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Developmental Biology

मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राथमिक myogenic कोशिकाओं और fibroblasts के अलगाव और मात्रात्मक Immunocytochemical विशेषता

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52049

Abstract

मरम्मत और कंकाल की मांसपेशी के उत्थान निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाएं हैं जो उपग्रह कोशिकाओं की कार्रवाई की आवश्यकता है। ये संस्कृति में अध्ययन मानव पेशी बायोप्सी enzymatic पाचन का उपयोग कर नमूने और उनके myogenic गुणों से अलग किया जा सकता है। मात्रात्मक, enzymatic पाचन से प्राप्त दो मुख्य पक्षपाती सेल प्रकार के होते हैं: (i) के उपग्रह CD56 + के रूप में शुरू की पहचान की कोशिकाओं (करार दिया myogenic कोशिकाओं या मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं), और बाद में CD56 / + desmin + कोशिकाओं और (ii) muscle- और ते-7 + - CD56 के रूप में पहचान ली गई fibroblasts,। Fibroblasts संस्कृति में बहुत कुशलता से पैदा करना और मिश्रित सेल आबादी में इन कोशिकाओं संस्कृति हावी करने के लिए myogenic कोशिकाओं उग सकता है। मानव पेशी से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि इस प्रकार संस्कृति में या तो सेल प्रकार की सहज व्यवहार की जांच के लिए कोशिश कर रहा है जब एक महत्वपूर्ण पद्धति विचार है। यहाँ हम descrदोनों एक उच्च शुद्धता (> 95% myogenic कोशिकाओं) और अच्छी उपज (~ देता है जो कोलैजिनेज का उपयोग कोशिकाओं की कोमल enzymatic पाचन के आधार पर छंटाई और चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) द्वारा पीछा dispase की एक प्रणाली IBE 2.8 एक्स 10 6 ± 8.87 संस्कृति में प्रयोगों के लिए इन विट्रो में 7 दिन) के बाद x 10 5 कोशिकाओं / जी ऊतक। यह दृष्टिकोण CD56 के खिलाफ एक एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय microbeads के मोतियों के साथ मिश्रित पेशी व्युत्पन्न सेल की आबादी incubating और फिर एक चुंबकीय क्षेत्र में हालांकि कोशिकाओं गुजर पर आधारित है। Microbeads के लिए बाध्य CD56 + कोशिकाओं CD56 जबकि क्षेत्र द्वारा बनाए रखा जाता है - कोशिकाओं कॉलम के माध्यम से बेरोक गुजरती हैं। छँटाई प्रक्रिया के किसी भी स्तर से सेल निलंबन चढ़ाया और सुसंस्कृत किया जा सकता है। एक दिया हस्तक्षेप, सेल आकृति विज्ञान, और अभिव्यक्ति और परमाणु प्रतिलेखन कारक सहित प्रोटीन का स्थानीयकरण निम्नलिखित विशिष्ट एंटीबॉडी और एक छवि पी के साथ Immunofluorescent लेबलिंग का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैrocessing और विश्लेषण पैकेज।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी की मरम्मत और उत्थान उपग्रह कोशिकाओं 1, myogenic स्टेम कोशिकाओं 2,3। की कार्रवाई की आवश्यकता है विवो इन कोशिकाओं को हर myofibre की sarcolemma और बेसल लामिना के बीच स्थित एक reversibly मौन राज्य में मौजूद हैं, लेकिन पैदा करने के लिए सक्रिय हो, फ्यूज और मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में अंतर है, क्षतिग्रस्त मरम्मत और 3 पुनर्जीवित कर रहा है। उपग्रह कोशिकाओं enzymatic पाचन 4 का उपयोग युवा और बुजुर्ग मानव पेशी बायोप्सी नमूने और उनके myogenic गुणों से अलग किया जा सकता है बाद में प्राथमिक संस्कृति 5 में अध्ययन किया जा सकता है। सेल की आबादी के दोनों उपज और पवित्रता के संबंध में इस अलगाव की प्रक्रिया की दक्षता में इस्तेमाल किया तरीकों पर निर्भर करता है और नमूने के लिए नमूना से भिन्न हो सकते हैं। enzymatic पाचन से प्राप्त दो मुख्य पक्षपाती सेल प्रकार CD56 / + desmin कोशिकाओं, और म्यू के रूप में शुरू में पहचान उपग्रह कोशिकाओं (अब करार दिया myogenic कोशिकाओं या मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं), कर रहे हैंscle व्युत्पन्न CD56 के रूप में पहचान fibroblasts, - और TE7 + कोशिकाओं 5। Fibroblasts एक तेजी से proliferative दर है और myogenic कोशिकाओं की तरह सेल सेल संपर्क पर अपरिवर्तनीय विकास गिरफ्तारी और टर्मिनल भेदभाव से गुजरना नहीं है; इस प्रकार मिश्रित आबादी में, fibroblasts के संस्कृति हावी करने के लिए myogenic कोशिकाओं उग सकता है।

Fibroblasts अक्सर हालांकि, अपने आप में अध्ययन के योग्य कोशिकाओं के रूप में fibroblasts में एक बढ़ती रुचि वे मांसपेशियों की मरम्मत 6 दौरान myogenic कोशिकाओं के साथ एक सहयोगी भूमिका है दिखाया गया है, खासकर के रूप में अब वहाँ है, मांसपेशियों में जीव के लिए एक जलन के रूप में देखा गया है । मानव पेशी से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव और शुद्धि इस प्रकार संस्कृति में दोनों प्रकार की कोशिकाओं का सहज व्यवहार की जांच के लिए कोशिश कर रहा है जब एक महत्वपूर्ण पद्धति विचार है। प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) कोशिकाओं को आगे के अध्ययन के लिए हल किया जा सकता है जिसके द्वारा एक विधि है और / या गिना औरविश्लेषण किया। FACS मज़बूती से मानव myogenic कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन बाद में संस्कृति के लिए कोशिकाओं की उपज इस प्रकार अब तक सात उच्च नहीं किया गया है। ऐसे वार्धक्य 4 के साथ जुड़े उपग्रह सेल व्युत्पन्न myogenic कोशिकाओं और बहुत ही गरीब प्रसार और भेदभाव के रूप में दैहिक कोशिकाओं के सीमित प्रतिकृति संभावित को देखते हुए अधिक कोमल दृष्टिकोण की आवश्यकता है। एक मांसपेशी फाइबर संस्कृतियों दूसरे, कम आक्रामक, उनके sublaminal आला में और संस्कृति 8,9 में उनकी सक्रियता के बाद अभी भी निवासी murine उपग्रह कोशिकाओं प्राप्त करने के साधन प्रदान करते हैं। बहरहाल, यह इस तकनीक मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न कोशिकाओं का अध्ययन करने में रुचि कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है जिसका अर्थ है कि (फाइबर शायद ही कभी कण्डरा को कण्डरा से प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि) मानव पेशी बायोप्सी सामग्री से अक्सर संभव नहीं है। इसके अलावा, एक फाइबर तकनीक केवल बहुत सीमित सेल नंबर प्रदान करता है।

यहाँ हम जनरल पर आधारित छँटाई की एक प्रणाली का वर्णनTLE एंजाइमी कोलैजिनेज का उपयोग कोशिकाओं की पाचन और चुंबकीय सक्रिय सेल के लगातार दो राउंड छँटाई एक उच्च शुद्धता (> 95% myogenic कोशिकाओं) और उपज (~ दोनों देता है, जो (एमएसीएस) द्वारा पीछा dispase 2.8 एक्स 10 6 ± 8.87 x 10 5 कोशिकाओं / संस्कृति में प्रयोगों के लिए जी ऊतक)। CD56 सीटू 10 में और इन विट्रो 11 में मानव उपग्रह कोशिकाओं की पहचान के लिए स्वर्ण मानक सतह मार्कर माना जाता है और मनका कुर्की के लिए आदर्श सतह मार्कर उम्मीदवार प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण में CD56 एंटीबॉडी लोहे के आक्साइड और पोलीसेकेराइड युक्त superparamagnetic मोती एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र 12,13 में रखा एक उच्च ढाल चुंबकीय सेल जुदाई कॉलम के माध्यम से कोशिकाओं के लिए बाध्य और पारित कर रहे हैं संयुग्मित। जुदाई स्तंभों मजबूत चुंबकीय क्षेत्र ढ़ाल (~ 4tesla) पैदा उनकी सतह की ओर चुंबकीय क्षेत्र लाइनों ध्यान केंद्रित करने की सेवा है, जो लौह-चुंबकीय इस्पात ऊन या लोहे के क्षेत्रों के एक मैट्रिक्स से भर रहे हैं 14। इन स्तंभों में भी थोड़ा चुंबकीय कोशिकाओं आकर्षित कर रहे हैं और उनकी सतह से 14 adsorbed। अनबाउंड (CD56 -) चुंबकीय microbeads के साथ लेबल CD56 + कोशिकाओं चुंबकीय क्षेत्र 12,15 से हटाने तक संभाल कर रखा जाता है, जबकि कोशिकाओं कॉलम के माध्यम से गुजरती हैं।

छँटाई प्रक्रिया के किसी भी स्तर से सेल निलंबन आगे प्रयोग के लिए वांछित घनत्व पर चढ़ाया जा सकता है। सेलुलर घटक immunocytochemistry का उपयोग कर पहचाना जा सकता है एक दिया हस्तक्षेप के बाद व्यापक क्षेत्र या confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged और किसी भी छवि में सभी लेबल की कोशिकाओं का तेजी से उद्देश्य माप की अनुमति देता है कि एक छवि विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण किया। Myogenic सेल, जबकि मानव fibroblasts आसानी adipocytes में transdifferentiate - हमारी प्रयोगशाला में हम उस CD56 प्रदर्शित करने के लिए छवि विश्लेषण 16 द्वारा पीछा इस दोहरे immunomagnetic छँटाई दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया हैउपग्रह मूल के इस adipogenic रूपांतरण करने के लिए 5 अत्यधिक प्रतिरोधी रहे हैं।

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Protocol

नोट: हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन के अध्ययन के लिए सभी विषयों भाग लेने के लिए उनके लिखित, सूचित सहमति दे दी है और सभी प्रयोगों ब्रिटेन की राष्ट्रीय स्वास्थ्य सेवा आचार समिति के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया (लंदन रिसर्च आचार समिति; संदर्भ: 10 / H0718 / 10) और के अनुसार मानव ऊतक अधिनियम और हेलसिंकी की घोषणा।

1. प्रारंभिक तैयारी स्नायु बायोप्सी करने से पहले (15 मिनट)

  1. मानव कंकाल की मांसपेशियों की वृद्धि मध्यम बनाओ। एक स्नातक की उपाधि प्राप्त बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तो कंकाल की मांसपेशी बेसल के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब को भरने के पूरक मिश्रण के 2.5 मिलीलीटर, 10 मिलीलीटर सही अंतिम सांद्रता के लिए भ्रूण बछड़ा सीरम, एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) और glutamine (तालिका 1) जोड़ने मध्यम।
  2. एक बाँझ 20 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कंकाल की मांसपेशी बेसल माध्यम के 15 मिलीलीटर रखो और यह वजन। एक बार जगह बर्फ पर इस ट्यूब तौला। मानव मांसपेशियों नमूना प्राप्त करने के लिए इसका प्रयोग करें।
  3. एक और 20 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मीटर को तैयार2 मिलीग्राम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक Collagenase डी और Dispase द्वितीय एंजाइम समाधान के एल / मिलीलीटर कंकाल की मांसपेशी बेसल मध्यम में इन एंजाइमों का जायजा aliquots के भंग करके प्रत्येक। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इसे पारित करके इस समाधान फिल्टर बाँझ। 15 मिनट के लिए गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या नहाने के पानी में इस बाँझ एंजाइम मिश्रण रखें।
    नोट: एंजाइमों के इस मिश्रण में थोड़ा ट्रिप्सिन से gentler और बेहतर है सेल व्यवहार्यता 17 रखता है।
  4. एक पेट्री डिश और बाँझ नलियां की एक जोड़ी अलग निर्धारित करें।

2. स्नायु बायोप्सी प्रक्रिया (45 मिनट-1 घंटा)

  1. प्रतिभागियों को भर्ती करने से पहले, (उदाहरण के लिए, नैतिक, संस्थागत, सरकारी आदि) सभी प्रासंगिक शासी निकायों, समितियों और स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं से पूर्ण नैतिक निकासी और (प्रयोगकर्ताओं के लिए प्रासंगिक टीकाकरण सहित) प्रक्रियात्मक अनुमोदन प्राप्त करते हैं।
  2. (बाँझ शल्य शीट के साथ, उदाहरण के लिए) पैर के चारों ओर एक बाँझ क्षेत्र बनाने के एकएक एंटीसेप्टिक जीवाणुरोधी एजेंट (chlorhexidine) के साथ अच्छी तरह से बायोप्सी स्थल के आसपास के क्षेत्र को साफ चाहते हैं।
  3. Vastus की प्रावरणी overlying चमड़े के नीचे क्षेत्र में 2% lidocaine के स्थानीय इंजेक्शन द्वारा स्वयंसेवक के पैर पर प्रस्तावित बायोप्सी साइट चतनाशून्य पेशी lateralis।
  4. त्वचा और प्रावरणी के माध्यम से एक बाँझ सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर एक ~ 5 मिमी चौड़ा चीरा और अतिरिक्त चूषण के साथ Bergstrom सुई बायोप्सी प्रक्रिया 18 प्रदर्शन करते हैं।
  5. बाँझ संदंश का प्रयोग सुई लुमेन से मांसपेशियों को हटाने और बर्फ पर बेसल मध्यम में विसर्जित कर दिया। व्यवहार्य myogenic कोशिकाओं की अवधि 24 घंटे या उससे अधिक के बाद प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि जितनी जल्दी हो सके आगे की प्रक्रिया के लिए प्रयोगशाला में ऊतक परिवहन।
  6. , इस विषय debrief शुद्ध और एक बाहरी निविड़ अंधकार कवर करने के साथ कई बाँझ चिपकने वाला त्वचा बंद स्ट्रिप्स और aseptically पोशाक के साथ चीरा साइट सील।

3. स्नायु व्युत्पन्न अग्रदूत साबित प्रमाणित अलगLLS (1 घंटा, 30 मिनट)

  1. पेशी नमूना युक्त ट्यूब निकालें और यह (यकीन ट्यूब ऊतक के साथ पोंछते द्वारा सूखा है बनाने के लिए) वजन। अकेले मध्यम युक्त ट्यूब से मध्यम और नमूना युक्त ट्यूब का वजन घटाकर की मांसपेशी नमूना के वजन की गणना।
  2. रक्त की मांसपेशियों नमूना धोने के लिए समाधान के लिए कई बार भंवर। 30-60 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर पेशी तलछट करते हैं।
    1. पहले एक इलेक्ट्रॉनिक pipetting सहायता या चूषित्र का उपयोग कर, ट्यूब से मध्यम की लगभग पूरी मात्रा निकालें लेकिन ट्यूब में लगभग 2-3 मिलीलीटर छोड़ दें।
    2. पकवान पर पेशी नमूना ले जाने के लिए शेष तरल पदार्थ की अनुमति के एक बाँझ पेट्री डिश पर ट्यूब उलटें; किसी भी शेष मांसपेशी वसा या संयोजी ऊतक के किसी भी दृश्य टुकड़े शेष तरल जुटाने और एक pipette.Remove के साथ इसे दूर करने के लिए पकवान fragments.Rotate निकालने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें।
  3. 100-400 मिलीग्राम वजन बायोप्सी के लिए, गर्म के 3 मिलीलीटर जोड़नेएंजाइम समाधान का उपयोग करने और बाँझ नलियां बहुत छोटे-छोटे टुकड़ों (<1-2 मिमी 3) में पेशी नमूना काटा।
  4. एक बाँझ 10 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को पेशी के टुकड़े और एंजाइम समाधान और हस्तांतरण को आकर्षित एक विस्तृत बोर 25 एमएल पिपेट का उपयोग करना। कोलैजिनेज और dispase एंजाइम समाधान और एक छोटे 10 एमएल पिपेट ट्यूब में किसी भी शेष पेशी टुकड़े और जगह इकट्ठा का उपयोग करने का एक और 3-5 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश धो लें। सटीक मात्रा महत्वपूर्ण नहीं है।
  5. विचूर्णन के साथ 60 मिनट (10 एमएल पिपेट) हर 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (या पानी से स्नान) में शीशी रखें।
  6. एक घंटे के बाद नए सिरे से पूर्व गर्म मध्यम विकास के एक बराबर मात्रा के अलावा द्वारा एंजाइमी हदबंदी समाप्त करने और किसी भी बड़े myofibre मलबे को हटाने के लिए एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन से गुजरती हैं। कमरे के तापमान (20-25 सेल्सियस) पर छह मिनट के लिए 657 XG पर फ़िल्टर्ड सेल समाधान अपकेंद्रित्र।
  7. एक uncoated में मध्यम विकास और थाली की 5-7 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend टी-25टिशू कल्चर कुप्पी। 7 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए इस प्लेट हस्तांतरण। मध्यम हर 48 घंटा बदलें। इस अवस्था में myogenic कोशिकाओं गैर myogenic कोशिकाओं से विचार करने के लिए बहुत छोटे और गोल और मुश्किल कर रहे हैं।
    1. पहले मध्यम परिवर्तन पर, किसी भी गैर-पक्षपाती गोली कोशिकाओं के लिए सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र। ताजा मध्यम और फिर से थाली में इन फिर से निलंबित।
  8. संस्कृति में सात दिनों के बाद, myogenic (और fibroblast) कोशिकाओं के सबसे जुड़ी है, लेकिन कोशिकाओं अभी तक संगम तक पहुँच नहीं है कि सुनिश्चित करते हैं। Myogenic व्यापारियों को शुद्ध और मूल Gherardi और Chazaud 19,20 की प्रयोगशालाओं में से विकसित की है और आगे हमें 5 से संशोधित एक प्रोटोकॉल के अनुसार एमएसीएस प्रदर्शन करते हैं।

CD56 अभिव्यक्ति पर आधारित प्रकोष्ठों के 4. immunomagnetic मनका छंटनी (1.5 एचआर)

  1. तीन एक्सचेंजों के साथ (आमतौर पर 50-60% myogenic कोशिकाओं 5 में शामिल होंगे जो) सेल monolayer कुल्ला सात दिनों के बादकमरे के तापमान फॉस्फेट बफर समाधान के (पीबीएस) अलगाव से किसी भी शेष गैर पक्षपाती कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए।
    1. कोशिकाओं Trypinize (0.04% trypsin CA में 0.73 मिमी EDTA के साथ 2 + मुक्त पीबीएस) 3 मिनट के लिए। कोशिकाओं को अलग कर लेते हैं, पर-पाचन को रोकने के लिए कंकाल की मांसपेशी मध्यम विकास के 5-10 मिलीलीटर जोड़ने। गिनती के लिए पूरा मध्यम का एक उचित मात्रा में कमरे के तापमान (20-25 सी) और resuspend में छह मिनट के लिए 657 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    2. वांछित विधि का उपयोग सेल निलंबन का एक छोटा सा नमूना गणना (जैसे, एक hemocytometer या एक स्वचालित गिनती डिवाइस का उपयोग) और सेल नंबर और व्यवहार्यता शुरू करने की गणना।
  2. Immunocytochemical के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली (यदि आवश्यक हो या बड़ा पोत) में कुछ कुओं थाली या पूर्व छँटाई करने के लिए जनसंख्या के cytometry आधारित लक्षण वर्णन प्रवाह (fibroblasts और myogenic कोशिकाओं मौजूद सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं प्रकार होगा)।
  3. सेल निलंबन विज्ञापन के लिएबाँझ पीबीएस के डी 15 मिलीलीटर कोशिकाओं और मध्यम पतला करने के लिए। अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को फिर से और बफर छँटाई कमरे के तापमान के 170 μl में resuspend (एक एमएसीएस rinsing समाधान में 1% बीएसए, 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा है के माध्यम से निष्फल)।
    1. सेल समाधान में एक CD56 प्राथमिक एंटीबॉडी (क्लोन AF12-7H3, 130-050-401) संयुग्मित अच्छी तरह से मिश्रित चुंबकीय microbeads की 35 μl जोड़ें, पिपेट मिश्रण और कम से कोमल आंदोलन के साथ 4 सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं छोड़ने के लिए आधे रास्ते बिंदु।
  4. ऊष्मायन के बाद, एमएसीएस के 10 एमएल 6 मिनट के लिए 657 XG पर बफर और अपकेंद्रित्र छँटाई के साथ सेल और मनका समाधान पतला। बफर छँटाई के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
  5. स्टैंड पकड़े एमएसीएस को एमएसीएस विभाजक (चुंबक) जोड़ें। कारण मजबूत चुंबकीय क्षेत्र को खड़ा करने के लिए चुंबक जोड़ते समय ध्यान रखना। स्तंभ में स्लॉट और पूर्व जुदाई फिल्टर फिट बैठते हैं। पिपेट स्नेहन के लिए पूर्व जुदाई फिल्टर और कॉलम के माध्यम से बफर छँटाई के 1 मिलीलीटर।
  6. Immediatइली इसके बाद धीरे सेल निलंबन मिश्रण और पूर्व जुदाई फिल्टर के माध्यम से और स्तंभ में पूरे 1 मिलीलीटर ड्रिप।
  7. बफर छँटाई के 1 मिलीलीटर (या 500 μl) के साथ स्तंभ तीन बार धोएं। मध्यम विकास की एक छोटी राशि से युक्त एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पहली क्रमबद्ध पर कॉलम के माध्यम से पारित जो गैर बनाए रखा कोशिकाओं को इकट्ठा। अंश और अत्यधिक संयोजी ऊतक fibroblasts के लिए समृद्ध होगा - इन कोशिकाओं को पहले क्रमबद्ध CD56 हैं। स्तंभ washes के बीच सूखे से बाहर मत देना।
  8. Washes के बाद पूर्व जुदाई फिल्टर को हटाने और स्तंभ के लिए एमएसीएस बफर के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने। फिर तुरंत चुंबक से स्तंभ को हटाने और स्तंभ के शीर्ष में सवार निराशाजनक द्वारा एक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पहली क्रमबद्ध CD56 + अंश इकट्ठा।
    नोट: सवार स्तंभ के शीर्ष में बहुत कसकर फिट बैठता है और संचालित करने के लिए काफी मुश्किल हो सकता है; स्तंभ अभी भी च है हालांकि, जबकि यह किया जाना चाहिएबफर के ULL, ताकि गति के लिए आवश्यक है। सवार भी कठिन है और तेजी निराशाजनक बचें।
  9. उदाहरण के लिए, का उपयोग कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन चढ़ाना करने से पहले, trypan नीले परख। 8 एक्स 1 2 मिमी गिनती क्षेत्रों से व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत (hemocytometer के दोनों कक्षों) निर्धारित करते हैं।
    नोट: कोशिकाओं की आवश्यकता शुद्धता के आधार पर छाँटे गए एकल या डबल या तो किया जा सकता है। सावधानी से किया, तो इन कोशिकाओं को बहुत अच्छी तरह से डबल छँटाई प्रक्रिया सहन और व्यवहार्यता 95%> बहुत अधिक है। डबल छंटाई के लिए, बफर की छंटाई के 1 एमएल के साथ चिकना और कदम 4.6 से आगे बढ़ना है, एक और स्तंभ की स्थापना की।
    1. इमेजिंग 24 अच्छी तरह से बर्तन 21 में स्थित है और सेल लगाव (जैसे कोलेजन या laminin) के लिए ईसीएम अणु की अपनी पसंद के साथ लेपित गिलास coverslips के लिए सीधे पर, थाली कोशिकाओं प्रदर्शन किया जा रहा है। इधर, 0.1-0.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन मैं (3 टेबल) का उपयोग करें।

हम 5. छंटनीइसके तत्काल बाद अलगाव के बाद एक स्नायु व्युत्पन्न तंतुकोशिकाएं।

  1. तुरंत अलगाव के बाद तंतुप्रसू पूर्वज शुद्ध निम्नलिखित संशोधनों के साथ ऊपर के रूप में प्रोटोकॉल को रोजगार के लिए:
    1. तुरंत एक बार एक 100 माइक्रोन सेल झरनी यद्यपि और उसके बाद फिर से एक 40 माइक्रोन झरनी हालांकि पूरा मध्यम और फिल्टर में अलगाव resuspend कोशिकाओं के बाद। छह मिनट के लिए 657 XG पर पीबीएस और स्पिन के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. बफर छँटाई एमएसीएस में कोशिकाओं Resuspend और कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए मानव विरोधी तंतुकोशिका microbeads में सेते हैं।
    3. रास स्तंभ और मिडी-एमएसीएस विभाजक (3 टेबल) का उपयोग और 40 माइक्रोन पूर्व जुदाई फिल्टर स्थापित करें।
    4. , आवश्यक शुद्धता पर निर्भर करता है एक या दो प्रकार के प्रदर्शन सीरम युक्त मध्यम में जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं को हस्तांतरण, एक गणना करते हैं, और वांछित घनत्व पर बाहर प्लेट

6. Immunocytochemical धुंधला हो जाना (1 दिन और रात)।

  1. फिक्सकोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए ठंडा पीबीएस में 8% paraformaldehyde के एक बराबर मात्रा के अलावा द्वारा उनके कुओं में कोशिकाओं। और 10 मिनट महाप्राण लगानेवाला के बाद पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
  2. पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में कम से कम एक घंटा के लिए कोशिका की सतह एंटीजन, ब्लॉक कोशिकाओं immunostain और फिर प्रासंगिक प्राथमिक एंटीबॉडी (तालिका 4) के साथ जांच करने के लिए।
    1. इंट्रासेल्युलर एंटीजन के लिए, तो ब्लॉक और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं, 1% BSA और 10 मिनट के लिए नेन 3 (0.01%) के साथ पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स 100 के अलावा द्वारा निर्धारण के बाद कोशिकाओं permeabilize। एक कमाल मंच पर कोमल आंदोलन के साथ सभी प्राथमिक एंटीबॉडी incubations रात भर कमरे के तापमान पर (या 4 डिग्री सेल्सियस पर) निष्पादित करें।
  3. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर प्रजाति विशिष्ट fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक घंटे ऊष्मायन (तालिका 4) के लिए सेते हैं।
  4. निकालने के बादअनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी, पीबीएस के तीन एक्सचेंजों के साथ कोशिकाओं कुल्ला और फिर फ्लोरोसेंट डीएनए डाई Hoechst 33342 (1 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के एक कमाल मंच पर 10 मिनट के लिए समाधान के साथ counterstain।
  5. कोशिका की सतह एंटीजन और intracellular एंटीजन दोनों के एक साथ दृश्य के लिए, पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जांच की कोशिकाओं को उनके उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा सतह एंटीजन सेल। अगला, ठंड पीएफए, Permeabilize, ब्लॉक में कोशिकाओं को फिर से ठीक करने और उनके उचित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा साइटोप्लास्मिक या परमाणु एंटीजन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  6. धुंधला करने के बाद, घुमावदार संदंश का उपयोग कर अपने कुओं से coverslips निकालें और आसुत जल का उपयोग coverslip के पीछे कुल्ला। Coverslip के सेल एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर मध्यम 22 सेट बढ़ते विरोधी फीका की एक बूंद पर नीचे स्लाइड निर्धारित करना।

प्रकोष्ठों के immunofluorescent धुंधला के साथ संयोजन में 7. तेल रेड हे धुंधला (2 घंटा)

  1. पता चलता है5,23 - कोशिकाओं के लिपिड सामग्री तेल रेड हे (([4 (Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol 1) के साथ धुंधला द्वारा 24 अच्छी तरह से बर्तन में चढ़ाया। प्रथम (V / डब्ल्यू) तेल रेड ओ 60 99% triethyl-फॉस्फेट की मिलीलीटर और आसुत जल का 40 मिलीलीटर में तेल रेड हे की 500 मिलीग्राम भंग करके 0.5% के एक शेयर के समाधान तैयार है। उपयोग करें जब तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर इस समाधान को बनाए रखें।
  2. उपयोग की दिन पर, एक 36% कर 12 तेल रेड हे शेयर समाधान के मिलीलीटर और आसुत जल के 8 मिलीग्राम से युक्त triethyl फॉस्फेट काम कर समाधान (w / v)। सभी सघन तेल रेड हे (जो छवि गुणवत्ता impairs) को हटाने के लिए फिल्टर पेपर 42 नंबर के माध्यम से इस समाधान फ़िल्टर।
  3. धीरे समाधान छह मिनट के लिए 1200 XG पर घूमती है, जिसके बाद एक घंटे के लिए एक पानी के स्नान में इस काम कर समाधान गर्म है। सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक ताजा 20 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए फिल्टर पेपर (संख्या 42) और हस्तांतरण के माध्यम से फिर से फिल्टर।
  4. कोशिकाओं, तय permeabilised और immunostained किया गया है के बाद, पीबीएस निकालें और तेल रेड हे / Triethyl-फॉसफोरस के 500 μl जोड़ने60 मिनट के लिए वेल्स को phate समाधान। कोशिका झिल्ली permeabilisation के लिए यहां इस्तेमाल किया एकाग्रता में ट्राइटन एक्स सेलुलर लिपिड सामग्री 23 को प्रभावित नहीं करता है।
    नोट: तेल रेड हे 540 और 580 एनएम और इसलिए टेक्सास लाल फिल्टर के बीच तरंग दैर्ध्य से उत्साहित है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 23 में तेल रेड हे उत्सर्जन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोशिकाओं को बहुत दृढ़ता से (यानी, बहुत उच्च वसा सामग्री) दाग रहे हैं अगर तेल रेड ओ से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन कभी कभी दूर लाल चैनल में रिसाव हो सकता है।
  5. ऊष्मायन के बाद, अतिरिक्त तेल रेड हे हटाने और पीबीएस के 500 μl के साथ कोशिकाओं को पांच बार कुल्ला। खंड दोनों brightfield / चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा या टेक्सास लाल फिल्टर का उपयोग epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा तेल रेड हे डाई का पता लगाने 6 में वर्णित के रूप में immunostaining के लिए के रूप में coverslips के माउंट (, पूर्व बीपी 560/40, बी एफटी 585, एम बी पी 630 नि: शुल्क बदलाव / 75, कार्ल Zeiss)।

8. इसके बाद एक के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से micrographs प्राप्तalysis

नोट: यह सुनिश्चित करें मात्रात्मक तुलना में किया जा करने के लिए स्लाइड कि समान शर्तों (जैसे, जोखिम, कैमरा और अधिग्रहण सेटिंग्स आदि) पर फोटो खिंचवाने और एक ही माइक्रोस्कोपी सत्र में कब्जा कर लिया है, एक ही समाधान के साथ दाग रहे हैं। सब के बाद अधिग्रहण स्वरूपण भी समान हो और डिजिटल छवियों 24 के लिए सुझाव दिशा निर्देशों के साथ सख्त अनुसार होना चाहिए।

  1. छवि अधिग्रहण (widefield माइक्रोस्कोपी) के लिए, माइक्रोस्कोप और प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत पर बारी और प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत को गर्म और स्थिर करने के लिए अनुमति देने के लिए समय की सिफारिश की राशि के लिए छोड़ दें।
  2. कैमरे के लिए प्रकाश पथ को अवरुद्ध करके कैमरे के लिए अंधेरे मौजूदा सेट; अधिकतम संकल्प पर एक छवि हासिल करने और बाद में प्राप्त कर लिया छवियों को सही करने के लिए इस का उपयोग करें।
  3. तरल प्रकाश गाइड एक (phenylmethyl सिलिकॉन तेल से भर Fluoroplastic का लचीला ट्यूब) द्वारा दिया epifluorescence के द्वारा Immunofluorescent जांच रोशनएन डी का संकेत है, (फिल्टर 45 मुख्यालय टेक्सास लाल पारी मुक्त, ग्रीन (फिल्टर 44 FITC के विशेष पारी मुक्त) और नीले (फिल्टर एक औंधा महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर 49 DAPI के पाली) मुक्त बैंड पास फिल्टर सेट (10X, 20X सेट लाल के माध्यम से कल्पना 40X, 0.25, 0.75, 0.95 संख्यात्मक apertures क्रमशः) के साथ apochromatic उद्देश्यों की योजना है।
  4. पिक्सेल संतृप्ति छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के 'Overexposure' सुविधा का उपयोग कर प्रत्येक फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए डिटेक्टर के रैखिक सीमा के भीतर इष्टतम जोखिम खोजने से बचने के लिए। प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल के लिए मानकीकृत लोगों तक पहुंचाने का एक नोट करें।
  5. अलग-अलग चैनलों पर कब्जा और स्केल या pseudocolored झगड़ा (में चिह्नित छवि फ़ाइल स्वरूप) उच्चतम थोड़ी गहराई में छवियों फ़ाइलों को बचाने (अधिमानतः 16 बिट - 65,536 ग्रे मान) रिकॉर्डिंग डिवाइस द्वारा प्रदान की गई है (जैसे सीसीडी (चार्ज डिवाइस युग्मित) खुर्दबीन के लिए फिट ठंडा) । 1388 X 1040 या इससे अधिक के लिए छवि संकल्प सेट करें। ज्ञात डि के पैमाने बार या वस्तु शामिल करना न भूलेंछवि में mensions।
  6. जहां संभव जानकारी 25 के नुकसान को रोकने के लिए .JPEG प्रारूप में 16 बिट में चिह्नित छवि फ़ाइल स्वरूप (झगड़ा) में फ़ाइलों और नहीं बचा लो।
  7. (इस के लिए स्वत: सुधार हो सकता है खुर्दबीन के साथ बंडल सॉफ्टवेयर) रोशनी के evenness पर किसी भी चिंताएं हैं, तो कोशिकाओं के बिना coverslip के एक 'फ्लैट क्षेत्र' छवि ले, लेकिन दाग और एक ही तरीके के रूप में प्रयोगात्मक स्लाइड्स में घुड़सवार; इस छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में रोशनी दोषों के बाद अधिग्रहण के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  8. छवि अधिग्रहण (confocal माइक्रोस्कोपी) के लिए, प्रत्येक इमेजिंग प्रयोग (संतृप्ति बचने के लिए) के लिए डिटेक्टर लाभ और लेजर शक्ति का अनुकूलन। सामान्य में, मापा प्रतिदीप्ति लेजर सत्ता के स्तर के लिए आनुपातिक है। सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्राप्त करने के लिए 'एक हवादार' सेट पिनहोल आकार (सुधार के प्रस्ताव विशेष रूप से मजबूत संकेतों के लिए 0.5 हवादार पर प्राप्त किया जा सकता है)। चींटी के माध्यम से Z अक्ष के साथ विभिन्न स्तरों पर ऑप्टिकल वर्गों लोकोशिकाओं ibody लेबल और छवि विश्लेषण के लिए प्रत्येक चैनल के लिए एक 16 बिट अधिकतम प्रक्षेपण बचाने के लिए।

Fluorescently 9. प्रदर्शन माप इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (देखने के क्षेत्र के प्रति 5 मिनट) का प्रयोग परमाणु प्रतिलेखन कारक लेबल।

  1. पहुंच व्यक्तिगत झगड़ा छवि फ़ाइलें और क्लिक कर और दूसरे में एक छवि खींचकर ओवरले इसी चैनल। प्रत्येक चैनल तो परतें पैनल में एक अलग परत के रूप में दिखाई देगा।
  2. नीचे समवर्ती देखे जा परतों अनुमति देने के लिए फिल्टर मेनू से हल्का चुनें। वैकल्पिक रूप से, 50% करने के लिए ऊपर परतों की अस्पष्टता को समायोजित।
    नोट: झगड़ा छवियों जानकारी की हानि के बिना फ़ाइल आकार को कम करने के लिए 'दोषरहित' Lempel-Ziv वेल्च (खराब) डेटा संपीड़न के साथ बचाया जा सकता है।
  3. विश्लेषण खिड़की (विश्लेषण> का चयन डेटा बिंदुओं> कस्टम) में, densit मतलब है, विश्लेषण का चयन करें और माप की आवश्यकता है (जैसे, एकीकृत घनत्व का चयनवाई, घेरा, हिस्टोग्राम आदि)। उन्हें अगले बॉक्स को अनचेक करके किसी भी अनावश्यक माप त्यागें। क्षेत्र माप विश्लेषण> सेट मापन स्केल पर माइक्रोन क्लिक में आवश्यक हैं। शासक उपकरण स्वचालित रूप से दिखाई देगा - पैमाने पर पट्टी की लंबाई का पता लगाने और माइक्रोमीटर में अपने ज्ञात लंबाई दर्ज करें। सॉफ्टवेयर तो वर्ग माइक्रोन में क्षेत्र मापन में बदल जाएगा।
    नोट: हिस्टोग्राम विश्लेषण चुना जाता है, माप दर्ज कर रहे हैं जब एक अतिरिक्त फ़ोल्डर (इस माइक्रोग्राफ में प्रत्येक व्यक्ति के चयन के क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह से सभी व्यक्तिगत चयन के माध्यम से योग के लिए 8 बिट histograms के साथ (चुना जा सकता है, जिनमें से पांच) दिखाई देगा एकाधिक चयन बना रहे हैं, तो हमेशा) हिस्टोग्राम-1 के रूप में प्रकट होता है। इस विश्लेषण 16 बिट प्रारूप में सॉफ्टवेयर के द्वारा प्रदर्शन किया है, लेकिन ब्याज की एक वस्तु भर पिक्सेल तीव्रता के वितरण की जांच के लिए बहुत उपयोगी है नहीं किया जा सकता।
  4. परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता के विश्लेषण के लिए पहली बार एक प्रतिनिधि का निर्माणहेक्स्ट या DAPI के दाग डीएनए के लिए सरीखे 'रंग सीमा चयन मास्क' (CRSM) परमाणु क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए। अन्य सभी परतों होना चाहिए, whilst वांछित चैनल छवियों मढ़ा जाता है एक बार, केवल हेक्स्ट चैनल परत चुना है परतें टैब में इसे करने के लिए आसन्न 'आंख आइकन' सुनिश्चित करने के द्वारा दृश्य में छोड़ दिया जाना चाहिए और फिर परत पर प्रकाश डाला है, (नीला पड़ जाता है) deselected। सम्मिश्रण लटकती परतों टैब में 'सामान्य' के लिए वापस सेट किया जाता है सुनिश्चित करें।
  5. रंग रेंज संवाद बॉक्स खोलें (> रंग श्रेणी का चयन करें) और 'नमूना रंग' के लिए चयन विकल्प लटकती निर्धारित किया है। 'जल्दी मुखौटा' (लाल पृष्ठभूमि) के लिए सेट चयन पूर्वावलोकन के साथ ('+' चिन्ह दिखाई देता है) शिफ्ट कुंजी पकड़ और प्रतीत होता है कि आँख dropper उपकरण का उपयोग कर नाभिक के भीतर क्लिक करके नाभिक के भीतर सभी नीले रंग टन का चयन करें।
    1. अवांछित टन का चयन कर रहे हैं, Alt कुंजी ('─'sign दिखाई देता है) दबाने और क्लिक करके उन्हें हटानेउन पर। केवल मैन्युअल रूप से चयनित रंग टन माप में शामिल किए गए हैं और 'स्थानीयकृत रंग समूहों' अनियंत्रित छोड़ दिया जाना चाहिए कि इतने शून्य पर fuzziness पैमाने बनाए रखें।
  6. एक कार्यक्रम के विशिष्ट निकालने फ़ाइल (.AXT फ़ाइल) के रूप में कंप्यूटर की हार्ड डिस्क को इस CRSM बचाओ। एक और यादृच्छिक नाभिक, भार, अद्यतन के क्षेत्र, और CRSM (चयन करें, रंग रेंज, लोड) को बचाने के साथ। परमाणु चयन प्रतिनिधि हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम पांच यादृच्छिक क्षेत्रों के लिए यह करो।
    1. मानव आँख ग्रे 26 के अलग रंगों के बीच से रंग के विभिन्न रंगों के बीच विभेद करने के लिए बेहतर करने में सक्षम है क्योंकि सुविधाओं को अलग करने के लिए एक मुखौटा के निर्माण के लिए एक स्केल छवि का एक रंगीन संस्करण का उपयोग करें।
  7. धुंधला के लिए खंड परमाणु क्षेत्रों के लिए परमाणु CRSM का प्रयोग करें। नाभिक छवि> समायोजन> दहलीज पर क्लिक चुना है और सही करने के लिए स्लाइडर सभी तरह के कदम जाने के बाद, नाभिक काले ऐसी है कि बारी। वैकल्पिक रूप से,ठीक क्लिक करें और 'भर' तो का चयन करने के लिए 'भरें: ब्लैक' का चयन करें। तब सब पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए हटाना अब प्रेस का चयन> उलटा पर क्लिक करें और (विकल्प चुन प्रतीत होता है कि अगर 'को भरने: व्हाइट')। यह अनिवार्य रूप से अपने चयन पर आधारित छवि binarizes। तब ओवरलैपिंग नाभिक (फिल्टर> द्विआधारी छवि> वाटरशेड सुविधा जुदाई) अलग करने के लिए फिल्टर टैब से वाटरशेड प्लगइन लोड।
    1. कई नाभिक भारी अतिव्यापी रहे हैं, उन्हें सही का निशान हटा विश्लेषण से नाभिक हटाने के लिए (Alt कुंजी पकड़ो और शिथिल कमंद उपकरण के साथ उन्हें चारों ओर खींचना)।
  8. अब बाइनरी परमाणु परत पर, व्यक्ति नाभिक का चयन करने के लिए, रंग रेंज और> छाया> का चयन करने के लिए जाना। किसी भी एक काला नाभिक के भीतर वैकल्पिक पकड़ पारी और क्लिक करें। सभी नाभिक तुरंत चयन किया जाएगा। फिर उस परत के चयन और सभी सही का निशान हटा (जैसे myogenin) परमाणु प्रतिलेखन कारक धुंधला युक्त परत करने के लिए इस चयन का स्थानांतरणअन्य परतों। अग्रसर लाइनों अब myogenin चैनल में नाभिक की स्थिति दिखाई जाएगी।
  9. Pseudocolored छवियों के साथ काम कर रहे हैं केवल (परतों टैब के दाईं ओर) चैनल पट्टी पर क्लिक करें और केवल ग्रीन चैनल (छवि अब ग्रे दिखाई देगा) का चयन करें। तो छवि> मोड> स्केल पर क्लिक करें। दिखाई देते हैं 'दिखाई परतों समतल और छिपा परतों त्यागने' क्लिक करें ठीक होगा एक चेतावनी है, तो एक और चेतावनी कहेंगे ओके क्लिक करें फिर 'अन्य चैनलों को त्यागें। स्केल चयनित नाभिक का केवल एक परत अब परतों पैलेट में उपस्थित रहेंगे।
    1. चयनित नाभिक के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए मापन प्रवेश में रिकॉर्ड माप क्लिक करें। परत विश्लेषण किया तो (जैसे myogenin धुंधला) पहले से ही तो बस रिकॉर्ड माप प्रेस एक कच्चे 16 बिट स्केल छवि है।
    2. TXT के रूप में निर्यात चयनित माप अपनी पसंद के स्थान पर फ़ाइल। ये तो आगे की कार्रवाई की और अन्य डेटा सॉफ्टवेयर से निपटने के पी में विश्लेषण किया जा सकताackages
      नोट: यदि जरूरी हुआ तो संपादित करें> कदम पिछड़े कमांड (प्रेस एक साथ ऑल्ट, कंट्रोल और जेड कुंजी के सभी) पिछले सभी परतों पुनर्स्थापित करता है।
    3. गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति परिणाम मात्रात्मक और प्रतिदीप्ति तीव्रता का मापन के रूप में तुलनीय होने के लिए 27 के लिए सही हमेशा संकेत और पृष्ठभूमि का मिश्रण हैं।
      1. वर्ग चयन उपकरण का चयन करें और (वांछित और छवि में कोशिकाओं के confluency के आधार पर यदि या बड़ा) 20 20 से पिक्सल का चयन 'तय आकार' की जाँच करें। पारी देखने के क्षेत्र भर में फैले दस या अधिक पृष्ठभूमि क्षेत्रों का चयन धारण करते हुए। मापन प्रवेश में 'प्रेस रिकॉर्ड माप'।
      2. (मापन प्रवेश में मतलब है 'ग्रे मूल्य' के रूप में दिया जाता है) सभी 10 चयनित पृष्ठभूमि क्षेत्रों के पिक्सेल प्रति औसत एकीकृत घनत्व (सभी पिक्सेल ग्रे मूल्यों का योग) की गणना। (लक्ष्य वस्तु में पिक्सेल की संख्या से पिक्सेल प्रति औसत पृष्ठभूमि घनत्व गुणा
      3. अंतिम पृष्ठभूमि को सही मूल्य उपज के लिए वस्तुओं मूल एकीकृत घनत्व से घटाना पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति। यह दृष्टिकोण गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में क्षेत्र परिवर्तन के संभावित क्षेत्र के लिए खातों।
        नोट: यह इस सुधार अंतिम मूल्यों पर काफी प्रभाव पड़ता है के रूप में केवल सदाशयी पृष्ठभूमि क्षेत्रों का चयन करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। चयन करते समय आवर्धक कांच का उपयोग में Zooming सिफारिश की है।
      4. यह भी सामान्य पृष्ठभूमि सुधारा (नाभिक प्रति मतलब ग्रे स्तर / तीव्रता लेने के रूप में ही) पिक्सल में नाभिक के क्षेत्र द्वारा मूल्य एकीकृत घनत्व के लिए अधिक योगदान होता है कि परमाणु स्थानीयकृत पृष्ठभूमि संकेत के किसी भी संभावित प्रभाव को कम से कम करने के लिए विभाजित करने के लिए उपयोगी हो सकता है परमाणु आकार (चित्रा -3 सी) में वृद्धि के साथ मूल्य।

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Representative Results

शुद्ध myogenic कोशिकाओं और fibroblasts adipogenesis के लिए अपनी क्षमता का आकलन करने के लिए कहीं भी 7-30 के बीच दिनों से adipogenic पोषण मध्यम द्वारा पीछा तीन दिनों के लिए adipogenic भेदभाव मध्यम में संवर्धित किया जा सकता है। शुद्ध सेल आबादी का प्रयोग, adipogenic और myogenic वंश मार्करों के लिए immunostaining के साथ संयोजन में तेल रेड हे धुंधला ही तंतुप्रसू अंश adipogenic भेदभाव (चित्रा 2) में सक्षम था कि पता चला है। fibroblasts द्वारा वसा की भारी संचय नग्न आंखों (पैनल ए) के लिए दिख रहा है, और उनकी पूरी transdifferentiation परमाणु PPAR γ (चित्रा 2 पैनलों बी और सी और चित्रा 3) का बहुत मजबूत अभिव्यक्ति के द्वारा दिखाया गया है। 15 दिनों के इलाज के द्वारा, इन कोशिकाओं को किसी भी उनकी सब्सट्रेट ते-7 (एक संयोजी ऊतक प्रतिजन) शेष (पैनल डी) जारी किया है। इसके विपरीत, myogenic कोशिकाओं desmin और भारी मायोसिन की अभिव्यक्ति सहित अपने सामान्य फेनोटाइप बनाए रखने केश्रृंखला (चित्रा 2 पैनलों ई और एफ) और परमाणु PPARγ (चित्रा -3 सी) upregulate नहीं है।

Myogenic कोशिकाओं (desmin +) के एक क्षेत्र के मात्रात्मक विश्लेषण का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है। पैनल बी क्षेत्र का विश्लेषण से पता चलता है, और पैनल ए (पृष्ठभूमि सुधार के बाद) मात्रा निर्धारित प्रतिदीप्ति तीव्रता से पता चलता है। इस विधि को स्पष्ट रूप से इस विशिष्ट बोने घनत्व और समय बिंदु पर व्यक्तिगत नाभिक में myogenin अभिव्यक्ति की भिन्नता से पता चलता है। चित्रा -3 सी सीधे एक सेल-दर-सेल स्तर पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक स्तर की तुलना करने के लिए विधि की उपयोगिता को दर्शाता है। छाँटे गए CD56 + myogenic कोशिकाओं adipocyte उत्प्रेरण मध्यम से संपर्क के बाद ही बहुत कम स्तर को बनाए रखने, जबकि मांसपेशियों fibroblasts के adipogenic प्रतिलेखन कारक PPARγ का एक उच्च स्तरीय एक्सप्रेस - यहाँ हम CD56 कि दिखा।


चित्रा 1:। Immunomagnetic मनका छँटाई द्वारा प्राप्त myogenic कोशिकाओं और fibroblasts की शुद्ध आबादी (अटल बिहारी) संस्कृति में एक सप्ताह के बाद myogenic कोशिकाओं कोशिका की सतह कोशिका आसंजन अणु CD56 (एन एम) और मांसपेशियों के विशिष्ट मध्यवर्ती रेशा desmin व्यक्त हल। परमाणु Ki-67 अभिव्यक्ति इन कोशिकाओं proliferating हैं कि सबूत उपलब्ध कराता है। झिल्ली, साइटोप्लास्मिक और परमाणु के घटकों की धुंधला प्रोटोकॉल कदम 6.5 में वर्णित है। (सीडी) myogenic कोशिकाओं तंतुप्रसू मार्कर ते-7 व्यक्त नहीं करते। मानव पेशी से व्युत्पन्न (ई) Fibroblasts ते-7 और (च) ट्रांसमेम्ब्रेन प्लेटलेट व्यक्त व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर α (PDGFRα)। स्केल सलाखों हैं: (ए) 20 माइक्रोन =; (बी, सी और ई) = 200 माइक्रोन, (डी एंड एफ) 50 व# 181;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न CD56 - / ते-7 + fibroblasts और CD56 / + desmin + adipocyte उत्प्रेरण मध्यम (एम) में सुसंस्कृत myogenic कोशिकाओं। Adipocyte उत्प्रेरण मध्यम (एम) और इस में सुसंस्कृत तेल रेड हे धुंधला निम्नलिखित नग्न आंखों से आसानी से देखा जा सकता है जब एमएसीएस द्वारा पृथक (ए) Fibroblasts adipocytes में अंतर। Myogenic कोशिकाओं एआईएम में समय की इसी अवधि के बाद adipogenic भेदभाव के कोई सबूत दिखाने के लिए और बहुत ही सीमित तेल रेड हे धुंधला दिखा। (बी एंड सी) एचएआईएम में उमान पेशी व्युत्पन्न fibroblasts के अत्यधिक एक्सप्रेस PPARγ और संस्कृति के बाद CEBPα () नहीं दिखाया। (सी) fibroblasts के वे उन्हें चारों ओर एक घने नेटवर्क रूपों जो इंट्रासेल्युलर ईसीएम प्रोटीन शेष जारी adipocytes में अंतर के रूप में। (ई) myogenic सेल उनके myogenic बनाए रखने के आकृति विज्ञान और ऐसे desmin और (च) मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी), टर्मिनल myogenic भेदभाव के एक मार्कर के रूप में वंश मार्करों की अभिव्यक्ति है, और लिपिड जमा करने के लिए असफल। स्केल सलाखों हैं: (बी, डी) = 200 माइक्रोन (ई, एफ) = 100 माइक्रोन, (ग) = 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3: नमूना डेटा fr प्राप्त ओम वर्णित छवि विश्लेषण विधि (एडोब फोटोशॉप विस्तारित दृष्टिकोण) का उपयोग संस्कृतियों immunolabelled। (ए) सीरम मुक्त भेदभाव माध्यम में 24 घंटा के बाद मांसपेशियों विशिष्ट परमाणु प्रतिलेखन कारक myogenin के लिए एक सेल-दर-सेल प्रतिदीप्ति तीव्रता साजिश है। (बी) desmin / + myogenin + मानव myogenic व्यापारियों के प्रतिनिधि micrographs। स्केल सलाखों हैं: (बी) 50 माइक्रोन = छाँटे गए CD56 / + Desmin + myogenic आबादी (CD56 +) और CD56 से व्यक्तिगत नाभिक में (सी) PPARγ प्रतिदीप्ति तीव्रता - / ते-7 / + PDGFRα / + कोलेजन छठी + कोशिकाओं (CD56। -) 15 दिनों के लिए adipocyte उत्प्रेरण मध्यम में संस्कृति के बाद। प्रतिदीप्ति मूल्यों दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच परमाणु आकार में बदलाव के लिए खाते में परमाणु क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत थे। (ए) और (बी) में क्षैतिज काली सलाखों मतलब दिखा।52,049 / 52049fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मध्यम घटकों कंसंट्रेशन सूची नहीं। वाणिज्यिक स्रोत
मानव कंकाल की मांसपेशी मध्यम विकास: सी 23,060 (सूचीबद्ध सभी कारकों से युक्त 'का उपयोग करने के लिए तैयार' आता है)
कंकाल की मांसपेशी बेसल मध्यम - PromoCell
भ्रूण बछड़ा सीरम 15% PromoCell (5%) और एफसीएस गोल्ड, PAA लैबोरेटरीज (10%) - बिल्ली नहीं। A15-151
Fetuin (गोजातीय) 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
Epidermal वृद्धि कारक 10 एनजी / एमएल PromoCell
बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (संयोजक मानव) एक एनजी / एमएल PromoCell
Dexamethasone 0.4 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
इंसुलिन (पुनः संयोजक मानव) 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
एल Glutamine 292 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Myogenic भेदभाव मध्यम सी 23,260
कंकाल की मांसपेशी बेसल मध्यम - PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / </ टीडी> सिग्मा
नोट: PromoCell, हीडलबर्ग, जर्मनी; सिग्मा Aldrich कंपनी लिमिटेड, डोरसेट, ब्रिटेन

तालिका 1: सेल संस्कृति मीडिया घटकों और सांद्रता।

मध्यम रचना कंसंट्रेशन सूची नहीं। कंपनी
Preadipocyte मध्यम विकास सी 27,410 (तैयार उपयोग करने के लिए)
भ्रूण बछड़ा सीरम 0.05 मिलीग्राम / मिलीलीटर PromoCell
Endothelial सेल के विकास के पूरक 0.004 मिलीग्राम / मिलीलीटर PromoCell
एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (पुनः संयोजक मानव) 10 एनजी / एमएल PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Glutamine 292 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
डी बायोटिन 8.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
इंसुलिन (पुनः संयोजक मानव) 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
Dexamethasone 400 एनजी / एमएल PromoCell
IBMX 44 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
एल थायरोक्सिन 9 एनजी / एमएल PromoCell
Ciglitazone 3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
Streptomycin 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Glutamine 292 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Preadipocyte भेदभाव मध्यम सी 27,436 (तैयार उपयोग करने के लिए)
डी बायोटिन 8.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
इंसुलिन (पुनः संयोजक मानव) 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
Dexamethasone 400 एनजी / एमएल PromoCell
IBMX 44 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
एल थायरोक्सिन 9 एनजी / एमएल PromoCell
Ciglitazone 3 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
एसtreptomycin 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Glutamine 292 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Adipocyte पोषण मध्यम सी 27,438 (तैयार उपयोग करने के लिए)
डी बायोटिन 8.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
इंसुलिन (पुनः संयोजक मानव) 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / PromoCell
Dexamethasone 400 एनजी / एमएल PromoCell
पेनिसिलिन 100 यू / एमएल सिग्मा
स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
Glutamine 292 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / सिग्मा
नोट: PromoCell, हीडलबर्ग, जर्मनी; सिग्मा Aldrich कंपनी लिमिटेड, डोरसेट, ब्रिटेन

तालिका 2: adipogenic सेल संस्कृति मीडिया की संरचना है।

उपकरण / अभिकर्मक के नाम कंपनी सूची नहीं। टिप्पणियाँ / विवरण
सेल संस्कृति Collagenase डी रॉश 11088866001
Dispase द्वितीय सिग्मा D4693-1G फिल्टर उपयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए
Trypsin / EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 माइक्रोन सेल झरनी बी.डी. बायोसाइंसेज 352,360
कोलेजन समाधान (0.1% एसिटिक एसिड में 3 मिलीग्राम / एमएल) सिग्मा, डोरसेट, ब्रिटेन C8919
Minisart SRP15 सिरिंज फिल्टर (0.2 माइक्रोन) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene) PTFE (झिल्ली
CD56 मानव microbeads Miltenyi बायोटेक 130-050-401 चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी (एमएसीएस)
Microbeads की सीमित शैल्फ जीवन के बारे में पता
विरोधी तंतुप्रसू microbeads, मानव Miltenyi बायोटेक 130-050-601
40 माइक्रोन पूर्व जुदाई फिल्टर Miltenyi बायोटेक 130-041-407
बड़े सेल Collumns Miltenyi बायोटेक 130-042-202 ये कॉलम एक प्रवाह अवरोध के साथ आते हैं। प्रवाह रोकनेवाला का प्रयोग यहाँ वर्णित उच्च myogenic purities प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है।
रास कॉलम Miltenyi बायोटेक 130-042-401
MiniMacs seperator Miltenyi बायोटेक 130-042-102 इस विभाजक बड़े सेल कॉलम नहीं बल्कि लोकसभा स्तंभ फिट बैठता है।
MidiMACS Miltenyi बायोटेक 130-042-302
एमएसीएस multistand Miltenyi बायोटेक 130-042-303
बीएसए सिग्मा फिल्टर उपयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए
तेल रेड हे सिग्मा O0625 लिपिड धुंधला
Triethyl फॉस्फेट सिग्मा 538,728
वाटमान कागज सिग्मा Z241121-1PAK नं 42, Ashless। फिल्टर एक अर्द्ध सर्कल बनाने के लिए परिपत्र फिल्टर पेपर गुना तैयार करते हैं, तो एक शंकु आकार बनाने के लिए फिर से आधे में अर्द्ध सर्कल गुना। छानने के लिए एक कीप में शंकु फिट बैठते हैं।
बढ़ते
गोल्ड antifade अभिकर्मक लम्बा खींच आण्विक जांच, Invitrogen P36930 इस के साथ या DAPI के बिना खरीदा जा सकता है और प्रारंभिक प्रतिदीप्ति बुझाना नहीं करता है।
AxioVision कार्ल Zeiss संपर्क जीस छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर
एडोब फ़ोटोशॉप CS5 विस्तारित एडोब (प्यूघ कंप्यूटर से खरीदा) ADPH16982 * छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर

तालिका 3: उपकरण और अभिकर्मकों।

नाम / प्रतिजन एंटीबॉडी प्रजातियों और निर्धारण क्लोन नाम उपयोग के लिए कमजोर पड़ने सूची नहीं।
Myogenic मार्करों:
CD56 (एन एम) माउस एम सी आईजीजी 1 मेरा-31 (: 100 1) 347,740 बी.डी.
Desmin खरगोश एम सी आईजीजी 1 D93F5 (एक्सपी) (: 250 1) 5332S चंचु
Myogenin माउस एम सी आईजीजी 1 F5D (01:50) F5D DSHB
मायोसिन भारी चेन माउस एम सी IgG2b, कापा प्रकाश श्रृंखला MF20 (: 200 1) MF20 DSHB
Fibroblast / संयोजी
तिवारीssue मार्करों:
विरोधी मानव तंतुप्रसू माउस एम सी आईजीजी 1 ते-7 (: 100 1) CBL271 Millipore
PDGFRα खरगोश एम सी आईजीजी D13C6 (: 500 1) 5241 चंचु
Proliferative मार्कर:
Ki67 खरगोश एम सी आईजीजी SP6 (: 200 1) सांसद-325-CRM1 एमडी
Adipogenic
प्रतिलेखन कारक:
PPARγ माउस एम सी आईजीजी 1 E8 (01:20) SC-7273 सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी
कुंजी: एम सी: मोनोक्लोनल,पीसी: पॉलीक्लोनल, DSHB: विकास अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा यूएसए;
चंचु: न्यू इंग्लैंड Biolabs, ब्रिटेन; एमडी: ए Menarini निदान, ब्रिटेन; बी.डी.: बी.डी. बायोसाइंस, ब्रिटेन।

टेबल 4: प्राथमिक एंटीबॉडी।

<Tr />
एंटीजन एंटीबॉडी प्रजातियों और निर्धारण घोला सूची नहीं। कंपनी
Alexafluor488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) 1000: 1 एक-11001 एमपी
Alexafluor 594 बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) 1000: 1 ए 11,005 एमपी
Alexafluor 594 बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) 1000: 1 ए 11,012 एमपी
कुंजी: एच + एल = भारी और प्रकाश जंजीरों; सांसद: आण्विक जांच, Invitrogen जीवन टेक्नोलॉजीज, पैस्ले ब्रिटेन

तालिका 5: माध्यमिक एंटीबॉडी।

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Discussion

हम पेशी बायोप्सी सामग्री के छोटे नमूनों से मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न व्यापारियों के चयनात्मक संवर्धन के लिए एक immunomagentic छँटाई प्रक्रिया का वर्णन किया है। इस तकनीक fibroblasts के लिए मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न संस्कृतियों के नुकसान पर काबू पाने के लिए हमारी प्रयोगशाला में अमूल्य किया गया है, लेकिन यह भी मांसपेशियों व्युत्पन्न progenitors के अलग आबादी के अद्वितीय व्यवहार को समझने के लिए किया गया है। एक बार शुद्ध myogenic कोशिकाओं में प्रोटीन और / या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए जांच की, या नीचे की ओर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से micrographs में हित के विशिष्ट क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और सरल तरीका है कि हम भी विस्तार से सेल शुद्धि के अलावा। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से डिजिटल छवियों सेल जीव विज्ञानियों को निकालने के लिए के लिए जानकारी का खजाना होते हैं; वास्तव में पिक्सल जरूरी मानव आंखों के लिए आचार नहीं है कि डेटा पकड़ो। इस तकनीक के साथ मात्रात्मक डेटा एक बड़ी संख्या के बारे में प्राप्त किया जा सकता है आबादी में व्यक्ति की कोशिकाओं की। प्रवाह cytometry की तुलना में जब छवि विश्लेषण की एक अनूठी विशेषता सेल आकार orcell सेल बातचीत में परिवर्तन के साथ प्रोटीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन सहसंबंधी करने की क्षमता है। इसके अलावा, क्षमता, जिससे उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह के लिए क्षमता को कम करने के दृश्य के कई क्षेत्रों में किए जाने के लिए, तेजी से सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप अनुकूलित और प्रतिनिधि चयन मास्क की अनुमति देता बना सकते हैं और बचाने के लिए।

एमएसीएस आधारित सेल शुद्धि

इस पद्धति का एक लाभ कोशिकाओं को सफलतापूर्वक तुरंत अलगाव के बाद या संस्कृति में कुछ दिनों (जब उपज अधिक हो जाएगा) के बाद या तो शुद्ध किया जा सकता है।

महत्वपूर्ण बात, myogenic कोशिकाओं से पहले इस कॉलम के माध्यम से अपने मार्ग में बाधा उत्पन्न करती है क्योंकि छँटाई करने के लिए मिला हुआ बनने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए, और आगे विस्तार और प्रयोग के लिए प्राप्त proliferative कोशिकाओं का अनुपात कम हो जाएगा।

टी "> प्राप्त प्रारंभिक ऊतक के नमूने पर निर्भर करता है,। तरीके चुनिंदा lyse एरिथ्रोसाइट्स, हालांकि इस मांसपेशी व्युत्पन्न कोशिकाओं को किसी भी अनावश्यक रासायनिक तनाव से बचने के लिए मौजूद इस स्तर पर संस्कृति में गैर पक्षपाती एरिथ्रोसाइट्स के एक उच्च संख्या में हो सकता है कदम से बचा। हम मानव मांसपेशियों व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रारंभिक संस्कृति पर एरिथ्रोसाइट्स के किसी भी उल्लेखनीय नकारात्मक प्रभाव नहीं मनाया है जाता है, और myogenic कोशिकाओं देते हैं एक बार इन एरिथ्रोसाइट्स मीडिया परिवर्तन से हटा रहे हैं।

बस से पहले (जैसे, अन्य कोमल प्रोटिएजों या EDTA आधारित विधियों) छँटाई करने के लिए सेल टुकड़ी के अन्य तरीकों कोशिका की सतह प्रतिजन की अभिव्यक्ति कम या tryptic पाचन के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है, जिसमें कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मानव myogenic कोशिकाओं पर CD56 की अभिव्यक्ति मजबूत और (यहाँ वर्णित एंटीबॉडी के साथ assayed) जब एक छोटी trypsinsation के लिए प्रतिरोधी है।

यह छँटाई बफर Calc को बाधित करने के लिए EDTA के शामिल है कि महत्वपूर्ण हैIUM निर्भर सेल सेल आसंजन; इस छँटाई के लिए एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त (और बनाए रखने) के लिए महत्वपूर्ण है। सेल नंबर के आधार पर, आकृति और आकार को हल किया जाना, अलग कॉलम (3 टेबल देखें) के बारे में किए जाने के लिए एक विकल्प नहीं है।

बरकरार रखा कोशिकाओं को रिहा करने के चुंबकीय क्षेत्र से कॉलम निकाला जा रहा है ताकि संग्रह ट्यूब (यहां तक ​​कि skirted अगर) पारगमन में कोशिकाओं के नुकसान से बचने के लिए स्तंभ के बहुत करीब तैनात एक धारक में रखा गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए मुश्किल हो सकता है।

हम कंकाल की मांसपेशी से मानव प्राथमिक कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए इस तकनीक का वर्णन किया है, हालांकि, इस प्रोटोकॉल को आसानी से एक विशिष्ट / अद्वितीय सेल सतह मार्कर में जाना जाता है जिसके लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य लाभ पूरी प्रक्रिया एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट की बाँझ काम के माहौल में बाहर किया जा सकता है कि इस तथ्य शामिल हैं। इसके अलावा, एमएसीएस प्रक्रिया की वजह से कम से FACS छँटाई की तुलना में कोशिकाओं पर gentler हैकतरनी बलों और बड़ा कोशिकाओं के लिए एक विशेष लाभ हो सकता है। इस्तेमाल किया चुंबकीय मोती, छोटे गैर विषैले और संस्कृति में biodegradable हैं। दरअसल, एमएसीएस सफलतापूर्वक अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक नंबर की शुद्धि और अध्ययन के लिए लागू किया गया है।

इस तकनीक की एक सीमा एमएसीएस आसानी से एक साथ कई मार्करों के लिए नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के मार्कर और आकार की राशि ही बाद में, छँटाई प्रक्रिया के दौरान सुनिश्चित नहीं किया जा सकता है।

छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के अनुकूलन के लिए विचार

यहाँ का प्रदर्शन छवि विश्लेषण विधि कोशिकाओं की बड़ी आबादी में एक सेल-दर-सेल आधार पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। एक व्यापक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज में परतों की सुविधा और चयन मास्क का शोषण करके, प्रयोगकर्ता निष्पक्ष अनुमति देने के लिए, एकाधिक छवियों भर में विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों का चयन कर सकते हैंव्यक्तिगत विशेषताओं की मात्रा का ठहराव, और उनके भीतर घटकों के किसी भी संख्या। हम सफलतापूर्वक यों और सीधे एक adipogenic चुनौती के संपर्क में अलग सेल आबादी में प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति की सीमा तुलना करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है।

(एक विशिष्ट मार्कर का प्रतिनिधित्व) प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल दूसरों से अलग रखा है और बहु ​​रंग immunolabelling प्रयोगों के लिए उपयोगी है, जो पर या आवश्यकता के रूप में बंद कर दिया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 28 से मात्रात्मक और अर्द्ध मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए प्रयास करते समय कारकों की एक संख्या को ध्यान में रखा जाना चाहिए। बुनियादी अर्द्ध मात्रात्मक माप की अनुमति देगा इन पर ध्यान किए जाने के लिए। अक्सर शोधकर्ताओं हित के विभिन्न प्रोटीन लेबल करने के लिए fluorochromes का एक नंबर का उपयोग करना चाहते हैं; प्रधानमंत्री महत्व का व्यक्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच भेद करने में सक्षम होने की क्षमता है। ज्यादातर मामलों में यह चयनात्मक excitat द्वारा हासिल की हैएक समय में केवल एक fluorochrome के आयन। हालांकि, उत्सर्जन और / या उत्तेजना स्पेक्ट्रा काफी ओवरलैप या अपर्याप्त-खून बहाना के माध्यम से या पार बात प्राप्त छवि डेटा की सटीकता समझौता हो सकता है तो फ़िल्टर्ड रहे हैं। प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के पारित होने के एक अनुचित का पता लगाने के चैनल में है और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 29,30 के एक ओवरलैप के कारण होता है के माध्यम से भरो।

कर रहे हैं पर विचार करने के लिए कुछ अंक: कि उत्सर्जन फिल्टर सेट, यह सुनिश्चित करना (confocal माइक्रोस्कोपी में लेसरों द्वारा हासिल की है) के रूप में बहुत ही चयनात्मक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर, अच्छी तरह से अलग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है जो fluorochromes चुनने अवांछित तरंग दैर्ध्य बाहर करने के लिए काफी कड़े हैं, और बहुरंगा इमेजिंग प्रदर्शन सबसे लंबे समय तक पर (यानी, 'reddest') अवशोषण स्पेक्ट्रा आम तौर पर उत्सर्जन स्पेक्ट्रा जबकि छोटी तरंग दैर्ध्य (नीले प्रकाश) की ओर टेढ़ी कर रहे हैं कि इस तथ्य के लिए खाते में पहली बार चोटी के उत्सर्जन डाई तरंगदैर्ध्य अब wavel की ओर टेढ़ी कर रहे हैंengths (लाल बत्ती)। फ्लोरोसेंट लेबल के स्पेक्ट्रा Invitrogen द्वारा प्रदान की जाने वाली 'प्रतिदीप्ति Spectraviewer' पर उपलब्ध हैं।

उच्च गुणवत्ता के उद्देश्यों के उपयोग के विश्लेषण के लिए किस्मत में छवियों के लिए महत्वपूर्ण है। एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (> 1.3) सबसे अच्छा है और आवर्धन widefield माइक्रोस्कोपी में कैमरे के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। संख्यात्मक एपर्चर के एक समारोह में 29 चुकता रूप Z-संकल्प में सुधार के रूप में दोनों widefield और confocal माइक्रोस्कोपी में, एनए, महत्वपूर्ण है। कहां गोलाकार और रंगीन aberrations 29 दोनों के लिए सही कर रहे हैं, जो योजना-apochromatic लेंस के संभव बनाने का उपयोग करें। वे पहले 29 उद्देश्य माइक्रोस्कोप में अपने प्रवेश के लिए स्थानिक और लौकिक जुटना कम करने के लिए स्रोत रोशनी पांव मार से असमान रोशनी को कम करने के रूप में तरल प्रकाश गाइड का प्रयोग पुरजोर सिफारिश की है।

यह ठीक से quantifi संतृप्त पिक्सल नहीं किया जा सकता है, के रूप में छवियों के संतृप्ति से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैसबसे तीव्र ग्रे स्तर पर जानकारी की कतरन के कारण एड 26 मूल्यों।

विभिन्न 'Plugins' रिश्तेदार आसानी के साथ प्रदर्शन करने के लिए फ्लैट क्षेत्र सुधार प्रक्रियाओं को सक्षम करने के लिए उपलब्ध हो सकता है; उदाहरण के लिए डॉ जॉन सी रस इन मुफ्त उपलब्ध ऑनलाइन (http://www.drjohnruss.com/download.html) के कई बना दिया है। इस संदर्भ छवि में इसी एक प्रयोगात्मक माइक्रोग्राफ में प्रत्येक पिक्सेल की चमक के अनुपात प्लगइन का उपयोग कर की गणना की जाती है और मूल की जगह है। परिणाम तो छवि की चमक सीमा को भरने के लिए पहुंचा रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, ImageJ की छवि कैलकुलेटर असमान रोशनी के लिए सही करने का एक और अर्थ है।

यह डिटेक्टर 29 तक पहुँचने से बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति रोकता के रूप में कुछ छवि विश्लेषण के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी पसंद की विधि हो सकती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण सुन्न सीमित widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में काफी लंबा समय लग सकता हैएक ही सत्र में प्राप्त किया जा सकता है कि देखने के अलग-अलग क्षेत्रों के एर।

हाल ही में अन्य तरीकों का मानव मांसपेशियों के ऊतकों से myogenic कोशिकाओं के संवर्धन के लिए सूचित किया गया है। CXCR4 / + CD56 + myogenic कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए FACS द्वारा पीछा किया: Bareja 31 (CD11b, CD31, CD34 और CD45 के लिए) एमएसीएस कमी का एक संयोजन का इस्तेमाल किया। इस प्रक्रिया का एक अत्यधिक समृद्ध myogenic आबादी उत्पन्न करने में सक्षम था हालांकि, हालांकि, यह यहाँ विस्तृत विधि की तुलना में काफी लंबी है, कई और अधिक लगातार कदम और ऊतकों की ग्राम प्रति कम शुद्ध myogenic कोशिकाओं की एक कम उपज में परिणाम होता है।

/ CD56 / + Pax7 + कोशिकाओं (ठेठ उपग्रह कोशिकाओं) myogenic वंश potenti के रूप में के रूप में अच्छी तरह से osteogenic प्रदर्शन कर सकते हैं - हाल ही में एक अध्ययन में, कई मार्कर का उपयोग और FACS द्वारा मानव भ्रूण की पेशी से Castiglioni 32 अलग myofibre जुड़े कोशिकाओं CD34 पता चला है किअल, लेकिन आम सहमति में हमारे काम के साथ adipogenic क्षमता दिखाने के लिए नहीं है। कोशिकाओं गैर myogenic थे, लेकिन adipogenic और osteogenic भेदभाव करने में सक्षम थे - ये लेखकों को भी CD34 / + PAX7 दिखाया। CD90 अभिव्यक्ति CD34 + गैर myogenic अंश में (मांसपेशी fibroblasts के 33 में से एक मार्कर) के संवर्धन इन कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा वयस्क मानव कंकाल की मांसपेशी में adipocytes का प्रमुख स्रोत होने के लिए दिखाया गया है, जो किया गया fibroblasts, हो सकता है कि पता चलता है संस्कृतियों (संदर्भ 5 और चित्रा 2)। पेशी व्युत्पन्न fibroblasts के भी osteogenic भेदभाव संभावित वारंट आगे की जांच पड़ताल की है या नहीं।

Reproducibly शुद्ध myogenic सेल संस्कृतियों की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए (7 करने के लिए विरोध के रूप में) और एक लामिना का प्रवाह हुड की सड़न रोकनेवाला शर्तों के भीतर तेजी से किया जा सकता है Castiglioni 32 की विधि के विपरीत, हमारे विधि केवल एक एंटीबॉडी की आवश्यकता है। एक और methodologicaएल फर्क इन लेखकों अलग पेशी से सीधे कोशिकाओं को अलग किया और फिर एक सप्ताह के लिए हम सबसे अक्सर संस्कृति कोशिकाओं जबकि छंटाई और खेती से पहले, संस्कृति में इन पीछा करता है। हमारे हाथ में इस दृष्टिकोण कोशिकाओं से बेहतर सहन किया है। महत्वपूर्ण बात है, संस्कृति में कुल समय दो दृष्टिकोणों के बीच अनिवार्य रूप से बराबर है। इसके अलावा, भ्रूण कंकाल की मांसपेशी यह myogenic व्यापारियों की उपज वयस्क मांसपेशियों की तुलना में जब भ्रूण मांसपेशियों के ऊतकों से अधिक से अधिक है कि आश्चर्य की बात नहीं है hyperplasic और hypertrophic मांसपेशियों की वृद्धि 34 के दौर से गुजर रहा है कि दी

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

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References

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मानव कंकाल की मांसपेशी से प्राथमिक myogenic कोशिकाओं और fibroblasts के अलगाव और मात्रात्मक Immunocytochemical विशेषता
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Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

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