Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Snabb Fluorescerande Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

Kombinera RNA fluorescent in situ hybridisering (FISH) med immunofluorescens (immun FISH) skapar en teknik som kan användas vid enstaka cellnivå för att upptäcka de rumsliga dynamiken i RNA lokalisering med samtidig insikt i lokalisering av proteiner, epigenetiska modifieringar och andra detaljer vilket kan belysas genom immunofluorescens. X-kromosom inaktive är ett paradigm för lång icke-kodande RNA (lncRNA) medierad geners uttryck. X-inaktiv specifika transkript (Xist) lncRNA ackumulation (kallas Xist moln) på en av de två X-kromosomer i däggdjurs honor är ett kritiskt steg för att initiera X-kromosom inaktive. Xist RNA direkt eller indirekt interagerar med olika kromatin-modifierande enzymer och introducerar distinkta epigenetiska landskap till den inaktiva X-kromosomen (Xi). En känd epigenetiska kännetecken för Xi är Histon H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifiering. Här beskriver vi en enkel och snabb immun FISHprotokoll för att upptäcka Xist RNA använder RNA FISH med flera oligonukleotidprober kombination med immunofluorescens av H3K27me3 att undersöka lokalisering av Xist RNA och tillhörande epigenetiska förändringar. Användning av oligonukleotidsonder resulterar i en kortare inkubationstid och känsligare detektion av Xist-RNA jämfört med in vitro transkriberade RNA-prober (riboprober). Protokollet ger ett kraftfullt verktyg för att förstå dynamiken i lncRNAs och dess tillhörande epigenetisk modifiering, kromatinstruktur, kärnkraft organisation och transkriptionsreglering.

Introduction

Däggdjur X-kromosom inaktive (XCI) är en strategi för att kompensera för obalansen i X-bunden gen dosering mellan XX och XY, där en av de två X-kromosomer i honor är transkriptioninaktiv 1. X-kromosom inaktive är en stor modellsystem för långa icke-kodande RNA (lncRNA) forskning. X-kromosom inaktive regleras av flera lncRNAs, och har studerats under de senaste decennierna för att avslöja de hörningsmekanismerna mellan lncRNAs, transkription, kromatinstruktur och kärnkraftsorganisation 2, 3.

X inaktivecenter (XIC) belägen på X-kromosomen är en komplex genetisk lokus består av ett antal gener som producerar icke-kodande RNA 4. X-inaktiv specifika transkript (Xist) lncRNA i eutherian däggdjur är en sådan lncRNA som spelar en avgörande roll i X-kromosomen inaktive 5,6. Xist transkripten omger platsen för fuTure Xi att initiera X-kromosom inaktive, och visas som ett moln när visualiseras med RNA FISH; denna formation kallas den "Xist Cloud" 7. Eftersom Xist RNA interagerar med olika kromatin-modifierande enzymer, är samlokalisering av Xist moln med olika epigenetiska modifieringar för tyst kromatin och repressiva transkription observeras under X-kromosom inaktive 8. Exempelvis Xist RNA interagerar med Polycomb repressiva komplex 2 (PRC2) som ansvarar för H3K27me3 och inducerar en repressiv kromatin tillstånd 9. Förekomsten av Xist molnet på Xi och dess samlokalisering med den intensiva H3K27me3 modifieringen innebär en frivillig heterokromatin landskapet i Xi 10,11.

Cytogenetiska tekniker, såsom DNA / RNA FISH har kommit långt från den traditionella metoden att använda radiomärkta prober 12 till senaste och avancerade tekniker med förbättrad känslighet ochfluorescerande avbildning med flera oligonukleotidprober 13,14. DNA / RNA FISH kombination med immunofluorescens har rutinmässigt används som ett cytologisk verktyg för att förstå spatiotemporal kärnkraftsorganisation, RNA lokalisering, kromatinstrukturen och modifieringar. Den mest standardprob förberedelse för RNA FISH innebär användning av plasmiden eller bakteriella artificiella kromosom (BAC) kloner och deras efterföljande märkning antingen med nicktranslation eller slumpmässig priming 15. Men nästan 70% av gener i möss och 40% av generna hos människa visar en överlappning av sinnes och antisense avskrifter 16, därför krävde ett strängspecifikt FISH metod för att skilja förnuft och antisense avskrifter. In vitro transkriberade RNA-sonder (riboprob ) används ofta för strängspecifik RNA FISH 17,18; Men handlar det om att förbereda en plasmidklon eller PCR-produkt med T7, SP6 eller T3 promotor och syntetiserande riboprober. Vidare riboprober härledd från Genometic DNA eller cDNA innehåller ofta ospecifika regioner och repetitiva element, vilket resulterar i höga bakgrundsljud. En annan fråga är att riboprober, som är några hundra nukleotider lång och innehåller flera fluoroforer, inte effektivt kan tränga in i kärnan. För att kringgå detta, har flera kortare oligonukleotidprober märkta med en enda fluorofor vid slutet utvecklats som har god känslighet, likformig signalstyrka, och enkel rening och hantering 14. Dessutom, DNA-oligonukleotider i allmänhet är mer stabil än RNA. Vi tillämpade en liknande strategi att använda oligonukleotider i Xist RNA FISH 19 med immunofluorescens för att förstå de epigenetiska dynamiken i Xi inducerade av Xist lncRNA under processen med X-kromosomen inaktivering. Detta protokoll beskriver skapandet av oligonukleotidprober och korrekt beredning av celler, samt utnyttjande av immunofluorescens och RNA FISH. Xist RNA FISH använda flera oligonucleotides är kostnadseffektivt tillvägagångssätt på lång sikt om Xist RNA FISH utförs rutinmässigt i en laboratorium. Denna teknik kan användas för att identifiera lncRNAs i celler samtidigt kartlägga sin samlokalisering med epigenetiska modifieringar eller faktorer. En stor fördel med protokollet är möjligheten att enkelt ändra den efter sina forskningsintressen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sond Framställning

  1. Skaffa flera unika oligonukleotider i Xist (20-30 nukleotid längd oligonukleotider, 63-65 ºC smälttemperatur, Tabell 1) med en 5'-amino modifiering och suspendera i vatten.
  2. Pool ekvimolära mängder av oligonukleotider med 5'-amino modifiering (totalt 4,5 | ig) och märk med aminreaktiv fluorescerande färgämne enligt tillverkarens instruktion.
    1. Lös de poolade oligonukleotider i slutliga 5 pl av nukleasfritt vatten och tillsätt 3 | il av 1 M natriumvätekarbonat till oligonukleotidlösningen.
    2. Lägg 2 pl DMSO till flaskan med aminreaktiva färgämne och vortex kort stund.
    3. Blanda oligonukleotidlösningen med det reaktiva färgämnet i DMSO och inkubera blandningen vid rumstemperatur under 1 h i mörker.
  3. Rena den fluorescent märkta oligonukleotidprober från G-25-kolonn, följt av etanolutfällning.
    1. Lägg 40 pl nukleasfritt vatten till märkningsblandningen som framställts i Steg 1.2.3 och tillämpas på kolonnen G-25. Centrifugera vid 750 xg under 2 minuter.
    2. Lägg 50 pl nukleasfritt vatten, 10 | il 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 250 ul etanol till den renade sonden från steg 1.3.2. Förvara vid -80 ° C under 30 minuter och centrifugera vid 21.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
    3. Tvätta de utfällda oligonukleotiderna en gång med 1 ml 70% etanol.
    4. Återsuspendera i 50 pl nukleasfritt vatten eller TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) för en slutlig koncentration av ca 10 pM.
  4. Späd de fluorescent märkta oligonukleotidprober till en slutlig koncentration av 250 nM med hybridiseringsbuffert (10% formamid; 2 x SSC [300 mM NaCl; 30 mM natriumcitrat]; 2 mg / ml BSA; 10% dextransulfat).
    OBS: Med denna snabba FISK protokoll, oligonukleotid pklädnader i Xist utformades och användes vid en högre koncentration än den normala FISH-protokollet med användning av oligonukleotidprober för att förkorta inkubationstiden för hybridisering.

2. Skjut Förberedelse

OBS: Objektglasen kan förberedas för immuno-FISH med användning mus embryonala stamceller (ES) eller embryoid kropp (EB) differentierande celler 20, 21 genom att antingen odla dem direkt på ett poly-lysin-behandlade objektglas eller med användning cytospin med cellsuspensionen. Här är glaspreparering av cytospin visas.

  1. Aspirera odlingsmedium i en 6-brunnsskål. Tvätta med PBS (rumstemperatur), och aspirera noggrant.
  2. Lägg 0,5 ml trypsin till 6-brunnsskål, inkubera i 5-10 min vid 37 ° C.
  3. Lägg 5 ml medium och dispergera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ned flera gånger.
  4. Överför celler till ett 15 ml rör, centrifugera i 5 min vid 200 xg vid rumstemperatur.
  5. Kasta mediet end försiktigt suspendera cellerna i 2 ml PBS.
  6. Räkna celler med användning av hemocytometer, och utspädd cellsuspension vid 4 x 10 5 celler / ml av PBS.
  7. Montera en bild, en filterkort och en kammare med en klämma och placera dem i rätt hål i rotorn av cytospin. Lägg 250 l av varje prov som framställts i steg 2,6 i varje kammare av de församlade enheterna i cytospin. Centrifugera vid 1500 rpm under 10 min vid rumstemperatur.
  8. Fyll 3 Coplin burkar på is med 40 ml vardera av iskall PBS, CSK buffert (10 mm rör pH 6,8; 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 3 mM MgCl2), och CSKT buffert (CSK buffert med 0,5% Triton X-100), respektive.
  9. Efter cytospin är klar, snabbt överföra sliden i iskall PBS och inkubera i 5 min.
  10. Överför glida in iskall CSK buffert och inkubera i 1 minut.
  11. Överför sliden i iskallt CSKT buffert och inkubera i 5 min.
  12. Transfer tillbaka sliden i iskallt CSK buffer och inkubera under en minut.
  13. Överför sliden i 4% paraformaldehyd i PBS och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur.

3. Immunofluorescens

  1. Placera glasen i en coplinkärlet med PBST (1 x PBS med 0,1% Tween-20) för flera sek.
  2. Placera glasen på en vinkling som tillåter återstående buffert rinna ner bilden. Torka försiktigt överflödig vätska från glaset och placera den i en tom pipett-tip box med vatten. Överlägg sliden med 40 | il blockeringslösning (1 x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), försiktigt placera ett täckglas, och inkubera under 10 min vid rumstemperatur.
  3. Avlägsna täck, avlägsna den blockerande lösningen och tillsätt 40 pl av Histon H3K27me3 primär antikropp utspädd till en koncentration av 1: 500 i blockeringslösning. Placera täckglas tillbaka på objektglaset och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
    OBS: En RNas inhibitor i blockerande lösningen skulle kunna vara till hjälp för att bevara RNA i detta RNA FISH protokollet när polyklonala antikroppar används.
  4. Tvätta skjut 2 gånger i Coplin burkar fyllda med PBST, i 5 min vardera, försiktigt skaka medan tvätt.
  5. Placera glasen på en vinkling som tillåter återstående buffert rinna ner bilden. Torka försiktigt överflödig vätska och placera bilden tillbaka i rutan tips. Overlay med 40 | il av den sekundära antikroppen (1: 500) utspädd i blockeringslösning, placera ett täckglas, och inkubera under 15 minuter i mörker. För de följande stegen, hålla sliden i mörker vid alla tidpunkter.
  6. Tvätta 2 gånger i Coplin burkar med PBST som i steg 3.4.

4. RNA FISH med oligonukleotidsonder

  1. Pre-värma en tom pipett-tip box med vatten i botten för att förhindra diabilder från torkning vid 37 ° C för RNA FISH i steg 4.3.
  2. Placera glasen på en vinkling som tillåter återstående buffert rinna ner bilden. Torka försiktigt överflödig vätska från glaset från steg 3,6 och placera bilden i pipett-tip box med water vid botten. Lägg 500 pl av FISH tvättbuffert (10% formamid i 2xSSC) på objektglaset och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
  3. Ta bort FISH tvättlösning, till 8 pl oligonukleotidprober på bilden, placera en täckglas, och överföra bilden till en förvärmd pipett-tip box med vatten i botten; inkubera vid 37 ° C under 1-2 h.
  4. Placera 3 förvärmda Coplin-kärl i ett vattenbad vid 37 ° C med FISH tvättbuffert, FISH tvättbuffert med DAPI, och 2 x SSC.
  5. Efter 1-2 h inkubation för RNA FISH lade glida in den förvärmda FISH tvättbuffert.
  6. Inkubera objektglaset under några minuter tills täck faller av av sliden.
  7. Placera bilden tillbaka in i tvättbuffert, och fortsätta inkubation under 5 min.
  8. Överför bild till en annan coplinkärlet med förvärmda FISH tvättbuffert med 0,5 ng / ml DAPI och inkubera i 5 min.
  9. Överför bild till en annan coplinkärlet med förvärmda 2x SSC och inkubera i 5 kmn.
  10. Placera glasen på en vinkling som tillåter återstående buffert rinna ner bilden. Torka försiktigt överflödig vätska och placera bilden tillbaka till en torr spetslåda. Lägg 4 pl antifad med DAPI på bilden och placera ett täckglas.
  11. Täta täckglas med nagellack och observera i mikroskop. Sliden kan lagras vid 4 ° C i mörker under några månader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa bilder av snabb immun FISH visas i figur 1A. Co-lokalisering av Xist RNA molnet och H3K27me3 signal på Xi upptäcktes i differentiera kvinnliga celler. Vid dag 12 efter differentiering, hade mer än 90% av EB-celler en Xist molnet (Figur 1B). Kort oligonukleotidsonder effektivt trängde in i kärnorna, vilket leder till en visualisering av nästan alla H3K27me3 signaler samlokaliserad med Xist RNA (Figur 1C, 97%, n = 150).

Figur 1
Figur 1: Xist RNA och H3K27me3 samlokalisering på Xi i differentiera mus EB (A) Immuno-FISH för Xist RNA med H3K27me3 modifiering differentiera kvinnliga EB-celler på dag 12 efter differentiering.. Xist prober märktes med Alexa Fluor 488, och anti-H3K27me3 primär antikropp var av mindreskyddas av anti-mus IgG Alexa Fluor 555-konjugerad sekundär antikropp. Kärnor motfärgades med DAPI. Den inramade regionen förstoras i bottenpanelerna. Skala barer:... 10 mikrometer (B) Frekvens av Xist moln- och H3K27me3-positiva celler i EB vid dag 12 efter differentiering (C) Frekvens av samlokalisering av Xist moln med H3K27me3 signal i EB på dag 12 efter differentiering Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Sekvens av fluorescerande oligonukleotider för Xist RNA FISH. De 48 oligonukleotider syntetiserades med en 5'-amino modifikation att förbereda fluorescerande oligonukleotidprober för Xist RNA FISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna uppsats har vi presenterat en snabb immun FISH protokoll som tar mindre än 5 timmar att slutföra förberedelserna slide, Xist RNA FISH och immunofluorescens för H3K27me3. I jämförelse med den allmänna immun FISH strategi för Xist RNA upptäckt, som vanligtvis behöver övernattning inkubation för RNA FISH, detta protokoll inte bara avsevärt minskar tiden utan också förbättrar känsligheten hos immun FISH använder oligonukleotidprober.

Eftersom Xist starkt transkriberas under X-kromosom inaktivering och dess utskrift befinns intensivt samlas på Xi i cis, är det lätt att upptäcka Xist RNA signal i differentiering och differentierade celler genom RNA FISH utnyttjar en relativt kort inkubationstid. Denna immun FISH protokoll skulle kunna tillämpas på andra proteiner av intresse och riklig RNA, även om optimering i immunofluorescens och RNA FISH kan krävas. För att tillämpa protokollet till andra RNA, numlet möjliga oligonukleotidsonder skulle behöva övervägas, följt av trial-and-error optimering av sondens koncentration, inkubationstid och temperatur för RNA FISH. Ett exempel på andra applikationer är vår tidigare framgång i att upptäcka telomeriska RNA använder enstaka LNA sonder 22. För sond utformning och förberedelse för detektion av låga rikliga RNA-mål, se artikeln av Raj och Tyagi 23. En annan fråga som måste beaktas är permeabilization steget. Det behövs noggranna överväganden rörande olika permeabilization villkor; till exempel, kan mildare effekter än vad som beskrivs i våra protokoll inträffa med permeabilisering efter fixering 15. Olika permeabilization förfaranden måste också beaktas vid genomförande av immun FISH med olika celltyper. Ordningen på immunofluorescens och RNA FISH kan också påverka detektering av målproteiner, modifieringar och RNA genom immun FISH. Om RNA FISH är utföred före immunofluorescens, är en timme inkubation under RNA FISH segmentet nog att upptäcka Xist RNA-signal. Eftersom formamid finns i hybridiseringsbuffert och FISH tvättbuffert påverkar H3K27me3 immunofluorescens negativt, vi alltid utföra H3K27me3 immunofluorescens före Xist RNA FISH i detta protokoll. För andra applikationer, på uppdrag av förfarandena skulle bero på målproteiner och epigenetiska förändringar observeras av immunofluorescens. Som den primära antikroppen som vi använde för H3K27me3 immunofluorescens har en hög titer och specificitet till H3K27me3 24, kan vi använda en kortare inkubationstid för immunofluorescens. Emellertid, reaktionstid och temperatur för immunfärgning är beroende av den antikropp som används och således behövs optimering för varje antikropp.

Använda oligonukleotidsonder, var Xist RNA-detektion av RNA-FISH förbättrats avsevärt. I våra tidigare studier fann vi att en delmängd av differentiating celler med H3K27me3 färgning på Xi är inte förknippade med Xist RNA-signalen 25. Eftersom H3K27me3 modifiering på Xi är associerad med PRC2 rekrytering av Xist RNA 9-11, 26, spekulerade vi att detta berodde på den ineffektiva penetration av riboprober i kärnorna jämfört med antikropp för immunofluorescens. Genom att använda oligonukleotidprober i detta protokoll, konstaterade vi att H3K27me3 signal i differentiera kvinnliga celler nästan alltid tillsammans lokaliserade med Xist RNA (Figur 1).

Denna snabba immun FISH protokoll ger oss möjlighet att få en ögonblicksbild av de dynamiska förändringar kretsar kring Xist lncRNA och erbjuder ett nytt verktyg för att hjälpa till att få en bättre förståelse för hur lncRNA fungerar. IncRNAs påverka olika cellulära funktioner såsom genomisk prägling, genreglering, RNA översättning, och RNA mognad 27. Utveckla en ökad förståelse för de olika rolls spelas av lncRNA skulle bidra till att driva fältet framåt och möjliggöra framtida upptäckter i regleringen av vitala cellulära processer i människokroppen, samt bidra till utvecklingen av potentiella mål för sjukdomsbehandlingar. Eftersom detta protokoll kan enkelt optimeras med avseende på andra markörer och lncRNAs av intresse, det är ett bra verktyg för att bidra till att lösa mysterier olika lncRNAs i celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Xp1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
Xp2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
XP4 cgcaacaccgcacactaatacg
Xp5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
Xp7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
XP8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
XP12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
Xp19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
XP20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
Xp24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
Xp25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
Xp27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
XP30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
XP32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Tags

Genetik Xist X-kromosom inaktive FISK histon metylering epigenetik långa icke-kodande RNA
Snabb Fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet för Xist RNA Kombinerad med Immunfluorescens av histonmodifiering i X-kromosomen Inaktive
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter