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Biology

त्वरित फ्लोरोसेंट Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

इम्यूनोफ्लोरेसेंस (इम्युनो-मछली) के साथ सीटू संकरण (मछली) में शाही सेना फ्लोरोसेंट संयोजन प्रोटीन, epigenetic संशोधनों और अन्य विवरण के स्थानीयकरण में एक साथ अंतर्दृष्टि के साथ शाही सेना स्थानीयकरण के स्थानिक गतिशीलता का पता लगाने के लिए एकल कोशिका के स्तर पर नियोजित किया जा सकता है कि एक तकनीक बनाता है जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस से प्रकाश डाला जा सकता है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA) मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने के लिए एक प्रतिमान है। स्तनधारी महिलाओं में दो एक्स क्रोमोसोम में से एक पर (एक Xist बादल कहा जाता है) एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलेख (Xist) lncRNA संचय एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता आरंभ करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। Xist शाही सेना सीधे या परोक्ष रूप से विभिन्न क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों के साथ सूचना का आदान प्रदान और निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) के लिए अलग epigenetic परिदृश्य का परिचय। ग्यारहवीं में से एक में जाना जाता epigenetic बानगी histone H3 trimethyl-लाइसिन 27 (H3K27me3) संशोधन है। यहाँ, हम एक सरल और त्वरित इम्युनो-मछली का वर्णनXist शाही सेना के स्थानीयकरण और संबद्ध epigenetic संशोधनों की जांच करने के H3K27me3 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ युग्मित कई oligonucleotide जांच के साथ शाही सेना मछली का उपयोग कर Xist आरएनए का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल। Oligonucleotide जांच एक छोटी ऊष्मायन समय में परिणाम और इन विट्रो लिखित शाही सेना जांच (riboprobes) की तुलना में Xist शाही सेना के और अधिक संवेदनशील पता लगाने का उपयोग करना। इस प्रोटोकॉल lncRNAs की गतिशीलता और उसके संबंधित epigenetic संशोधन, chromatin संरचना, परमाणु संगठन और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

स्तनधारी एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) महिलाओं में दो एक्स क्रोमोसोम के एक transcriptionally एक निष्क्रिय है जिसमें XX और XY, के बीच एक्स से जुड़े जीन खुराक में असंतुलन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए एक रणनीति है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA) अनुसंधान के लिए एक महान मॉडल प्रणाली है। एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता कई lncRNAs द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और बड़े पैमाने पर lncRNAs, प्रतिलेखन, chromatin संरचना और परमाणु संगठन 2, 3 के बीच crosstalk तंत्र को उजागर करने के लिए पिछले कुछ दशकों में अध्ययन किया गया है।

एक्स गुणसूत्र पर स्थित एक्स निष्क्रियता केंद्र (XIC) गैर-कोडिंग RNAs के चार उत्पादन जीनों के एक नंबर के शामिल एक जटिल आनुवंशिक ठिकाना है। एक्स-निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलेख (Xist) lncRNA eutherian स्तनधारियों में एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता 5,6 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो एक ऐसे lncRNA है। Xist टेप फू के स्थान के चारों ओरसंरचना क्सी एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता आरंभ, और आरएनए मछली का उपयोग कल्पना जब एक बादल के रूप में प्रकट करने के लिए; इस गठन "Xist बादल" 7 के रूप में भेजा जाता है। Xist आरएनए विभिन्न क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों के साथ सूचना का आदान प्रदान के बाद से, चुप क्रोमेटिन और दमनकारी प्रतिलेखन के लिए अलग epigenetic संशोधनों के साथ Xist बादलों के सह स्थानीयकरण एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता 8 दौरान मनाया जाता है। उदाहरण के लिए, Xist आरएनए H3K27me3 के लिए जिम्मेदार है और एक दमनकारी क्रोमेटिन राज्य 9 लाती है जो polycomb दमनकारी जटिल 2 (PRC2) के साथ सूचना का आदान प्रदान। ग्यारहवीं और गहन H3K27me3 संशोधन के साथ अपने सह स्थानीयकरण पर Xist बादल की घटना क्सी 10,11 के एक ऐच्छिक heterochromatin परिदृश्य का प्रतिनिधित्व करता है।

इस तरह के डीएनए / आरएनए मछली के रूप में सितोगेनिक क तकनीक, बढ़ाया संवेदनशीलता और साथ हाल ही में और उन्नत तकनीकों को radiolabelled जांच 12 का उपयोग करते हुए पारंपरिक विधि से एक लंबा सफर तय किया हैकई oligonucleotide जांच 13,14 का उपयोग कर फ्लोरोसेंट इमेजिंग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ युग्मित डीएनए / आरएनए मछली नियमित spatiotemporal परमाणु संगठन, आरएनए स्थानीयकरण, chromatin संरचना और संशोधनों को समझने के लिए एक कोशिकाविज्ञान उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। शाही सेना मछली के लिए सबसे मानक जांच तैयारी प्लाज्मिड या बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) क्लोन और निक अनुवाद या यादृच्छिक भड़काना 15 के साथ या तो उनके बाद लेबलिंग का इस्तेमाल शामिल है। हालांकि, चूहों में जीन का लगभग 70% और मनुष्यों में जीन का 40% भावना और एंटी-सेन्स टेप भेद करने के क्रम में इसलिए एक कतरा-विशिष्ट मछली विधि की आवश्यकता होती है, भावना और एंटी-सेन्स टेप 16 साल की एक ओवरलैप दिखाते हैं। इन विट्रो लिखित शाही सेना जांच (riboprobe ) अक्सर कतरा-विशिष्ट शाही सेना मछली 17,18 के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, इस T7, SP6, या T3 प्रमोटर और synthesizing riboprobes साथ एक प्लाज्मिड क्लोन या पीसीआर उत्पाद की तैयारी शामिल है। इसके अलावा, genom से निकाली गई Riboprobesआईसी डीएनए या सीडीएनए अक्सर उच्च पृष्ठभूमि शोर में जो परिणाम गैर विशिष्ट क्षेत्रों और दोहराए तत्वों, होते हैं। एक और मुद्दा है, लंबाई में कुछ सौ न्यूक्लियोटाइड कर रहे हैं और कई fluorophores के होते हैं जो riboprobes, कुशलता नाभिक में घुसना नहीं कर सकते हैं। इस नाकाम करने के लिए, अंत में एक एकल फ्लोरोफोरे के साथ लेबल कई छोटे oligonucleotide जांच अच्छा संवेदनशीलता, वर्दी सिग्नल की शक्ति, और शुद्धि की आसानी और 14 से निपटने के लिए है कि विकसित किया गया है। इसके अलावा, डीएनए oligonucleotides के आम तौर पर शाही सेना की तुलना में अधिक स्थिर रहे हैं। हम एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता की प्रक्रिया के दौरान Xist lncRNA द्वारा प्रेरित क्सी की epigenetic गतिशीलता को समझने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ Xist आरएनए मछली 19 में oligonucleotides के उपयोग करने का एक समान रणनीति लागू होता है। इस प्रोटोकॉल oligonucleotide जांच और कोशिकाओं की समुचित तैयारी के निर्माण के लिए, साथ ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली का उपयोग का वर्णन करता है। कई oligonucle का उपयोग कर Xist आरएनए मछलीXist आरएनए मछली एक प्रयोगशाला में नियमित तौर पर किया जाता है अगर otides लंबी अवधि में लागत प्रभावी तरीका है। इस तकनीक को एक साथ epigenetic संशोधन या कारकों के साथ अपने सह स्थानीयकरण मानचित्रण, जबकि कोशिकाओं में lncRNAs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ आसानी से एक अनुसंधान के हितों के अनुरूप करने के लिए इसे संशोधित करने की क्षमता है।

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Protocol

1. जांच तैयारी

  1. एक 5'-अमीनो संशोधन के साथ कई विशिष्ट Xist में oligonucleotides (20-30 न्यूक्लियोटाइड लंबाई oligonucleotides, 63-65 डिग्री सेल्सियस तापमान के पिघलने, 1 टेबल) प्राप्त करें और पानी में निलंबित।
  2. 5'-अमीनो संशोधन (कुल 4.5 माइक्रोग्राम प्रति) और निर्माता के अनुदेश निम्नलिखित एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल के साथ oligonucleotides के पूल equimolar मात्रा में।
    1. Nuclease मुक्त पानी के अंतिम 5 μl में जमा oligonucleotides भंग और oligonucleotide समाधान के लिए एक एम सोडियम बाइकार्बोनेट के 3 μl जोड़ें।
    2. संक्षेप में एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई और भंवर की शीशी के लिए 2 μl DMSO के जोड़ें।
    3. DMSO में प्रतिक्रियाशील डाई के साथ oligonucleotide समाधान मिक्स और अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
  3. इथेनॉल वर्षा द्वारा पीछा जी-25 कॉलम द्वारा fluorescently लेबल oligonucleotide जांच शुद्ध।
    1. चरण 1.2.3 में उत्पादित लेबलिंग मिश्रण करने के लिए 40 μl nuclease मुक्त पानी जोड़ें और जी-25 स्तंभ के लिए लागू होते हैं। 2 मिनट के लिए 750 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. चरण 1.3.2 से शुद्ध जांच करने के लिए 50 μl nuclease मुक्त पानी, 10 μl 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और 250 μl इथेनॉल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 21,000 XG पर 30 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    3. 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार उपजी oligonucleotides धो लें।
    4. 50 μl में फिर से निलंबित nuclease मुक्त पानी या ते (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.5, 1 मिमी EDTA) लगभग 10 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता के लिए।
  4. संकरण बफर के साथ 250 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए fluorescently लेबल oligonucleotide जांच पतला (10% formamide; 2x एसएससी [300 मिमी NaCl, 30 मिमी सोडियम साइट्रेट], 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 10% dextran सल्फेट)।
    नोट: इस त्वरित मछली प्रोटोकॉल के साथ, oligonucleotide पीXist में वस्त्र डिजाइन किए हैं और संकरण के लिए ऊष्मायन समय कम करने के क्रम में oligonucleotide जांच का उपयोग कर सामान्य मछली प्रोटोकॉल तुलना में एक उच्च एकाग्रता में इस्तेमाल किया गया।

2. स्लाइड तैयार

नोट: स्लाइड माउस भ्रूणीय स्टेम (ते) या embryoid शरीर (ईबी) का उपयोग इम्युनो-मछली के लिए तैयार किया जा सकता है या तो एक पाली lysine इलाज स्लाइड पर उन्हें सीधे बढ़ रहा है या सेल निलंबन के साथ Cytospin का उपयोग करके कोशिकाओं 20, 21 फर्क। इधर, Cytospin द्वारा स्लाइड तैयारी दिखाया गया है।

  1. 6 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति के माध्यम aspirate। अच्छी तरह से पीबीएस (कमरे के तापमान), और महाप्राण के साथ धोएं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए सेते, 6 अच्छी तरह से पकवान trypsin के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फैलाने के।
  4. कमरे के तापमान पर 200 XG पर 5 मिनट के लिए, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र कोशिकाओं स्थानांतरण।
  5. मध्यम एक त्यागेंधीरे 2 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं को निलंबित चाहते हैं।
  6. Hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, और पीबीएस द्वारा 4 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में सेल निलंबन पतला।
  7. एक स्लाइड, एक फिल्टर कार्ड और एक क्लिप के साथ एक कक्ष इकट्ठा और Cytospin के रोटर में उपयुक्त स्लॉट में उन्हें जगह है। Cytospin में इकट्ठे इकाइयों के प्रत्येक कक्ष में कदम 2.6 में तैयार प्रत्येक नमूने के 250 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र।
  8. 40 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस, CSK बफर से प्रत्येक के साथ बर्फ पर तीन coplin जार भरें (10 मिमी पाइप, पीएच 6.8; 100 मिमी NaCl, 300 मिमी सुक्रोज, 3 मिमी 2 MgCl), और CSKT बफर (0.5% ट्राइटन साथ CSK बफर एक्स-100), क्रमशः।
  9. Cytospin समाप्त हो गया है, के बाद जल्दी से ठंडा पीबीएस में स्लाइड हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  10. ठंडा CSK बफर में स्लाइड स्थानांतरण और 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  11. ठंडा CSKT बफर में स्लाइड स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  12. ठंडा CSK buf में वापस स्लाइड स्थानांतरणfer और 1 मिनट के लिए सेते हैं।
  13. पीबीएस में 4% paraformaldehyde में स्लाइड स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. कई सेकंड के लिए (0.1% बीच-20 के साथ 1x पीबीएस) PBST के साथ एक coplin जार में स्लाइड रखें।
  2. स्लाइड नीचे प्रवाह करने के लिए बफर शेष की अनुमति के एक तिरछा पर स्लाइड रखें। ध्यान से स्लाइड बंद अतिरिक्त तरल पोंछे और पानी के साथ एक खाली pipet-टिप बॉक्स में जगह है। धीरे से एक coverslip जगह, अवरुद्ध समाधान के 40 μl (1x पीबीएस, 1% बीएसए, 0.1% बीच 20) के साथ स्लाइड ओवरले, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. , Coverslip के निकालें अवरुद्ध समाधान निकालने के लिए, और एक के एक एकाग्रता के लिए पतला Histone H3K27me3 प्राथमिक एंटीबॉडी के 40 μl जोड़ें: 500 अवरुद्ध समाधान में। वापस स्लाइड पर coverslip जगह और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: अवरुद्ध समाधान में एक RNase अवरोध करनेवाला इस शाही सेना वित्तीय संस्थाओं में शाही सेना को बनाए रखने के लिए उपयोगी हो सकता हैपॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है जब एच प्रोटोकॉल।
  4. धो धीरे धोने जबकि मिलाते हुए, 5 मिनट प्रत्येक के लिए, PBST के साथ भरा coplin जार में 2 बार स्लाइड।
  5. स्लाइड नीचे प्रवाह करने के लिए बफर शेष की अनुमति के एक तिरछा पर स्लाइड रखें। ध्यान से अतिरिक्त तरल पोंछे और वापस टिप बॉक्स में स्लाइड जगह है। माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) के 40 μl के साथ ओवरले अवरुद्ध समाधान में पतला, एक coverslip जगह है, और अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं। निम्न चरणों के लिए, हर समय अंधेरे में स्लाइड रहते हैं।
  6. 3.4 कदम के रूप में PBST के साथ जार coplin में दो बार धोएं।

Oligonucleotide जांच के साथ 4. शाही सेना मछली

  1. 4.3 चरण में शाही सेना मछली के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने से स्लाइड को रोकने के लिए तल पर पानी के साथ एक खाली pipet-टिप बॉक्स पूर्व गर्म।
  2. स्लाइड नीचे प्रवाह करने के लिए बफर शेष की अनुमति के एक तिरछा पर स्लाइड रखें। सावधानी से कदम 3.6 से स्लाइड बंद अतिरिक्त तरल पोंछ और वाट के साथ pipet-टिप बॉक्स में स्लाइड जगहतल पर एर। स्लाइड पर मछली धोने बफर (2x एसएससी में 10% formamide) के 500 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. , मछली धोने समाधान निकालें स्लाइड पर oligonucleotide जांच के 8 μl जोड़ने के लिए, एक कवर पर्ची जगह है, और निचले भाग में पानी के साथ एक पूर्व गर्म pipet-टिप बॉक्स करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण; 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. मछली धोने बफर, DAPI के साथ मछली धोने बफर, और 2x एसएससी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 3 पूर्व गर्म coplin जार रखें।
  5. शाही सेना मछली के लिए 1-2 घंटे ऊष्मायन के बाद, पूर्व गर्म मछली धोने बफर में स्लाइड डाल दिया।
  6. Coverslip के स्लाइड के बंद हो जाता है जब तक कुछ मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं।
  7. वापस धोने बफर में स्लाइड प्लेस, और 5 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी है।
  8. 0.5 एनजी / एमएल DAPI के साथ पूर्व गर्म मछली धोने बफर के साथ एक और coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. पूर्व गर्म 2x एसएससी के साथ एक और coplin जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 5 मील के लिए सेतेएन।
  10. स्लाइड नीचे प्रवाह करने के लिए बफर शेष की अनुमति के एक तिरछा पर स्लाइड रखें। ध्यान से अतिरिक्त तरल पोंछे और एक सूखी टिप बॉक्स में वापस स्लाइड जगह है। स्लाइड पर DAPI के साथ antifade के 4 μl जोड़ें और एक coverslip जगह है।
  11. नेल पॉलिश के साथ coverslip सील और एक माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं। स्लाइड कुछ महीनों के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

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Representative Results

त्वरित इम्युनो-मछली की छवियों प्रतिनिधि चित्रा 1 ए में दिखाया जाता है। क्सी पर Xist आरएनए बादल और H3K27me3 संकेत के सह स्थानीयकरण महिला कोशिकाओं फर्क में खोजा गया था। भेदभाव पर 12 दिन में, ईबी कोशिकाओं के 90% से अधिक एक Xist बादल (चित्रा 1 बी) था। (; 150 97%, एन = चित्रा 1C) लघु oligonucleotide जांच कुशलता से लगभग सभी H3K27me3 संकेतों Xist शाही सेना के साथ सह-स्थानीयकृत के एक दृश्य के लिए अग्रणी, नाभिक में प्रवेश।

चित्रा 1
चित्रा 1: Xist शाही सेना और H3K27me3 भेदभाव पर 12 दिन में महिला ईबी कोशिकाओं फर्क में H3K27me3 संशोधन के साथ Xist शाही सेना के लिए माउस ईबी (ए) इम्यूनो-मछली फर्क में क्सी पर सह स्थानीय बनाना।। Xist जांच एलेक्सा Fluor 488 के साथ लेबल रहे थे, और विरोधी H3K27me3 प्राथमिक एंटीबॉडी डे के किया गया थाविरोधी माउस आईजीजी एलेक्सा Fluor 555 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी से tected। नाभिक DAPI साथ counterstained थे। बॉक्सिंग क्षेत्र नीचे पैनल में बढ़ाया है। स्केल सलाखों:।।। 10 माइक्रोन (बी) के भेदभाव पर 12 दिन में ईबी में Xist cloud- और H3K27me3 पॉजिटिव कोशिकाओं की आवृत्ति (सी) भेदभाव पर 12 दिन में ईबी में H3K27me3 संकेत के साथ Xist बादल के सह स्थानीयकरण की फ्रीक्वेंसी करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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तालिका 1: Xist आरएनए मछली के लिए fluorescently लेबल oligonucleotides के अनुक्रम। 48 oligonucleotides के Xist आरएनए मछली के लिए fluorescently लेबल oligonucleotide जांच को तैयार करने के लिए एक 5'-अमीनो संशोधन के साथ संश्लेषित किया गया।

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Discussion

इस पत्र में, हम H3K27me3 के लिए स्लाइड तैयार करने, Xist आरएनए मछली, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस पूरा करने के लिए कम से कम 5 घंटा लेता है कि एक त्वरित इम्युनो-मछली प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। आमतौर पर शाही सेना मछली के लिए रात भर ऊष्मायन की जरूरत है जो Xist आरएनए का पता लगाने के लिए जनरल इम्युनो-मछली दृष्टिकोण के साथ इसकी तुलना में, इस प्रोटोकॉल में काफी समय बिताया कम कर देता है, लेकिन यह भी oligonucleotide जांच का उपयोग कर प्रतिरक्षा-मछली की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है ही नहीं।

Xist अत्यधिक एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता के दौरान लिखित है और तीव्रता से सीआईएस में क्सी पर जमा करने के लिए इसकी प्रतिलिपि पाया जाता है के बाद से, यह फर्क और आरएनए मछली द्वारा विभेदित कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत संक्षिप्त ऊष्मायन समय के उपयोग में Xist आरएनए संकेत का पता लगाने के लिए आसान है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि यह इम्युनो-मछली प्रोटोकॉल, ब्याज और प्रचुर मात्रा में शाही सेना के अन्य प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है। आदेश में, अन्य शाही सेना को NUM प्रोटोकॉल लागू करने के लिएसंभव oligonucleotide जांच के बेर आरएनए मछली के लिए जांच की एकाग्रता का परीक्षण और त्रुटि अनुकूलन, ऊष्मायन समय है, और तापमान के द्वारा पीछा किया, विचार करने की आवश्यकता होगी। अन्य अनुप्रयोगों का एक उदाहरण एकल LNA जांच 22 का उपयोग कर telomeric आरएनए का पता लगाने में हमारी पिछली सफलता है। जांच के डिजाइन और कम प्रचुर मात्रा में शाही सेना के ठिकानों का पता लगाने के लिए तैयार करने के लिए, राज और त्यागी 23 से लेख का संदर्भ लें। विचार किया जाना चाहिए कि एक और मुद्दा permeabilization के कदम है। अलग permeabilization के हालत के बारे में सावधानी से विचार की जरूरत है; उदाहरण के लिए, हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित है से मामूली प्रभाव निर्धारण 15 के बाद permeabilization के साथ हो सकता है। विभिन्न permeabilization के प्रक्रियाओं को भी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग कर इम्युनो-मछली बाहर ले जाने पर विचार करने की जरूरत है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली के आदेश भी इम्युनो-मछली द्वारा लक्ष्य प्रोटीन, संशोधन, और आरएनए का पता लगाने को प्रभावित कर सकता है। शाही सेना मछली प्रदर्शन है, तोएड पूर्व इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, शाही सेना मछली खंड के दौरान एक घंटे ऊष्मायन Xist आरएनए संकेत का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। संकरण बफर और मछली धोने बफर में निहित formamide नकारात्मक H3K27me3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस को प्रभावित करता है हालांकि, बाद से, हम हमेशा इस प्रोटोकॉल में Xist आरएनए मछली के लिए पूर्व H3K27me3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस बाहर ले जाने के लिए। अन्य अनुप्रयोगों के लिए, लक्ष्य प्रोटीन और epigenetic संशोधनों पर निर्भर करेगा प्रक्रियाओं के आदेश इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मनाया जा। हम H3K27me3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस्तेमाल किया प्राथमिक एंटीबॉडी H3K27me3 24 के लिए एक उच्च अनुमापांक और विशिष्टता है के रूप में, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक छोटी ऊष्मायन समय का उपयोग करने में सक्षम हैं। हालांकि, प्रतिक्रिया समय और immunostaining के लिए तापमान इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर कर रहे हैं और इस तरह अनुकूलन प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए आवश्यक है।

Oligonucleotide जांच का प्रयोग, आरएनए मछली द्वारा Xist आरएनए का पता लगाने में काफी सुधार हुआ है। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने पाया है कि अलग से एक सबसेटक्सी पर H3K27me3 धुंधला के साथ ferentiating कोशिकाओं Xist आरएनए संकेत 25 के साथ संबद्ध नहीं हैं। क्सी पर H3K27me3 संशोधन Xist आरएनए 9 से PRC2 भर्ती के साथ जुड़ा हुआ है - 11, 26, हम इस इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एंटीबॉडी की तुलना में नाभिक में riboprobes का अकुशल पैठ के कारण किया गया है कि अनुमान लगाया। इस प्रोटोकॉल में oligonucleotide जांच का उपयोग करके, हम लगभग हमेशा Xist आरएनए (चित्रा 1) के साथ सह-स्थानीयकृत महिला कोशिकाओं फर्क में है कि H3K27me3 संकेत मनाया।

यह जल्दी इम्युनो-मछली प्रोटोकॉल हमें Xist lncRNA के आसपास घूमने गतिशील परिवर्तन का एक स्नैपशॉट हासिल करने के लिए अनुमति देता है और lncRNA काम करता है जिस तरह से एक बेहतर समझ हासिल करने में मदद करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करता है। ऐसे जीनोमिक Imprinting, जीन विनियमन, आरएनए अनुवाद, और शाही सेना परिपक्वता 27 के रूप में विभिन्न सेलुलर कार्यों को प्रभावित IncRNAs। विविध भूमिका की एक वृद्धि की समझ का विकासआगे के क्षेत्र में वृद्धि और मानव शरीर के भीतर महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के नियमन में भविष्य की खोजों के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही रोग के उपचार के लिए संभावित ठिकानों के विकास में योगदान करने में मदद मिलेगी lncRNA द्वारा निभाई है। इस प्रोटोकॉल आसानी से अन्य मार्करों और ब्याज की lncRNAs के लिए सम्मान के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, यह कोशिकाओं में विभिन्न lncRNAs के रहस्यों को सुलझाने के लिए एक महान उपकरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

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References

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जेनेटिक्स अंक 93 Xist एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता मछली हिस्टोन मिथाइलेशन epigenetics लंबे समय से गैर-कोडिंग आरएनए
त्वरित फ्लोरोसेंट<em&gt; बगल में</emएक्स गुणसूत्र निष्क्रियता में Histone संशोधन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ Xist आरएनए कम्बाइंड के लिए&gt; संकरण प्रोटोकॉल
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Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

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