Abstract
Ремонт и восстановление скелетных мышц требуется действие сателлитных клеток, которые являются резидентом мышечные стволовые клетки. Они могут быть выделены из образцов биопсии мышц человек с использованием ферментативного расщепления и их миогенными свойств исследуемых в культуре. Количественно два основных прилипшие типы клеток, полученные из ферментативного пищеварения: (я) сателлитные клетки (называемые миогенные клетки или клетки предшественников мышечных волокон), которые были определены первоначально как CD56 +, а позже CD56 + / Desmin + клеток и (II) мышечно- полученные фибробласты, идентифицированные как CD56 - и TE-7 +. Фибробласты пролиферируют очень эффективно в культуре и в группах смешанных клеток эти клетки могут захватить миогенные клетки доминируют в культуре. Выделение и очистка из различных типов клеток из человеческой мышцы, таким образом, важным фактором методической при попытке исследовать врожденной поведение любой тип клеток в культуре. Здесь мы DESCRМБП систему сортировки, основанный на пологом ферментативного переваривания клеток с использованием коллагеназы и диспазу затем магнитного сортировка клеток (MACS), которая дает как высокую чистоту (> 95% миогенные клетки) и хороший урожай (~ 2,8 х 10 6 ± 8,87 х 10 5 клеток / г ткани после 7 дней в пробирке) для экспериментов в области культуры. Этот подход основан на инкубации смешанный мышц, полученных клеточной популяции с магнитных шариков микрошариков, конъюгированных с антителом против CD56, а затем прохождение клетки, хотя в магнитном поле. CD56 + клетки, связанные с микрошариков, сохраняются в области, тогда как CD56 - клетки проходят беспрепятственно через колонку. Клеточные суспензии из любой стадии процесса сортировки может быть высевали и культивировали. После данного вмешательства, морфологию клеток и экспрессию и локализацию белков, включая ядерные транскрипционные факторы могут быть количественно, используя Иммунофлуоресцентной маркировки специфическими антителами и изображение рrocessing и анализ пакета.
Introduction
Ремонт и восстановление скелетных мышц требуется действие спутниковых клеток 1, миогенные стволовых клеток 2,3. В естественных условиях эти клетки существуют в состоянии покоя обратимо, расположенной между сарколеммы и базальной пластинки каждого myofibre, но активируются к пролиферации, предохранитель и дифференцировать как мышечная ткань повреждена, ремонт и регенерируется 3. Спутниковые клетки могут быть выделены из молодых и пожилых человек мышечных биоптатов с использованием ферментативного расщепления 4 и их миогенными свойств может затем быть изучены в первичной культуре 5. Эффективность этого процесса изоляции в отношении как выхода и чистоты популяции клеток зависит от используемых методов и может меняться от образца к образцу. Два основных прилипшие типы клеток, полученные из ферментативного расщепления являются клетки-сателлиты (в настоящее время называются миогенные клетки или клетки предшественников мышечных волокон), которые были определены первоначально как CD56 + / Desmin клеток и муSCLE полученных фибробласты, идентифицированные как CD56 - и TE7 + клеток 5. Фибробласты имеют быстрый темп пролиферации и не подвергаются необратимому остановку роста и терминальной дифференцировки на межклеточных контактов как миогенных клеток; Таким образом, в смешанных популяциях, фибробласты могут захватить миогенные клетки доминируют в культуре.
Фибробласты часто рассматривается как раздражение для мышц биологов, однако, в настоящее время растет интерес к фибробластов клетки, достойных изучения в их собственном праве, в частности, как они были показаны иметь кооперативную роль миогенных клеток во время мышечной ремонта 6 , Выделение и очистка из различных типов клеток из человеческой мышцы, таким образом, важным фактором методической при попытке исследовать врожденной поведение обоих типов клеток в культуре. Флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) представляет собой способ, при котором клетки могут быть отсортированы для дальнейшего изучения и / или подсчитывали ианализируются. FACS, как было показано, чтобы надежно обогатить миогенные клетки человека, но выход клеток для последующей культуры до сих пор не была высокой 7. Учитывая ограниченный потенциал репликации соматических клеток, таких как сателлитных клеток, полученных из миогенных клеток и очень плохом пролиферации и дифференцировки, связанных со старением 4, более нежные подходы. Холост культуры мышечных волокон предложить другой, менее агрессивны, средства получения мышиных клетки-сателлиты по-прежнему проживают в их sublaminal нише и после их активации в культуре 8,9. Тем не менее, это часто не представляется возможным из человеческой мышечной биопсии материала (из-за волокна редко могут быть получены из сухожилия к сухожилия), что означает, что этот метод не может быть доступным для многих исследовательских лабораторий, заинтересованных в изучении мышечных клеток, полученных человека. Кроме того, единая методика только волокна обеспечивает очень ограниченное число клеток.
Здесь мы опишем систему сортировки, основанный на генTLE ферментативное расщепление клеток с использованием коллагеназы и диспазу в сопровождении двух последовательных раундов магнитного активированного сортировки клеток (MACS), которая дает как высокую чистоту (> 95% миогенные клетки) и выход (~ 2,8 х 10 6 ± 8,87 х 10 5 клеток / г ткани) для экспериментов в области культуры. CD56 считается золотым стандартом поверхностным маркером для идентификации клеток-сателлитов человека в месте 10 и в пробирке 11 и обеспечивает идеальный кандидат поверхностный маркер для крепления борта. При таком подходе CD56 антитела, конъюгированного с оксидом железа и полисахарида, содержащего суперпарамагнитные шарики связаны с клетками и пропускают через высокий градиент магнитного разделительной колонны клеток, помещенной в сильном магнитном поле 12,13. В разделительные колонны заполнены с матрицей ферромагнитных стали шерсти или железа сферах, которые служат, чтобы сосредоточиться силовых линий магнитного поля к их поверхности, генерирующих сильные градиенты магнитного поля (~ 4tesla) 14, В этих колонн даже несколько магнитных клетки притягиваются и адсорбируют на своей поверхности 14. Unbound (CD56 -) клетки проходят через колонку, тогда как CD56 + клетки, помеченные магнитных микросфер, сохраняются до удаления от магнитного поля 12,15.
Клеточные суспензии из любой стадии процесса сортировки можно покрыть при желаемой плотности для дальнейших экспериментов. После данного вмешательства клеточные компоненты могут быть определены с помощью иммуноцитохимии, отображаемого использованием широкого поля или конфокальной флуоресцентной микроскопии и количественный анализ с использованием подхода, анализа изображений, что позволяет быстро объективное измерение всех меченых клеток в той или иной образ. В нашей лаборатории мы использовали этот двоякий подход иммуномагнитный сортировки с последующим анализом изображений 16, чтобы продемонстрировать, что CD56 - фибробласты человека легко трансформироваться в адипоциты, в то время как миогенной клеткис спутниковой происхождения обладают высокой устойчивостью к этой адипогенной преобразования 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований, проведенных в нашей лаборатории все субъекты дали письменное информированное согласие на участие и все эксперименты были проведены с одобрения Национального комитета по этике Health Service UK (Комитет Лондоне этике исследований; ссылка: 10 / H0718 / 10) и в соответствии с Закон тканей человека и Хельсинкской декларации.
1. Начальная подготовка Перед мышечной биопсии (15 мин)
- Сделайте скелетную среду для роста мышц человека. Для градуированной стерильной 50 мл коническую пробирку добавляют 2,5 мл пищевых добавок смеси 10 мл фетальной телячьей сыворотки, антибиотики (пенициллин / стрептомицин) и глютамина к соответствующим конечных концентраций (таблица 1), а затем заполнить трубку до 50 мл скелетных мышц базальной средой.
- Поместите 15 мл скелетных мышц базальной среде в стерильные 20 мл коническую пробирку и взвешивают. После взвешивания Поместите эту пробирку на льду. Используйте это, чтобы получить образец мышцах человека.
- В другом 20 мл трубки подготовить 10 мл раствора фермента к коллагеназы D и диспаза II до конечной концентрации 2 мг / мл каждого растворением стокового аликвот этих ферментов в скелетной мышце базальной среде. Фильтр-стерилизовать этот раствор при пропускании его через фильтр 0,22 мкм. Поместите эту стерильную смесь ферментов в инкубаторе или водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы согреться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь ферментов немного мягче, чем трипсин и лучше сохраняет жизнеспособность клеток 17. - Отложите в чашку Петри и пару стерильных скальпелей.
2. биопсии мышц Порядок (45 мин-1 час)
- До набора участников, получить полную разрешение этического и процессуального одобрение (в том числе соответствующих прививок для экспериментаторов) от всех соответствующих руководящих органов, комитетов и медицинских работников (например, этические, институциональные, правительственные и т.д.).
- Создать стерильное поле вокруг ноги (например, стерильными хирургическими листов)бы тщательно очистите поверхность вокруг биопсии с антисептическим антибактериального агента (хлоргексидина).
- Анестезировать предлагаемый биопсии на ноге добровольца местной инъекции 2% лидокаина в подкожной области, лежащей фасции латеральной широкой мышцы.
- Сделайте ~ 5 мм широкий разрез, используя стерильные хирургические лезвия через кожу и фасции и выполнить процедуру биопсии Bergström иглы 18 с дополнительным всасывания.
- Использование стерильного пинцета удалите мышцы от иглы просвет и погрузиться в базальной среде на льду. Транспорт ткани в лабораторию для дальнейшей обработки, как только возможно, хотя жизнеспособные миогенные клетки могут быть получены после периода 24 ч или более.
- Проанализируйте эту тему, очистить и уплотнить место разреза с несколькими стерильными клейкими кожи закрытия полос и асептически платье с внешней гидроизоляционного покрытия.
3. Изоляция мышц, полученных прекурсорами Ceзаполняет (1 час, 30 мин)
- Снимите трубку, содержащую образец мышечной и взвесить его (убедитесь, что труба сухая, вытирая салфеткой). Рассчитать вес образца мышечной путем вычитания веса в пробирку, содержащую среду и образец из трубки, содержащей только среду.
- Вихревой решение несколько раз с целью промывки мышц образец крови. Пусть мышц осадок при комнатной температуре в течение 30-60 сек.
- Удалить практически весь объем среды из трубы, во-первых, используя электронный помощи пипетки или аспиратор, но оставить примерно 2-3 мл в трубке.
- Invert трубку на в стерильную чашку Петри, позволяющей оставшуюся жидкость нести образец мышц на блюдо; использовать стерильный скальпель, чтобы извлечь все оставшиеся мышцы fragments.Rotate блюдо для мобилизации оставшуюся жидкость и удалить его с pipette.Remove каких-либо видимых частей жира или соединительной ткани.
- Для биопсии весом 100-400 мг, добавить 3 мл теплойРаствор фермента и с использованием стерильных скальпелей сократить образец мышечной на очень мелкие кусочки (<1-2 мм 3).
- Использование широким отверстием 25 мл пипетки составить фрагменты мышц и ферментного раствора и перенести в стерильный 10 мл коническую трубку. Вымойте чашки Петри с дальнейшей 3-5 мл коллагеназы и диспазу ферментного раствора и с помощью меньшего пипетки 10 мл собирать все оставшиеся фрагменты мышц и место в трубе. Точный объем не является критическим.
- Поместите флакон в 37 ° C инкубатора (или на водяной бане) в течение 60 мин с растиранием (10 мл пипетки) каждые 15 мин.
- После 1 ч прекратить ферментативной диссоциации добавлением эквивалентного объема свежего подогретого ростовой среде и передать клеточной суспензии через 100 мкм фильтр для удаления больших myofibre мусора. Центрифуга отфильтрованный раствор клеток в 657 мкг в течение 6 мин при комнатной температуре (20-25 ° C).
- Ресуспендируют осадок клеток в 5-7 мл ростовой среды, и пластины в непокрытого Т-25тканевой культуры колбы. Передача этой пластины в инкубатор при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 7 дней. Изменить среду каждые 48 ч. На этом этапе миогенные клетки очень малы и округлые, и трудно отличить от не-миогенными клеток.
- На первой смены среды, центрифугировать супернатант для осаждения либо без прилипшие клетки. Повторное приостановить их в свежей среде и повторного пластины.
- После 7 дней в культуре, гарантировать, что большинство миогенными (и фибробластов) клетки придавали но клетки еще не достигли слияния. Очищают миогенные предшественников и выполнять MACS в соответствии с протоколом, первоначально разработанным в лабораториях Герарди и Chazaud 19,20 и далее модифицированной нами 5.
4. иммуномагнитного бисера Сортировка элементов на основе CD56 выражения (1,5 ч)
- После 7 дней полоскания клеточного монослоя (которые, как правило, будет содержать 50-60% миогенные клетки 5) с тремя биржамикомнатной температуры раствор фосфатного буфера (PBS) для удаления оставшихся без прилипшие клетки и мусор из изоляции.
- Trypinize клетки (0,04% трипсина в Ca 2+ -Free PBS с 0,73 мМ ЭДТА) в течение 3 минут. Как только клетки были отключены, добавить 5-10 мл скелетных среде роста мышц, чтобы предотвратить чрезмерное пищеварения. Гранул клетки центрифугированием при 657 х г в течение 6 мин при комнатной температуре (20-25 ° C) и ресуспендируют в соответствующем объеме полной среды для подсчета.
- Граф небольшой образец суспензии клеток с помощью нужный метод (например, с помощью гемоцитометра или автоматизированный подсчет устройство) и рассчитать стартовый номер клеток и жизнеспособность.
- Пластина несколько скважин в 96-луночный планшет (или больше судна, если это необходимо) на иммуноцитохимическое или проточной цитометрии основе характеристику населения до сортировки (фибробласты и миогенные клетки будут наиболее распространенными типами клеток, присутствующих).
- К клеточной суспензии с объявлениемD 15 мл стерильной PBS, чтобы разбавить клетки и среду. Центрифуга клетки снова и ресуспендируют их в 170 мкл буфера сортировки комнатной температуре (1% BSA в промывной раствор MACS, стерилизуют с помощью пропускания через фильтр 0,22 мкм).
- Добавить 35 мкл и смешанных магнитных микрогранул, конъюгированных с первичным антителом CD56 (клон AF12-7H3, 130-050-401) в раствор клеток, пипетки, чтобы перемешать и оставить для инкубации в течение 15 мин при 4 ° С при осторожном перемешивании в полпути.
- После инкубации разбавить клеток и шарик раствор с 10 мл MACS буфера и центрифуги сортировки по 657 мкг в течение 6 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл буфера сортировки.
- Добавить Маков сепаратор (магнит) к ПДК, имеющих позицию. Будьте осторожны при добавлении магнит на стойке из-за сильного магнитного поля. Гнездится в колонке и установите фильтр грубой очистки. Пипетка 1 мл буфера сортировки через фильтр грубой очистки и колонны для смазки.
- ImmediatEly после этого, осторожно перемешать клеточной суспензии и капать всю 1 мл через фильтр грубой очистки и в колонну.
- Вымойте колонку три раза 1 мл (или 500 мкл) буфера для сортировки. Сбор не-сохраняется клетки, которые проходят через колонку на первого рода в стерильной 50 мл коническую пробирку, содержащую небольшое количество питательной среды. Эти клетки являются сортировать CD56 - доля и будет высоко обогащенного для соединительной фибробластов ткани. Не позволяйте колонка высыхать между стирок.
- После промывки удалить фильтр грубой очистки и добавить 2,5 мл буфера MACS на колонку. Затем сразу же удалить столбец из магнита и собирать первого рода CD56 + фракции в отдельной 50 мл коническую пробирку при нажатии на поршень в верхней части колонны.
ПРИМЕЧАНИЕ: поршень подходит очень плотно в верхней части колонны и может быть довольно сложно работать; Однако, это должно быть сделано в то время как колонна по-прежнему Fлный буфера, так что скорость требуется. Избегайте нажатия поршень слишком сильно и быстро. - Перед металлизированный оценки жизнеспособности клеток с использованием, например, трипанового синего. Определить процент жизнеспособных клеток из 8 х 1 мм 2 подсчета полей (обеих палат гемоцитометре).
ПРИМЕЧАНИЕ: клетки могут быть либо одинарной или двойной сортируются в зависимости от чистоты требуется. Если все сделано аккуратно эти клетки переносят процедуру двойной сортировки очень хорошо и жизнеспособность очень высока> 95%. Для двойной сортировки, созданный еще один столбец, смазать 1 мл сортировки буфера и перейти с шага 4.6.- Если изображения должны быть выполнены, плиты клетки непосредственно на покровные стекла, расположенных в 24-луночные 21 и, покрытые ваш выбор ECM молекулы для прикрепления клеток (например, коллагена или ламинина). Здесь используют 0,1-0,5 мг / мл коллагена-I (таблица 3).
5. Сортировка HumН. Фибробласты мышц происходит сразу же после изоляции.
- Для очистки фибробластов клетки-предшественники сразу же после выделения используют протокол, как указано выше, со следующими изменениями:
- Сразу после выделения Ресуспендируют клеток в полной среде и фильтр один раз, хотя в мкм ячейки фильтра 100, а затем снова, хотя 40 мкм сито. Добавить 5 мл PBS и спина на 657 мкг в течение 6 мин.
- Ресуспендируют клеток в буфер MACS сортировки и инкубировать в фибробластов микрошарики против человека в течение 15-30 мин при комнатной температуре.
- Используйте столбец LS и Юг-MACS сепаратор (таблица 3) и установите предварительного разделения фильтра 40 мкм.
- Выполнение одного или двух видов в зависимости от требуемой чистоты, передавать клетки как можно быстрее в среде, содержащей сыворотку, выполнить подсчет, и пластины при желаемой плотности
6. Иммуноцитохимическая Окрашивание (1 день и на ночь).
- ФиксироватьКлетки в их скважин добавлением равного объема 8% параформальдегидом в ледяной PBS в течение 10 мин при осторожном перемешивании. После 10 мин аспирации фиксатора и мыть дважды PBS.
- Для immunostain антигены на поверхности клеток, блок клетки в течение по меньшей мере 1 ч в 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, а затем исследовать с соответствующими первичными антителами (таблица 4).
- Для внутриклеточных антигенов, проницаемыми клеток после фиксации добавлением 0,2% Тритон Х-100 в PBS с 1% BSA и NaN 3 (0,01%) в течение 10 мин, а затем блокируют и инкубируют с первичными антителами. Выполнение Все инкубации первичных антител в течение ночи при комнатной температуре (или при температуре 4 ° С) при осторожном перемешивании на качалке платформы.
- Удаления несвязанного первичного антитела и мыть клетки три раза холодным PBS. Инкубировать в течение 1 часа инкубации с видоспецифических флуоресцентно меченных вторичных антител (таблица 4), при комнатной температуре.
- После удалениянесвязанные вторичные антитела, клетки промойте с тремя обмена PBS, а затем контрастное с флуоресцентным красителем ДНК Hoechst 33342 (1 мкг / мл) раствора в течение 10 мин на качающейся платформе.
- Для одновременной визуализацией обеих антигенов клеточной поверхности и внутриклеточных антигенов, зонд клетки сначала с первичными антителами к клеточной поверхности антигены с последующим их соответствующими вторичными антителами. Далее, вновь зафиксировать клетки в холодной PFA, проницаемыми, блока и инкубировать с первичными антителами против цитоплазмы или ядерных антигенов с последующим их соответствующими вторичными антителами.
- После окрашивания, удалить покровные из своих скважин с использованием изогнутых щипцов и промойте спину покровного стекла с использованием дистиллированной воды. Положите покровное клеток, скользят вниз по капле анти-увядает монтажа среда 22 сет на предметное стекло микроскопа.
7. Масло Красный O Окрашивание в комбинации с иммунофлуоресцентного окрашивания клеток (2 ч)
- ПоказыватьСодержание липидов в клетках помещали в 24-луночные окрашиванием Oil Red О (1 - ([4- (Xylylazo) ксилил] азо) -2-нафтола) 5,23. Первый подготовки исходного раствора 0,5% (вес / объем) Масло Красный вывода растворением 500 мг Oil Red O в 60 мл 99% триэтил-фосфата и 40 мл дистиллированной воды. Поддерживать эту раствор при комнатной температуре в темноте до использования.
- В день применения, сделать 36% (вес / объем) триэтил-фосфат рабочего раствора, содержащего 12 мл исходного раствора масла красный O и 8 мл дистиллированной воды. Фильтр на этот раствор через бумажный фильтр числа 42, чтобы удалить все кристаллизованного масла Red O (что ухудшает качество изображения).
- Осторожно нагреть этот рабочий раствор на водяной бане в течение 1 ч, после чего раствор центрифугируют при 1200 х г в течение 6 мин. Удалить супернатант и фильтровать снова через фильтровальную бумагу (номер 42) и передачи в новую пробирку 20 мл.
- После клетки были исправлены, permeabilised и иммуноокрашиванию, удалите PBS и добавьте 500 мкл масла Red O / триэтил-фосФейт решение скважин в течение 60 мин. Triton-X в концентрации, используемой здесь клеточной мембраны permeabilisation не влияет сотовой содержание липидов 23.
Примечание: Масло Красный вывода возбуждается длинами волн между 540 и 580 нм и, следовательно, Техас Red фильтра может быть использован для обнаружения излучения масла красный O в флуоресцентной микроскопии 23. Обратите внимание, что флуоресцентное излучение от нефтяной Red О иногда может протекать в дальнего красного канала, если клетки очень сильно окрашенных (т.е. очень высокое содержание жира). - После инкубации удалить излишки масла Red O и промыть клеткам пять раз с 500 мкл PBS. Установите покровные, как и для иммунной окраски, как описано в разделе 6. Обнаружение нефти Red O красителя, как светлое / фазово-контрастной микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопии с использованием Texas Red фильтр (сдвиг бесплатно, экс BP 560/40, Б. FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. Получение микрофотографии от флуоресцентной микроскопии для последующего Анalysis
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слайды можно сравнить количественно окрашивают же растворов, сфотографировали в одинаковых условиях (например, воздействия, и настроек камеры на приобретение и т.д.) и захватил в той же сессии микроскопии. Все форматирование после приобретения должны быть идентичны и в строгом соответствии с предлагаемыми руководящими принципами для цифровых изображений 24.
- Для получения изображения (с широким полем зрения микроскопа), включите микроскопа и флуоресцентного источника света и оставьте на рекомендуемое количество времени, чтобы позволить источник света флуоресценции для прогрева и стабилизации.
- Установите темновой ток для камеры, блокируя путь света к камере; получить изображение при максимальном разрешении и использовать это, чтобы исправить впоследствии полученные изображения.
- Осветить иммунофлуоресцентном зондов с эпифлуоресцентной поставляемого жидких световодов (гибкий шланг из фторопласта, наполненный фенилметил силиконового масла) ай сигналы визуализируется через красный (набор фильтров 45 HQ Texas красное смещение бесплатно, зеленый (набор фильтров 44 FITC специальный сдвиг бесплатный) и голубой (набор фильтров 49 DAPI сдвига бесплатно) полосовые фильтры на перевернутом эпи-флуоресцентного микроскопа (10x, 20x, 40X, планировать апохроматические целей с 0,25, 0,75, 0,95 численных отверстий соответственно).
- Чтобы избежать насыщения пикселей найти оптимальное воздействие в пределах линейного диапазона детектора для каждого флуоресцентного маркера с помощью функции "передержки" программного обеспечения захвата изображений. Запишите стандартизированной воздействия для каждого флуоресцентной метки.
- Захват отдельных каналов и сохранить в оттенках серого или псевдоцветной TIFF (Tagged формат файла изображения) файлы изображений в глубины старший бит (предпочтительно 16 бит - 65536 серые значения), предоставляемые записывающего устройства (например, охлаждением ПЗС (прибор с зарядовой связью устройства) установлен на микроскоп) , Установите разрешение изображения на 1388 х 1040 или выше. Не забудьте включить в масштабную линейку или объект известными димерность в изображении.
- Где можно сохранять файлы в режиме 16 бит тегами формат файла изображения (.tiff), а не в формате .jpeg, чтобы предотвратить потерю информации 25.
- Если есть какие-либо опасения по поводу равномерности освещения (программное обеспечение в комплекте с микроскопом может иметь автоматическую коррекцию для этого) принять "плоского поля" образ покровного без клеток, но окрашенных и установлен таким же образом, как экспериментальные горки; это может быть использовано для коррекции освещения дефектов после приобретения в программное обеспечение для анализа изображений.
- Для получения изображения (конфокальной микроскопии), оптимизировать прибыль детектора и мощность лазера для каждого эксперимента томография (избежать насыщения). В общем, флуоресценции измеряли пропорциональна уровню мощности лазера. Установите обскуры размер "1 воздушный", чтобы достичь наилучшего соотношения сигнал-шум (улучшенная разрешение может быть достигнуто при 0,5 воздушном для особо сильных сигналов). Возьмите оптических срезов на разных уровнях по Z-оси, проходящей через муравьяibody-меченых клеток и сохранить 16 бит Максимальная проекцию для каждого канала для анализа изображений.
9. проведения измерений флуоресцентно меченных ядерных транскрипционных факторов в процессе обработки и анализа изображений программное обеспечение (5 мин на поле зрения).
- Доступ к файлам изображений индивидуальный TIFF и наложения соответствующих каналов, нажав и перетащив одно изображение в другое. Каждый канал появится в виде отдельного слоя в панели слоев.
- Выберите облегчить в меню фильтра, чтобы слои ниже, чтобы быть визуализированы одновременно. Также можно настроить прозрачность верхних слоев до 50%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Tiff изображения могут быть сохранены с "без потерь" Lempel-Ziv-Welch (LZW) сжатие данных для снижения размера файлов без потери информации. - В окне анализа (Analysis> выбрать данные Точки> Пользовательский), выберите Анализ и выберите измерений, необходимо (например, интегральная плотность, значит, DENSITу, округлости, гистограмма и т.п.). Откажитесь от любых ненужных измерений, сняв флажок рядом с ними. Если для измерения площади требуются мкм нажмите на анализ> Задать шкалу измерений. Инструмент правитель автоматически появится - проследить длину линейки, и введите его известной длины в микронах. Программное обеспечение будет конвертировать измерения площадей в квадратных микрон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран анализ гистограммы, когда измерения записываются появится дополнительная папка (расположение которых можно выбрать) с 8 битных гистограмм для каждого отдельного выделенной области в микрофотографии, а также сумма всех индивидуальных выборов (это всегда выступает как гистограмме 1, если несколько выбор сделан). Этот анализ не может быть выполнена с помощью программного обеспечения в битовом формате 16, но является очень полезным для изучения распределения интенсивностей пикселей по всей объекта интереса. - Для анализа интенсивности ядерной флуоресценции сначала построить представи'Color Range Selection Mask "тель (CRSM) для Hoechst или DAPI окрашенных ДНК, чтобы определить ядерной области. Как только нужные изображения каналов накладываются друг на друга, только канал слой Hoechst должны быть оставлены на виду, обеспечивая на иконке глаза "прилегающий к нему на вкладке слоев выбран, а затем слой выделен (синеет), в то время как все остальные слои должны быть снят. Убедитесь, что смешивание выпадающий снова устанавливается: "Normal" на вкладке слоев.
- Откройте диалоговое окно Color Range (Выделение> Цветовой диапазон) и установите параметр выбора выпадающее "выборочных цветов». С помощью ручки выбора просмотра установлен в 'быструю маску "(на красном фоне) выберите все синие цветовые тона в пределах ядер, удерживая клавишу переключения (появляется знак' + ') и нажав в ядрах с помощью глазной пипетки инструмент, который появляется.
- Если выбраны нежелательные тона, удалите их, нажав клавишу Alt ('появляется ─'sign) и нажавна них. Поддержание масштаб размытость при нулевом, так что только выбранные вручную цветовые тона включены в измерении и «Локализованные наборы цветов" следует остановить.
- Сохранить CRSM на жесткий диск компьютера в качестве-программа отдельного файла экстракт (.AXT файла). С другой случайного поля ядер, нагрузка, обновление и сохранить CRSM (Выбрать, Цветовой диапазон, нагрузка). Делайте это в течение по крайней мере пяти случайных полей, чтобы обеспечить ядерное выбор представляют.
- Используйте цветные версии изображения в градациях серого для создания маски для выделения функции, потому что человеческий глаз способен лучше различать различные оттенки цвета, чем между различными оттенками серого 26.
- Используйте ядерной CRSM сегментировать ядерных регионов для окрашивания. После того, как ядра были отобраны Нажмите на изображение> Adjustment> Threshold и переместите ползунок всю дорогу направо, так что ядра становятся черными. В качестве альтернативы,щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Fill 'выберите' Fill, чтобы: черный. Затем нажмите на Select> Inverse и теперь нажать на кнопку Удалить, чтобы удалить все фоновые (если появляется опция выбора 'заполнить на: White'). В сущности, это преобразует к двоичному виду изображения на основе вашего выбора. Затем загрузите плагин водораздел на вкладке фильтров, чтобы отделить перекрывающихся ядер (Filter> Binary Image> Водораздел разделения функция).
- Если многие ядра сильно перекрываются, удалить ядра из анализа, сняв их (удерживайте клавишу Alt и свободно рисовать вокруг них с лассо).
- На сейчас двоичной ядерного слоя, перейдите к Select> Color Range и> Тени для выбора отдельных ядер. Альтернативная сдвиг удержания и нажмите в пределах одного черного ядра. Будет немедленно выбраны все ядра. Затем перенесите этот выбор в слое, содержащем окрашивание ядерного фактора транскрипции (например, миогенин), выбрав этот слой и сняв вседругие слои. Походные линии теперь будут показывать положение ядер в миогенин канала.
- При работе с псевдоцветной изображений только нажать на палитре Channels (справа на вкладке Слои) и выберите только зеленый канал (в настоящее время изображение будет выглядеть серым). Затем нажмите на Image> Mode> Grayscale. Появится предупреждение "Свести видимые слои и отказаться от скрытых слоев" нажмите кнопку ОК, а затем еще одно предупреждение скажут: "отбросить другие каналы снова нажмите кнопку ОК. Только один слой в оттенках серого выбран ядер теперь будет присутствовать в палитре слоев.
- Нажмите Запись измерений в журнал замеров с целью получения данных для выбранных ядер. Если слой для анализа (например, миогенин окрашивание) уже сырой 16 бит черно-белое изображение, то просто нажмите Записать измерения.
- Экспорт выбранных измерений, TXT файл в место по вашему выбору. Они могут быть дополнительно обработаны и проанализированы в другой обработки данных программного обеспечения рackages
ПРИМЕЧАНИЕ: Edit> шаг назад команда (нажмите все Alt, Ctrl и Z одновременно клавиши) восстанавливает все предыдущие слои, если требуется. - Правильный код для неспецифической фоновой флуоресценции 27 Для того чтобы результаты количественного и сопоставимых измерений интенсивности флуоресценции всегда смесь сигнала и фона.
- Выберите квадратный инструмент выбора и проверить "фиксированный размер Выбрать 20 от 20 пикселей (или больше, если необходимо, и в зависимости от слияния клеток в изображении). Удерживая сдвиг отобрать десять или более фоновых зон, разбросанных по всему полю зрения. Нажмите 'Запись Измерения »в журнале измерений.
- Рассчитайте среднее интегральную плотность (сумма всех точек значений серого) на пиксель всех 10 выбранных фоновых участках (с учетом как «средней серой значение 'в журнале измерений). Умножить среднюю плотность фона на пиксель на число пикселей в целевом объекте (
- Вычитание фона флуоресценции от объектов оригинальное интегральной плотности с получением конечного фона скорректированное значение. Этот подход учитывает потенциальное поле для изменения поля в неспецифической фоновой флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно важно, чтобы выбрать только добросовестных фоновых участках, как эта поправка имеет значительное влияние на конечные значения. Увеличение с помощью лупы рекомендуется при принятии выбор.- Он также может быть полезно разделить общий фон скорректированное значение на площадь ядра в пикселях (так же, как принимать среднюю уровня серого / интенсивность на ядро), чтобы свести к минимуму любые потенциальные воздействия ядерного локализованной фонового сигнала, что будет способствовать более интегрированному плотности значение с увеличением размеров ядра (рис 3C).
- Вычитание фона флуоресценции от объектов оригинальное интегральной плотности с получением конечного фона скорректированное значение. Этот подход учитывает потенциальное поле для изменения поля в неспецифической фоновой флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Очищенные миогенные клетки и фибробласты могут культивироваться в адипогенной дифференциации среды в течение трех дней, после чего адипогенной питательной среде из любой точки между 7-30 дней, чтобы оценить их потенциал для адипогенеза. Используя населения очищенные клетки, Нефть Red O окрашивание в сочетании с иммуногистохимическое адипогенных и миогенных маркеров клона показало, что только фибробластов доля была способна адипогенной дифференциации (рис 2). Крупное накопление жира фибробластами видна невооруженным глазом (панель А), и их полное трансдифференцировка показано очень сильной экспрессии ядерного PPAR γ (рис 2 панели B & C и на рисунке 3). К 15-дневного курса лечения, эти клетки выпустили всю оставшуюся TE-7 (соединительная ткань антиген) на их подложке (панель D). В отличие от миогенные клетки сохраняют свою нормальную фенотип в том числе выражения десмина и миозина тяжелойцепь (рис 2 панели E & F) и не апрегулируются ядерных PPAR, (3С).
Пример количественного анализа в области миогенными клеток (десмин +) показана на фиг.3. Панель В показывает поле анализировали, и панель показывает количественное интенсивность флуоресценции (после коррекции фона). Этот метод наглядно показывает изменение миогенин выражения в отдельных ядер в этой удельной плотности и времени посева точки. 3С демонстрирует полезность метода напрямую сравнивать уровни факторов транскрипции в различных типах клеток по мобильному за ячейкой уровне. Здесь мы показываем, что CD56 - мышечные фибробласты выразить Высокий уровень адипогенных PPAR, транскрипционных факторов в то время как сортируются CD56 + миогенные клетки сохраняют только очень низкие уровни после воздействия адипоцитов индуцирующего Medium.
Рисунок 1:. Очищенные популяции миогенных клеток и фибробластов, полученных иммуномагнитной борта сортировки (AB) Через неделю в культуре сортируются миогенные клетки экспрессируют клеточной поверхности клеточной адгезии молекулы CD56 (N-CAM) и мышечной конкретных промежуточных десмин накаливания. Ядерная выражение Ki-67 обеспечивает доказательства того, что эти клетки разрастаются. Окрашивание мембраны, цитоплазматических и ядерных компонентов описано в стадии протокола 6,5. (CD) Миогенные клетки не экспрессируют маркер фибробластов TE-7. (E) Фибробласты, полученные из человеческих мышц выразить ТЕ-7 и (F) трансмембранный тромбоцитов -derived рецептора α фактор роста (PDGFRα). Scale бары: (A) = 20 мкм; (В, С и Е) = 200 мкм, (D & F) 50 &# 181; м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Human мышц происходит CD56 - / TE-7 + фибробласты и CD56 + / десмин + миогенные клетки, культивируемые в адипоцитов индуцирующего Medium (AIM). (A) Фибробласты выделенные MACS дифференцироваться в адипоциты при культивировании в среде адипоцитов индуцирующего (AIM) и это можно увидеть легко невооруженным глазом с последующим окрашиванием масляным красным O. Миогенные клетки не проявляют никаких признаков адипогенной дифференциации после тот же период времени в AIM и показывают очень ограниченное окрашивание масляным красным O. (B & C) HУмань мышечные полученных фибробласты высокой экспресс PPAR, и CEBPα (не показан) после того, как культуры в AIM. (С), как фибробласты дифференцироваться в адипоциты они высвобождают остальных внутриклеточной ECM белок, который образует плотную сеть вокруг них. (Е) Миогенный клеток поддерживать их Миогенный морфологии и экспрессии клона маркеров, таких как десмина и (F) тяжелой цепи миозина (МНС), маркера терминальной дифференцировки миогенного, и не накапливать липиды. Шкала бары: (B, D) = 200 мкм (E, F) = 100 мкм; (C) = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Примеры данные, полученные FR ом immunolabelled культур, используя метод анализа изображений, описанный (Adobe Photoshop Extended подход). (А) участок ячейка за ячейкой интенсивность флуоресценции для мышц специфического фактора транскрипции ядерного миогенин после 24 ч в бессывороточной среде для дифференцировки. (Б) Характерные микрофотографии десмина + / + миогенин миогенные предшественников человека. Scale бары: (B) = 50 мкм (С) PPAR, интенсивность флуоресценции в отдельных ядер из отсортированного CD56 + / Десмин + миогенными популяций (CD56 +) и CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Коллаген VI + клетки (CD56. -) после культивирования в адипоцитов индуцирующего среда для 15 дней. Значения флуоресценции нормализовали по ядерной области для учета изменений в ядерной размера между двумя типами клеток. Горизонтальные черные полосы в (А) и (В) показать среднее.52049 / 52049fig3large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Компоненты среды | Концентрация | Каталог нет. | Коммерческая источник |
| Человеческого скелета среднего роста мышц: | C-23060 (входит в "готов к использованию ', содержащий все факторы, перечисленные) | ||
| Скелетных мышц базальная среда | - | PromoCell | |
| Плода телячьей сыворотки | 15% | PromoCell (5%) и FCS Золото, ПАК лаборатории (10%) - категория нет. A15-151 | |
| Фетуина (бычий) | 50 мкг / мл | PromoCell | |
| Фактор эпидермального роста | 10 нг / мл | PromoCell | |
| Коэффициент Basic роста фибробластов (рекомбинантный человеческий) | 1 нг / мл | PromoCell | |
| Дексаметазон | 0,4 мкг / мл | PromoCell | |
| Инсулин (рекомбинантный человеческий) | 10 мкг / мл | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| Стрептомицин | 100 мкг / мл | Сигма | |
| L-Глютамин | 292 мкг / мл | Сигма | |
| Миогенный дифференциация среднего | C-23260 | ||
| Скелетных мышц базальная среда | - | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| Стрептомицин | 100 мкг / мл </ TD> | Сигма | |
| Примечание: PromoCell, Гейдельберг, Германия; Sigma-Aldrich Company Ltd, Дорсет, Великобритания | |||
Таблица 1: компоненты среды клеточной культуры и концентрации.
| Состав среды | Концентрация | Каталог нет. | Компания |
| Средний преадипоцитов роста | C-27410 (готов к использованию) | ||
| Плода телячьей сыворотки | 0,05 мл / мл | PromoCell | |
| Эндотелиальная дополнения рост клеток | 0,004 мл / мл | PromoCell | |
| Фактор эпидермального роста (рекомбинантный человеческий) | 10 нг / мл | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| Стрептомицин | 100 мкг / мл | Сигма | |
| Глутамин | 292 мкг / мл | Сигма | |
| D-биотин | 8,0 мкг / мл | PromoCell | |
| Инсулин (рекомбинантный человеческий) | 0,5 мкг / мл | PromoCell | |
| Дексаметазон | 400 нг / мл | PromoCell | |
| IBMX | 44 мкг / мл | PromoCell | |
| L-тироксин | 9 нг / мл | PromoCell | |
| Циглитазон | 3 мкг / мл | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| СтрептоMYCIN | 100 мкг / мл | Сигма | |
| Глутамин | 292 мкг / мл | Сигма | |
| Преадипоцитов дифференциация среднего | C-27436 (готов к использованию) | ||
| D-биотин | 8,0 мкг / мл | PromoCell | |
| Инсулин (рекомбинантный человеческий) | 0,5 мкг / мл | PromoCell | |
| Дексаметазон | 400 нг / мл | PromoCell | |
| IBMX | 44 мкг / мл | PromoCell | |
| L-тироксин | 9 нг / мл | PromoCell | |
| Циглитазон | 3 мкг / мл | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| Streptomycin | 100 мкг / мл | Сигма | |
| Глутамин | 292 мкг / мл | Сигма | |
| Adipocyte питательной среде | C-27438 (готов к использованию) | ||
| D-биотин | 8,0 мкг / мл | PromoCell | |
| Инсулин (рекомбинантный человеческий) | 0,5 мкг / мл | PromoCell | |
| Дексаметазон | 400 нг / мл | PromoCell | |
| Пенициллин | 100 ед / мл | Сигма | |
| Стрептомицин | 100 мкг / мл | Сигма | |
| Глутамин | 292 мкг / мл | Сигма | |
| Примечание: PromoCell, Гейдельберг, Германия; Sigma-Aldrich Company Ltd, Дорсет, Великобритания | |||
Таблица 2: Состав адипогенной клеточной культуральной среде.
| Название оборудования / реагента | Компания | Каталог нет. | Комментарии / описание |
| Клеточная культура | Коллагеназа D | Roche | 11088866001 |
| Диспазу II | Сигма | D4693-1G | Должен быть фильтр стерилизовать перед использованием |
| Трипсин / ЭДТА | (Gibco), Invitrogen | 15400-054 | |
| Фильтр 100 мкм клеток | BD Biosciences | 352360 | |
| Коллаген раствор (3 мг / мл в 0,1% уксусной кислоты) | Сигма, Дорсет, Великобритания | C8919 | |
| Minisart SRP15 шприц фильтр (0,2 мкм) | Портняжная мышца | 17573ACK | Фторопласт (PTFE) мембрана |
| CD56 человека Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Магнитные сортировка клеток (MACS) Будьте в курсе ограниченный срок годности микрогранул |
| Противовоспалительные фибробластов Microbeads, человек | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 мкм фильтры грубой очистки | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Большие Сотовые Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | Эти колонки поставляются с резистором потока. Использование резистора потока нет необходимости, чтобы получить высокие миогенные чистоты, описанные здесь. |
| LS колонки | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | Этот сепаратор масштабирует столбец большой клетке, но не столбец LS. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS многоклетевые | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Сигма | Должен быть фильтр стерилизовать перед использованием | |
| Нефть Red O | Сигма | O0625 | Окрашивание липидов |
| Триэтилфосфат | Сигма | 538728 | |
| Ватман | Сигма | Z241121-1PAK | № 42, Ashless. Чтобы подготовить фильтр сложить круглую фильтровальную бумагу, чтобы сделать полукруг, затем сложите полукруг в полтора раза, чтобы сформировать форму конуса. Установите конус в воронку для фильтрования. |
| Монтаж | |||
| Продлить Gold Antifade Реагент | Молекулярные зонды, Invitrogen | P36930 | Это может быть приобретен с или без DAPI и не погасить первоначальный флуоресценции. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Связаться с Zeiss | Изображение aquisition программное обеспечение |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (приобретенный у Пью компьютеров) | ADPH16982 * | Программное обеспечение для анализа изображений |
Таблица 3: Оборудование и реагенты.
| Имя / антиген | Антител видов и изотипа | Клон имя | Разведение для использования | Каталог нет. | |
| Миогенные маркеры: | |||||
| CD56 (N-CAM) | Мышь MC IgG 1 | MY-31 | (1: 100) | 347740 | BD |
| Desmin | Кролик MC IgG 1 | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | NEB |
| Миогенин | Мышь MC IgG 1 | F5D | (1:50) | F5D | DSHB |
| Тяжелой цепи миозина | Мышь MC IgG2b, легкой цепи каппа | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| Фибробластов / соединительная | |||||
| тиСГУП маркеры: | |||||
| Анти-фибробластов человека | Мышь MC IgG 1 | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRα | Кролик MC IgG | D13C6 | (1: 500) | 5241 | NEB |
| Пролиферативные маркеры: | |||||
| Ki67 | Кролик MC IgG | SP6 | (1: 200) | MP-325-Crm1 | Мэриленд |
| Adipogenic | |||||
| транскрипционные факторы: | |||||
| PPAR, | Мышь MC IgG 1 | E8 | (1:20) | Sc-7273 | Santa Cruz Biotechnology |
| Ключ: MC: моноклональные,шт: поликлональные, DSHB: Развивающее Исследования Hybridoma банк, Айова США; | |||||
| NEB: New England Biolabs, Великобритания; MD: А. МЕНАРИНИ Диагностика, Великобритания; BD: BD Bioscience, Великобритания. | |||||
Таблица 4: Первичные антитела.
| Антиген | Антител видов и изотипа | Разведение | Каталог нет. | Компания |
| Alexafluor488 | Антимышиного IgG (H + L) | 1: 1000 | -11001 | Член парламента |
| Alexafluor 594 | Антимышиного IgG (H + L) | 1: 1000 | -11005 | Член парламента |
| Alexafluor 594 | Козьих антител против кроличьего IgG (H + L) | 1: 1000 | -11012 | Член парламента | </ TR>
| Ключ: H + L = легкие и тяжелые цепи; MP: Молекулярные зонды, Invitrogen Life Technologies, Paisley Великобритания | ||||
Таблица 5: Вторичные антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали immunomagentic сортировки процедуру для селективного обогащения прекурсоров человеческие мышечные, полученных от небольших образцов биопсии мышц материала. Эта техника была неоценима в нашей лаборатории для преодоления потерь культур человеческие мышечные, полученных с фибробластами, но и для понимания уникальной поведение различных групп населения мышечных полученных клеток-предшественников. После очистки миогенные клетки могут быть исследованы на изменение белка и / или экспрессии гена, или использовать для последующих экспериментов.
В дополнение к очистке клеток мы также подробно быстрой и простой метод анализа конкретных регионах, представляющих интерес в микрофотографии от флуоресцентной микроскопии. Цифровые изображения из флуоресцентной микроскопии содержат огромное количество информации для клеточных биологов, чтобы извлечь; Действительно пикселей хранения данных, которые не обязательно различимы для человеческого глаза. С помощью этого метода количественные данные могут быть получены о большом количестве отдельных клеток в популяции. Уникальной особенностью анализа изображений при сравнении с проточной цитометрии является возможность сопоставить изменения в экспрессии белка с изменением формы клеток взаимодействий orcell-клеток. Кроме того, способность создавать и сохранять оптимальные и представительства маски выбор позволяет быстрые, точные и воспроизводимые измерения, чтобы быть во многих полях зрения, тем самым снижая потенциал для смещения пользователя.
MACS на основе очистки клеток
Одним из преимуществ этого метода является то, что клетки могут быть успешно очищают либо сразу после выделения или через несколько дней в культуре (при выход будет выше).
Важно отметить, что миогенные клетки не должно быть позволено стать сливной до сортировки, потому что это препятствует их прохождение через колонку, и сократить долю пролиферативных клеток, полученных для дальнейшего расширения и экспериментов.
T "> В зависимости от исходного образца ткани, полученной, может быть большое число неприлипающих эритроцитов в культуре на данном этапе. Методы существуют, чтобы избирательно лизируют эритроциты, однако, чтобы избежать ненужного химическому воздействию в клетках мышц, полученных этим шаг избегать. Мы не наблюдали заметное негативное влияние эритроцитов на ранней культуры мышечных клеток, полученных человека, и эти эритроциты удаляются смены носителя раз миогенные клетки приложить.Другие способы открепления клеток непосредственно перед сортировкой (например, другие мягкие протеазы или методы, основанные ЭДТА) могут быть использованы для клеток, в которых экспрессия антигена клеточной поверхности низкая или особенно чувствительны к трипсином переваривания. Выражение CD56 по миогенных клеток человека является сильным и устойчивым к короткому trypsinsation (при анализе с антител, описанных здесь).
Важно, чтобы сортировать буфер содержит ЭДТА ингибировать вычий-зависимую адгезию клетка-клетка; это очень важно для получения (и поддержание) в одной клеточной суспензии для сортировки. В зависимости от количества клеток, форма и размеры должны быть отсортированы, есть выбор, чтобы быть сделаны относительно ректификационной колонны (таблица 3).
Удаление столбца из магнитного поля, чтобы освободить сохраненные клетки может быть сложно, так гарантировать, что отборная труба (даже если юбкой) помещают в держатель, расположенный в непосредственной близости к колонке, чтобы избежать потери клеток в процессе транспортировки.
Хотя мы описали эту технику для использования с человека первичных клеток из скелетных мышц, этот протокол может быть легко адаптирована для других типов клеток, для которых конкретный / уникальный клеточной поверхности маркер известных. Другие преимущества включают в себя тот факт, что вся процедура может осуществляться в стерильной производственной среды в шкафу с ламинарным потоком. Кроме того, процедура MACS мягче на клетках по сравнению с FACS сортировки из-за низкойсдвиговые силы и может быть особое преимущество для больших клеток. Магнитные шарики, используемые малы, нетоксичным и биологическому разложению в культуре. Действительно, MACS был успешно применен для очистки и изучения ряда других типов клеток.
Одним из ограничений этого метода является то, что MACS не могут быть легко выполнены для нескольких маркеров одновременно. Кроме того, количество маркера и размера клеток не может быть установлена в процессе сортировки, только после этого.
Рекомендации по оптимизации сбора и анализа изображения
Метод анализа изображений показал, здесь представляет собой мощный инструмент для выяснения изменений в уровне экспрессии белков на клеточной за ячейкой основе в больших популяциях клеток. Эксплуатируя слои объекта и маски выбора в широко доступного программного пакета, экспериментатор может объективно выбрать различные сигналы флуоресцентные через несколько изображений, чтобыКоличественное определение индивидуальных особенностей, и любое число компонентов в них. Мы успешно использовали этот метод для количественного определения и непосредственно сравнить спектр выражения фактора транскрипции в различных клеточных популяций, подверженных к адипогенной вызов.
Каждый флуоресценции канал (представляющий собой специфический маркер), может быть отделена от других и включить или выключить по мере необходимости, что удобно для экспериментов многоцветных immunolabelling.
Ряд факторов необходимо принимать во внимание при попытке извлечь количественные и полу-количественные данные из флуоресцентной микроскопии 28. Внимание к этим позволит основные полуколичественного измерения должны быть сделаны. Часто исследователи хотят использовать ряд флуорохромов для обозначения различных белков, представляющих интерес; первостепенное значение имеет способность быть в состоянии различать отдельные спектры излучения. В большинстве случаев это достигается путем селективного excitatионов только одного флуорохромом одновременно. Однако, если спектры испускания и / или возбуждения значительно перекрываются или неадекватно фильтровали и затем проступание или перекрестные помехи могут повлиять на точность данных изображения, полученных. Кровотечение через это прохождение флуоресценции в неподходящем канала обнаружения и вызвано перекрытием спектров излучения 29,30.
Некоторые моменты, чтобы рассмотреть: выбор флуорохромии, которые имеют хорошо разделены возбуждения и спектры излучения, используя очень избирательно длин волн возбуждения (как это достигается лазеров в конфокальной микроскопии), обеспечение наборов фильтров выбросов достаточно жесткими, чтобы исключить нежелательные длины волн, а также выполнение многоцветный изображений на длинный (то есть, "самая красная ') пиковой длине волны краситель выбросов первым объяснить тот факт, что спектры поглощения, как правило, перекос в сторону более коротких длин волн (синий свет), тогда как спектры излучения смещены в сторону более Вавельengths (красный свет). Спектры флуоресцентных меток доступны в "флуоресценции Spectraviewer", представленной Invitrogen.
Использование задач высококачественных имеет решающее значение для изображений, предназначенных для анализа. Высокой числовой апертурой (> 1,3) является лучшим и увеличениях должны быть адаптированы к камере в широкопольными микроскопии. В обоих Widefield и конфокальной микроскопии, НС имеет решающее значение, так как Z-разрешение улучшает как функция числовой апертуры в квадрат 29. Где можно модель использование плана-апохроматический линз, которые будут исправлены в течение двух сферических и хроматических аберраций 29. Использование жидких световодов настоятельно рекомендуется, так как они уменьшают неравномерность освещения скремблирования освещение источник, чтобы уменьшить пространственную и временную когерентность до его вступления в объектив микроскопа 29.
Важно, чтобы избежать насыщенности изображения, как насыщенные пиксели не может быть должным образом quantifiред-за подрезки информации на наиболее интенсивной уровня серого значения 26.
Могут быть доступны для того, чтобы процедуры коррекции плоского поля, чтобы выполнены с относительной легкостью Различные "плагины"; например д-р Джон С. Расс сделал многие из этих доступен бесплатно в Интернете (http://www.drjohnruss.com/download.html). С помощью этого плагина соотношение яркости каждого пикселя в экспериментальной микрофотографии в соответствующей одной в опорном изображении рассчитывается и заменяет оригинал. Затем результаты масштабируются для заполнения диапазон яркости изображения. Кроме того, калькулятор образ ImageJ является еще одним способом корректировки неравномерного освещения.
Для некоторого анализа изображений, конфокальной микроскопии может быть методом выбора, так как предотвращает выход из фокус флуоресценции от достижения детектора 29. Тем не менее, этот подход может принимать, по существу, больше, чем Widefield флуоресцентной микроскопии, ограничивая онемениеэр отдельных полей зрения, которые могут быть получены в одном сеансе.
Недавно другие методы были зарегистрированы для обогащения миогенных клеток из мышечной ткани человека. Bareja 31 использовали комбинацию MACS истощения (для: CD11b, CD31, CD34 и CD45), а затем FACS для положительного отбора CXCR4 + / CD56 + миогенных клеток. Тем не менее, хотя эта процедура могла генерировать высоко обогащенного миогенный население, это значительно большего времени, чем в способе, подробно здесь, содержит много более последовательных этапов и приводит к снижению выхода очищенных миогенными клеток нижних на грамм ткани.
В другом недавнем исследовании, Кастильони 32 изолированные myofibre-ассоциированной клетки плода мышцах человека по FACS с использованием нескольких маркеров и показали, что CD34 - / CD56 + / Pax7 + клеток (архетипические сателлитных клеток) могут проявлять остеогенной а также миогенной клонов Potentiаль, но в целом согласен с нашей работой не показывают Adipogenic потенциал. Эти авторы также показали, что CD34 + / Pax7 - клетки, не миогенная, но были способны адипогенной и остеогенной дифференцировки. Обогащение CD90 выражения (маркера мышечных фибробластов 33) в CD34 + Non-миогенной фракции предположить, что большая часть этих клеток, возможно, были фибробласты, которые были показаны, чтобы быть основным источником адипоцитов взрослого человека скелетных мышц культуры (ссылка 5 и Рисунок 2). Если мышцы, полученных фибробласты также остеогенные дифференциация потенциальных требует дальнейшего исследования.
В отличие от метода Кастильони 32, наш метод требует только одного антитела (в отличие от 7) воспроизводимо получать высокие выходы чистых культур миогенного клеток и может быть быстро выполнена в асептических условиях в ламинарном боксе. Далее methodologicaл отличие состоит в том, что эти авторы изолированные клетки непосредственно из диссоциированного мышцы, а затем с последующим их в культуре, в то время как мы чаще всего культуры клеток в течение 1 недели перед сортировкой и культивирования. В наших руках этот подход лучше переносится клетками. Важно отметить, что общее время в культуре, по существу, эквивалентны между двумя подходами. Кроме того, учитывая, что плода скелетных мышц проходит гиперпластических и гипертрофических рост мышц 34 это не удивительно, что выход миогенных прекурсоров больше от плода мышечной ткани, чем взрослые мышцы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
