Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

המהיר פלורסנט Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

שילוב ניאון RNA הכלאה באתר (דגים) עם immunofluorescence (חיסוני דגים) יוצר בטכניקה שיכולה להיות מועסק ברמת התא הבודד כדי לזהות את הדינמיקה המרחבית של לוקליזציה RNA עם תובנה סימולטני ללוקליזציה של חלבונים, שינויים אפיגנטיים ופרטים נוספים אשר יכול להיות מודגש על ידי immunofluorescence. איון כרומוזום X הוא פרדיגמה להשתקת גנים ארוכה RNA קידוד שאינו (lncRNA) בתיווך. הצטברות X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA (נקראת Xist ענן) באחת משני כרומוזומים X-בנקבות יונקים היא שלב קריטי ליזום איון כרומוזום X. RNA Xist במישרין או בעקיפין אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים ומציג נופים אפיגנטיים ברורים לכרומוזום X פעיל (Xi). סימן היכר ידוע אפיגנטיים אחד Xi הוא trimethyl ליזין היסטון H3 27 שינוי (H3K27me3). כאן אנו מתארים חיסוני FISH פשוט ומהירפרוטוקול לאיתור Xist RNA באמצעות RNA FISH עם בדיקות oligonucleotide מרובות בשילוב עם immunofluorescence של H3K27me3 לבחון את הלוקליזציה של Xist RNA ושינויים אפיגנטיים הקשורים. שימוש בתוצאות בדיקות oligonucleotide בזמן דגירה קצר יותר וגילוי רגיש יותר של Xist RNA בהשוואה לבדיקות RNA במבחנה עיבד (riboprobes). פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של lncRNAs והשינוי אפיגנטיים הקשורים אליו, מבנה הכרומטין, ארגון גרעיני ורגולצית תעתיק.

Introduction

איון כרומוזום X יונקים (xci) הוא אסטרטגיה כדי לפצות על חוסר האיזון במינון גן צמוד X בין XX וXY, שבו אחד משני כרומוזומי X-בנקבות הוא תעתיק 1 מומת. איון כרומוזום X הוא מערכת מודל נהדרת עבור RNA קידוד שאינו ארוך מחקר (lncRNA). איון כרומוזום X מוסדר על ידי lncRNAs מרובה, ונחקר בהרחבה בעשרות השנים האחרונות לחשוף את מנגנוני crosstalk בין lncRNAs, שעתוק, מבנה הכרומטין וארגון גרעיני 2, 3.

מרכז איון X (XIC) הממוקם על כרומוזום X הוא מוקד גנטי מורכב מורכב ממספר גני ייצור RNAs ללא קידוד 4. X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA ביונקי eutherian הוא lncRNA אחד כזה אשר ממלא תפקיד מכריע באיון כרומוזום X 5,6. תמלילי Xist מקיפים את מיקומו של פוture Xi ליזום איון כרומוזום X, ומופיע כענן כאשר דמיינו באמצעות RNA FISH; מערך זה נקרא "Xist הענן" 7. מאז Xist RNA אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים, שיתוף לוקליזציה של ענני Xist עם שינויים אפיגנטיים שונים להכרומטין השקט ושעתוק דיכוי הוא ציין במהלך איון כרומוזום X 8. לדוגמא, Xist RNA אינטראקציה עם מורכב Polycomb מדכא 2 (PRC2) האחראית על H3K27me3 וגורם למצב הכרומטין דיכוי 9. המופע של ענן Xist על Xi ושיתוף הלוקליזציה שלה עם שינוי H3K27me3 האינטנסיבי מייצג נוף heterochromatin פקולטטיביים של Xi 10,11.

טכניקות ציטוגנטית, כגון DNA / RNA FISH יש כברת דרך מהשיטה המסורתית באמצעות בדיקות radiolabelled 12 לטכניקות האחרונות ומתקדמות ברגישות ובמשופרותהדמיה ניאון באמצעות בדיקות oligonucleotide מרובות 13,14. FISH DNA / RNA בשילוב עם immunofluorescence נעשה שימוש באופן שגרתי ככלי ציטולוגית להבין ארגון spatiotemporal גרעיני, לוקליזציה RNA, מבנה הכרומטין ושינויים. הכנת הבדיקה סטנדרטית ביותר עבור RNA FISH כרוך בשימוש בפלסמיד או כרומוזום מלאכותי שיבוטים חיידקים (BAC) והתיוג הבא שלהם או עם תרגום לכינוי או לתחולו אקראי 15. עם זאת, כמעט 70% מהגנים בעכברים ו -40% מהגנים בבני האדם להראות חפיפה של תמלילי תחושה וantisense 16, ומכאן צורך בשיטת FISH גדיל הספציפי כדי להבדיל תמלילי תחושה וantisense. במבחנה בדיקות RNA עיבד (riboprobe ) משמש לעתים קרובות לFISH גדיל RNA ספציפי 17,18; עם זאת, מדובר בהכנת שיבוט פלסמיד או מוצר PCR עם T7, SP6, או אמרגן T3 וriboprobes סינתזה. יתר על כן, Riboprobes נגזר מgenomic DNA או cDNA לעתים קרובות מכיל אזורים שאינם ספציפיים ואלמנטים חוזרים, אשר יביאו לרעש רקע גבוה. בעיה נוספת היא שriboprobes, שהם כמה מאה נוקלאוטידים באורך ומכיל fluorophores מרובה, לא יכולה לחדור ביעילות לתוך הגרעין. כדי לעקוף את זה, בדיקות oligonucleotide קצרות מרובות שכותרתו עם fluorophore אחד בסוף פותחו שיש לי רגישות טובה, עוצמת אות אחידה, וקלות לניקוי וטיפול 14. בנוסף, oligonucleotides DNA הוא בדרך כלל יציב יותר מRNA. אנחנו מוחלים אסטרטגיה דומה של שימוש בoligonucleotides Xist RNA FISH 19 עם immunofluorescence להבין את הדינמיקה אפיגנטיים של Xi הנגרמת על ידי Xist lncRNA במהלך התהליך של איון כרומוזום X. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של בדיקות oligonucleotide והכנה נכונה של תאים, כמו גם ניצול של immunofluorescence וRNA FISH. Xist RNA FISH באמצעות oligonucle מרובהotides היא גישה יעילה עלות בטווח הארוך אם Xist RNA FISH מבוצע באופן שוטף במעבדתו של אחד. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות lncRNAs בתאים תוך מיפוי שיתוף הלוקליזציה שלה עם שינויים או גורמים אפיגנטיים בו-זמנית. אחד יתרונות עיקריים של הפרוטוקול הוא היכולת לשנות אותו בקלות כדי להתאים תחומי המחקר של אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בדיקה הכנה

  1. להשיג oligonucleotides מרובה הייחודי בXist (oligonucleotides 20-30 נוקלאוטיד באורך, טמפרטורת 63-65 מעלות צלזיוס היתוך, טבלת 1) עם שינוי 5'-אמינו ולהשעות במים.
  2. כמויות בריכת equimolar של oligonucleotides עם 5'-אמינו שינוי (סה"כ 4.5 מיקרוגרם) ותווית עם צבע פלואורסצנטי אמין-reactive הבא הוראות היצרן.
    1. ממיסים את oligonucleotides נקווה ב5 μl הסופי של מים nuclease חינם ולהוסיף 3 μl של סודיום ביקרבונט 1 M לפתרון oligonucleotide.
    2. הוספת DMSO 2 μl לבקבוקון של צבע אמין-reactive ובקצרה מערבולת.
    3. מערבבים את פתרון oligonucleotide עם צבע תגובתי בDMSO דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 בחושך.
  3. לטהר את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently על ידי עמודת G-25 ואחריו משקעים אתנול.
    1. מוסיף מים nuclease ללא 40 μl לתערובת התיוג מיוצרת בשלב 1.2.3 ואחול על עמודת G-25. צנטריפוגה ב 750 XG למשך 2 דקות.
    2. הוסף 50 מים μl nuclease ללא, 10 נתרן אצטט μl 3 M (pH 5.2) ו -250 אתנול μl לבדיקה המטוהרת מהשלב 1.3.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 21,000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
    3. שטוף את oligonucleotides זירז פעם אחת עם 1 מיליליטר של אתנול 70%.
    4. להשעות מחדש ב -50 μl nuclease ללא מים או TE (10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) לריכוז סופי של כ -10 מיקרומטר.
  4. לדלל את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently לריכוז סופי של nM 250 עם חיץ הכלאה (פוראמיד 10%; 2x SSC [300 מ"מ NaCl; ציטראט 30 מ"מ נתרן]; 2 מ"ג / מיליליטר BSA, 10% סולפט dextran).
    הערה: עם פרוטוקול FISH זה מהר, p oligonucleotideגלימות בXist תוכננו והשתמשו בריכוז גבוה מפרוטוקול FISH הרגיל באמצעות בדיקות oligonucleotide כדי לקצר את זמן הדגירה של הכלאה.

2. החלק הכנה

הערה: ניתן להכין שקופיות לאימונו-FISH באמצעות עכבר גזע עוברי (ES) או גוף embryoid (EB) הבחנה תאים 20, 21 או על ידי גידולם ישירות בשקופית שטופל פולי-ליזין או באמצעות cytospin עם השעיה תא. כאן, הכנת שקופיות על ידי cytospin מוצגת.

  1. לשאוב את מדיום התרבות בצלחת 6 באר. לשטוף עם PBS (בטמפרטורת חדר), ולשאוב ביסודיות.
  2. הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין לצלחת 6-גם, דגירה למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. הוסף 5 מיליליטר של מדיום ולפזר תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים.
  4. העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 200 בטמפרטורת חדר.
  5. מחק את המדיוםד בעדינות להשעות את התאים 2 מיליליטר PBS.
  6. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ולדלל השעיה תא ב 4 x 10 5 תאים / מיליליטר ידי PBS.
  7. להרכיב שקופיות, כרטיס מסנן וקאמרי עם קליפ ולהכניס אותם לתוך החריצים המתאימים ברוטור של cytospin. הוסף 250 μl של כל דגימה מוכנה בשלב 2.6 לכל תא של היחידות שהתכנסו בcytospin. צנטריפוגה ב 1500 סל"ד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. מלאו 3 צנצנות coplin על קרח עם 40 מיליליטר כל אחד מחיץ PBS, CSK קר כקרח (10 צינורות מ"מ, pH 6.8; 100 מ"מ NaCl; 300 סוכרוז מ"מ; 3 מ"מ MgCl 2), וחיץ CSKT (חיץ CSK עם 0.5% Triton X-100), בהתאמה.
  9. לאחר cytospin הוא סיים, להעביר במהירות את השקופית לתוך PBS קר כקרח ודגירה של 5 דקות.
  10. העבר את השקופית למאגר CSK קר כקרח ודגירת דקות 1.
  11. העבר את השקופית למאגר CSKT קר כקרח ודגירה של 5 דקות.
  12. העבר את השקופית בחזרה לbuf CSK קר כקרחFER דגירה דקות 1.
  13. העבר את השקופית לתוך paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.

3. Immunofluorescence

  1. מניחים את השקופיות בצנצנת coplin עם PBST (1x PBS עם Tween-20 0.1%) לכמה שניות.
  2. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף מהשקופיות ולמקם אותו בתיבת pipet-קצה ריק עם מים. כיסוי השקופית עם 40 μl של פתרון חסימה (1x PBS, BSA 1%, 20-Tween 0.1%), מניח בעדינות coverslip, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. הסר את coverslip, להסיר את פתרון החסימה, ולהוסיף 40 μl של הנוגדן הראשוני היסטון H3K27me3 המדולל לריכוז של 1: 500 בחסימת פתרון. מניחים את coverslip חזרה על שקופיות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
    הערה: מעכב RNase בפתרון החסימה עשויה להיות מועילה כדי לשמר RNA בRNA FIS זהפרוטוקול H כאשר נוגדני polyclonal משמשים.
  4. לשטוף להחליק 2 פעמים בצנצנות coplin מלאות PBST, במשך 5 דקות כל אחד, בעדינות רועדת בזמן הכביסה.
  5. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת הקצה. שכבה עם 40 μl של הנוגדנים משני (1: 500) מדוללים בחסימת פתרון, במקום coverslip, ודגירה במשך 15 דקות בחושך. לשלבים הבאים, לשמור על השקופיות בחושך בכל העת.
  6. לשטוף 2 פעמים בCoplin צנצנות עם PBST כמו בשלב 3.4.

FISH RNA 4. עם oligonucleotide בדיקות

  1. טרום חם תיבת pipet-קצה ריק עם מים בתחתית כדי למנוע שקופיות מהתייבשות על 37 מעלות צלזיוס במשך FISH RNA בשלב 4.3.
  2. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות את נוזל עודף השקופיות מצעד 3.6 ובמקום להחליק לתוך תיבת pipet-הקצה עם ואטאה בתחתית. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף FISH (פוראמיד 10% ב2x SSC) בשקופית ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. הסר פתרון לשטוף FISH, להוסיף 8 μl של בדיקות oligonucleotide לשקופית, במקום להחליק כיסוי, ולהעביר את השקופיות לתיבת pipet-טיפ מראש חימם עם מים בתחתית; לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות.
  4. מניחים 3 צנצנות coplin מראש חימם באמבט מים ב 37 ° C עם חיץ לשטוף FISH, חיץ לשטוף FISH עם DAPI, ו2x SSC.
  5. לאחר הדגירה שעה 1-2 לRNA FISH, לשים את השקופיות לחיץ לשטוף FISH מראש חימם.
  6. דגירה השקופיות במשך כמה דקות עד coverslip נופל של השקופית.
  7. מניחים את השקף חזרה לחיץ לשטוף, ולהמשיך דגירה במשך 5 דקות.
  8. העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם חיץ לשטוף FISH מראש חימם עם 0.5 ng / ml DAPI ודגירה של 5 דקות.
  9. העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם מראש חימם 2x SSC ודגירה של 5 ק"מn.
  10. מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת קצה יבשה. הוסף 4 μl של antifade עם DAPI לשקופית ומניח coverslip.
  11. לאטום את coverslip עם לק ולהתבונן תחת מיקרוסקופ. השקופית יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך כמה חודשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נציג תמונות של חיסוני FISH מהיר מוצגות באיור 1 א. שיתוף לוקליזציה של אות הענן וH3K27me3 Xist RNA על Xi התגלתה בהבחנת תאים נקביים. ביום 12 על בידול, יותר מ -90% מתאי EB היו ענן Xist (איור 1). בדיקות oligonucleotide הקצר חדרו יעילות לתוך הגרעינים, שמובילות להדמיה של כמעט כל אותות H3K27me3 שיתוף מקומי עם Xist RNA (איור 1 ג; 97%, n = 150).

איור 1
איור 1: RNA Xist וH3K27me3 שיתוף למקם על Xi בהבחנת העכבר EB () החיסוני-FISH לXist RNA עם שינוי H3K27me3 בהבחנת תאי EB נקבה ביום 12 על בידול.. בדיקות Xist תויגו עם אלקסה פלואוריד 488, ואנטי-H3K27me3 נוגדן ראשוני היה דהtected על ידי נוגדנים משני 555 מצומדות- אנטי עכבר IgG אלקסה פלואוריד. גרעינים היו counterstained עם DAPI. האזור התאגרף מוגדל בלוחות התחתון. ברים בקנה מידה:... 10 מיקרומטר (B) תדר של תאי cloud- וH3K27me3 החיוביים Xist בEB ביום 12 על בידול (C) תדר של שיתוף לוקליזציה של ענן Xist עם אות H3K27me3 בEB ביום 12 על בידול אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1: רצף של oligonucleotides שכותרתו fluorescently לXist RNA FISH. 48 oligonucleotides היו מסונתז עם שינוי 5'-אמינו כדי להכין את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently לXist RNA FISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, שהצגנו פרוטוקול חיסוני FISH מהיר שלוקח פחות מ 5 שעות כדי להשלים הכנת שקופיות, Xist RNA FISH, וimmunofluorescence לH3K27me3. בהשוואה לגישה חיסונית FISH הכללי לXist RNA זיהוי, אשר בדרך כלל צריך דגירה הלילה לRNA FISH, פרוטוקול זה לא רק מפחית באופן משמעותי את משך זמן, אלא גם משפר את הרגישות של חיסון-FISH באמצעות בדיקות oligonucleotide.

מאז Xist הוא עיבד מאוד במהלך איון כרומוזום X והתמליל שלה נמצא לצבור עוצמה על Xi בחבר עמים, זה קל לזהות Xist RNA אות בהבחנה ותאים מובחנים על ידי RNA FISH ניצול זמן דגירה קצר יחסית. הפרוטוקול חיסוני הדג הזה יכול להיות מיושם על חלבונים אחרים בעלי עניין וRNA בשפע, אם כי ייתכן שתהיה צורך באופטימיזציה immunofluorescence וRNA FISH. על מנת ליישם את הפרוטוקול לRNA האחר, numבער של בדיקות oligonucleotide אפשריות היה צריך להילקח בחשבון, ואחריו אופטימיזציה של ניסוי וטעייה של הריכוז של החללית, זמן דגירה, וטמפרטורה לRNA FISH. אחת דוגמאות ליישומים אחרים היא ההצלחה הקודמת שלנו באיתור RNA telomeric באמצעות בדיקות LNA אחת 22. לעיצוב בדיקה והכנה לגילוי מטרות RNA שפע נמוכים, עיינו במאמר של ראג ​​'וTyagi 23. נושא נוסף שיש לקחת בחשבון הוא צעד permeabilization. יש צורך בשיקול דעת זהירה לגבי מצב permeabilization שונה; לדוגמא, השפעות מתונות יותר ממה שמתואר בפרוטוקול שלנו יכולות להתרחש עם permeabilization לאחר קיבוע 15. נהלי permeabilization שונים גם צריכים להילקח בחשבון בעת ​​ביצוע חיסוני FISH באמצעות תאים מסוגים שונים. סדר immunofluorescence וRNA FISH עשוי להשפיע גם על זיהוי של חלבוני יעד, שינויים, ו- RNA על ידי חיסוני FISH. אם FISH RNA הוא לבצעed לפני immunofluorescence, דגירה שעה אחת במגזר FISH RNA הוא מספיק כדי לזהות Xist RNA אות. עם זאת, מאז פוראמיד הכלול במאגר ההכלאה ולשטוף חיץ FISH משפיע לרעה על immunofluorescence H3K27me3, אנחנו תמיד לבצע immunofluorescence H3K27me3 לפני Xist RNA FISH בפרוטוקול זה. עבור יישומים אחרים, בסדר הגודל של הליכים יהיו תלויה בחלבוני היעד ושינויים אפיגנטיים להיות שנצפה על ידי immunofluorescence. כנוגדן הראשוני שמשמשים לimmunofluorescence H3K27me3 יש כייל גבוה וספציפיות ל -24 H3K27me3, אנו יכולים להשתמש בזמן דגירה קצר יותר עבור immunofluorescence. עם זאת, זמן תגובה וטמפרטורה לimmunostaining תלוי בנוגדן המשמש ובכך יש צורך באופטימיזציה עבור כל נוגדן.

באמצעות בדיקות oligonucleotide, זיהוי RNA Xist על ידי RNA FISH השתפר באופן משמעותי. במחקרים הקודמים שלנו, מצאנו כי תת-קבוצה של DIFתאי ferentiating עם כתמי H3K27me3 על Xi אינם קשורים לאות Xist RNA 25. מאז שינוי H3K27me3 על Xi קשור גיוס PRC2 ידי Xist RNA 9-11, 26, שהערכנו כי זו נבעה מהחדירה יעילה של riboprobes לגרעינים בהשוואה לנוגדן לimmunofluorescence. באמצעות בדיקות oligonucleotide בפרוטוקול זה, שמה לב שאות H3K27me3 בהבחנת תאים נשיים כמעט תמיד שיתוף מקומי עם Xist RNA (איור 1).

פרוטוקול חיסוני FISH מהיר זו מאפשר לנו להשיג תמונת מצב של השינויים הדינמיים המסתובבים סביב Xist lncRNA ומציע כלי חדש כדי לעזור להשיג הבנה טובה יותר של הדרך lncRNA עובדת. IncRNAs משפיע על תפקוד תאי שונים כגון הטבעה גנומית, ויסות הגנים, תרגום RNA, והתבגרות RNA 27. פיתוח הבנה מוגברת של התפקיד המגווןמנוגן על ידי lncRNA יעזרו להניע את השדה קדימה ולאפשר לתגליות עתידיות ברגולציה של תהליכים תאיים חיוניים בגוף האדם, כמו גם לתרום לפיתוח של מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלה. מאז פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות ביחס לסמנים וlncRNAs עניין אחרים, זה הוא כלי נהדר כדי לעזור להתמודד עם המסתורין של lncRNAs השונים בתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Xp1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
XP2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
Xp4 cgcaacaccgcacactaatacg
Xp5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
Xp7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
Xp8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
Xp12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
Xp19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
Xp20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
Xp24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
Xp25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
Xp27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
Xp30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
Xp32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Tags

גנטיקה גיליון 93 ללא קידוד RNA הארוך Xist איון כרומוזום X FISH מתילציה היסטון אפיגנטיקה,
המהיר פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter