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Biology

Fluorescent Rápida Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
* These authors contributed equally

Abstract

Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.

Introduction

Mammalian inactivação do cromossoma X (XCI) é uma estratégia para compensar o desequilíbrio de dosagem do gene ligado ao X e XY entre XX, em que um dos dois cromossomas X em fêmeas é transcricionalmente inactiva 1. Inativação do cromossomo X é um grande sistema modelo para RNA longo não-codificante (lncRNA) pesquisa. Inativação do cromossomo X é regulada por vários lncRNAs, e tem sido amplamente estudado ao longo das últimas décadas para descobrir os mecanismos de crosstalk entre lncRNAs, transcrição, estrutura da cromatina e organização nuclear 2, 3.

O centro X inactivação (XIC) localizado no cromossoma X é um locus genético complexo composto de um número de genes que produzem não codificantes RNAs 4. X-inativo transcrição específico (Xist) lncRNA em mamíferos eutherian é um desses lncRNA que desempenha um papel crucial na inativação do cromossomo X 5,6. Transcrições XIST rodeiam o local do future Xi para iniciar inativação do cromossomo X, e aparecem como uma nuvem quando visualizada usando RNA FISH; esta formação é referido como o "Xist Nuvem" 7. Desde Xist ARN interage com vários enzimas de modificação de cromatina, a co-localização das nuvens XIST com diferentes modificações epigenética para cromatina silenciosa e repressor de transcrição é observado durante a inactivação do cromossoma X 8. Por exemplo, Xist ARN interage com Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) que é responsável pela H3K27me3 e induz um estado repressivo 9 cromatina. A ocorrência da nuvem Xist no Xi e sua co-localização com a modificação intensiva H3K27me3 representa uma paisagem heterocromatina facultativa do Xi 10,11.

Técnicas de citogenética, como o DNA / RNA FISH têm percorreu um longo caminho desde o método tradicional utilizando sondas radiomarcados 12 às técnicas recentes e avançados, com maior sensibilidade eimagens fluorescentes usando várias sondas de oligonucleotídeos 13,14. PEIXES ADN / ARN acoplado com a imunofluorescência foi rotineiramente usado como uma ferramenta para compreender citológico organização espaço-temporal nuclear, ARN de localização, a estrutura da cromatina e modificações. A preparação mais padrão sonda para RNA FISH envolve o uso de plasmídeo ou cromossoma artificial (BAC) clones bacterianas e sua rotulagem subsequente quer com tradução nick ou iniciação ao acaso 15. No entanto, cerca de 70% dos genes em ratos e 40% de genes em humanos mostram uma sobreposição de transcritos de sentido e anti-16, exigindo assim um método FISH específico de cadeia, a fim de distinguir o sentido e anti-transcrições. Em sondas de ARN transcritos in vitro (ribossonda ) são frequentemente utilizados para específicos de cadeia de ARN FISH 17,18; No entanto, isto envolve a preparação de um clone de plasmídeo ou com o produto de PCR de T7, SP6 ou T3 promotor e ribossondas sintetizar. Além disso, ribossondas derivado genomic DNA ou cDNA geralmente contêm regiões não-específicas e elementos repetitivos, que resultam em alto ruído de fundo. Outra questão é que ribossondas, que são algumas centenas de nucleótidos de comprimento e contêm vários fluoróforos, não pode penetrar de forma eficiente para o núcleo. Para contornar este, várias sondas de oligonucleótidos mais curtos marcados com um fluoróforo único no final foram desenvolvidos que possuem uma boa sensibilidade, a intensidade do sinal uniforme, e facilidade de purificação e de manuseamento 14. Além disso, os oligonucleótidos de ADN são geralmente mais estáveis ​​do que o RNA. Nós aplicamos uma estratégia similar de usar oligonucleotídeos em Xist RNA FISH 19 com imunofluorescência para entender a dinâmica epigenéticas do Xi induzidas por Xist lncRNA durante o processo de inativação do cromossomo X. Este protocolo descreve a criação de sondas de oligonucleótidos e preparação de células apropriada, bem como a utilização de imunofluorescência e ARN FISH. Xist RNA FISH usando oligonucle múltiplaotides é o custo abordagem eficaz a longo prazo, se Xist RNA FISH é realizada rotineiramente em um laboratório. Esta técnica pode ser usada para identificar lncRNAs em células, ao mesmo tempo mapeando sua co-localização com modificações epigenética ou factores. Uma das principais vantagens do protocolo é a capacidade de modificá-lo facilmente para atender um de interesses de pesquisa.

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Protocol

1. Preparação Probe

  1. Obter vários oligonucleotídeos únicas em Xist (oligonucleotídeos 20-30 nucleotídeos de comprimento, 63-65 ºC de temperatura de fusão, a Tabela 1) com uma modificação 5'-amino e suspender em água.
  2. Piscina quantidades equimolares de oligonucleotídeos com 5'-amino modificação (total 4,5 g) e etiqueta com corante fluorescente amino-reactivo seguindo as instruções do fabricante.
    1. Dissolve-se os oligonucleótidos reunidos no final de 5 ul de água isenta de nuclease e adicionar 3 mL de 1 M de bicarbonato de sódio à solução de oligonucleótido.
    2. Adicionar 2 mL de DMSO para o frasco de corante e vortex brevemente reactivo com amina.
    3. Misturar a solução de oligonucleótido com o corante reactivo em DMSO e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h no escuro.
  3. Purifica-se as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência por coluna G-25 seguido de precipitação com etanol.
    1. Adicionar 40 ul livre de nuclease de água à mistura de rotulagem produzido no Passo 1.2.3 e aplicar à coluna de G-25. Centrifugar a 750 xg por 2 min.
    2. Adicionar 50 ul de água livre de nuclease, 10 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 250 ul de etanol a sonda purificada a partir do passo 1.3.2. Armazenar a -80 ° C durante 30 min e centrifuga-se a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
    3. Lavar os oligonucleótidos precipitados uma vez com 1 ml de etanol a 70%.
    4. Re-suspender em 50 ul de água isenta de nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para uma concentração final de aproximadamente 10 pM.
  4. Dilui-se as sondas de oligonucleótidos marcados com fluorescência para uma concentração final de 250 nM com tampão de hibridação (formamida a 10%; 2 x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sódio 30 mM], 2 mg / ml de BSA, 10% de sulfato de dextrano).
    NOTA: Com este protocolo FISH rápida, oligonucleotídeo pmantos de Xist foram concebidos e utilizados com uma concentração mais elevada do que o protocolo normal de FISH utilizando sondas oligonucleotídicas, a fim de encurtar o tempo de incubação para a hibridação.

2. Deslize Preparação

NOTA: As lâminas podem ser preparados para imuno-FISH utilizando o rato-tronco embrionárias (ES) ou corpo embryoid (EB) diferenciação de células 20, 21 ou por cultivá-las diretamente em um slide tratados com poli-lisina ou usando cytospin com suspensão de células. Aqui, preparação da lâmina por cytospin é mostrado.

  1. Aspirar o meio de cultura em um prato de 6 poços. Lavar com PBS (temperatura ambiente), e aspirado cuidadosamente.
  2. Adicionar 0,5 ml de tripsina para o prato de 6 poços, incubar durante 5-10 min a 37 ° C.
  3. Adicionar 5 ml de meio e dispersar as células por suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
  4. Transferir as células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente.
  5. Descartar o meio de umd suavemente suspender as células em 2 ml de PBS.
  6. Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão celular a 4 x 10 5 células / ml por PBS.
  7. Montar uma corrediça, um cartão de filtro e uma câmara com um grampo e colocá-los dentro das ranhuras adequadas no rotor do cytospin. Adicionar 250 mL de cada amostra preparada no passo 2.6 em cada câmara das unidades montadas na cytospin. Centrifuga-se a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  8. Encher frascos de 3 coplin sobre gelo com 40 mL de cada um de tampão PBS, CSK gelado (10 mM PIPES, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarose 300 mM; MgCl2 3 mM) e tampão CSKT (CSK com tampão de 0,5% de Triton X-100), respectivamente.
  9. Após a citocentrifugação está terminado, rapidamente transferir a corrediça em PBS gelado e incubar durante 5 min.
  10. Transferir as lâminas para tampão CSK gelada e incubar durante 1 min.
  11. Transferir as lâminas para tampão CSKT gelada e incubar durante 5 min.
  12. Transferir as lâminas de volta para gelada CSK buffer e incubar durante 1 min.
  13. Transferir as lâminas em 4% de paraformaldeído em PBS e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.

3. Imunofluorescência

  1. Colocar as lâminas em um frasco coplin com PBST (1x PBS com 0,1% de Tween-20) durante vários segundos.
  2. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide e colocá-lo em uma caixa de pipeta-tip vazio com água. Sobrepor a lâmina com 40 ul de solução de bloqueio (PBS 1x, 1% BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente uma lamela, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
  3. Retirar as lamelas, remover a solução de bloqueamento e adicionar 40 ul de anticorpo de histona H3K27me3 primário diluído para uma concentração de 1: 500 em solução de bloqueio. Coloque a lamela de volta sobre a lâmina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Um inibidor RNase na solução de bloqueio pode ser útil para preservar RNA neste RNA FISProtocolo de H quando são utilizados anticorpos policlonais.
  4. Wash deslizar 2 vezes em frascos coplin cheios de PBST, durante 5 minutos cada, agitando suavemente durante a lavagem.
  5. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta na caixa de ponta. Sobreposição com 40 ul do anticorpo secundário (1: 500) diluídos em solução de bloqueio, colocar uma lamela, e incubar durante 15 min no escuro. Para os passos seguintes, manter o slide no escuro em todos os momentos.
  6. Lavar duas vezes em frascos Coplin com PBST como no passo 3.4.

4. FISH RNA com Oligonucleotide Sondas

  1. Pré-aquecer uma caixa de pipeta-tip vazio com água na parte inferior para evitar slides de secagem a 37 ° C por RNA FISH no passo 4.3.
  2. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide a partir do passo 3.6 e coloque a lâmina na caixa de pipeta-ponta com water na parte inferior. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de FISH (10% de formamida em 2 x SSC) sobre a lâmina e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Remover solução de lavagem FISH, adicione 8 mL de sondas de oligonucleotídeos para o slide, coloque uma lamela, e transferir o slide para uma caixa de pipeta-ponta pré-aquecido com água na parte inferior; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas.
  4. Coloque 3 frascos coplin pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C com tampão de lavagem FISH, tampão de lavagem FISH com DAPI, e 2x SSC.
  5. Depois de 1-2 incubação hr para RNA FISH, coloque o slide no tampão de lavagem FISH pré-aquecido.
  6. Incubar a lâmina durante alguns minutos até que a lamela cai fora da lâmina.
  7. Colocar a lâmina de volta para o tampão de lavagem, e continuar a incubação durante 5 min.
  8. Transferir as lâminas para outro frasco coplin com tampão de lavagem pré-aquecido FISH com 0,5 ng / ml DAPI e incubar por 5 min.
  9. Transferir as lâminas para outro frasco coplin com pré-aquecido 2x SSC e incubar por 5 min.
  10. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta em uma caixa de ponta seca. Adicione 4 l de antifade com DAPI para o slide e colocar uma lamela.
  11. Selar a lamela com unha polonês e observar ao microscópio. A corrediça pode ser armazenado a 4 ° C no escuro, por alguns meses.

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Representative Results

Imagens representativas de rápida imuno-FISH são apresentados na Figura 1A. A co-localização do sinal de Xist ARN nuvem e H3K27me3 no Xi foi detectado na diferenciação das células do sexo feminino. No dia 12 após a diferenciação, mais de 90% das células tinha uma nuvem EB Xist (Figura 1B). Sondas oligonucleotídicas curto eficientemente penetrou nos núcleos, levando a uma visualização de quase todos H3K27me3 sinais co-localizada com Xist ARN (Figura 1C; 97%, n = 150).

Figura 1
Figura 1: RNA Xist e H3K27me3 co-localizar no Xi na diferenciação do mouse EB (A) Immuno-FISH para Xist RNA com modificação H3K27me3 na diferenciação de células EB femininos no dia 12 na diferenciação.. XIST sondas foram marcadas com Alexa Fluor 488, e anti-H3K27me3 anticorpo primário foi desgido por anti-IgG de ratinho com Alexa Fluor 555 anticorpo secundário conjugado. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. A região em caixa é ampliada nos painéis inferiores. Barras de escala:... 10 mm (B) Freqüência de XIST células em nuvem e H3K27me3-positivas na EB no dia 12 na diferenciação (C) Freqüência de co-localização de Xist nuvem com sinal H3K27me3 na EB no dia 12 na diferenciação favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Seqüência de oligonucleotídeos marcados fluorescente para Xist RNA FISH. Os 48 oligonucleótidos foram sintetizados com uma modificação 5'-amino para preparar as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência para ARN Xist FISH.

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Discussion

Neste artigo, apresentamos um protocolo de imuno-FISH rápida, que leva menos de 5 horas para completar a preparação slide, Xist RNA FISH, e imunofluorescência para H3K27me3. Em comparação com a abordagem geral imuno-FISH para Xist RNA de detecção, que normalmente precisa de incubação durante a noite para RNA FISH, este protocolo não só reduz significativamente o tempo gasto, mas também melhora a sensibilidade imunológica-FISH usando sondas de oligonucleotídeos.

Uma vez que é altamente Xist transcritas durante inactivação do cromossoma X e a sua transcrição é encontrada a acumular-se sobre o intensamente Xi em cis, que é fácil de detectar Xist sinal de ARN e na diferenciação de células diferenciadas, por FISH de ARN utilizando um tempo de incubação relativamente breve. Este protocolo de imuno-FISH pode ser aplicado para outras proteínas de interesse e RNA abundantes, embora optimização em imunofluorescência e ARN FISH pode ser necessária. A fim de aplicar o protocolo para outro RNA, o númeero de possíveis sondas oligonucleotídicas que devem ser considerados, seguido por optimização de tentativa-e-erro de concentração da sonda, tempo de incubação e temperatura de ARN FISH. Um exemplo de outras aplicações é o nosso sucesso anterior na detecção de RNA telomeric utilizando sondas LNA solteiro 22. Para o projeto da sonda e preparação para a detecção de alvos baixos de RNA abundantes, consulte o artigo de Raj e Tyagi 23. Outra questão que deve ser considerado é o passo permeabilização. É necessária uma análise cuidadosa sobre diferentes condições de permeabilização; por exemplo, os efeitos mais suaves do que o que está descrito no nosso protocolo pode ocorrer com permeabilização após fixação 15. Vários procedimentos permeabilização também precisam ser considerados aquando da realização de imuno-FISH, utilizando diferentes tipos de células. A fim de imunofluorescência e ARN FISH também podem afectar a detecção de proteínas alvo, modificações e ARN por imuno-FISH. Se RNA FISH é executared antes de imunofluorescência, uma hora de incubação, durante o segmento de ARN FISH é suficiente para detectar o sinal de RNA Xist. No entanto, uma vez que a formamida contida no tampão de hibridação e tampão de lavagem FISH afeta negativamente H3K27me3 imunofluorescência, nós sempre realizar H3K27me3 imunofluorescência antes Xist RNA FISH neste protocolo. Para outras aplicações, a fim de procedimentos que dependem das proteínas alvo e modificações epigenética a ser observada por imunofluorescência. Como o anticorpo primário foi utilizado para imunofluorescência H3K27me3 tem um elevado título e especificidade para H3K27me3 24, somos capazes de utilizar um tempo de incubação mais curto para imunofluorescência. No entanto, o tempo de reacção e temperatura para imunocoloração são dependentes do anticorpo utilizado e, assim, é necessária optimização para cada anticorpo.

Utilizando sondas de oligonucleótidos, Xist detecção de ARN pela ARN-FISH foi significativamente melhorada. Em nossos estudos anteriores, verificou-se que um subconjunto de differentiating células com coloração H3K27me3 no Xi não estão associados ao sinal de Xist ARN 25. Desde H3K27me3 modificação no Xi é associada com o recrutamento PRC2 por Xist ARN 9-11, 26, especulamos que isto era devido à penetração ineficaz de ribossondas para os núcleos em comparação com o anticorpo para imunofluorescência. Ao usar sondas de oligonucleotídeos neste protocolo, observou-se que o sinal H3K27me3 na diferenciação de células femininas quase sempre co-localizados com Xist RNA (Figura 1).

Este protocolo de imuno-FISH rápido nos permite ter um instantâneo das mudanças dinâmicas que giram em torno Xist lncRNA e oferece uma nova ferramenta para ajudar a obter uma melhor compreensão do modo lncRNA funciona. IncRNAs afetar várias funções celulares como imprinting genômico, regulação gênica, tradução de RNA, e maturação RNA 27. Desenvolver uma maior compreensão do papel diversoé tocada por lncRNA ajudaria a impulsionar o campo para a frente e para permitir futuras descobertas na regulação de processos celulares vitais dentro do corpo humano, bem como contribuir para o desenvolvimento de alvos potenciais para o tratamento de doenças. Uma vez que este protocolo pode ser facilmente otimizado em relação a outros marcadores e lncRNAs de interesse, é uma grande ferramenta para ajudar a resolver os mistérios de vários lncRNAs nas células.

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Materials

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Xp2 cgatcagcagcaacagtacacg
Xp3 gcaattggttgcttttatccagtcc
XP4 cgcaacaccgcacactaatacg
XP5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
XP7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
XP8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
Xp12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
Xp19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
XP20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
Xp24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
Xp25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
Xp27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
XP30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
XP32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

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References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

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Yue, M., Charles Richard, J. L.,More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

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