Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig Fluorescent Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

Kombinere RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) med immunfluorescens (immun-FISH) skaper en teknikk som kan brukes på celle nivå for å oppdage de romlige dynamikken i RNA lokalisering med samtidig innsikt i lokalisering av proteiner, epigenetiske modifikasjoner og andre detaljer som kan bli markert ved immunfluorescens. X-kromosom inaktivering er et paradigme for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) -mediert genet Slå. X-inaktive spesifikk transkripsjon (Xist) lncRNA akkumulering (kalt en Xist sky) på en av de to X-kromosomer i pattedyr kvinner er et kritisk punkt for å starte X-kromosom inaktivering. Xist RNA direkte eller indirekte samhandler med ulike kromatin modifiserende enzymer og introduserer forskjellige epigenetiske landskap til den inaktive X-kromosom (Xi). En kjent epigenetisk kjennetegn på Xi er Histone H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifikasjon. Her beskriver vi en enkel og rask immun-FISHprotokoll for påvisning Xist RNA bruker RNA FISH med flere oligonukleotidprober kombinert med immunfluorescens av H3K27me3 å undersøke lokalisering av Xist RNA og tilhørende epigenetiske modifikasjoner. Ved å bruke oligonukleotidprober resulterer i en kortere inkuberingstid og mer følsom påvisning av Xist RNA sammenlignet med in vitro-transkriberte RNA-prober (riboprober). Denne protokollen gir et kraftig verktøy for å forstå dynamikken i lncRNAs og dens tilhørende epigenetisk modifikasjon, kromatinstruktur, kjernekraft organisasjon og transkripsjonsregulering.

Introduction

Pattedyr-X-kromosom inaktive (XCI) er en strategi for å kompensere for ubalansen i X-bundet gen dosering mellom XX og XY, karakterisert ved at en av de to X-kromosomet hos kvinner er transkripsjonelt inaktivert 1. X-kromosom inaktivering er en stor modellsystem for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) forskning. X-kromosom inaktivering er regulert av flere lncRNAs, og har blitt grundig studert i løpet av de siste tiårene for å avdekke crosstalk mekanismer mellom lncRNAs, transkripsjon, kromatinstruktur og kjernefysiske organisasjon 2, 3.

X inaktivesenter (XIC) lokalisert på X-kromosomet er en kompleks genetisk lokus som består av et antall gener som produserer ikke-kodende RNA 4. X-inaktive spesifikk transkripsjon (Xist) lncRNA i eutherian pattedyr er en slik lncRNA som spiller en avgjørende rolle i X-kromosom inaktive 5,6. Xist transkripsjoner surround plasseringen av future Xi å starte X-kromosom inaktivering, og vises som en sky når visualisert ved hjelp av RNA FISH; denne formasjonen blir referert til som "Xist Cloud" 7. Siden Xist RNA samhandler med ulike kromatin modifiserende enzymer, er samlokalisering av de Xist skyer med ulike epigenetiske modifikasjoner for stille kromatin og undertrykkende transkripsjon observert under X-kromosom inaktive 8. For eksempel samhandler med polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) som er ansvarlig for H3K27me3 og induserer en undertrykkende kromatin tilstand 9 Xist RNA. Forekomsten av Xist skyen på Xi og dens samlokalisering med den intensive H3K27me3 modifikasjon representerer en fakultativ heterochromatin landskapet i Xi 10,11.

Cytogenetiske teknikker, for eksempel DNA / RNA FISH har kommet en lang vei fra den tradisjonelle metoden ved hjelp av radiomerkede sonder 12 til siste og avanserte teknikker med forbedret sensitivitet ogfluorescerende bildebehandling bruker flere oligonukleotidprober 13,14. DNA / RNA FISH kombinert med immunfluorescens har blitt rutinemessig brukt som en cytologisk verktøy for å forstå spatiotemporal atom organisasjon, RNA lokalisering, kromatinstruktur og modifikasjoner. Den mest vanlige probe RNA klargjøring for FISH innebærer bruk av plasmid eller bakterielle kunstig kromosom (BAC) kloner og deres påfølgende merking enten ved nick-translasjon eller tilfeldig priming 15. Imidlertid nesten 70% av gener hos mus og 40% av gener hos mennesker viser en overlapping på sense og antisense-transkripter 16, og dermed kreve en tråd-spesifikke FISH metode for å skille sense og antisense-transkripter. In vitro-transkriberte RNA-prober (riboprobe ) blir ofte brukt for tråd-spesifikke RNA FISH 17,18; Men dette innebærer fremstilling av en plasmid klon eller PCR-produkt med T7, SP6, eller T3-promoteren og syntetisere riboprober. Videre riboprober avledet fra genomic DNA eller cDNA inneholder ofte ikke-spesifikke regioner og repetitive elementer, noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy. En annen sak er at riboprober, som er et par hundre nukleotider i lengde og inneholder flere fluoroforene, kan ikke effektivt trenge inn i kjernen. For å omgå dette, har flere kortere oligonukleotid-prober merket med en enkelt fluorofor ved enden blitt utviklet som har god følsomhet, styrke ensartet signal, og å lette rensing og håndtering 14. I tillegg er DNA-oligonukleotider er generelt mer stabile enn RNA. Vi har anvendt en lignende strategi med å bruke oligonukleotider i Xist RNA FISH 19 med immunfluorescens å forstå den epigenetiske dynamikken i Xi indusert av Xist lncRNA under prosessen med X-kromosom inaktivering. Denne protokollen beskriver dannelsen av oligonukleotidprober og riktig tilberedning av celler, så vel som anvendelse av immunfluorescens og RNA fisk. Xist RNA FISH bruker flere oligonucleotides er kostnadseffektiv tilnærming på lang sikt hvis Xist RNA FISH utføres rutinemessig i ett laboratorium. Denne teknikken kan brukes til å identifisere lncRNAs i cellene og samtidig kartlegging dens ko-lokalisering med epigenetiske modifikasjoner eller faktorer. En stor fordel med protokollen er muligheten til enkelt å endre det som passer ens forskningsinteresser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Probe Forberedelse

  1. Innhente flere unike oligonukleotider i Xist (20-30 nucleotide lengde oligonukleotider, 63-65 ºC smeltetemperatur, Tabell 1) med en 5'-amino modifikasjon og suspendere i vann.
  2. Basseng ekvimolare mengder av oligonukleotider med 5'-amino modifikasjon (totalt 4,5 mikrogram) og merke med amin-reaktivt fluorescerende fargestoff etter produsentens anvisninger.
    1. Oppløse de samlede oligonukleotider i siste 5 mL av nukleasefritt vann og tilsett 3 mL av en M natriumbikarbonat til oligonukleotid løsning.
    2. Tilsett 2 mL DMSO til glasset med amin-reaktive fargestoff og vortex kort.
    3. Bland oligonukleotid løsning med det reaktive farvestoff i DMSO og inkubere blandingen ved romtemperatur i 1 time i mørke.
  3. Rens det fluorescerende merkede oligonukleotid-prober ved G-25-kolonne, etterfulgt av etanolutfelling.
    1. Legg 40 mL nukleasefritt vann til merking blanding produsert i trinn 1.2.3 og gjelder for G-25-kolonne. Sentrifuger ved 750 x g i 2 min.
    2. Tilsett 50 ul nuclease-fritt vann, 10 ul 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 250 pl etanol til det rensede probe fra trinn 1.3.2. Oppbevar ved -80 ° C i 30 minutter og sentrifuger ved 21 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
    3. Vask de utfelte oligonukleotider en gang med 1 ml 70% etanol.
    4. Re-suspen i 50 ul nuclease-fritt vann eller TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) i en endelig konsentrasjon på omtrent 10 pM.
  4. Fortynn de fluorescensmerkede oligonukleotidprober til en sluttkonsentrasjon på 250 nM med hybridiseringsbuffer (10% formamid, 2 x SSC [300 mM NaCl, 30 mM natriumsitrat], 2 mg / ml BSA, 10% dekstransulfat).
    MERK: Med denne raske FISH protokollen, oligonukleotid pkapper i Xist ble utformet og anvendt i en høyere konsentrasjon enn den normale FISH-protokollen ved å bruke oligonukleotidprober for å redusere inkubasjonstiden for hybridisering.

2. Skyv Forberedelse

MERK: Slides kan være forberedt på immun-FISH bruker mus embryonale stamceller (ES) eller embryoid kroppen (EB) differensierende celler 20, 21 ved enten vokser dem direkte på en poly-lysin-behandlet lysbilde eller bruke cytospin med cellesuspensjon. Her er sklie forberedelse av cytospin vist.

  1. Aspirer dyrkingsmedium i en 6-brønnen parabolen. Vask med PBS (romtemperatur), og aspirer grundig.
  2. Tilsett 0,5 ml trypsin i 6-brønners skål, inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C.
  3. Tilsett 5 ml medium og dispergere cellene ved forsiktig pipettering opp og ned flere ganger.
  4. Overføre celler til et 15 ml rør, sentrifuger i 5 minutter ved 200 x g ved romtemperatur.
  5. Kast medium end forsiktig suspendere cellene i 2 ml PBS.
  6. Tell cellene ved hjelp av hemocytometer, og fortynnet cellesuspensjon på 4 x 10 5 celler / ml med PBS.
  7. Montere et lysbilde, en filterkort og et kammer med et klipp og plassere dem i de riktige sporene i rotoren av cytospin. Tilsett 250 ul av hver prøve fremstilt i trinn 2.6 i hvert kammer av de sammensatte enheter i Cytospin. Sentrifuger ved 1500 rpm i 10 min ved romtemperatur.
  8. Fyller tre Coplin krukker på is med 40 ml hver av iskald PBS, CSK buffer (10 mm rør, pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mm sukrose, 3 mM MgCI2), og CSKT buffer (CSK buffer med 0,5% Triton X-100), henholdsvis.
  9. Etter cytospin er ferdig, raskt overføre sleiden i iskald PBS og inkuberes i 5 min.
  10. Overfør lysbilde i iskald CSK buffer og inkuberes i 1 min.
  11. Overfør lysbilde i iskald CSKT buffer og inkuberes i 5 min.
  12. Overfør raset tilbake i iskald CSK buffer og inkuberes i 1 min.
  13. Overfør sleiden i 4% paraformaldehyd i PBS og inkuberes i 10 minutter ved romtemperatur.

3. Immunfluorescens

  1. Plassere objektglassene i en Coplin krukke med PBST (1 x PBS med 0,1% Tween-20) i flere sekunder.
  2. Plasser lysbilder på skrå slik at resterende buffer å strømme ned lysbildet. Tørk forsiktig overflødig væske av raset og legg den i en tom pipette-tip boks med vann. Overlappe sleiden med 40 ul blokkeringsløsning (1 x PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20), forsiktig plassere et dekkglass, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.
  3. Fjern dekkglass, fjerne den blokkerende løsning, og tilsett 40 pl av Histone H3K27me3 primært antistoff fortynnet til en konsentrasjon på 1: 500 i blokkerende oppløsning. Plassere dekkglass tilbake på sleiden og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
    MERK: En RNase inhibitor i blokkering løsningen kan være nyttig for å bevare RNA i denne RNA FISH protokollen ved polyklonale antistoffer anvendes.
  4. Vask skyv to ganger i Coplin krukker fylt med PBST, for 5 min hver, forsiktig risting mens vask.
  5. Plasser lysbilder på skrå slik at resterende buffer å strømme ned lysbildet. Tørk forsiktig overflødig væske og plasser raset tilbake i boksen tips. Overlegg med 40 ul av det sekundære antistoff (1: 500) fortynnet i blokkeringsløsning, plassere et dekkglass, og inkuber i 15 min i mørket. For de neste trinnene, holde raset i mørket til alle tider.
  6. Vask to ganger i Coplin krukker med PBST som i trinn 3.4.

4. RNA FISH med oligonukleotidprober

  1. Forvarme en tom pipette-spissen boks med vann i bunnen for å forhindre skred tørker ved 37 ° C for RNA FISH i trinn 4.3.
  2. Plasser lysbilder på skrå slik at resterende buffer å strømme ned lysbildet. Tørk forsiktig overflødig væske ut av lysbildet fra trinn 3.6 og plasser lysbilde i pipette-tip boks med water på bunnen. Legg 500 mL av FISH vaskebuffer (10% formamide i 2x SSC) på lysbildet og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
  3. Fjern FISH vaskeløsning, legge til 8 mL av oligonukleotidprober inn på lysbildet, plasserer en dekkglass, og overføre lysbildet til en forvarmet pipette-tip boks med vann i bunnen; Inkuber ved 37 ° C i 1-2 timer.
  4. Plassere tre forhånds varmet Coplin krukker i et vannbad ved 37 ° C med FISH vaskebuffer, FISH vaskebuffer med DAPI, og 2x SSC.
  5. Etter 1-2 timers inkubasjon for RNA FISH, sette lysbilde i forvarmet FISH vaskebuffer.
  6. Ruge lysbildet i noen minutter inntil dekkglass faller ut av raset.
  7. Plasser glir tilbake i vaskebuffer, og fortsette inkubering i 5 min.
  8. Overfør sleiden til en annen Coplin krukke med forvarmet FISH vaskebuffer med 0,5 ng / ml DAPI og inkuberes i 5 min.
  9. Overføre lysbilde til et annet Coplin krukke med forvarmet 2x SSC og inkuberes i 5 min.
  10. Plasser lysbilder på skrå slik at resterende buffer å strømme ned lysbildet. Tørk forsiktig overflødig væske og plasser raset tilbake i en tørr tips boks. Tilsett 4 mL av antifade med DAPI inn på lysbildet og plassere en dekkglass.
  11. Forsegle dekkglass med neglelakk og observere under et mikroskop. Raset kan lagres ved 4 ° C i mørket for et par måneder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative bilder av rask immun-FISH er vist i figur 1A. Samlokalisering av Xist RNA sky og H3K27me3 signal på Xi ble oppdaget i differensiere kvinnelige celler. På dag 12 ved differensiering, mer enn 90% av EB cellene hadde en Xist sky (figur 1B). Kort oligonukleotidprober effektivt trengt inn i kjernene, som fører til en visualisering av nesten alle H3K27me3 signaler samlokalisert med Xist RNA (figur 1C, 97%, n = 150).

Figur 1
Figur 1: Xist RNA og H3K27me3 co-lokalisere på Xi i differensiere mus EB (A) Immuno-FISH for Xist RNA med H3K27me3 modifikasjon i differensiere kvinnelige EB celler på dag 12 ved differensiering.. Xist prober ble merket med Alexa Fluor 488, og anti-H3K27me3 primært antistoff ble debeskyttet av anti-mus IgG Alexa Fluor 555-konjugert sekundært antistoff. Atomkjerner ble kontra med DAPI. Eske regionen er forstørret i bunnplatene. Skala barer:... 10 mm (B) Frekvens av Xist Cloud- og H3K27me3-positive celler i EB på dag 12 ved differensiering (C) Frekvens av samlokalisering av Xist sky med H3K27me3 signal i EB på dag 12 ved differensiering Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Sekvens av fluoresceinmerket oligonukleotider for Xist RNA FISH. De 48 oligonukleotider ble syntetisert med en 5'-amino modifikasjon å forberede fluorescensmerkede oligonukleotidprober for Xist RNA FISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen har vi presentert en rask immun-FISH protokoll som tar mindre enn fem timer å fullføre lysbilde forberedelse, Xist RNA FISH, og immunfluorescens for H3K27me3. Sammenlignet med den generelle immun-FISH tilnærming for Xist RNA deteksjon, som vanligvis trenger overnatting inkubasjon for RNA FISH, denne protokollen ikke bare reduserer tid brukt, men også forbedrer følsomheten immun-FISH hjelp oligonukleotidprober.

Siden Xist er sterkt transkribert under X-kromosom inaktivering og dens transkripsjon er funnet å intenst akkumuleres på Xi i cis, er det lett å detektere Xist RNA-signal i differensierings og differensierte celler ved RNA FISH benytte en forholdsvis kort inkubasjonstid. Dette immuno-FISH protokoll kan anvendes for andre proteiner av interesse og rikelig RNA, selv om optimalisering i immunfluorescens og RNA FISH kan være nødvendig. For å søke protokollen til andre RNA, numFordel mulige oligonukleotidprober ville trenge å bli betraktet, etterfulgt av prøve-og-feile-optimalisering av sondens konsentrasjon, inkubasjonstid og temperatur for RNA FISK. Et eksempel på andre programmer er vår tidligere suksess i å oppdage telomeric RNA ved hjelp av enkle LNA sonder 22. For probe design og forberedelse for påvisning av lave rikelig RNA mål, se artikkel av Raj og Tyagi 23. Et annet problem som må vurderes er permeabilization trinn. Nøye vurdering om forskjellig permeabilization tilstanden er nødvendig; for eksempel, kan mildere effekt enn det som er beskrevet i vår protokoll oppstå med permeabilization etter fiksering 15.. Ulike permeabilization prosedyrer må også tas i betraktning ved gjennomføring av immuno-FISH hjelp av ulike celletyper. Rekkefølgen av immunfluorescens og RNA FISH kan også påvirke påvisning av målproteiner, modifikasjoner og RNA ved immun-FISH. Hvis RNA FISH er utføreed før immunofluorescens, er én time inkubasjon i løpet av RNA FISH segment nok til å detektere Xist RNA-signal. Men siden formamidet finnes i hybridiseringsbuffer og FISH vaskebuffer påvirker negativt H3K27me3 immunfluorescens, vi alltid utføre H3K27me3 immunfluorescens før Xist RNA FISH i denne protokollen. For andre programmer, rekkefølgen av prosedyrer vil avhenge målproteinene og epigenetiske modifikasjoner å bli observert av immunfluorescens. Som den primære antistoffet vi brukte for H3K27me3 immunfluorescens har en høy titer og spesifisitet til H3K27me3 24, er vi i stand til å bruke en kortere inkubasjonstid for immunfluorescens. Imidlertid, reaksjonstid og temperatur for farging er avhengig av antistoffet som brukes, og derved optimalisering er nødvendig for hvert antistoff.

Ved hjelp oligonukleotidprobene, ble Xist RNA påvisning av RNA FISH betydelig forbedret. I våre tidligere studier, fant vi at en undergruppe av differentiating celler med H3K27me3 flekker på Xi er ikke forbundet med Xist RNA signal 25. Siden H3K27me3 modifikasjon på Xi er forbundet med PRC2 rekruttering av Xist RNA 9 - 11, 26, vi spekulert på at dette var på grunn av den ineffektive inntrengning av riboprober i kjernene i forhold til antistoffet for immunfluorescens. Ved å bruke oligonukleotidprober i denne protokollen, observerte vi at H3K27me3 signal i differensierings kvinnelige celler nesten alltid co-lokalisert med Xist RNA (Figur 1).

Denne rask immun-FISH protokollen tillater oss å få et øyeblikksbilde av de dynamiske endringene kretser rundt Xist lncRNA og tilbyr et nytt verktøy for å bidra til å få en bedre forståelse av hvordan lncRNA fungerer. IncRNAs påvirke ulike cellulære funksjoner som genomisk imprinting, genregulering, RNA oversettelse, og RNA modning 27. Utvikle en økt forståelse av den mangfoldige rollens spilt av lncRNA vil bidra til å drive banen frem, og tillate for fremtidige funn i reguleringen av vitale cellulære prosesser i kroppen, samt bidra til utvikling av potensielle mål for sykdomsbehandlinger. Siden denne protokollen kan lett optimalisert med hensyn til andre markører og lncRNAs av interesse, er det et flott verktøy for å hjelpe takle mysterier ulike lncRNAs i cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

XP1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
XP2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
Xp4 cgcaacaccgcacactaatacg
Xp5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
Xp7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
Xp8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
XP12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
Xp14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
Xp19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
Xp20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
Xp24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
Xp25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
Xp27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
XP30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
Xp31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
Xp32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
Xp36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Tags

Genetikk Xist X-kromosom inaktivering FISH histoner metylering epigenetikk lang ikke-kodende RNA
Hurtig Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protokoll for Xist RNA Kombinert med Immunfluorescens av Histone Modification i X-kromosom inaktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter