Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

خيارات نيون Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

الجمع بين RNA فلوري التهجين في الموقع (FISH) مع المناعي (المناعية FISH) في يخلق التقنية التي يمكن استخدامها على مستوى خلية واحدة للكشف عن ديناميات المكانية للتوطين RNA مع البصيرة في وقت واحد في توطين البروتينات أو تعديلات جينية وغيرها من التفاصيل والتي يمكن التي أبرزها المناعي. X-كروموسوم تعطيل هو نموذج لفترة طويلة غير المشفر RNA (lncRNA) بوساطة إسكات الجينات. -X غير نشط نص معين (Xist) تراكم lncRNA (وتسمى سحابة Xist) على واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث الثدييات هو خطوة حاسمة لبدء كروموسوم X-تعطيل. Xist RNA يتفاعل مباشرة أو غير مباشرة مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين ويقدم المناظر الطبيعية جينية مميزة لغير نشط X-كروموسوم (شي). واحد السمة المميزة جينية معروف من شي هي هيستون H3 ثلاثي ميثيل يسين 27 (H3K27me3) التعديل. هنا، نحن تصف المناعية FISH بسيطة وسريعةبروتوكول للكشف عن Xist RNA باستخدام RNA FISH مع تحقيقات قليل النوكليوتيد متعددة إلى جانب المناعي من H3K27me3 لدراسة توطين Xist RNA وتعديلات جينية المرتبطة بها. استخدام نتائج تحقيقات قليل النوكليوتيد في فترة حضانة أقصر والكشف عن أكثر حساسية من Xist RNA مقارنة في المختبر كتب تحقيقات RNA (riboprobes). يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لفهم ديناميات lncRNAs وما يرتبط بها من تعديله جينية، هيكل الكروماتين، والتنظيم النووية وتنظيم النسخي.

Introduction

الثدييات X-كروموسوم تعطيل (XCI) هو استراتيجية للتعويض عن الخلل في العاشر مرتبطة جرعة الجينات بين XX XY و، حيث واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث هو transcriptionally المعطل 1. X-كروموسوم تعطيل هو نظام نموذج رائع لفترة طويلة RNA غير المشفر (lncRNA) البحوث. وينظم X-كروموسوم تعطيل من قبل lncRNAs متعددة، وتمت دراسة على نطاق واسع على مدى العقود القليلة الماضية لكشف آليات الحديث المتبادل بين lncRNAs، النسخ، هيكل الكروماتين وتنظيم النووية 2 و 3.

مركز X تعطيل (XIC) تقع على الصبغي X-هو موضع الجيني معقدة تتألف من عدد من الجينات إنتاج الرنا غير الترميز 4. -X غير نشط نص معين (Xist) lncRNA في الثدييات eutherian هو واحد من هذا القبيل lncRNA التي تلعب دورا حاسما في كروموسوم X-تعطيل 5،6. النصوص Xist تحيط موقع فوالبنية شي لبدء كروموسوم X-تعطيل، وتبدو وكأنها سحابة عندما تصور باستخدام RNA FISH. ويشار إلى هذا التشكيل ب "Xist الغيمة" 7. منذ Xist RNA يتفاعل مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين، ويلاحظ شارك في توطين الغيوم Xist مع تعديلات جينية مختلفة لونين الصمت والنسخ القمعي خلال كروموسوم X-تعطيل 8. على سبيل المثال، يتفاعل Xist RNA مع polycomb مجمع القمعي 2 (PRC2) وهي المسؤولة عن H3K27me3 وتفضي إلى حالة لونين القمعية 9. وقوع سحابة Xist على زيان والتي تشترك في التعريب مع تعديل H3K27me3 المكثف يمثل المشهد المغاير الاختياري للشي 10،11.

وتأتي التقنيات الوراثية الخلوية، مثل DNA / RNA FISH شوطا طويلا من الطريقة التقليدية باستخدام تحقيقات radiolabelled 12 إلى التقنيات الحديثة والمتقدمة مع تعزيز الحساسية والتصوير الفلورسنت باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد متعددة 13،14. FISH DNA / RNA إلى جانب المناعي وقد استخدم بشكل روتيني كأداة الخلوي لفهم تنظيم الزمانية المكانية النووية، RNA الترجمة، وهيكل الكروماتين والتعديلات. إعداد التحقيق الأكثر القياسي لRNA FISH ينطوي على استخدام البلازميد أو البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) استنساخ ووضع العلامات لاحقا إما مع الترجمة نيك أو فتيلة العشوائي 15. ومع ذلك، ما يقرب من 70٪ من الجينات في الفئران و 40٪ من الجينات في البشر تظهر تداخل الحس والعقاقير النصوص 16، وبالتالي تتطلب طريقة FISH حبلا محددة من أجل التمييز الشعور والعقاقير النصوص. في المختبر تحقيقات RNA كتب (riboprobe ) غالبا ما تستخدم لحبلا محددة RNA FISH 17،18. ومع ذلك، وهذا ينطوي إعداد استنساخ البلازميد أو منتج PCR مع T7، SP6 أو T3 المروج وriboprobes تجميع. وعلاوة على ذلك، riboprobes المستمدة من genomجيم DNA أو كدنا] غالبا ما تحتوي على مناطق غير محددة والعناصر المتكررة، مما يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء في الخلفية. وثمة مسألة أخرى هي أن riboprobes، والتي هي بضع مئات من النيوكليوتيدات في الطول واحتواء fluorophores متعددة، لا يمكن أن تخترق بفاعلية في النواة. للتحايل على هذا، تم وضع عدة تحقيقات قليل النوكليوتيد أقصر المسمى مع fluorophore واحد في نهاية التي لديها حساسية جيدة، وقوة الإشارة موحدة، وسهولة تنقية ومعالجة 14. وبالإضافة إلى ذلك، [أليغنوكليوتيد DNA عادة ما تكون أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. طبقنا استراتيجية مماثلة باستخدام [أليغنوكليوتيد في Xist RNA FISH 19 مع المناعي لفهم ديناميات جينية من شي الناجمة عن Xist lncRNA خلال عملية كروموسوم X-تعطيل. يصف هذا البروتوكول خلق تحقيقات قليل النوكليوتيد والإعداد المناسب من الخلايا، وكذلك الاستفادة من RNA المناعي وFISH. Xist RNA FISH باستخدام oligonucle متعددةotides هو نهج فعال من حيث التكلفة في المدى الطويل إذا يتم تنفيذ Xist RNA FISH بشكل روتيني في مختبر واحد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد lncRNAs في الخلايا في حين رسم في وقت واحد شارك في التعريب مع تعديلات جينية أو عوامل. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هي القدرة على تعديله بسهولة لتناسب مصالح المرء البحوث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد التحقيق

  1. الحصول أليغنوكليوتيد] فريدة متعددة في Xist ([أليغنوكليوتيد 20-30 النوكليوتيدات طول، 63-65 درجة مئوية درجة حرارة انصهار، الجدول 1) مع تعديل 5'-الأمينية وتعليق في الماء.
  2. تجمع كميات متساوي المولية من [أليغنوكليوتيد مع 5'-الأمينية تعديل (إجمالي 4.5 ميكروغرام) وتسمية مع أمين رد الفعل صبغة الفلورسنت التالية تعليمات الشركة المصنعة.
    1. حل [أليغنوكليوتيد المجمعة في 5 ميكرولتر النهائية من nuclease خالية من المياه وإضافة 3 ميكرولتر من 1 M بيكربونات الصوديوم إلى حل قليل النوكليوتيد.
    2. إضافة 2 ميكرولتر DMSO إلى قارورة-أمين صبغ رد الفعل ودوامة لفترة وجيزة.
    3. مزيج الحل قليل النوكليوتيد مع صبغ رد الفعل في DMSO واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام.
  3. تنقية تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى من قبل العمود G-25 تليها هطول الأمطار الإيثانول.
    1. إضافة 40 ميكرولتر nuclease خالية من الماء إلى الخليط وضع العلامات وردت في الخطوة 1.2.3 وتنطبق على العمود G-25. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 2 دقيقة.
    2. إضافة 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء، و 10 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 250 ميكرولتر الإيثانول إلى التحقيق تنقيته من الخطوة 1.3.2. متجر في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 21،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. غسل أليغنوكليوتيد] عجلت مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 70٪.
    4. اعادة تعليق في 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء أو TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA) لتركيز النهائي من ما يقرب من 10 ميكرومتر.
  4. تمييع تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى إلى تركيز النهائي من 250 نانومتر مع العازلة التهجين (10٪ الفورماميد، 2X SSC [300 مم كلوريد الصوديوم، و 30 ملي سيترات الصوديوم]، 2 ملغ / مل BSA، و 10٪ كبريتات ديكستران).
    ملاحظة: مع هذا البروتوكول FISH سريع، قليل النوكليوتيد صتم تصميم الجلباب في Xist وتستخدم بتركيز أعلى من بروتوكول FISH العادي باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد من أجل تقصير فترة حضانة لالتهجين.

2. الانزلاق إعداد

ملاحظة: الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية FISH باستخدام الماوس الجذعية الجنينية (ES) أو هيئة مضغي الشكل (EB) التفريق خلايا 20 و 21 من قبل أي من تزايد بشكل مباشر على شريحة تعامل بولي يسين أو باستخدام cytospin مع التعليق الخلية. هنا، يظهر إعداد الشريحة التي cytospin.

  1. نضح مستنبت في صحن 6 جيدا. يغسل مع PBS (درجة حرارة الغرفة)، ونضح بدقة.
  2. إضافة 0.5 مل من التربسين إلى الطبق 6-جيدا، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C.
  3. إضافة 5 مل من المتوسط ​​وتفريق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة.
  5. تجاهل المتوسطة لد بتعليق بلطف الخلايا في 2 مل PBS.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وتمييع تعليق خلية في 4 × 10 5 خلية / مل من برنامج تلفزيوني.
  7. تجميع الشرائح، بطاقة مرشح وغرفة مع مقطع ووضعها في فتحات مناسبة في الدوار من cytospin. إضافة 250 ميكرولتر من كل عينة أعدت في الخطوة 2.6 في كل غرفة من وحدات تجميعها في cytospin. أجهزة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. ملء 3 الجرار coplin على الجليد مع 40 مل كل من الجليد الباردة PBS، CSK عازلة (10 أنابيب ملي، ودرجة الحموضة 6.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، 300 ملي السكروز، 3 ملي MgCl 2)، وعازلة CSKT (CSK عازلة مع 0.5٪ تريتون X-100)، على التوالي.
  9. بعد الانتهاء من cytospin، ونقل بسرعة الشريحة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة واحتضان لمدة 5 دقائق.
  10. نقل الشريحة إلى الجليد الباردة CSK العازلة واحتضان لمدة 1 دقيقة.
  11. نقل الشريحة إلى عازلة الجليد الباردة CSKT واحتضان لمدة 5 دقائق.
  12. نقل الشريحة مرة أخرى في الجليد الباردة CSK BUFفر واحتضان لمدة 1 دقيقة.
  13. نقل الشريحة إلى 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

3. المناعي

  1. ضع الشرائح في جرة coplin مع PBST (1X PBS مع 0.1٪ توين-20) لعدة ثوان.
  2. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة ووضعها في مربع الماصة طرف فارغة بالماء. تراكب الشريحة مع 40 ميكرولتر من عرقلة الحل (1X PBS، 1٪ BSA، 0.1٪ توين-20)، ضع بلطف ساترة، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة ساترة، وإزالة عرقلة الحل، وإضافة 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة هيستون H3K27me3 الأساسي المخفف لتركيز 1: 500 في عرقلة الحل. ضع ساترة مرة أخرى على الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إن المانع ريبونوكلياز في عرقلة الحل قد يكون من المفيد للحفاظ على الحمض النووي الريبي في هذا RNA FISH بروتوكول عندما تستخدم الأجسام المضادة.
  4. غسل الشريحة 2 مرات في الجرار coplin مليئة PBST، لمدة 5 دقائق لكل منهما، في حين هز بلطف الغسيل.
  5. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى المربع تلميح. تراكب مع 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) مخففة في عرقلة الحل، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام. للخطوات التالية، والحفاظ على الشريحة في الظلام في جميع الأوقات.
  6. غسل 2 مرات في coplin الجرار مع PBST كما في الخطوة 3.4.

4. RNA FISH مع قليل النوكليوتيد تحقيقات

  1. قبل الدافئة مربع الماصة طرف فارغة بالماء في الجزء السفلي لمنع الشرائح من الجفاف عند 37 درجة مئوية لمدة RNA FISH في الخطوة 4.3.
  2. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة من الخطوة 3.6 و ضع الشريحة في مربع الماصة طرف مع واتإيه في الأسفل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة FISH (10٪ الفورماميد في 2X SSC) على الشريحة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة FISH الحل غسيل، وإضافة 8 ميكرولتر من تحقيقات قليل النوكليوتيد على الشريحة ضع زلة تغطية، ونقل الشريحة إلى مربع الماصة طرف قبل تحسنت مع المياه في أسفل؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  4. ضع 3 الجرار coplin قبل تحسنت في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع غسل العازلة FISH، FISH غسل عازلة مع دابي، و2X SSC.
  5. بعد 1-2 ساعة الحضانة لRNA FISH، وطرح الشريحة في المخزن المؤقت قبل تحسنت غسل FISH.
  6. احتضان شريحة لبضع دقائق حتى تسقط ساترة الخروج من الشريحة.
  7. ضع الشريحة مرة أخرى في غسل العازلة، وتستمر الحضانة لمدة 5 دقائق.
  8. نقل الشريحة إلى جرة coplin آخر مع درجة حرارة ما قبل FISH غسل العازلة مع 0.5 نانوغرام / مل دابي واحتضان لمدة 5 دقائق.
  9. تحويل الشريحة إلى جرة coplin أخرى مع تدفئته قبل 2X SSC واحتضان لمدة 5 ميلن.
  10. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى مربع طرف الجاف. إضافة 4 ميكرولتر من antifade مع دابي على الشريحة ووضع ساترة.
  11. ختم ساترة مع طلاء الأظافر ومراقبة تحت المجهر. ويمكن تخزين الشريحة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة بضعة أشهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر الصور التمثيلية للسريع المناعية FISH في الشكل 1A. تم الكشف عن التعاون توطين Xist RNA السحابية وH3K27me3 إشارة على زيان في تمييز الخلايا الإناث. في اليوم 12 على التمايز، وكان أكثر من 90٪ من خلايا EB سحابة Xist (الشكل 1B). تحقيقات قليل النوكليوتيد قصيرة اخترقت بكفاءة في نوى، مما يؤدي إلى تصور المترجمة شارك ما يقرب من جميع H3K27me3 إشارات مع Xist RNA (الشكل 1C، 97٪، ن = 150).

الشكل (1)
الشكل 1: RNA Xist وH3K27me3 شارك في توطين على زيان في التفريق الماوس EB (A) المناعي FISH لXist RNA مع H3K27me3 تعديل في تمييز الخلايا EB الإناث في اليوم 12 على التمايز. وصفت تحقيقات Xist مع اليكسا فلور 488، ومكافحة H3K27me3 الأجسام المضادة الأولية تم إلغاءtected التي كتبها المضادة للماوس مفتش اليكسا فلور 555 الضد الثانوية مترافق. تم counterstained نوى مع دابي. ويضاعف من المنطقة محاصر في لوحات القاع. الحانات النطاق:... 10 ميكرون (B) تواتر Xist خلايا cloud- وH3K27me3 إيجابية في EB في اليوم 12 على التمايز (C) تردد من شارك في توطين Xist سحابة مع إشارة H3K27me3 في EB في اليوم 12 على التمايز الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تسلسل أليغنوكليوتيد] fluorescently المسمى لXist RNA FISH. تم توليفها ال 48 [أليغنوكليوتيد مع تعديل 5'-الأمينية لإعداد تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى لXist RNA FISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، قدمنا ​​سريع بروتوكول المناعية FISH أن يستغرق أقل من 5 ساعة لاستكمال إعداد الشرائح، Xist RNA FISH، والمناعي للH3K27me3. وبالمقارنة مع النهج المناعية FISH العام لXist RNA الكشف، الذي يحتاج عادة الحضانة بين عشية وضحاها RNA FISH، هذا البروتوكول ليس فقط يخفف كثيرا من الوقت الذي يقضيه ولكن أيضا يحسن حساسية المناعة FISH باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد.

منذ Xist وكتب غاية خلال كروموسوم X-تعطيل وجدت نسخة لتتراكم بشكل مكثف على زيان في رابطة الدول المستقلة، فمن السهل للكشف عن Xist RNA إشارة في التفريق وخلايا متباينة من قبل RNA FISH الاستفادة من فترة حضانة قصيرة نسبيا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول المناعية FISH للبروتينات أخرى من الفائدة وRNA وفيرة، وعلى الرغم من التحسين في المناعي وRNA FISH قد تكون مطلوبة. من أجل تطبيق بروتوكول لRNA الآخرين، والأسطواناتسوف نوفمبر تحقيقات قليل النوكليوتيد الممكنة تحتاج إلى النظر فيها، تليها الأمثل التجربة والخطأ التركيز التحقيق، وفترة حضانة، ودرجة الحرارة لRNA FISH. وأحد الأمثلة على التطبيقات الأخرى هو نجاحنا السابق في الكشف عن الحمض النووي الريبي الكروموسومات باستخدام تحقيقات LNA واحدة (22). لتصميم التحقيق والتحضير لكشف الأهداف المنخفضة RNA وفيرة، والرجوع إلى المقالة التي كتبها راج وتياجي 23. والمشكلة الأخرى التي يجب أخذها بعين الاعتبار هي الخطوة permeabilization. هناك حاجة إلى دراسة متأنية بشأن حالة permeabilization مختلفة؛ على سبيل المثال، والآثار أكثر اعتدالا مما هو موضح في بروتوكول لدينا يمكن أن يحدث مع permeabilization بعد تثبيت 15. تحتاج إجراءات permeabilization مختلف أيضا إلى أخذها في الاعتبار عند تنفيذ المناعية FISH باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا. ترتيب المناعي وRNA FISH قد تؤثر أيضا على الكشف عن البروتينات المستهدفة، والتعديلات، وRNA التي كتبها المناعية FISH. إذا RNA FISH هو أداءإد قبل المناعي، واحدة الحضانة ساعة خلال الجزء RNA FISH كافية للكشف عن Xist RNA الإشارة. ومع ذلك، منذ الفورماميد الواردة في المخزن المؤقت التهجين وFISH غسل العازلة يؤثر سلبا H3K27me3 المناعي، نحمل دائما H3K27me3 المناعي قبل Xist RNA FISH في هذا البروتوكول. لتطبيقات أخرى، وترتيب الإجراءات سوف تعتمد على البروتينات المستهدفة وتعديلات جينية التي يتعين مراعاتها من قبل المناعي. وبما أن الأجسام المضادة الأولية كنا لH3K27me3 المناعي لديه عيار عالية وخصوصية لH3K27me3 24، ونحن قادرون على استخدام أقصر فترة حضانة لالمناعي. ومع ذلك، وقت رد الفعل ودرجة الحرارة لالمناعية تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة وبالتالي هناك حاجة الأمثل لكل الأجسام المضادة.

باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد، Xist الكشف عن الحمض النووي الريبي RNA FISH وقد تحسنت بشكل ملحوظ. في دراساتنا السابقة، وجدنا أن مجموعة فرعية من DIFferentiating الخلايا مع H3K27me3 تلطيخ على شي لا ترتبط مع Xist RNA إشارة 25. منذ يرتبط تعديل H3K27me3 على زيان مع تجنيد PRC2 التي كتبها Xist RNA 9-11، 26، فإننا تكهن بأن ذلك يرجع إلى اختراق غير الفعال للriboprobes في نوى مقارنة مع الأجسام المضادة للالمناعي. باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد في هذا البروتوكول، لاحظنا أن H3K27me3 إشارة في تمييز الخلايا الإناث دائما تقريبا شارك المترجمة مع Xist RNA (الشكل 1).

هذا البروتوكول المناعية FISH سريع يسمح لنا للحصول على لقطة من التغيرات الدينامية التي تدور حول Xist lncRNA ويوفر أداة جديدة للمساعدة في الحصول على فهم أفضل للطريقة التي يعمل lncRNA. IncRNAs تؤثر على مختلف الوظائف الخلوية مثل يطبع الجينومية، تنظيم الجينات والترجمة RNA، RNA ونضوج 27. تطوير زيادة فهم دور متنوعق الذي لعبته lncRNA شأنه أن يساعد على دفع هذا المجال إلى الأمام والسماح للاكتشافات مستقبلية في تنظيم العمليات الخلوية الحيوية داخل جسم الإنسان، وكذلك المساهمة في تطوير الأهداف المحتملة لعلاج المرض. وبما أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون الأمثل بسهولة فيما يتعلق علامات وlncRNAs من مصلحة أخرى، بل هو أداة عظيمة للمساعدة في معالجة أسرار مختلف lncRNAs في الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

XP1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
XP2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
Xp4 cgcaacaccgcacactaatacg
Xp5 gccatcttagacacattcaagagcat
Xp6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
Xp7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
Xp8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
Xp12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
Xp19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
Xp20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
Xp24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
Xp25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
Xp27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
Xp30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
Xp32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Tags

علم الوراثة، العدد 93، Xist، تعطيل كروموسوم X-، FISH، هيستون مثيلة، علم التخلق وطويلة غير الترميز RNA
خيارات نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter