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Developmental Biology

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52049

Abstract

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites, que são as células estaminais musculares residente. Estes podem ser isolados a partir de amostras de biópsia do músculo humano, utilizando a digestão enzimática e as suas propriedades miog�icas estudadas em cultura. Quantitativamente, os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são: (i) as células satélites (denominados células miogénicas ou células precursoras do músculo), inicialmente identificadas como CD56 + e mais tarde como células CD56 + / + e desmina (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 - e TE-7 +. Os fibroblastos proliferam de forma muito eficiente na cultura e nas populações de células mistas essas células podem invadir células miogênicas para dominar a cultura. O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de qualquer um dos tipos de células em cultura. Aqui nós descrIBE um sistema de triagem baseada na digestão enzimática suave de células utilizando colagenase e dispase seguido por triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e um bom rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 5 x 10 células / g de tecido depois de 7 dias in vitro) para experiências em cultura. Esta abordagem baseia-se na incubação da população mista de células derivadas do músculo com microesferas contas magnéticas conjugadas com um anticorpo contra CD56 e, em seguida, passando células embora um campo magnético. As células CD56 + ligadas a microesferas são mantidas pelo campo enquanto que CD56 - células transitar livremente através da coluna. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada e cultivadas. Após um determinado intervenção, morfologia celular, e a expressão e localização de proteínas, incluindo os factores de transcrição nuclear pode ser quantificada utilizando rotulagem de imunofluorescência com anticorpos específicos e uma imagem pRATAMENTO e pacote de análise.

Introduction

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites 1, as células estaminais miog�icas 2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado 3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática 4 e suas propriedades pode ser subsequentemente miog�icas estudado em cultura primária 5. A eficiência deste processo de isolamento em conta tanto o rendimento e a pureza da população celular depende dos métodos utilizados e podem variar de amostra para amostra. Os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são as células satélites (células miogénicas agora denominadas células precursoras ou músculo), inicialmente identificadas como células CD56 + / desmina, e mufibroblastos derivados de LECSA, identificadas como CD56 - e TE7 + 5 células. Os fibroblastos têm uma taxa de proliferação rápida e não sejam submetidos a parada do crescimento irreversível e diferenciação terminal em cima do contato célula-célula, como as células miogênicas; assim, em populações mistas, os fibroblastos podem invadida células miogênicas a dominar a cultura.

Os fibroblastos têm sido muitas vezes visto como uma irritação para os biólogos musculares, no entanto, agora há um interesse crescente em fibroblastos como células dignos de estudo em seu próprio direito, nomeadamente no que eles foram mostrados para ter um papel de cooperação com células miogênicas durante a reparação muscular 6 . O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de ambos os tipos de células em cultura. Activada por fluorescência de células (FACS) é um método pelo qual as células podem ser classificadas para estudo adicional e / ou contados eanalisado. FACS tem sido demonstrado de forma fiável para enriquecer células miogénicas humanos, mas o rendimento de células para cultura posterior, até agora não tem tido grande 7. Dado o potencial de replicação limitado de células somáticas, tais como células derivadas de células-satélite Miogênicos e os muito pobres proliferação e diferenciação associados à senescência 4, abordagens mais suaves são obrigatórios. Culturas de fibras musculares individuais oferecem uma outra, menos agressivo, os meios de obtenção de células satélites murino ainda residente em seu nicho sublaminal e após a sua ativação em cultura 8,9. No entanto, isso muitas vezes não é possível a partir de material da biópsia do músculo humano (porque as fibras raramente pode ser obtido a partir de tendão para tendão) o que significa que esta técnica pode não ser acessível a muitos laboratórios de pesquisa interessados ​​em estudar as células derivadas de músculos humanos. Além disso, a técnica de uma única fibra apenas fornece o número de células muito limitadas.

Aqui nós descrevemos um sistema de triagem com base no gendigestão enzimática tle de células utilizando colagenase e dispase seguido por duas rondas sucessivas de triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e rendimento (2,8 x 10 ~ 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tecido) para experimentos em cultura. CD56 é considerado o marcador de superfície padrão de ouro para a identificação de células satélites humanos in situ e in vitro 10 11 e proporciona o marcador de superfície candidato ideal para a fixação do grânulo. Nesta abordagem, os anticorpos CD56 conjugado com óxido de ferro superparamagnético e grânulos contendo polissacáridos estão ligados às células e passado através de uma coluna de separação de células magnético de gradiente elevado colocada num campo magnético forte 12,13. As colunas de separação são cheios com uma matriz de lã de aço ou de ferro ferromagnéticos esferas que servem para concentrar as linhas de campo magnético para a sua superfície gerar fortes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) 14. Nestas colunas mesmo células ligeiramente magnéticas são atraídas e adsorvido à sua superfície 14. Unbound (CD56 -) células passam através da coluna enquanto que as células CD56 + marcadas com microesferas magnéticas são mantidos até a retirada do campo magnético 12,15.

As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada a uma densidade desejada para posterior experimentação. Após um determinado intervenção os constituintes celulares podem ser identificados usando imunocitoquímica, fotografada usando de campo amplo ou microscopia de fluorescência confocal e analisados ​​quantitativamente usando uma abordagem de análise de imagem que permite a rápida medição objectivo de todas as células marcadas em qualquer imagem. Em nosso laboratório temos usado essa abordagem triagem imunomagn�ica duplo seguido por análise de imagem 16 para demonstrar que CD56 - fibroblastos humanos prontamente transdiferenciam em adipócitos, enquanto célula miogênicas de origem satélite são altamente resistentes a esta conversão adipogênica 5.

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Protocol

NOTA: Para os estudos realizados em nosso laboratório de todos os indivíduos deram o seu escrito, o consentimento informado para participar e todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Ética Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido (Comitê de Ética em Pesquisa Londres; referência: 10 / H0718 / 10) e de acordo com a Human Tissue Act e da Declaração de Helsinki.

1. Preparação inicial antes da biópsia do músculo (15 min)

  1. Adicione meio de crescimento do músculo esquelético humano. Para uma estéril tubo de 50 ml formou adicionar 2,5 ml da mistura de suplemento, 10 ml de soro fetal de vitela, antibióticos (penicilina / estreptomicina) e de glutamina para as concentrações finais correctas (Tabela 1), em seguida, encher o tubo de 50 ml com basal músculo esquelético médio.
  2. Colocar 15 ml do meio de base do músculo esquelético em 20 ml estéreis tubo cónico e pesá-lo. Uma vez que pesava lugar este tubo no gelo. Use-o para receber a amostra de músculo humano.
  3. Em outro tubo de 20 ml preparar 10 ml de uma solução de enzima colagenase e Dispase II D a uma concentração final de 2 mg / mL por dissolução de cada banco de aliquotas destas enzimas no músculo esquelético meio basal. Filtro-esterilizar esta solução por passagem através de um filtro de 0,22 um. Coloque esta mistura de enzima estéril em banho de água ou incubadora a 37 ° C durante 15 minutos para aquecer.
    NOTA: Esta mistura de enzimas é um pouco mais suave do que a tripsina e melhor mantém a viabilidade das células 17.
  4. Separe uma placa de Petri e um par de bisturis esterilizados.

2. Procedimento de biópsia muscular (45 min-1 hr)

  1. Antes de recrutar participantes, obter autorização ético completo e aprovação processual (incluindo vacinas relevantes para experimentadores) de todos os órgãos sociais relevantes, comissões e serviços de saúde (por exemplo, ético, institucional, etc. governamental).
  2. Criar um campo estéril a em torno da perna (por exemplo, com lençóis cirúrgicos estéreis) umd limpe bem a área em torno do local da biópsia com um agente antibacteriano anti-séptico (clorexidina).
  3. Anestesiar o local da biópsia proposto na perna do voluntário por injeção local de lidocaína a 2% na região subcutânea que recobre a fáscia do músculo vasto lateral.
  4. Faça um ~ 5 milímetros incisão ampla usando uma lâmina cirúrgica estéril através da pele e fáscia e realizar o procedimento de biópsia por agulha Bergström 18 com sucção adicional.
  5. Utilizando uma pinça estéril remover o músculo do lúmen de agulhas e mergulhar em meio basal no gelo. Transportar o tecido para o laboratório para posterior processamento, logo que possível embora as células miogénicas viáveis ​​podem ser obtidas depois de períodos de 24 h ou mais.
  6. Discuta o assunto, limpar e selar o local da incisão com várias tiras de pele de fechamento adesivas estéreis e vestido de forma asséptica com uma cobertura impermeável exterior.

3. Isolando derivados de Muscle Precursor CeLLS (1 hr, 30 min)

  1. Remover o tubo contendo a amostra de músculo e pesá-lo (certificar-se de tubo é seca limpando-o com o tecido). Calcule o peso da amostra de músculo subtraindo o peso do tubo de amostra contendo o meio e do tubo contendo apenas meio de cultura.
  2. Agitar a solução várias vezes para lavar a amostra de sangue do músculo. Deixe o músculo sedimento à temperatura ambiente durante 30-60 seg.
    1. Remover quase todo o volume do meio do tubo, primeiro usando um auxiliar de pipetagem electrónico ou aspirador mas deixar aproximadamente 2-3 ml no tubo.
    2. Inverter o tubo sobre a placa de petri esterilizada permitindo que o fluido restante para transportar uma amostra do músculo para o prato; usar o bisturi estéril para extrair qualquer músculo remanescente fragments.Rotate o prato para mobilizar o líquido restante e removê-lo com uma pipette.Remove quaisquer pedaços visíveis de gordura ou de tecido conjuntivo.
  3. Para biópsias pesando 100-400 mg, adicionar 3 ml de warmsolução de enzima e utilizando bisturis esterilizados cortar a amostra de músculo em pedaços muito pequenos (<1-2 mm 3).
  4. Usando um grande furo de 25 ml pipeta elaborar a solução fragmentos musculares e enzima e transferir para um estéril 10 ml tubo cônico. Lave a placa de Petri com mais um 3-5 ml de solução de enzima colagenase e dispase e usando um menor de 10 ml pipeta recolher quaisquer fragmentos musculares restantes e colocar no tubo. O volume exacto não é crítica.
  5. Colocar o frasco dentro de uma incubadora a 37 ° C (ou banho de água) durante 60 minutos, com trituração (10 ml pipeta) a cada 15 min.
  6. Depois de 1 hr terminar dissociação enzimática por adição de um volume equivalente de meio de crescimento fresco pré-aquecido e passar a suspensão de células através de um filtro de 100 um para remover qualquer detrito grande myofibre. Centrifuga-se a solução filtrada a célula 657 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C).
  7. Ressuspender o sedimento de células em 5-7 ml de meio de crescimento e uma placa em T-25 não revestidobalão de cultura de tecidos. Transferir esta placa à incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 7 dias. Alterar o meio cada 48 horas. Nesta fase as células miogénicas são muito pequenas e arredondadas e difícil de discernir a partir de células não miogénicas.
    1. Na primeira mudança de meio, centrifugar o sobrenadante para sedimentar quaisquer células não aderentes. Re-suspender estes em meio fresco e re-plate.
  8. Após 7 dias em cultura, garantir que a maioria das células miogénicas (e fibroblastos) ter anexado mas as células ainda não atingiram a confluência. Purifica-se os precursores e executar MACS miogénicos de acordo com um protocolo desenvolvido originalmente por nos laboratórios de Gherardi e Chazaud 19,20 e ainda modificado por nós 5.

4. Immunomagnetic Bead Seleção de células com base em CD56 Expression (1,5 h)

  1. Após 7 dias de enxágüe a monocamada de células (que normalmente contêm 50-60% de células miogênicas 5) com três trocasde solução tampão de fosfato temperatura ambiente (PBS) para remover quaisquer restantes células não aderentes e os restos do isolamento.
    1. Trypinize as células (0,04% de tripsina em PBS livre de Ca 2+ com 0,73 mM de EDTA), durante 3 minutos. Uma vez que as células têm destacado, adicione 5-10 ml de meio de crescimento do músculo esquelético para evitar o excesso de digestão. Agregar as células por centrifugação a 657 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente (20-25 ° C) e ressuspender em um volume apropriado de meio completo para a contagem.
    2. Contagem de uma pequena amostra da suspensão celular usando o método desejado (por exemplo, utilizando um hemocitómetro ou um dispositivo de contagem automatizada) e calcular o número inicial de células e viabilidade.
  2. Placa de alguns poços em uma placa de 96 poços (ou maior navio se necessário) para immunocytochemical ou fluxo caracterização baseada citometria da população antes de triagem (fibroblastos e células miogênicas serão os mais abundantes tipos presentes células).
  3. Para o anúncio suspensão de célulasD 15 ml de PBS estéril para diluir as células e meio. Centrifugar novamente as células e ressuspender-los em 170 ul de tampão de triagem temperatura ambiente (1% de BSA numa solução de lavagem MACS, esterilizado por meio de passagem através de um filtro de 0,22 nm).
    1. Adicionar 35 ul de microesferas magnéticas bem misturadas conjugados a um anticorpo primário CD56 (clone AF12-7H3, 130-050-401) para a solução de células, pipeta para misturar e deixa-se incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação suave no meio ponto.
  4. Após a incubação, dilui-se a solução da célula e pérola com 10 ml de tampão e centrifuga-se MACS triagem em 657 xg durante 6 minutos. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de triagem.
  5. Adicionar o separador MACs (ímã) para os MACS segurando estande. Tome cuidado ao adicionar ímã para o suporte devido ao forte campo magnético. Slot na coluna e montar o filtro de pré-separação. Pipetar 1 mL de tampão de triagem por meio do filtro de pré-coluna de separação e para a lubrificação.
  6. Immédiately após este, misturar suavemente a suspensão de células e de todo o gotejamento de 1 ml através de um filtro de pré-separação e para dentro da coluna.
  7. Lava-se a coluna três vezes com 1 ml (ou 500 ul) de tampão de triagem. Recolher as células não-retido que passam através da coluna no primeiro tipo num tubo cónico de 50 ml estéril contendo uma pequena quantidade de meio de crescimento. Essas células são a primeira espécie CD56 - Fração e será altamente enriquecido para fibroblastos de tecido conjuntivo. Não deixe a coluna secar entre as lavagens.
  8. Após lavagens a remover o filtro de pré-separação e adicionar 2,5 ml de tampão à coluna MACS. Em seguida, remover imediatamente a coluna do magnete e recolhem o primeiro tipo CD56 + fracção num tubo cónico de 50 ml separado por compressão do êmbolo para o topo da coluna.
    NOTA: O êmbolo se encaixa muito firmemente na parte superior da coluna e pode ser bastante complicado para operar; no entanto, isso deve ser feito enquanto a coluna ainda é full de tampão, de modo que é necessária velocidade. Evite pressionar o êmbolo muito duro e rápido.
  9. Antes de avaliar a viabilidade do plaqueamento das células, utilizando, por exemplo, o ensaio de azul de tripano. Determine a porcentagem de células viáveis ​​a partir de campos de 8 x 1 mm 2 de contagem (ambas as câmaras do hemocitômetro).
    NOTA: As células podem ser simples ou dupla classificados dependendo da pureza requerida. Se feito com cuidado essas células tolerar o procedimento duplo de classificação muito bem e viabilidade é muito alto> 95%. Para dupla classificação, configurar outra coluna, lubrifique com 1 ml de classificação de tampão e prossiga a partir do passo 4.6.
    1. Se imagem é para ser realizado, células da placa diretamente em lamelas de vidro situadas em placas de 24 poços 21 e revestidos com sua escolha de molécula de ECM para a fixação das células (por exemplo, colágeno ou laminina). Aqui, utilizar 0,1-0,5 mg / ml de colagénio-I (quadro 3).

5. Seleção de Humum derivado do músculo fibroblastos imediatamente depois do isolamento.

  1. Para purificar fibroblastos progenitores imediatamente após o isolamento, empregar o protocolo tal como acima com as seguintes modificações:
    1. Imediatamente após Suspenda as células de isolamento em meio completo e filtro uma vez que um filtro mm célula 100 e, em seguida, novamente através de uma peneira de 40 mm. Adicionar 5 ml de PBS e girar em 657 g durante 6 min.
    2. Ressuspender as células em tampão de triagem MACS e incubar em fibroblastos microesferas anti-humanos durante 15-30 min à temperatura ambiente.
    3. Utilize a coluna LS e o separador Midi-MACS (Tabela 3) e instalar o filtro de pré-separação de 40 mm.
    4. Executar um ou dois tipos, dependendo da pureza requerida, transferência das células, logo que possível, em meio contendo soro, realizar uma contagem, e a placa a uma densidade desejada

6. Immunocytochemical coloração (1 dia e durante a noite).

  1. Fixarcélulas nas suas cavidades por adição de um volume igual de 8% de paraformaldeído em PBS arrefecido em gelo durante 10 min com agitação suave. Após 10 min aspirado fixador e lava-se duas vezes com PBS.
  2. Para imunocoloração antigénios da superfície celular, as células de bloco para pelo menos 1 h, em 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e em seguida sondar com os anticorpos primários relevantes (Tabela 4).
    1. Para antigénios intracelulares, permeabilizar as células após a fixação por adição de 0,2% de Triton X-100 em PBS com BSA a 1% e NaN3 (0,01%) durante 10 min, então o bloco e incubar com anticorpos primários. Executar todas as incubações do anticorpo primário durante a noite à temperatura ambiente (ou a 4 ° C), com agitação suave, numa plataforma oscilante.
  3. Remover o anticorpo primário não ligado e lave as células três vezes com PBS frio. Incubar durante 1 hora de incubação com anticorpos secundários fluorescentemente marcado específicos de espécie (Tabela 4) à temperatura ambiente.
  4. Após a remoção doanticorpos secundários não ligados, lavar as células com três trocas de PBS e, em seguida, contracoloração com o corante de ADN fluorescente Hoechst 33342 (1 ug / ml) solução durante 10 minutos numa plataforma oscilante.
  5. Para a visualização simultânea de ambos os antigénios da superfície das células e antigénios intracelulares, células primeira sonda com anticorpos primários para os antigénios de superfície celular seguidos pelos respectivos anticorpos secundários apropriados. Em seguida, re-fixar as células frio PFA, permeabilizar, bloco e incubar com anticorpos primários contra antígenos citoplasmáticos ou nucleares seguidos pelos seus anticorpos secundários apropriados.
  6. Após a coloração, remover lamelas das suas cavidades, utilizando pinças curvas e enxaguar a parte de trás da lamela utilizando água destilada. Coloque o celular lamela deslize para baixo em uma gota de montagem médio 22 set em uma lâmina de vidro anti-fade.

7. Oil Red O Coloração por imunofluorescência em combinação com coloração de células (2 h)

  1. Revelaro teor de lípidos de células plaqueadas em placas de 24 poços através de coloração com Vermelho de Óleo O (1 - ([4- (Xylylazo) xilil] azo) -2-naftol) 5,23. Em primeiro lugar preparar uma solução de estoque de 0,5% (w / v) de Oil Red O dissolvendo 500 mg de Oil Red O, em 60 ml de 99% de trietil-fosfato e 40 ml de água destilada. Manter esta solução à temperatura ambiente no escuro até ser utilizado.
  2. No dia da utilização, fazer uma de 36% (w / v) de solução de trietil-fosfato de trabalho, contendo 12 ml de solução de estoque Oil Red O e 8 mL de água destilada. Filtrar esta solução através do número de papel de filtro 42 para remover todos cristalizada Oil Red O (o que prejudica a qualidade da imagem).
  3. Aquecer suavemente esta solução de trabalho em um banho de água durante 1 hora, após o que a solução é centrifugada a 1.200 x g durante 6 min. Remover o sobrenadante e filtra-se novamente através de papel de filtro (número 42) e transferência para um tubo de 20 ml fresco.
  4. Depois de células foram fixadas, permeabilizadas e imunocorados, remova o PBS e adicionar 500 mL de Oil Red O / Triethyl-fossolução phate aos poços para 60 min. Triton-X na concentração utilizada aqui para permeabilização da membrana celular não afeta o teor lipídico celular 23.
    NOTA: Oil Red O é excitado por comprimentos de onda entre 540 e 580 nm e, consequentemente, o filtro de Texas-vermelho pode ser usado para detectar Oil Red O emissão em microscopia de fluorescência 23. Note-se que a emissão de fluorescência de Oil Red O ocasionalmente pode vazar para o canal vermelho distante, se as células são muito fortemente coradas (conteúdo ou seja, muito rica em gordura).
  5. Após a incubação, remover o excesso de Oil Red O e lavar as células cinco vezes com 500 ul de PBS. Montar as lamelas como para immunostaining conforme descrito no capítulo 6. Detectar corante Oil Red O tanto por microscopia de contraste de brightfield / fase ou por microscopia de epifluorescência, utilizando o filtro Texas Red (shift livre, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).

8. A obtenção de micrografias de microscopia de fluorescência para posterior UmANÁLISE

NOTA: Certifique-se de que desliza para ser comparado quantitativamente estão manchadas com as mesmas soluções, fotografado em condições idênticas (por exemplo, exposição, configurações de câmera e de aquisição etc.) e capturado na mesma sessão de microscopia. Toda a formatação de pós-aquisição também devem ser idênticas e em estrita conformidade com as diretrizes sugeridas para imagens digitais 24.

  1. Para a aquisição de imagens (microscopia widefield), ligue a fonte de luz e microscópio de fluorescência e deixar para a quantidade recomendada de tempo para permitir que a fonte de luz de fluorescência para aquecer e se estabilizar.
  2. Ajustar a corrente de escuro para a câmera, bloqueando o caminho da luz para a câmera; adquirir uma imagem com resolução máxima e usar isso para corrigir imagens adquiridos posteriormente.
  3. Iluminar sondas de imunofluorescência por epifluorescência entregue por guias de luz líquidos (tubo flexível de fluoroplastic preenchido com óleo fenil silicone) and sinais visualizados através vermelho (conjunto de filtros de 45 HQ Texas desvio para o vermelho livre, verde (conjunto de filtros 44 FITC turno especial livre) e azul (conjunto de filtros filtros de passagem livre) banda de 49 turnos DAPI em um microscópio invertido epi-fluorescência (10X, 20X, 40X, planejar objetivos apocromáticas com 0,25, 0,75, 0,95 aberturas numéricas, respectivamente).
  4. Para evitar a saturação de pixel encontrar a exposição ideal dentro da gama linear do detector para cada marcador fluorescente usando o recurso "Superexposição" do software de aquisição de imagem. Anote a exposição padronizado para cada etiqueta fluorescente.
  5. Captura de canais individuais e salvar em tons de cinza ou tiff pseudocolored (image file format) arquivos de imagens em profundidade bit mais alto (de preferência de 16 bits - 65.536 valores de cinza) fornecida pelo dispositivo de gravação (por exemplo, arrefecido CCD (Charged Coupled Device) ajustada ao microscópio) . Defina a resolução de imagem de 1388 x 1040 ou superior. Certifique-se de incluir uma barra de escala ou objeto de di conhecidamensões na imagem.
  6. Sempre que possível salvar arquivos no formato de arquivo bit tag de imagem de 16 (.tiff) e não em formato .jpeg para evitar a perda de informações 25.
  7. Se houver quaisquer preocupações sobre a uniformidade de iluminação (software empacotado com microscópio pode ter correção automática para isso) dar uma imagem 'flat-field' de lamela sem células, mas manchado e montado da mesma forma slides como experimentais; este pode ser utilizado para corrigir defeitos de iluminação após a aquisição em software de análise de imagem.
  8. Para a aquisição de imagens (microscopia confocal), otimizar o ganho de detector e potência do laser para cada experiência de imagem (evitar a saturação). Em geral, a fluorescência medida é proporcional ao nível de potência de laser. Defina o tamanho pinhole para '1 arejado' para alcançar melhor relação sinal-ruído (melhor resolução pode ser alcançado em 0,5 arejado para sinais particularmente fortes). Tome secções ópticas em patamares ao longo do eixo z através da formigacélulas ibody marcado e salvar uma projeção máxima de 16 bits para cada canal para análise de imagens.

9. Medidas de palco de fluorescente etiquetado fatores de transcrição nuclear Usando Processamento de Imagem e Análise de Software (5 min por campo de visão).

  1. Acesso a arquivos de imagem TIFF indivíduo e sobreposição correspondente canais clicando e arrastando uma imagem em outra. Cada canal irá aparecer como uma camada separada no painel de camadas.
  2. Selecione Clarear a partir do menu filtro para permitir camadas abaixo de ser visualizadas simultaneamente. Em alternativa, ajustar a opacidade das camadas superiores a 50%.
    NOTA: As imagens TIFF podem ser salvas com o 'lossless' Lempel-Ziv-Welch (LZW) de compressão de dados para diminuir os tamanhos dos arquivos sem perda de informação.
  3. Na janela de análise (Análise> Selecionar Pontos de Dados> Personalizado), selecione Análise e escolher as medidas necessárias (por exemplo, a densidade Integrado, densit dizery, circularidade, histograma, etc.). Descarte qualquer medições desnecessárias, desmarcando a caixa ao lado deles. Se a medição da área são necessários mm clique em Análise> Definir Escala de Medida. A ferramenta régua aparecerá automaticamente - traçar o comprimento da barra de escala e insira seu comprimento conhecido em micrômetros. O software irá então converter a medição da área em microns quadrados.
    NOTA: Se a análise do histograma é selecionada, quando as medições são registradas uma pasta adicional aparecerá (cuja localização pode ser escolhido) com 8 bits histogramas para cada área de seleção individual na micrografia, bem como o somatório de todas as seleções individuais (isto sempre aparece como Histograma-1 se várias seleções são feitas). Esta análise não pode ser executada pelo software no formato de 16 bits, mas é muito útil para a análise da distribuição de intensidades de pixel ao longo de um objecto de interesse.
  4. Para a análise da intensidade de fluorescência nuclear primeiro construir uma representante "Color Range Seleção Máscara '(CRSM) para Hoechst ou DNA manchado DAPI para definir a área nuclear. Uma vez que as imagens dos canais desejados são sobrepostas, apenas a camada canal Hoechst deve ser deixado à vista, garantindo o "ícone do olho 'adjacente a ela na guia camadas é selecionada e, em seguida, camada é realçado (fica azul), enquanto que todas as outras camadas deve ser desmarcada. Certifique-se que a lista suspensa de mistura é definido de volta para 'Normal' no separador camadas.
  5. Abra a caixa de diálogo Color Range (Select> Color Range) e defina a opção suspensa seleção para "cores incluídos na amostra. Com a visualização da seleção definida como 'máscara rápida' (fundo vermelho) selecionar todos os tons de azul da cor dentro dos núcleos, segurando a tecla shift (sinal '+' aparece) e clicando dentro dos núcleos usando a ferramenta conta-gotas que aparece.
    1. Se os tons indesejados são selecionados, removê-los com a tecla Alt ('─'sign aparece) e clicando emem cima delas. Manter a escala imprecisão em zero para que os tons de cor única selecionados manualmente são incluídos na mensuração e "clusters de cor localizadas 'deve ser deixada em branco.
  6. Salve esta CRSM no disco rígido do computador como um programa específico (.AXT) arquivo de extração. Com outro campo aleatório de núcleos, carga, atualizar e salvar o CRSM (Select, Color Range, Load). Faça isso por pelo menos cinco campos aleatórios para garantir que as seleções nucleares são representativos.
    1. Use uma versão colorida de uma imagem em tons de cinza para a criação de uma máscara para isolar recursos, pois o olho humano é mais capaz de discriminar entre diferentes tons de cor do que entre vários tons de cinza 26.
  7. Use a CRSM nuclear para segmentar regiões nucleares para a coloração. Uma vez que os núcleos foram selecionadas Clique na imagem> Adjustment> Threshold e mova o controle deslizante totalmente para a direita, de modo que os núcleos ficar preta. Alternativamente,clique com botão direito e selecione "Fill", em seguida, escolha a opção 'Encha a: black'. Em seguida, clique em Select> Inverse e agora pressione Delete para remover todo o fundo (se a opção aparece escolher 'encher a: White'). Este binarizes essencialmente a imagem com base na sua seleção. Em seguida, carregar o plugin divisor de águas a partir da guia filtros para separar sobrepostas núcleos (Filter> imagem binária> separação característica de Bacias Hidrográficas).
    1. Se muitos núcleos são fortemente sobreposição, remova os núcleos de análise, desmarcando-los (Segure a tecla Alt e vagamente chamar ao seu redor com a ferramenta laço).
  8. Na camada nuclear agora binário, vá em Select> Color Range e> Sombras, para selecionar os núcleos individuais. Segure shift Alternativa e clique em qualquer um núcleo negro. Todos os núcleos irá imediatamente ser seleccionado. Em seguida, transfira esta seleção para a camada que contém fator de transcrição nuclear coloração (por exemplo, miogenina) selecionando a camada e desmarcando tudooutras camadas. Linhas de marcha irá agora mostrar a posição dos núcleos no canal miogenina.
  9. Se trabalhar com imagens pseudocolored só clicar na paleta Canais (à direita da guia camadas) e selecione apenas o canal verde (a imagem aparecerá agora cinza). Em seguida, clique em Imagem> Modo> Tons de Cinza. Um aviso aparecerá 'achatar as camadas visíveis e descartar as camadas ocultas' clique em OK, em seguida, um outro aviso vai dizer 'descartar outros canais' clique em OK novamente. Apenas uma única camada de tons de cinza selecionado núcleos será agora presente na paleta de camadas.
    1. Clique Medidas registro no Registro de Medidas para a obtenção de dados para os núcleos selecionados. Se a camada a ser analisado (coloração por exemplo miogenina) já é uma imagem crua 16 bit em tons de cinza, em seguida, basta pressionar Medidas Record.
    2. Exportação medições selecionadas como um arquivo txt para o local de sua escolha. Estes, então, podem continuar a ser processados ​​e analisados ​​em outro software de manipulação de dados packages
      NOTA: O comando Editar> step (press todos Alt, Ctrl e teclas Z simultaneamente) restaura todas as camadas anteriores, se necessário.
    3. Correta para não fundo específico de fluorescência 27 para que os resultados sejam quantitativa e comparáveis ​​como medições de intensidade de fluorescência são sempre uma mistura de sinal e de fundo.
      1. Selecione a ferramenta de seleção quadrado e verificar "tamanho fixo" escolher 20 por 20 pixels (ou maior, se desejar e, dependendo da confluência de células na imagem). Mantendo mudança selecionar dez ou mais áreas de fundo espalhados por todo o campo de visão. Prima 'Record' Medidas no Registro de Medidas.
      2. Calcule a densidade média integrada (soma de todos os valores de cinza de pixel) por pixel de todas as 10 regiões de fundo selecionada (dado como o "valor médio cinzenta" no registo de medição). Multiplique a média densidade de fundo por pixel pelo número de pixels no objeto alvo (
      3. Subtrair fluorescência de fundo dos objetos densidade integrada original para produzir o valor corrigido fundo final. Esta abordagem representa campo potencial para variação no campo de fundo não específico de fluorescência.
        NOTA: É de extrema importância para selecionar apenas as regiões de fundo de boa fé como esta correção tem um impacto considerável sobre os valores finais. Aproximar-se usando a lupa é recomendado ao fazer seleções.
      4. Também pode ser útil para dividir o valor do fundo geral corrigido pela área do núcleo em pixels (mesmo que tomar significativo nível de cinzento / intensidade por núcleo) para minimizar qualquer influência potencial de sinal de fundo localizada nuclear que contribuem mais para a densidade integrada valor, com o aumento do tamanho nuclear (Figura 3C).

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Representative Results

As células miogénicas purificada e fibroblastos podem ser cultivadas em meio de diferenciação adipogênica durante três dias, seguidos de meio de nutrição adipogénica de qualquer lugar entre 7-30 dias, para avaliar o seu potencial para a adipogénese. Usando as populações de células purificadas, Oil Red O coloração em combinação com a imunomarcação para marcadores de linhagem adipog�icas e miog�icas mostrou que apenas a fracção de fibroblastos era capaz de diferenciação de adipócitos (Figura 2). A acumulação maciça de gordura pelos fibroblastos é visível a olho nu (painel A), e a sua transdiferenciação completo é mostrado pelo muito forte expressão de PPAR γ nucleares (Figura 2 os painéis B e C e a Figura 3). Até 15 dias de tratamento, estas células têm lançado qualquer restante TE-7 (a antígeno tecido conjuntivo) em seu substrato (painel D). Em contraste, as células miogênicas manter seu fenótipo normal incluindo expressão de desmina e miosina pesadacadeia (Figura 2 painéis E e F) e não upregulate PPARy nucleares (Figura 3C).

Um exemplo de análise quantitativa de um campo de células miogénicas desmina (+) é mostrado na Figura 3. O painel B mostra os campos analisados, e o painel A mostra a intensidade de fluorescência quantificada (após correcção de fundo). Este método demonstra claramente a variação da expressão miogenina em núcleos individuais neste momento densidade de sementeira e de tempo específico. A Figura 3C demonstra a utilidade do método para comparar directamente os níveis do factor de transcrição em diferentes tipos de células em um nível de célula-por-célula. Aqui mostramos que CD56 - fibroblastos musculares expressam um alto nível dos adipog�icas PPARy factor de transcrição enquanto que CD56 + células miogénicas classificados manter apenas níveis muito baixos após a exposição ao meio de indução de adipocitos.


Figura 1:. Populações de células purificadas Miogênicos e fibroblastos obtidos por separação imunomagnética talão (AB) Após uma semana de cultura classificados células miogénicas expressar a molécula de adesão celular na superfície celular CD56 (N-CAM) e o músculo específica intermédia de filamentos desmina. Nuclear ki-67 fornece evidências de que essas células estão se proliferando. A coloração da membrana, citoplasmática e componentes nucleares é descrito no protocolo passo 6.5. (CD) Myogenic células não expressam o marcador de fibroblastos TE-7. (E) Os fibroblastos derivadas de músculo humano expressar TE-7 e (F) a plaquetas transmembranar α -derived receptor de factor de crescimento (PDGFRα). As barras de escala são: (A) = 20 mm; (B, C e E) = 200 um; (D & F) 50 &# 181;. M Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: CD56 derivados do músculo humano - / TE-7 + CD56 + fibroblastos e / desmina + células miogênicas cultivadas em meio indutor de adipócito (AIM). (A) Os fibroblastos isolados por MACS diferenciam em adipócitos quando cultivadas em meio indutor de adipocitos (AIM) e esta pode ser facilmente visto pelo olho nu seguinte Oil Red O coloração. Células miogênicas não mostram evidência de diferenciação adipogênica após o mesmo período de tempo no AIM e mostrar muito limitado coloração Oil Red O. (B & C) Hfibroblastos derivadas de músculos uman altamente expressa o PPARy e CEBPα (não mostrado) após a cultura em AIM. (C) À medida que os fibroblastos se diferenciam em adipócitos que libertem restantes intracelular proteína da MEC que se forma uma rede densa em torno deles. (E) células Miogênica manter a sua miogénica morfologia e expressão de marcadores de linhagem, tais como desmina e (F) da cadeia pesada de miosina (MHC), um marcador de diferenciação miogénica terminal, e deixar de acumular lípidos. Barras de escala são: (B, D) = 200 mm (E, F) = 100 mm; (C) = 100 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Os dados da amostra obtida fr om imunomarcadas culturas, utilizando o método de análise de imagem descrito (Adobe Photoshop abordagem Extended). (A) Um lote de fluorescência célula-por-célula intensidade específico para o factor de transcrição nuclear miogenina muscular após 24 horas em meio de diferenciação sem soro. (B) micrografias representativas de desmina + / + miogenina precursores miog�icas humanos. As barras de escala são: (B) = 50 mm (C) PPARy intensidade de fluorescência em núcleos individuais de classificados CD56 + / desmina + populações miogénicos (CD56 +) e CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Collagen VI células + (CD56. -) após a cultura em meio de indução de adipocitos por 15 dias. Os valores da fluorescência foram normalizados para a área nuclear para contabilizar variações no tamanho nuclear entre os dois tipos de células. Barras pretas horizontais em (A) e (B) mostram a média.52049 / "target =" _ 52049fig3large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os componentes do meio Concentração Catálogo não. Fonte Commercial
Esquelético meio de crescimento muscular humana: C-23060 (Vem "pronto para usar" contendo todos os fatores listados)
O músculo esquelético meio basal - PromoCell
Soro Fetal de Vitelo 15% PromoCell (5%) e FCS ouro, PAA Laboratories (10%) - gato não. A15-151
Fetuina (bovina) 50 ug / ml PromoCell
Fator de crescimento epidérmico 10 ng / mL PromoCell
Factor de crescimento de fibroblastos básico (recombinante humana) 1 ng / mL PromoCell
Dexametasona 0,4 ug / ml PromoCell
A insulina (humana recombinante) 10 ug / ml PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Estreptomicina 100 ug / ml Sigma
L-Glutamina 292 ug / ml Sigma
Meio de diferenciação miogênica C-23260
O músculo esquelético meio basal - PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Estreptomicina 100 ug / ml </ Td> Sigma
Nota: PromoCell, Heidelberg, Alemanha; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Reino Unido

Tabela 1: Os componentes de meios de cultura celular e concentrações.

Composição do meio Concentração Catálogo não. Companhia
O meio de crescimento de pré-adipócitos C-27410 (pronto para uso)
Soro Fetal de Vitelo 0,05 ml / ml PromoCell
Crescimento Celular Endotelial suplemento 0.004 ml / ml PromoCell
O Factor de Crescimento Epidérmico (recombinante humana) 10 ng / mL PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Estreptomicina 100 ug / ml Sigma
Glutamina 292 ug / ml Sigma
D-biotina 8,0 ug / ml PromoCell
A insulina (humana recombinante) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexametasona 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 ug / ml PromoCell
L-tiroxina 9 ng / mL PromoCell
Ciglitazona 3 ug / ml PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 ug / ml Sigma
Glutamina 292 ug / ml Sigma
Meio de diferenciação de pré-adipócitos C-27436 (pronto para uso)
D-biotina 8,0 ug / ml PromoCell
A insulina (humana recombinante) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexametasona 400 ng / ml PromoCell
IBMX 44 ug / ml PromoCell
L-tiroxina 9 ng / mL PromoCell
Ciglitazona 3 ug / ml PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Streptomycin 100 ug / ml Sigma
Glutamina 292 ug / ml Sigma
Meio nutrição adipócitos C-27438 (pronto para uso)
D-biotina 8,0 ug / ml PromoCell
A insulina (humana recombinante) 0,5 ug / ml PromoCell
Dexametasona 400 ng / ml PromoCell
Penicilina 100 U / ml Sigma
Estreptomicina 100 ug / ml Sigma
Glutamina 292 ug / ml Sigma
Nota: PromoCell, Heidelberg, Alemanha; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Reino Unido

Tabela 2: Composição do meio de cultura celular adipogénica.

Nome de equipamentos / reagente Companhia Catálogo não. Comentários / descrição
Cultura celular Colagenase D Roche 11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Deve ser esterilizado por filtração antes do uso
Tripsina / EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 um filtro de células BD Biosciences 352360
Solução de colagénio (3 mg / ml em ácido acético a 0,1%) Sigma, Dorset, Reino Unido C8919
Minisart SRP15 filtro de seringa (0,2 mm) Músculo da coxa 17573ACK Politetrafluoretileno (PTFE) membrana
CD56 Microbeads humanos Miltenyi Biotech 130-050-401 Magnéticos de celular ativado Triagem (MACS)
Esteja ciente do prazo de validade limitado de microesferas
Microesferas anti-fibroblastos, humana Miltenyi Biotech 130-050-601
40 mm filtros pré-separação Miltenyi Biotech 130-041-407
Grandes Collumns Celulares Miltenyi Biotech 130-042-202 Estas colunas vêm com uma resistência de fluxo. Uso da resistência de fluxo não é necessário para obter as elevadas purezas miog�icas descritos aqui.
LS colunas Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMACS Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 Este separador encaixa na coluna de células grandes, mas não a coluna LS.
MidiMACS Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Deve ser esterilizado por filtração antes do uso
Oil Red O Sigma O0625 Coloração Lipid
Fosfato Triethyl Sigma 538728
Papel Whatman Sigma Z241121-1PAK No. 42, sem cinzas. Para preparar o filtro de dobrar o papel de filtro circular para fazer um círculo semi, em seguida, dobre o semi-círculo ao meio novamente para formar uma forma de cone. Montar o cone em um funil para filtragem.
Montagem
Prolongar Reagente Antifade Ouro Molecular Probes, Invitrogen P36930 Isto pode ser comprado com ou sem DAPI e não saciar a fluorescência inicial.
AxioVision Carl Zeiss Contato Zeiss Software de aquisição de imagem
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (comprado de Pugh Computadores) ADPH16982 * Software de análise de imagem

Tabela 3: Equipamentos e reagentes.

Nome / antigénio Espécies e do isotipo de anticorpo Nome Clone A diluição para uso Catálogo não.
Marcadores miogênicos:
CD56 (N-CAM) Rato mc IgG 1 MY-31 (1: 100) 347740 BD
Desmin Coelho IgG 1 mc D93F5 (XP) (1: 250) 5332S NEB
Miogenina Rato mc IgG 1 F5D (1:50) F5D DSHB
Miosina Cadeia Pesada Rato mc IgG2b, cadeia leve kappa MF20 (1: 200) MF20 DSHB
Fibroblast / conjuntivo
timarcadores ssue:
Fibroblastos humanos anti- Rato mc IgG 1 TE-7 (1: 100) CBL271 Millipore
PDGFRα Coelho mc IgG D13C6 (1: 500) 5241 NEB
Marcadores proliferativa:
Ki67 Coelho mc IgG SP6 (1: 200) MP-325-CRM1 MD
Adipog�ica
factores de transcrição:
PPAR Rato mc IgG 1 E8 (1:20) Sc-7273 Biotecnologia Santa Cruz
Key: mc: monoclonal,pc: policlonal, DSHB: estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank, Iowa EUA;
NEB: New England BioLabs, Reino Unido; MD: Menarini Diagnósticos, Reino Unido; BD: BD Bioscience, Reino Unido.

Tabela 4: Anticorpos primários.

</ Tr>
Antígeno Espécies e do isotipo de anticorpo Diluição Catálogo não. Companhia
Alexafluor488 De cabra anti-IgG de ratinho (H + L) 1: 1000 A-11001 MP
AlexaFluor 594 De cabra anti-IgG de ratinho (H + L) 1: 1000 A-11005 MP
AlexaFluor 594 De cabra anti-coelho IgG (H + L) 1: 1000 A-11012 MP
Key: H + L = leves e pesadas correntes; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley Reino Unido

Tabela 5: Anticorpos secundários.

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Discussion

Nós descrevemos um procedimento de triagem immunomagentic para o enriquecimento selectivo de precursores derivadas de músculos humanos a partir de pequenas amostras de material de biópsia do músculo. Esta técnica tem sido valiosa no nosso laboratório para superar a perda de culturas derivadas de músculos humanos para fibroblastos, mas também para a compreensão do comportamento exclusivo das populações distintas de células progenitoras derivadas de músculos. Uma vez que as células miogénicas purificados podem ser investigados por alterações na proteína e / ou expressão de genes, ou usados ​​para experiências a jusante.

Além disso a purificação de células que também detalhe um método rápido e simples de análise de regiões específicas de interesse em micrografias de microscopia de fluorescência. As imagens digitais de microscopia de fluorescência contém uma riqueza de informações para os biólogos celulares para extrair; na verdade pixels armazenar dados que não é necessariamente discerníveis para o olho humano. Com esta técnica, os dados quantitativos podem ser obtidos de uma grande quantidade de células individuais de uma população. Uma característica única de análise de imagem quando comparado com a citometria de fluxo é a capacidade de correlacionar as alterações na expressão da proteína com alterações na forma das interacções célula-célula orcell. Além disso, a capacidade de criar e salvar máscaras selecção optimizada e representativos permite medições rápidas, precisas e reprodutíveis a ser feita através de muitos campos de visão, reduzindo assim o potencial de viés usuário.

Purificação de células à base de MACS

Uma das vantagens deste método é que as células pode ser purificada com sucesso quer imediatamente após o seu isolamento ou após alguns dias em cultura (quando o rendimento será mais elevado).

Fundamentalmente, as células miogênicas não devem ser autorizados a se tornar confluentes antes da classificação porque este impede a sua passagem pela coluna, e vai reduzir a proporção de células de proliferação obtidos para uma maior expansão e experimentação.

t "> Dependendo da amostra de tecido inicial obtido, pode haver um grande número de eritrócitos não aderentes em cultura nesta fase. Métodos existem para selectivamente lisar eritrócitos, no entanto, para evitar qualquer estresse químico desnecessário às células derivadas do músculo esta passo é evitado. Nós não observada qualquer impacto negativo notável de eritrócitos na cultura inicial de células derivadas de músculos humanos, e estes eritrócitos são removidos por mudanças de meio, uma vez as células miogénicas anexar.

Outros métodos de separação celular, imediatamente antes da triagem (por exemplo, outras proteases suaves ou métodos baseados em EDTA) pode ser utilizado para as células em que a expressão do antigénio da superfície celular é baixa ou particularmente sensível para a digestão tríptica. A expressão de CD56 em células miogénicas humanos é forte e resistente a uma curta trypsinsation (quando ensaiadas com os anticorpos aqui descritos).

É importante que o tampão de triagem contém EDTA para inibir calcio-dependente adesão célula-célula; isto é crucial para a obtenção de (e manter) uma suspensão de uma única célula de triagem. Dependendo do número de células, a forma e os tamanhos a serem classificados, há uma opção a ser feita sobre a coluna de separação (ver Tabela 3).

Remover a coluna a partir do campo magnético para libertar células retidas pode ser complicado para assegurar que o tubo de recolha (mesmo se contornado) é colocado em um suporte posicionado muito perto da coluna para evitar a perda de células em trânsito.

Embora tenhamos descrito desta técnica para utilização com células primárias humanas a partir de músculo esquelético, este protocolo pode ser facilmente adaptada para outros tipos de células para o qual um marcador da superfície celular específico / única é conhecida. Outras vantagens incluem o facto de que todo o processo pode ser realizado no ambiente de trabalho estéril de uma câmara de fluxo laminar. Além disso, o procedimento é mais suave sobre MACS as células em comparação com FACS triagem por causa da baixaforças de corte e pode ser uma vantagem particular para células maiores. Os grânulos magnéticos utilizados são pequenos, não-tóxicos e biodegradáveis ​​em cultura. Com efeito, MACS foi aplicado com sucesso na purificação e estudo de uma série de outros tipos de células.

Uma limitação desta técnica é que MACS não pode facilmente ser realizada por vários marcadores em simultâneo. Além disso, a quantidade de marcador e do tamanho das células não pode ser determinado durante o processo de triagem, só depois.

Considerações para otimizar a aquisição e análise de imagem

O método de análise de imagem demonstrado aqui fornece uma ferramenta poderosa para elucidar as alterações no nível de expressão de proteínas numa base de célula-por-célula em grandes populações de células. Ao explorar as máscaras facilidade camadas e seleção em um pacote de software amplamente disponível, o experimentador pode objetivamente selecionar sinais fluorescentes diferentes em várias imagens, para permitirquantificação de características individuais, e qualquer número de componentes dentro deles. Temos utilizado com sucesso este método para quantificar e comparar diretamente a faixa de fator de transcrição expressão em diferentes populações de células expostas a um desafio adipogênica.

Cada canal de fluorescência (representando um marcador específico) pode ser mantido separado dos outros e ligados ou desligados, conforme necessário, o que é útil para experimentos imunomarcação multi-cor.

Um número de factores deve ser tido em consideração quando se tenta extrair dados quantitativos ou semi-quantitativos de microscopia de fluorescência 28. Atenção para estes irão permitir medições semi-quantitativa básicas a serem feitas. Muitas vezes, os pesquisadores pretendem usar um número de fluorocromos para rotular diferentes proteínas de interesse; de primordial importância é a capacidade de ser capazes de distinguir entre os espectros de emissão individual. Na maioria dos casos isso é conseguido por excitat selectivaião de apenas um fluorocromo ao mesmo tempo. No entanto, se os espectros de emissão e / ou de excitação se sobrepõem significativamente ou são inadequadamente filtrada então sangrar-through ou cross-talk pode comprometer a exatidão dos dados de imagem obtidos. Sangrar através é a passagem de emissão de fluorescência em uma detecção canal inadequado e é causada por uma sobreposição de espectros de emissão 29,30.

Alguns pontos a serem considerados são: a escolha fluorocromos que têm excitação bem separados e espectros de emissão, utilizando comprimentos de onda de excitação muito seletivos (como é alcançada por lasers em microscopia confocal), garantindo que os conjuntos de filtros de emissão são rigorosos o suficiente para excluir comprimentos de onda indesejados, e obter imagens multicolor sobre o mais longo (ou seja, o "mais vermelho") Comprimento de onda de emissão de pico corante primeiro a explicar o fato de que o espectro de absorção são geralmente desviada para comprimentos de onda mais curtos (azul claro), enquanto que os espectros de emissão pendem para mais Wavelengths (luz vermelha). Os espectros dos marcadores fluorescentes estão disponíveis em "Fluorescência Spectraviewer 'fornecida por Invitrogen.

A utilização de objectivos de alta qualidade é crucial para as imagens destinadas análise. A alta abertura numérica (> 1,3) é o melhor e ampliações devem ser adaptadas para a câmera em microscopia widefield. Na microscopia confocal de campo amplo e, a NA é crítico, como z-resolução melhora como uma função do quadrado da abertura numérica 29. Sempre que possível, fazer uso de lentes plano-apochromatic que serão corrigidos para ambas as aberrações esféricas e cromáticas 29. O uso de guias de luz líquido é altamente recomendável, pois reduzem iluminação irregular embaralhando a iluminação de origem para reduzir a coerência espacial e temporal anterior à sua entrada em microscópio objetivo 29.

É importante para evitar a saturação de imagens, como pixels saturados não pode ser adequadamente quantified devido ao recorte da informação no mais intenso nível de cinza valoriza 26.

Vários 'plugins' pode estar disponível para permitir que os procedimentos de correção de flat-field de realizada com relativa facilidade; por exemplo, o Dr. John C. Russ fez muitas delas estarão disponíveis gratuitamente (http://www.drjohnruss.com/download.html). Usando este plug-in a razão entre o brilho de cada pixel na micrografia experimental para o correspondente na imagem de referência é calculado e substitui o original. Os resultados são então dimensionado para preencher o intervalo de brilho da imagem. Como alternativa, a calculadora imagem de ImageJ é outro meio de correção para a iluminação desigual.

Para algumas análises de imagem, microscopia confocal pode ser o método de escolha, uma vez que impede fora de foco fluorescência de alcançar o detector 29. No entanto, esta abordagem pode demorar muito mais tempo do que a microscopia de fluorescência widefield, limitando o dormenteer de campos de vista individuais que podem ser obtidos em uma única sessão.

Recentemente, outros métodos têm sido relatados para o enriquecimento de células miogénicas do tecido muscular humano. Bareja 31 utilizada uma combinação de exaustão de MACS (para: CD11b, CD31, CD34 e CD45), seguido por FACS para a selecção positiva de CXCR4 + / CD56 + células miogénicas. No entanto, embora este procedimento foi capaz de gerar uma população miogénica altamente enriquecido, que é consideravelmente mais longa do que o método descrito aqui, contém muitos mais passos consecutivos e resulta em um rendimento mais baixo de células miogénicas purificadas inferiores por grama de tecido.

Em outro estudo recente, Castiglioni 32 isoladas células-associado myofibre de músculo fetal humano por FACS utilizando múltiplos marcadores e mostrou que CD34 - células / CD56 + / Pax7 + (células satélites arquetípicas) podem exibir osteogênico, bem como miogênica potenti linhagemal, mas em geral de acordo com o nosso trabalho não mostram potencial adipogênica. Estes autores também mostraram que CD34 + / Pax7 - células eram não-miogênica, mas foram capazes de diferenciação adipogênica e osteogênica. O enriquecimento de expressão CD90 (um marcador de fibroblastos musculares 33) na fracção CD34 + não miogénica sugere que uma grande percentagem destas células podem ter sido fibroblastos, que foram mostrados para ser a fonte principal de adipócitos em músculo esquelético humano adulto culturas (de referência 5 e Figura 2). Se fibroblastos derivadas de músculos também têm potencial osteogênico diferenciação justifica investigação adicional.

Ao contrário do método de Castiglioni 32, o nosso método requer apenas um anticorpo (em oposição a 7) para se obter elevados rendimentos reprodutivelmente de culturas de células miogénica puras e pode ser realizada rapidamente nas condições assépticas de uma câmara de fluxo laminar. Um outro metodológicos adotadosl diferença é que esses autores isolaram células diretamente do músculo dissociado e depois seguiu estes em cultura, enquanto que na maioria das vezes células de cultura para uma semana antes de classificar e cultivar. Nas nossas mãos este método é melhor tolerado pelas células. É importante notar que o tempo total em cultura é essencialmente equivalente entre as duas abordagens. Além disso, dado que o músculo esquelético fetal é submetido a hiperplasia e hipertrofia muscular crescimento 34, não é surpreendente que o rendimento dos precursores miog�icas é maior a partir de tecido de músculo fetal quando comparado ao músculo adulto

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 μm cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

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References

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Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

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