sorteren en incuberen in anti-humane fibroblast Microkralen gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Gebruik de kolom LS en de Midi-MACS afscheider (tabel 3) en installeer de 40 micrometer pre-scheidingsfilter.
    4. Voer één of twee soorten, afhankelijk van de vereiste zuiverheid, overdracht van de cellen zo snel mogelijk in serum bevattend medium, voert een telling en plaat uit op het gewenste dichtheid

6. Immunocytochemische kleuring (1 dag en 's nachts).

  1. Reparerencellen in de wells door toevoeging van een gelijk volume 8% paraformaldehyde in ijskoude PBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden. Na 10 min aspireren fixatief en was twee keer met PBS.
  2. Om celoppervlak antigenen blok cellen immunostain ten minste 1 uur in 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS en vervolgens sonde de desbetreffende primaire antilichamen (Tabel 4).
    1. Voor intracellulaire antigenen, doorlaatbaar cellen na binding door toevoeging van 0,2% Triton X-100 in PBS met 1% BSA en NaN3 (0,01%) gedurende 10 min, dan blokkeren en geïncubeerd met primaire antilichamen. Voer alle primaire antilichaam incubaties overnacht bij kamertemperatuur (of bij 4 ° C) onder zacht schudden op een schudplatform.
  3. Verwijder ongebonden primaire antilichaam en was cellen drie keer met koude PBS. Incubeer gedurende 1 uur incubatie met soortspecifieke fluorescent gelabelde secundaire antilichamen (tabel 4) bij kamertemperatuur.
  4. Na verwijdering vanongebonden secundaire antilichamen, spoel cellen drie uitwisselingen van PBS en vervolgens tegenkleuring met fluorescente DNA kleurstof Hoechst 33342 (1 ug / ml) gedurende 10 minuten op een schudplatform.
  5. Voor de gelijktijdige weergave van zowel celoppervlak antigenen en intracellulaire antigenen, probe cellen eerst met primaire antilichamen tegen oppervlakteantigenen gevolgd door de geschikte secundaire antilichamen cel. Vervolgens re-fix de cellen in koude PFA, permeabilize, blok en incubeer met primaire antilichamen tegen cytoplasmatische of nucleaire antigenen gevolgd door hun geschikte secundaire antilichamen.
  6. Na het kleuren verwijdert dekglaasjes van de putjes met gebogen pincet en spoel de achterkant van het dekglaasje met gedestilleerd water. Leg het dekglaasje cel naar beneden glijden op een daling van de anti-fade montage medium 22 set op een glazen microscoopglaasje.

7. Oil Red O kleuring in combinatie met Immunofluorescente kleuring van cellen (2 uur)

  1. Onthullenhet vetgehalte van cellen in 24 putjes bedekt door kleuren met Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol) 5,23. Maak eerst een voorraadoplossing van 0,5% (w / v) Oil Red O door het oplossen van 500 mg Oil Red O in 60 ml 99% triethyl-fosfaat en 40 ml gedestilleerd water. Houd deze oplossing bij kamertemperatuur in het donker tot gebruik.
  2. Op de dag van gebruik, maken een 36% (w / v) triethyl- fosfaat werkoplossing gemaakt met 12 ml Oil Red O voorraadoplossing en 8 ml gedestilleerd water. Filter deze oplossing door filtreerpapier nummer 42 om alle gekristalliseerde Oil Red O (die de beeldkwaliteit verslechtert) te verwijderen.
  3. Verwarm zachtjes deze werkoplossing in een waterbad gedurende 1 uur waarna de oplossing wordt gecentrifugeerd bij 1200 xg gedurende 6 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof en filteren weer door filtreerpapier (nummer 42) en transfer naar een verse 20 ml buis.
  4. Na cellen zijn vastgesteld, gepermeabiliseerd en immunostained, verwijder de PBS en voeg 500 ul van Oil Red O / Triethyl-phosfosfaat oplossing aan de putjes gedurende 60 min. Triton-X bij een concentratie hier voor celmembraan permeabilisatie geen invloed cellulaire lipidegehalte 23.
    OPMERKING: Oil Red O wordt geëxciteerd door golflengte tussen 540 en 580 nm en dus de Texas-rood filter kan worden gebruikt Oil Red O emissie detecteren fluorescentiemicroscopie 23. Merk op dat de fluorescentie-emissie van Oil Red O af en toe kan lekken in de verre rode kanaal als cellen zeer sterk gekleurd zijn (dat wil zeggen, zeer hoog vetgehalte).
  5. Na incubatie, verwijderen overtollige olie Rood O en spoel de cellen vijf keer met 500 ul van PBS. Monteer de dekglaasjes als voor immunostaining zoals beschreven in hoofdstuk 6. Detect Oil Red O kleurstof door zowel helderveld / fasecontrastmicroscopie of door epifluorescentiemicroscopie behulp van de Texas Red filter (verschuiven gratis, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. Het verkrijgen Micrografen van fluorescentie microscopie voor Latere Analysis

OPMERKING: Zorg ervoor dat de dia's om kwantitatief te vergelijken zijn gekleurd met dezelfde oplossingen, gefotografeerd in identieke omstandigheden (bijvoorbeeld, belichting, camera en acquisitie instellingen etc.) en veroverde in dezelfde microscopie sessie. Alle post-acquisitie opmaak moet ook identiek zijn en in strikte overeenstemming met de voorgestelde richtlijnen voor digitale beelden 24.

  1. Voor het verwerven (groothoek microscopie), zet de microscoop en fluorescentie lichtbron en vertrekken naar de aanbevolen hoeveelheid tijd om de fluorescentie lichtbron op te warmen en te stabiliseren.
  2. Stel de donkere stroom voor de camera door het blokkeren van het licht pad naar de camera; verwerven van een beeld op maximale resolutie en gebruik deze om later verkregen beelden te corrigeren.
  3. Verlichten immunofluorescent sondes door epifluorescente door vloeibare lichtgeleiders (flexibele buis van fluoroplastic gevuld met fënylmethyl siliconenolie) een geleverdend signalen gevisualiseerd door rood (filter instellen 45 HQ Texas roodverschuiving gratis, groen (filter instellen 44 FITC speciale shift gratis) en blauw (filter instellen 49 DAPI shift gratis) band pass filters op een omgekeerde epi-fluorescentie microscoop (10X, 20X, 40X, plannen apochromatische doelstellingen met 0.25, 0.75, 0.95 numerieke respectievelijk openingen).
  4. Om te voorkomen pixel verzadiging vinden de optimale belichting binnen het lineaire bereik van de detector voor elke fluorescerende marker met behulp van de 'overbelichting' functie van het beeld acquisitie software. Maak een notitie van de gestandaardiseerde belichting voor elke fluorescent label.
  5. Leg afzonderlijke kanalen en opslaan grijstinten of pseudocolored tiff (Tagged Image File Format) beelden bestanden in de hoogste bit diepte (bij voorkeur 16 bit - 65.536 grijswaarden) die door de opname-apparaat (bijvoorbeeld gekoelde CCD (geladen coupled device) gemonteerd op de microscoop) . Stel de beeldresolutie naar 1388 x 1040 of hoger. Zorg ervoor dat u een schaal bar of voorwerp van bekende di omvattenqua afmetingen in de afbeelding.
  6. Waar mogelijk bestanden in 16 bit Tagged Image File Format (TIFF) en niet opslaan in JPEG-formaat om verlies van informatie 25 te voorkomen.
  7. Als die er zijn bezorgdheid over de gelijkmatigheid van de verlichting (software gebundeld met een microscoop kan de automatische correctie voor dit hebt) neem een ​​'flat-field' beeld van dekglaasje zonder cellen, maar gekleurd en gemonteerd op dezelfde manier als experimentele dia's; Dit kan worden gebruikt om te corrigeren voor de verlichting gebreken na verwerving beeldanalyse software.
  8. Voor het verwerven (confocale microscopie), optimaliseren detector winst en laservermogen voor elke beeldvorming experiment (verzadiging te vermijden). In het algemeen de fluorescentie gemeten is evenredig met de laser vermogen. Stel pinhole grootte "1 luchtig beste signaal-ruisverhouding te bereiken (verbeterde resolutie kan 0.5 luchtige voor zeer sterke signalen worden bereikt). Neem optische secties op verschillende niveaus langs de z-as door de mieribody-gelabelde cellen en opslaan van een 16 bit maximale projectie voor elk kanaal voor beeldanalyse.

9. Het uitvoeren van metingen van fluorescent gelabelde nucleaire transcriptiefactoren Met behulp van beeldverwerking en analyse Software (5 min per gezichtsveld).

  1. Toegang individuele tiff beeldbestanden en overlay bijbehorende kanalen door te klikken en één afbeelding te verslepen naar een andere. Elk kanaal zal dan verschijnen als een aparte laag in het deelvenster Lagen.
  2. Selecteer Lichter uit het menu filter om lagen onder gelijktijdig worden gevisualiseerd mogelijk te maken. Als alternatief, pas de dekking van de bovenste lagen tot 50%.
    OPMERKING: TIFF-afbeeldingen kunnen worden opgeslagen met de 'lossless' Lempel-Ziv-Welch (LZW) datacompressie om de bestandsgrootte te verlagen zonder verlies van informatie.
  3. In de analyse venster (Analyse> Select Data Points> Custom) selecteert u Analyse en kies de metingen vereist (bv Integrated dichtheid, bedoel dichthy, circulariteit, histogram etc.). Gooi alle onnodige metingen door het vinkje het vakje naast hen. Als gebied metingen nodig zijn in micrometer klik op Analyse> Set Measurement Scale. De heerser tool zal automatisch verschijnen - traceren van de lengte van de schaal bar en geef haar een bekende lengte in micrometers. De software zal dan omzetten gebied metingen in vierkante micron.
    Opmerking: Als het histogram analyse geselecteerd, bij de meting opgenomen een extra map weergegeven (de locatie kan worden gekozen) met 8 bits histogrammen voor elk selectiegebied in de microfoto als de som van alle individuele selecties (dit verschijnt altijd als Histogram-1 als meerdere selecties zijn gemaakt). Deze analyse kan worden uitgevoerd door de software in 16 bit formaat, maar is zeer nuttig voor het onderzoeken van de verdeling van pixelintensiteiten gedurende een object van belang.
  4. Voor de analyse van de fluorescentie-intensiteit nucleaire eerste bouw van een vertegenwoordiger 'Color Range Selection Mask' (CRSM) voor Hoechst of DAPI lood DNA om nucleaire gebied te definiëren. Zodra het gewenste kanaal beelden op elkaar, moet alleen de Hoechst kanaal laag in het oog worden gelaten door te zorgen voor het 'oogje' grenst aan het in het tabblad lagen is geselecteerd en vervolgens laag is gemarkeerd (wordt blauw), terwijl alle andere lagen moeten zijn gedeselecteerd. Zorg ervoor dat de vermenging dropdown is terug op 'Normaal' in het tabblad lagen.
  5. Open het dialoogvenster Color Range (Select> Color Range) en zet de selectie optie dropdown om "Bemonsterd kleuren '. Met de selectie voorvertoning ingesteld op 'quick mask' (rode achtergrond) selecteer alle blauwe kleurtinten binnen de kernen door de Shift-toets ('+' teken verschijnt) en te klikken binnen de kernen met behulp van de pipet die verschijnt.
    1. Als ongewenste tonen worden geselecteerd, verwijder deze door op de Alt-toets ('─'sign verschijnt) en klikkendaarop. Handhaving van de vaagheid schaal op nul, zodat alleen handmatig geselecteerde kleurtonen zijn opgenomen in de meting en 'Gelokaliseerde kleur clusters' moet aangevinkt worden gelaten.
  6. Bewaar deze CRSM naar de harde schijf van de computer als een programma-specifieke extract file (.AXT bestand). Met een ander willekeurig gebied van de kernen, belasting, bijwerken, en sla de CRSM (Select, Color Range, Load). Doe dit gedurende ten minste vijf willekeurige velden opdat nucleaire selecties representatief.
    1. Gebruik een gekleurde versie van een afbeelding in grijswaarden voor de creatie van een masker om functies te isoleren, omdat het menselijk oog is beter in staat om onderscheid te maken tussen de verschillende tinten van kleur dan tussen de verschillende grijstinten 26.
  7. Gebruik de nucleaire CRSM segmenteren nucleaire regio's voor het kleuren. Zodra kernen zijn geselecteerd Klik op de afbeelding> Adjustment> Drempel en verplaats de schuifregelaar helemaal naar rechts, zodat de kernen zwart. Als alternatief,klik met de rechtermuisknop en kies 'Fill' kies vervolgens 'Vul aan: zwart'. Klik vervolgens op Select> Inverse en nu druk op DELETE om alle achtergrond te verwijderen (als de optie verschijnt kies je 'invullen om: White'). Dit binarizes wezen het beeld op basis van uw keuze. Laadt dan de waterscheiding plugin van het tabblad filters om overlappende kernen (Filter> Binary> Watershed functie scheiding) te scheiden.
    1. Als veel kernen zijn sterk overlappend, verwijder de kernen uit de analyse door de selectie van hen (Houd de Alt-toets ingedrukt en los te trekken om hen heen met de lasso).
  8. Op de nu binaire nucleaire laag, ga dan naar Selecteren> Color Range en> Shadows, individuele kernen te selecteren. Alternatieve hold shift en klik binnen één zwarte kern. Alle kernen zal onmiddellijk worden geselecteerd. Overdragen dan deze selectie om de laag met nucleaire transcriptiefactor kleuring (bijv myogenin) door het selecteren van die laag en deselecteren van alleandere lagen. Lopende lijnen toont nu de positie van de kernen in de myogenin kanaal.
  9. Als het werken met pseudocolored beelden klik alleen op het palet Kanalen (aan de rechterkant van het tabblad lagen) en selecteert u alleen het groene kanaal (het beeld verschijnt nu grijs). Klik dan op Afbeelding> Modus> Grijswaarden. Er verschijnt een waarschuwing 'zichtbare lagen afvlakken en gooi verborgen lagen' klik OK, daarna nog een waarschuwing zal zeggen: 'gooi andere kanalen' klik nogmaals op OK. Slechts een enkele laag van grijstinten geselecteerde kernen zal nu aanwezig in het lagen palet zijn.
    1. Klik Record Metingen in het Measurement Log om gegevens voor de geselecteerde kernen te verkrijgen. Als de laag te analyseren (bijv myogenin vlekken) is al een ruwe 16 bit grijsschaalbeeld dan gewoon op de opnameknop drukt Metingen.
    2. Exporteer geselecteerde metingen als TXT-bestand naar de locatie van uw keuze. Deze kunnen dan verder worden verwerkt en in andere gegevensverwerking software p geanalyseerdackages
      LET OP: Het bewerken> stap achteruit commando (druk al Alt, Ctrl en Z toetsen tegelijkertijd) herstelt alle vorige lagen indien nodig.
    3. Corrigeer aspecifieke achtergrond 27 fluorescentie voor resultaten kwantitatieve en vergelijkbaar metingen van fluorescentie intensiteit altijd een mengsel van signaal en achtergrond.
      1. Selecteer de vierkante selectie-instrument en laat 'vaste grootte' kiest 20 bij 20 pixels (of groter indien gewenst en afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen in het beeld). Houd shift kiezen tien of meer achtergrond gebieden verspreid over het gezichtsveld. Druk op 'Record Metingen' in het Measurement Log.
      2. Bereken de gemiddelde geïntegreerde dichtheid (som van alle grijswaarden) per pixel van alle 10 geselecteerde achtergrond gebieden (gezien als de 'gemiddelde grijswaarde' in het meetprotocol). Vermenigvuldig het gemiddelde achtergronddensiteit per pixel door het aantal pixels in het doelobject (
      3. Trek achtergrond fluorescentie van de voorwerpen oorspronkelijke geïntegreerde dichtheid de uiteindelijke achtergrond gecorrigeerde waarde opleveren. Deze benadering verklaart potentiële veld veldvariatie aspecifieke achtergrondfluorescentie.
        LET OP: Het is van het grootste belang om alleen bonafide achtergrond regio's selecteren als deze correctie heeft een aanzienlijke invloed op de uiteindelijke waarden. Door in te zoomen met behulp van het vergrootglas wordt aanbevolen bij het maken van selecties.
      4. Het kan ook nuttig zijn de algemene achtergrond gecorrigeerde waarde van het gebied van de kern in pixels (zelfde als die gemiddelde grijsniveau / intensiteit per nucleus) om eventuele invloed van nucleair gelokaliseerde achtergrondsignaal die meer bijdraagt ​​tot de integrale densiteit minimaliseren worden gesplitst met een toenemende kerngrootte (figuur 3C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gezuiverde myogene cellen en fibroblasten worden gekweekt in adipogene differentiatie medium gedurende drie dagen, gevolgd door adipogenic voedings- middel van ergens tussen 7-30 dagen op hun vermogen om adipogenese beoordelen. De gezuiverde celpopulaties, Oil Red O kleuring in combinatie met immunokleuring voor adipogene en myogene lineage markers bleek dat alleen de fibroblast fractie staat adipogene differentiatie (figuur 2) was. De massieve ophoping van vet door de fibroblasten is zichtbaar voor het blote oog (paneel A), en de volledige transdifferentiatie blijkt uit de zeer sterke expressie van nucleaire PPAR γ (figuur 2 panelen B & C en figuur 3). Tegen 15 dagen behandeling, zijn deze cellen resterende TE-7 (a bindweefsel antigen) op hun substraat (paneel D) bezit. Daarentegen myogene cellen behouden hun normale fenotype inclusief uitdrukking van desmin en myosine heavyketen (figuur 2 panelen E & F) en nucleaire PPARy- (Figuur 3C) niet upregulate.

Een voorbeeld van een kwantitatieve analyse van een gebied van myogene cellen (desmine +) wordt in figuur 3 weergegeven. Paneel B toont het veld geanalyseerd en paneel A toont de gekwantificeerde fluorescentie-intensiteit (na achtergrondcorrectie). Deze methode toont duidelijk het verloop van myogenin expressie in afzonderlijke kernen in deze specifieke zaaidichtheid en tijdstip. Figuur 3C toont het nut van de methode transcriptiefactor niveaus in verschillende celtypes direct te vergelijken op een cel per celniveau. Hier laten we zien dat CD56 - spier fibroblasten drukken een hoog niveau van de adipogene transcriptiefactor PPARy dat gesorteerd CD56 + myogene cellen behouden slechts zeer lage niveaus na blootstelling aan adipocyten inducerend medium.


Figuur 1:. Gezuiverd populaties van myogene cellen en fibroblasten verkregen door immunomagnetische kraal sorteren (AB) Na een week in de cultuur naargelang myogene cellen brengen het celoppervlak celadhesiemolecuul CD56 (N-CAM) en de spier specifieke intermediaire filament desmine. Nucleaire ki-67 expressie levert het bewijs dat deze cellen worden prolifererende. De kleuring van het membraan, cytoplasmische en nucleaire bestanddelen wordt beschreven in protocol stap 6.5. (CD) myogene cellen niet drukken de fibroblast marker TE-7. (E) fibroblasten uit menselijk spier tot expressie TE-7 en (F) het transmembraan bloedplaatjes -afgeleide groeifactor receptor α (PDGFRα). Schaal bars zijn: (A) = 20 micrometer; (B, C & E) = 200 micrometer; (D & F) 50 &# 181; m. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Human-spier afgeleid CD56 - / TE-7 + fibroblasten en CD56 + / desmin + myogene cellen gekweekt in adipocyten inducerend medium (AIM). (A) fibroblasten geïsoleerd door MACS differentiëren tot adipocyten indien gekweekt in adipocyten inducerend medium (AIM) en dit kan gemakkelijk worden gezien met het blote oog na Oil Red O kleuring. Myogene cellen vertonen geen tekenen van adipogenic differentiatie na dezelfde periode in AIM en tonen zeer beperkte Oil Red O kleuring. (B & C) Human spier afgeleide fibroblasten zeer express PPARy en CEBPα (niet getoond) na het kweken in AIM. (C) Aangezien de fibroblasten differentiëren tot adipocyten Zij geven resterende intracellulaire ECM eiwit dat een dicht netwerk vormen heen. (E) myogene cellen behouden hun myogene morfologie en expressie van afstammings merkers zoals desmine en (F) myosine zware keten (MHC), een marker van terminal myogene differentiatie en niet lipide accumuleren. Schaal bars zijn: (B, D) = 200 micrometer (E, F) = 100 micrometer; (C) = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Voorbeeld van gegevens verkregen fr OM immunolabelled culturen met behulp van de afbeelding beschreven analysemethode (Adobe Photoshop Extended-benadering). (A) Een cel per cel fluorescentie-intensiteit diagram voor het spierspecifieke nucleaire transcriptiefactor myogenin na 24 uur in serumvrij differentiatiemedium. (B) Representatieve microfoto van desmine + / + myogenin menselijke myogene precursoren. Schaalbalken zijn: (B) = 50 pm (C) PPARy fluorescentie-intensiteit in individuele kernen uit gesorteerd CD56 + / Desmine + myogene populaties (CD56 +) en CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Collageen VI + cellen (CD56. -) na cultuur in Adipocyte inducerend medium voor 15 dagen. De fluorescentie waarden werden genormaliseerd nucleaire gebied van variaties in nucleaire grootte tussen de twee celtypen. Horizontale zwarte balken in (A) en (B) tonen het gemiddelde.52049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Mediumcomponenten Concentratie Catalogus no. Commerciële bron
Menselijk skelet spiergroei medium: C-23060 (Comes 'klaar voor gebruik' met alle genoemde factoren)
Skeletspieren basaal medium - PromoCell
Foetaal Calf Serum 15% PromoCell (5%) en FCS Gold, PAA Laboratories (10%) - Kat niet. A15-151
Fetuïne (runderen) 50 ug / ml PromoCell
Epidermale Groeifactor 10 ng / ml PromoCell
Basische fibroblastgroeifactor (Recombinant humaan) 1 ng / ml PromoCell
Dexamethason 0,4 ug / ml PromoCell
Insuline (recombinant humaan) 10 ug / ml PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycine 100 ug / ml Sigma
L-Glutamine 292 ug / ml Sigma
Myogene differentiatie medium C-23260
Skeletspieren basaal medium - PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycine 100 ug / ml </ Td> Sigma
Opmerking: PromoCell, Heidelberg, Duitsland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK

Tabel 1: Celkweek media componenten en concentraties.

Medium samenstelling Concentratie Catalogus no. Vennootschap
Preadipocyt groeimedium C-27410 (klaar voor gebruik)
Foetaal Calf Serum 0,05 ml / ml PromoCell
Endotheelcelgroei supplement 0,004 ml / ml PromoCell
Epidermale groeifactor (recombinant humaan) 10 ng / ml PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycine 100 ug / ml Sigma
Glutamine 292 ug / ml Sigma
D-Biotine 8.0 ug / ml PromoCell
Insuline (recombinant humaan) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexamethason 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 ug / ml PromoCell
L-Thyroxine 9 ng / ml PromoCell
Ciglitazon 3 ug / ml PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 ug / ml Sigma
Glutamine 292 ug / ml Sigma
Preadipocyt differentiatiemedium C-27436 (klaar voor gebruik)
D-Biotine 8.0 ug / ml PromoCell
Insuline (recombinant humaan) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexamethason 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 ug / ml PromoCell
L-Thyroxine 9 ng / ml PromoCell
Ciglitazon 3 ug / ml PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 ug / ml Sigma
Glutamine 292 ug / ml Sigma
Adipocyt voeding medium C-27438 (klaar voor gebruik)
D-Biotine 8.0 ug / ml PromoCell
Insuline (recombinant humaan) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexamethason 400 ng / ml PromoCell
Penicilline 100 U / ml Sigma
Streptomycine 100 ug / ml Sigma
Glutamine 292 ug / ml Sigma
Opmerking: PromoCell, Heidelberg, Duitsland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK

Tabel 2: Samenstelling van adipogenic celcultuur media.

Naam van de apparatuur / reagens Vennootschap Catalogus no. Opmerkingen / omschrijving
Celcultuur Collagenase D Roche 11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Moet worden gefiltersteriliseerd vóór gebruik
Trypsine / EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micrometer celzeef BD Biosciences 352.360
Collageen oplossing (3 mg / ml in 0,1% azijnzuur) Sigma, Dorset, UK C8919
Minisart SRP15 spuit filter (0,2 micrometer) Sartorius 17573ACK Polytetrafluoretheen (PTFE) membraan
CD56 menselijk Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Magnetische-geactiveerde Cell Sorting (MACS)
Wees je bewust van de beperkte houdbaarheid van microbolletjes
Anti-fibroblast Microbeads, menselijk Miltenyi Biotech 130-050-601
40 micrometer Pre-scheiding filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Grote Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 Deze kolommen zijn voorzien van een stroom weerstand. Gebruik van de stromingsweerstand is niet noodzakelijk om de hoge myogene zuiverheid hier beschreven te verkrijgen.
LS kolommen Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMACS Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 Deze afscheider past de grote kolom cel, maar niet de kolom LS.
MidiMACS Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Moet worden gefiltersteriliseerd vóór gebruik
Oil Red O Sigma O0625 Lipid vlekken
Triethylfosfaat Sigma 538.728
Whatman Papier Sigma Z241121-1PAK No. 42, Asloze. Ter voorbereiding op het filter vouw de circulaire filter papier om een ​​halve cirkel te maken, dan vouw de halve cirkel in de helft opnieuw om een ​​kegel vorm te vormen. Plaats de kegel in een trechter voor het filteren.
Montage
Verlengen Gold Antifade Reagens Molecular Probes, Invitrogen P36930 Dit kan worden gekocht met of zonder DAPI en geen initiële fluorescentie blussen.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss Afbeelding acquisitie software
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (gekocht bij Pugh Computer) ADPH16982 * Beeldanalysesoftware

Tabel 3: Uitrusting en reagentia.

Naam / antigen Antilichaam soorten en isotype Kloon naam Verdunning voor gebruik Catalogus no.
Myogene markers:
CD56 (N-CAM) Muis mc IgG 1 MY-31 (1: 100) 347.740 BD
Desmine Konijn mc IgG 1 D93F5 (XP) (1: 250) 5332S NEB
Myogenin Muis mc IgG 1 F5D (01:50) F5D DSHB
Myosine zware keten Muis mc IgG2b, kappa lichte keten MF20 (1: 200) MF20 DSHB
Fibroblast / bindweefsel
tissue markers:
Anti-menselijke fibroblast Muis mc IgG 1 TE-7 (1: 100) CBL271 Millipore
PDGFRα Konijn mc IgG D13C6 (1: 500) 5241 NEB
Proliferatieve markers:
Ki67 Konijn mc IgG SP6 (1: 200) MP-325-CRM1 MD
Adipogenic
transcriptiefactoren:
PPARy- Muis mc IgG 1 E8 (01:20) Sc-7273 Santa Cruz Biotechnology
Toets: mc: monoklonale,pc: polyklonale, DSHB: Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa USA;
NEB: New England BioLabs, UK; MD: A. Menarini Diagnostics, UK; BD: BD Bioscience, UK.

Tabel 4: primaire antilichamen.

</ Tr>
Antigeen Antilichaam soorten en isotype Verdunning Catalogus no. Vennootschap
Alexafluor488 Geit anti-muis IgG (H + L) 1: 1000 A-11001 MP
AlexaFluor 594 Geit anti-muis IgG (H + L) 1: 1000 A-11005 MP
AlexaFluor 594 Geit anti-konijn IgG (H + L) 1: 1000 A-11012 MP
Toets: H + L = zware en lichte ketens; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley UK

Tabel 5: Secundaire antilichamen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben een immunomagentic sorteren procedure beschreven voor de selectieve verrijking van de menselijke spier-afgeleide voorlopers van kleine monsters van spierbiopsie materiaal. Deze techniek onschatbare waarde in ons laboratorium voor het overwinnen van het verlies van menselijk spier afgeleide culturen fibroblasten, maar ook voor het begrijpen van de unieke gedrag van verschillende populaties van spier afgeleide voorlopercellen. Eenmaal gezuiverd myogene cellen kunnen worden onderzocht op veranderingen in eiwit en / of genexpressie, of voor downstream experimenten.

Naast cel zuivering ook detail een snelle en eenvoudige werkwijze voor het analyseren specifieke gebieden van belang microfoto van fluorescentiemicroscopie. Digitale beelden van fluorescentie microscopie bevatten een schat aan informatie voor de celbioloog te halen; inderdaad pixels over gegevens die niet noodzakelijkerwijs waarneembaar voor het menselijk oog. Met deze techniek kwantitatieve gegevens worden verkregen over een groot aantal van afzonderlijke cellen in een populatie. Een uniek kenmerk van beeldanalyse vergelijking met flow cytometrie is het vermogen om veranderingen in eiwitexpressie correleren met veranderingen in celvorm orcell-cel interacties. Verder is de capaciteit om snelle, nauwkeurige en reproduceerbare metingen maken en opslaan geoptimaliseerd en representatieve selectie maskers maakt worden gemaakt in vele gezichtsvelden waardoor de mogelijkheid voor de gebruiker vertekening verminderen.

-MACS gebaseerde cel zuivering

Een voordeel van deze methode is dat cellen met succes hetzij onmiddellijk na isolatie of na enkele dagen in kweek (wanneer de opbrengst hoger zal zijn) kan worden gezuiverd.

Essentieel belang dat myogene cellen niet mogen samenvloeiende worden vóór sorteren omdat dit belemmert hun passage door de kolom, en het aandeel van proliferatieve cellen verkregen voor verdere uitbreiding en proeven te verminderen.

t "> Afhankelijk van de eerste weefselmonster verkregen, kan er een groot aantal niet-hechtende erytrocyten in de cultuur in deze fase. Werkwijzen bestaan ​​selectief lyse erytrocyten echter onnodige chemische belasting van de spier afgeleide cellen dit te vermijden stap wordt vermeden. We hebben nog geen noemenswaardige negatieve impact van erytrocyten waargenomen op de vroege cultuur van de menselijke spier-afgeleide cellen, en deze erytrocyten worden verwijderd door de media verandert zodra myogene cellen hechten.

Andere werkwijzen van cel- onthechting juist voor het sorteren (bijv andere zachte proteasen of EDTA gebaseerde werkwijzen) worden gebruikt voor cellen waarin de expressie van het celoppervlak antigeen laag of bijzonder gevoelig tryptische digestie. De expressie van CD56 op menselijke myogene cellen is sterk en bestand tegen een korte trypsinsation (wanneer getest met de hier beschreven antilichamen).

Het is belangrijk dat de sortering buffer bevat EDTA calc remmenium-afhankelijke cel-cel adhesie; Dit is cruciaal voor het verkrijgen (en onderhouden) van een eencellige suspensie voor het sorteren. Afhankelijk van het aantal cellen, vorm en grootte worden gesorteerd, een keuze vereist van de scheidingskolom (zie tabel 3).

Het verwijderen van de kolom uit het magneetveld vastgehouden cellen vrij lastig zijn zodat voorkomen dat de verzamelbuis (zelfs indien begrenste) is geplaatst in een houder zeer dicht bij de kolom celverlies tijdens het transport.

Hoewel deze techniek is beschreven voor gebruik met humane primaire cellen van skeletspieren, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor andere celtypes waarvan uitdrukkelijk / unieke celoppervlak marker bekend. Andere voordelen omvatten het feit dat de gehele procedure van het steriele werkomgeving van een laminaire stroming kast kan worden uitgevoerd. Ook de MACS procedure is zachter op de cellen in vergelijking met FACS sortering vanwege de lageafschuifkrachten en een bijzonder voordeel voor grotere cellen. De magnetische korrels gebruikte kleine, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar in kweek. Inderdaad MACS is met succes toegepast voor de zuivering en studie van een aantal andere celtypen.

Een beperking van deze techniek is dat MACS kan niet gemakkelijk worden voor meerdere markers simultaan uitgevoerd. Ook kan de hoeveelheid marker en grootte van de cellen niet worden vastgesteld tijdens het sorteerproces, pas daarna.

Overwegingen voor het optimaliseren van het verwerven en analyseren

De beeldanalyse werkwijze hier toonde een krachtig hulpmiddel om veranderingen in de expressie van eiwitten op basis van grote populaties van cellen cel per cel helderen. Door het benutten van de lagen faciliteit en selectie maskers in een breed beschikbare software-pakket, kan de onderzoeker objectief selecteren verschillende fluorescente signalen over meerdere afbeeldingen toe te staankwantificering van verschillende bestanddelen en elk aantal componenten binnen hen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode te kwantificeren en te vergelijken zijn het bereik van transcriptiefactor uitdrukking in verschillende celpopulaties blootgesteld aan een adipogenic uitdaging.

Elk kanaal fluorescentie (die een specifieke merker) is gescheiden van de anderen worden bewaard en aan- of uitzetten, dat nuttig is voor multi-color immunolabel experimenten.

Een aantal factoren in aanmerking moeten worden genomen bij een poging om kwantitatieve en semi-kwantitatieve gegevens te extraheren uit fluorescentie microscopie 28. Aandacht voor zullen fundamentele semi-kwantitatieve metingen kunnen worden getroffen. Vaak willen onderzoekers een aantal fluorochromen gebruiken om verschillende eiwitten van belang te labelen; van primair belang is het vermogen om onderscheid te kunnen maken tussen individuele emissiespectra. Meestal wordt dit bereikt door selectieve excitation van één fluorochroom tegelijk. Indien emissie en / of excitatiespectra aanzienlijk overlappen of onvoldoende vervolgens gefiltreerd doorbloeding of overspraak kan de nauwkeurigheid van de beeldgegevens verkregen compromis. Bloeden door de passage van fluorescentie-emissie in een onterechte detectie kanaal en wordt veroorzaakt door een overlap van emissiespectra 29,30.

Enkele punten ter overweging zijn: het kiezen fluorchromen die goed gescheiden excitatie en emissie spectra hebben, met behulp van zeer selectieve excitatie golflengten (zoals wordt bereikt door lasers in confocale microscopie), ervoor te zorgen dat de emissie-filter sets zijn streng genoeg om ongewenste golflengten uit te sluiten, en het uitvoeren van multicolor beeldvorming op de langste (dat wil zeggen, de 'roodste') golflengtepiek emissie kleurstof eerste om rekening te houden met het feit dat absorptiespectra algemeen scheef naar kortere golflengten (blauw licht), terwijl de emissie spectra worden scheef naar langere wavelengths (rood licht). De spectra van fluorescente labels zijn beschikbaar in "Fluorescence Spectraviewer 'door Invitrogen.

Het gebruik van de doelstellingen van hoge kwaliteit is cruciaal voor afbeeldingen die bedoeld zijn voor analyse. Een hoge numerieke apertuur (> 1,3) is geschikt en vergrotingen moeten worden aangepast aan de camera groothoek microscopie. Zowel Widefield en confocale microscopie, de NA kritisch, als z resolutie verbetert als functie van de numerieke apertuur kwadraat 29. Waar mogelijk gebruik te maken van het plan-apochromatische lenzen die zijn gecorrigeerd voor zowel sferische en chromatische aberraties 29. Gebruik van vloeibare lichtgeleiders wordt ten zeerste aanbevolen als ze verminderen ongelijkmatige verlichting door versluiering de bron verlichting om ruimtelijke en temporele samenhang te verminderen voorafgaand aan de inwerkingtreding van de microscoop doelstelling 29.

Het is belangrijk om verzadiging van beelden te voorkomen, zoals verzadigde pixels niet goed worden kwantificeringed te wijten aan het knippen van informatie op de meest intense grijsniveauwaardes 26.

Verschillende 'plugins' Mogelijk om een ​​flatscreen-veld correctie procedures in staat te stellen uitgevoerd met relatief gemak zijn; bijvoorbeeld Dr. John C. Russ veel van deze gratis online beschikbaar (http://www.drjohnruss.com/download.html) heeft gemaakt. Met deze plugin de verhouding van de helderheid van elke pixel in de experimentele microfoto de overeenkomstige in het referentiebeeld wordt berekend en vervangt het origineel. De resultaten worden geschaald om de helderheid tussen de afbeelding vullen. Als alternatief kan de calculator van ImageJ is een ander middel van corrigeren voor ongelijke verlichting.

Voor sommige beeldanalyse kan confocale microscopie de methode zijn als het voorkomt out-of-focus fluorescentie bereiken de detector 29. Echter, deze benadering aanzienlijk langer dan groothoek fluorescentiemicroscopie nemen beperken verdoofder afzonderlijke gezichtsvelden die kunnen worden verkregen in een enkele sessie.

Recent andere werkwijzen beschreven voor de verrijking van myogene cellen uit menselijk spierweefsel. Bareja 31 gebruikt een combinatie van MACS depletie (voor: CD11b, CD31, CD34 en CD45), gevolgd door FACS voor positieve selectie van CXCR4 + / CD56 + myogene cellen. Hoewel deze procedure kon een sterk verrijkte populatie myogene genereren, is aanzienlijk langere dan de hier beschreven werkwijze, bevat veel meer opeenvolgende stappen en resulteert in een lagere opbrengst van gezuiverde myogene cellen minder per gram weefsel.

In een andere recente studie, Castiglioni 32 geïsoleerde-myofibre geassocieerd cellen uit menselijke foetale spieren door FACS met behulp van meerdere markers en toonde aan dat CD34 - / CD56 + / Pax7 + cellen (archetypische satelliet-cellen) en osteogene kunnen vertonen als myogenic lineage potential, maar in het algemeen akkoord met ons werk niet adipogenic potentieel tonen. Deze auteurs toonden ook aan dat CD34 + / PAX7 - cellen waren niet-myogene, maar in staat waren adipogenic en osteogene differentiatie. Verrijking van CD90 expressie (een marker van spier fibroblasten 33) in de CD34 + niet-myogene fractie suggereert dat een groot deel van deze cellen zijn fibroblasten, waarvan is aangetoond dat de belangrijkste bron van adipocyten in menselijke skeletspier volwassene kan hebben kweken (referentie 5 en Figuur 2). Of spier-afgeleide fibroblasten hebben ook osteogene differentiatie potentieel rechtvaardigt verder onderzoek.

In tegenstelling tot de werkwijze Castiglioni 32, onze werkwijze vereist slechts één antilichaam (tegenover 7) hoge opbrengsten aan zuiver myogene celculturen reproduceerbaar verkrijgen en kan binnen de aseptische omstandigheden van een laminaire stroming kap snel worden uitgevoerd. Een verdere methodological verschil is dat geïsoleerd deze auteurs cellen rechtstreeks van gedissocieerde spier en dan volgde deze in cultuur, terwijl we het vaakst cultuur cellen voor 1 week voor het sorteren en het cultiveren. In onze handen deze benadering beter verdragen door de cellen. Belangrijk totale tijd in kweek wezen gelijk tussen de twee benaderingen. Bovendien, gezien het feit dat de foetus skeletspieren ondergaat hyperplasic en hypertrofische spiergroei 34 is het niet verwonderlijk dat de opbrengst van myogene voorlopers groter uit foetaal spierweefsel in vergelijking met volwassen spier

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
  2. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
  3. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
  4. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
  5. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
  7. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
  8. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
  9. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  10. Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
  11. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
  12. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
  13. Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
  16. Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
  17. Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
  18. Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
  19. Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
  20. Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
  21. Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
  22. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
  23. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
  24. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
  27. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  28. Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
  29. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  30. Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
  31. Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
  32. Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
  33. Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
  34. Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).

Tags

Developmental Biology stamcelbiologie Tissue Engineering Stem Cells Satelliet-Cells skeletspier Adipocyten Myogene Cells myoblasts fibroblasten Magnetic Activated Cell Sorting Image Analysis
Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Agley, C. C., Rowlerson, A. M.,More

Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter