Abstract
Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.
Introduction
Mammalian inactivação do cromossoma X (XCI) é uma estratégia para compensar o desequilíbrio de dosagem do gene ligado ao X e XY entre XX, em que um dos dois cromossomas X em fêmeas é transcricionalmente inactiva 1. Inativação do cromossomo X é um grande sistema modelo para RNA longo não-codificante (lncRNA) pesquisa. Inativação do cromossomo X é regulada por vários lncRNAs, e tem sido amplamente estudado ao longo das últimas décadas para descobrir os mecanismos de crosstalk entre lncRNAs, transcrição, estrutura da cromatina e organização nuclear 2, 3.
O centro X inactivação (XIC) localizado no cromossoma X é um locus genético complexo composto de um número de genes que produzem não codificantes RNAs 4. X-inativo transcrição específico (Xist) lncRNA em mamíferos eutherian é um desses lncRNA que desempenha um papel crucial na inativação do cromossomo X 5,6. Transcrições XIST rodeiam o local do future Xi para iniciar inativação do cromossomo X, e aparecem como uma nuvem quando visualizada usando RNA FISH; esta formação é referido como o "Xist Nuvem" 7. Desde Xist ARN interage com vários enzimas de modificação de cromatina, a co-localização das nuvens XIST com diferentes modificações epigenética para cromatina silenciosa e repressor de transcrição é observado durante a inactivação do cromossoma X 8. Por exemplo, Xist ARN interage com Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) que é responsável pela H3K27me3 e induz um estado repressivo 9 cromatina. A ocorrência da nuvem Xist no Xi e sua co-localização com a modificação intensiva H3K27me3 representa uma paisagem heterocromatina facultativa do Xi 10,11.
Técnicas de citogenética, como o DNA / RNA FISH têm percorreu um longo caminho desde o método tradicional utilizando sondas radiomarcados 12 às técnicas recentes e avançados, com maior sensibilidade eimagens fluorescentes usando várias sondas de oligonucleotídeos 13,14. PEIXES ADN / ARN acoplado com a imunofluorescência foi rotineiramente usado como uma ferramenta para compreender citológico organização espaço-temporal nuclear, ARN de localização, a estrutura da cromatina e modificações. A preparação mais padrão sonda para RNA FISH envolve o uso de plasmídeo ou cromossoma artificial (BAC) clones bacterianas e sua rotulagem subsequente quer com tradução nick ou iniciação ao acaso 15. No entanto, cerca de 70% dos genes em ratos e 40% de genes em humanos mostram uma sobreposição de transcritos de sentido e anti-16, exigindo assim um método FISH específico de cadeia, a fim de distinguir o sentido e anti-transcrições. Em sondas de ARN transcritos in vitro (ribossonda ) são frequentemente utilizados para específicos de cadeia de ARN FISH 17,18; No entanto, isto envolve a preparação de um clone de plasmídeo ou com o produto de PCR de T7, SP6 ou T3 promotor e ribossondas sintetizar. Além disso, ribossondas derivado genomic DNA ou cDNA geralmente contêm regiões não-específicas e elementos repetitivos, que resultam em alto ruído de fundo. Outra questão é que ribossondas, que são algumas centenas de nucleótidos de comprimento e contêm vários fluoróforos, não pode penetrar de forma eficiente para o núcleo. Para contornar este, várias sondas de oligonucleótidos mais curtos marcados com um fluoróforo único no final foram desenvolvidos que possuem uma boa sensibilidade, a intensidade do sinal uniforme, e facilidade de purificação e de manuseamento 14. Além disso, os oligonucleótidos de ADN são geralmente mais estáveis do que o RNA. Nós aplicamos uma estratégia similar de usar oligonucleotídeos em Xist RNA FISH 19 com imunofluorescência para entender a dinâmica epigenéticas do Xi induzidas por Xist lncRNA durante o processo de inativação do cromossomo X. Este protocolo descreve a criação de sondas de oligonucleótidos e preparação de células apropriada, bem como a utilização de imunofluorescência e ARN FISH. Xist RNA FISH usando oligonucle múltiplaotides é o custo abordagem eficaz a longo prazo, se Xist RNA FISH é realizada rotineiramente em um laboratório. Esta técnica pode ser usada para identificar lncRNAs em células, ao mesmo tempo mapeando sua co-localização com modificações epigenética ou factores. Uma das principais vantagens do protocolo é a capacidade de modificá-lo facilmente para atender um de interesses de pesquisa.
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Protocol
1. Preparação Probe
- Obter vários oligonucleotídeos únicas em Xist (oligonucleotídeos 20-30 nucleotídeos de comprimento, 63-65 ºC de temperatura de fusão, a Tabela 1) com uma modificação 5'-amino e suspender em água.
- Piscina quantidades equimolares de oligonucleotídeos com 5'-amino modificação (total 4,5 g) e etiqueta com corante fluorescente amino-reactivo seguindo as instruções do fabricante.
- Dissolve-se os oligonucleótidos reunidos no final de 5 ul de água isenta de nuclease e adicionar 3 mL de 1 M de bicarbonato de sódio à solução de oligonucleótido.
- Adicionar 2 mL de DMSO para o frasco de corante e vortex brevemente reactivo com amina.
- Misturar a solução de oligonucleótido com o corante reactivo em DMSO e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h no escuro.
- Purifica-se as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência por coluna G-25 seguido de precipitação com etanol.
- Adicionar 40 ul livre de nuclease de água à mistura de rotulagem produzido no Passo 1.2.3 e aplicar à coluna de G-25. Centrifugar a 750 xg por 2 min.
- Adicionar 50 ul de água livre de nuclease, 10 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 250 ul de etanol a sonda purificada a partir do passo 1.3.2. Armazenar a -80 ° C durante 30 min e centrifuga-se a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Lavar os oligonucleótidos precipitados uma vez com 1 ml de etanol a 70%.
- Re-suspender em 50 ul de água isenta de nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para uma concentração final de aproximadamente 10 pM.
- Dilui-se as sondas de oligonucleótidos marcados com fluorescência para uma concentração final de 250 nM com tampão de hibridação (formamida a 10%; 2 x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sódio 30 mM], 2 mg / ml de BSA, 10% de sulfato de dextrano).
NOTA: Com este protocolo FISH rápida, oligonucleotídeo pmantos de Xist foram concebidos e utilizados com uma concentração mais elevada do que o protocolo normal de FISH utilizando sondas oligonucleotídicas, a fim de encurtar o tempo de incubação para a hibridação.
2. Deslize Preparação
NOTA: As lâminas podem ser preparados para imuno-FISH utilizando o rato-tronco embrionárias (ES) ou corpo embryoid (EB) diferenciação de células 20, 21 ou por cultivá-las diretamente em um slide tratados com poli-lisina ou usando cytospin com suspensão de células. Aqui, preparação da lâmina por cytospin é mostrado.
- Aspirar o meio de cultura em um prato de 6 poços. Lavar com PBS (temperatura ambiente), e aspirado cuidadosamente.
- Adicionar 0,5 ml de tripsina para o prato de 6 poços, incubar durante 5-10 min a 37 ° C.
- Adicionar 5 ml de meio e dispersar as células por suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
- Transferir as células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente.
- Descartar o meio de umd suavemente suspender as células em 2 ml de PBS.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão celular a 4 x 10 5 células / ml por PBS.
- Montar uma corrediça, um cartão de filtro e uma câmara com um grampo e colocá-los dentro das ranhuras adequadas no rotor do cytospin. Adicionar 250 mL de cada amostra preparada no passo 2.6 em cada câmara das unidades montadas na cytospin. Centrifuga-se a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Encher frascos de 3 coplin sobre gelo com 40 mL de cada um de tampão PBS, CSK gelado (10 mM PIPES, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarose 300 mM; MgCl2 3 mM) e tampão CSKT (CSK com tampão de 0,5% de Triton X-100), respectivamente.
- Após a citocentrifugação está terminado, rapidamente transferir a corrediça em PBS gelado e incubar durante 5 min.
- Transferir as lâminas para tampão CSK gelada e incubar durante 1 min.
- Transferir as lâminas para tampão CSKT gelada e incubar durante 5 min.
- Transferir as lâminas de volta para gelada CSK buffer e incubar durante 1 min.
- Transferir as lâminas em 4% de paraformaldeído em PBS e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
3. Imunofluorescência
- Colocar as lâminas em um frasco coplin com PBST (1x PBS com 0,1% de Tween-20) durante vários segundos.
- Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide e colocá-lo em uma caixa de pipeta-tip vazio com água. Sobrepor a lâmina com 40 ul de solução de bloqueio (PBS 1x, 1% BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente uma lamela, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Retirar as lamelas, remover a solução de bloqueamento e adicionar 40 ul de anticorpo de histona H3K27me3 primário diluído para uma concentração de 1: 500 em solução de bloqueio. Coloque a lamela de volta sobre a lâmina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
NOTA: Um inibidor RNase na solução de bloqueio pode ser útil para preservar RNA neste RNA FISProtocolo de H quando são utilizados anticorpos policlonais. - Wash deslizar 2 vezes em frascos coplin cheios de PBST, durante 5 minutos cada, agitando suavemente durante a lavagem.
- Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta na caixa de ponta. Sobreposição com 40 ul do anticorpo secundário (1: 500) diluídos em solução de bloqueio, colocar uma lamela, e incubar durante 15 min no escuro. Para os passos seguintes, manter o slide no escuro em todos os momentos.
- Lavar duas vezes em frascos Coplin com PBST como no passo 3.4.
4. FISH RNA com Oligonucleotide Sondas
- Pré-aquecer uma caixa de pipeta-tip vazio com água na parte inferior para evitar slides de secagem a 37 ° C por RNA FISH no passo 4.3.
- Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide a partir do passo 3.6 e coloque a lâmina na caixa de pipeta-ponta com water na parte inferior. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de FISH (10% de formamida em 2 x SSC) sobre a lâmina e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover solução de lavagem FISH, adicione 8 mL de sondas de oligonucleotídeos para o slide, coloque uma lamela, e transferir o slide para uma caixa de pipeta-ponta pré-aquecido com água na parte inferior; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas.
- Coloque 3 frascos coplin pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C com tampão de lavagem FISH, tampão de lavagem FISH com DAPI, e 2x SSC.
- Depois de 1-2 incubação hr para RNA FISH, coloque o slide no tampão de lavagem FISH pré-aquecido.
- Incubar a lâmina durante alguns minutos até que a lamela cai fora da lâmina.
- Colocar a lâmina de volta para o tampão de lavagem, e continuar a incubação durante 5 min.
- Transferir as lâminas para outro frasco coplin com tampão de lavagem pré-aquecido FISH com 0,5 ng / ml DAPI e incubar por 5 min.
- Transferir as lâminas para outro frasco coplin com pré-aquecido 2x SSC e incubar por 5 min.
- Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta em uma caixa de ponta seca. Adicione 4 l de antifade com DAPI para o slide e colocar uma lamela.
- Selar a lamela com unha polonês e observar ao microscópio. A corrediça pode ser armazenado a 4 ° C no escuro, por alguns meses.
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Representative Results
Imagens representativas de rápida imuno-FISH são apresentados na Figura 1A. A co-localização do sinal de Xist ARN nuvem e H3K27me3 no Xi foi detectado na diferenciação das células do sexo feminino. No dia 12 após a diferenciação, mais de 90% das células tinha uma nuvem EB Xist (Figura 1B). Sondas oligonucleotídicas curto eficientemente penetrou nos núcleos, levando a uma visualização de quase todos H3K27me3 sinais co-localizada com Xist ARN (Figura 1C; 97%, n = 150).
Figura 1: RNA Xist e H3K27me3 co-localizar no Xi na diferenciação do mouse EB (A) Immuno-FISH para Xist RNA com modificação H3K27me3 na diferenciação de células EB femininos no dia 12 na diferenciação.. XIST sondas foram marcadas com Alexa Fluor 488, e anti-H3K27me3 anticorpo primário foi desgido por anti-IgG de ratinho com Alexa Fluor 555 anticorpo secundário conjugado. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. A região em caixa é ampliada nos painéis inferiores. Barras de escala:... 10 mm (B) Freqüência de XIST células em nuvem e H3K27me3-positivas na EB no dia 12 na diferenciação (C) Freqüência de co-localização de Xist nuvem com sinal H3K27me3 na EB no dia 12 na diferenciação favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, apresentamos um protocolo de imuno-FISH rápida, que leva menos de 5 horas para completar a preparação slide, Xist RNA FISH, e imunofluorescência para H3K27me3. Em comparação com a abordagem geral imuno-FISH para Xist RNA de detecção, que normalmente precisa de incubação durante a noite para RNA FISH, este protocolo não só reduz significativamente o tempo gasto, mas também melhora a sensibilidade imunológica-FISH usando sondas de oligonucleotídeos.
Uma vez que é altamente Xist transcritas durante inactivação do cromossoma X e a sua transcrição é encontrada a acumular-se sobre o intensamente Xi em cis, que é fácil de detectar Xist sinal de ARN e na diferenciação de células diferenciadas, por FISH de ARN utilizando um tempo de incubação relativamente breve. Este protocolo de imuno-FISH pode ser aplicado para outras proteínas de interesse e RNA abundantes, embora optimização em imunofluorescência e ARN FISH pode ser necessária. A fim de aplicar o protocolo para outro RNA, o númeero de possíveis sondas oligonucleotídicas que devem ser considerados, seguido por optimização de tentativa-e-erro de concentração da sonda, tempo de incubação e temperatura de ARN FISH. Um exemplo de outras aplicações é o nosso sucesso anterior na detecção de RNA telomeric utilizando sondas LNA solteiro 22. Para o projeto da sonda e preparação para a detecção de alvos baixos de RNA abundantes, consulte o artigo de Raj e Tyagi 23. Outra questão que deve ser considerado é o passo permeabilização. É necessária uma análise cuidadosa sobre diferentes condições de permeabilização; por exemplo, os efeitos mais suaves do que o que está descrito no nosso protocolo pode ocorrer com permeabilização após fixação 15. Vários procedimentos permeabilização também precisam ser considerados aquando da realização de imuno-FISH, utilizando diferentes tipos de células. A fim de imunofluorescência e ARN FISH também podem afectar a detecção de proteínas alvo, modificações e ARN por imuno-FISH. Se RNA FISH é executared antes de imunofluorescência, uma hora de incubação, durante o segmento de ARN FISH é suficiente para detectar o sinal de RNA Xist. No entanto, uma vez que a formamida contida no tampão de hibridação e tampão de lavagem FISH afeta negativamente H3K27me3 imunofluorescência, nós sempre realizar H3K27me3 imunofluorescência antes Xist RNA FISH neste protocolo. Para outras aplicações, a fim de procedimentos que dependem das proteínas alvo e modificações epigenética a ser observada por imunofluorescência. Como o anticorpo primário foi utilizado para imunofluorescência H3K27me3 tem um elevado título e especificidade para H3K27me3 24, somos capazes de utilizar um tempo de incubação mais curto para imunofluorescência. No entanto, o tempo de reacção e temperatura para imunocoloração são dependentes do anticorpo utilizado e, assim, é necessária optimização para cada anticorpo.
Utilizando sondas de oligonucleótidos, Xist detecção de ARN pela ARN-FISH foi significativamente melhorada. Em nossos estudos anteriores, verificou-se que um subconjunto de differentiating células com coloração H3K27me3 no Xi não estão associados ao sinal de Xist ARN 25. Desde H3K27me3 modificação no Xi é associada com o recrutamento PRC2 por Xist ARN 9-11, 26, especulamos que isto era devido à penetração ineficaz de ribossondas para os núcleos em comparação com o anticorpo para imunofluorescência. Ao usar sondas de oligonucleotídeos neste protocolo, observou-se que o sinal H3K27me3 na diferenciação de células femininas quase sempre co-localizados com Xist RNA (Figura 1).
Este protocolo de imuno-FISH rápido nos permite ter um instantâneo das mudanças dinâmicas que giram em torno Xist lncRNA e oferece uma nova ferramenta para ajudar a obter uma melhor compreensão do modo lncRNA funciona. IncRNAs afetar várias funções celulares como imprinting genômico, regulação gênica, tradução de RNA, e maturação RNA 27. Desenvolver uma maior compreensão do papel diversoé tocada por lncRNA ajudaria a impulsionar o campo para a frente e para permitir futuras descobertas na regulação de processos celulares vitais dentro do corpo humano, bem como contribuir para o desenvolvimento de alvos potenciais para o tratamento de doenças. Uma vez que este protocolo pode ser facilmente otimizado em relação a outros marcadores e lncRNAs de interesse, é uma grande ferramenta para ajudar a resolver os mistérios de vários lncRNAs nas células.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
oligonucleotides with 5’-amino modification | IDT | ||
Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 | |
MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 | |
Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 | |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 | |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
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